抗皮肤衰老组合物及其用途和抗皮肤衰老产品的制作方法

1.本发明属于材料科学领域，具体地，涉及一种抗皮肤衰老组合物及其用途和抗皮肤衰老产品。


背景技术：

2.透明质酸(ha)是一种普遍存在于细胞外基质的糖胺聚糖，由n-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸的二糖重复序列组成。透明质酸广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。
3.皮肤衰老，也称为皮肤老化是指皮肤功能衰老性损伤，使皮肤对机体的防护能力，调节能力等减退，由此皮肤不能适应内外环境的变化，出现颜色、色泽、形态、质感等外观整体状况的改变。皮肤的老化分为内源性老化和外源性老化。内源性老化是指皮肤随年龄增长的自然老化。表现为皮肤变白，出现细小皱纹、弹性下降、皮肤松弛等。外源性老化的最主要原因是日晒所致的光老化。表现为皱纹、皮肤松弛、粗糙、淡黄或灰黄色的皮肤变色、毛细血管扩张、色素斑形成等。
4.皮肤衰老的原因主要由以下几点体现：1.真皮层细胞外基质的改变。胶原蛋白遍布全身，尤其是皮肤，骨骼和结缔组织。真皮层的细胞外基质主要由胶原蛋白组成，其次是弹性蛋白、糖胺聚糖等等。其中ⅰ型胶原蛋白占总胶原蛋白含量的80％-90％。真皮层的胶原蛋白是维持肌肤紧致饱满有弹性，并且承前启后连接真皮层与皮下脂肪层之间的基础。随着年龄的增长，真皮成纤维细胞分泌胶原蛋白的能力减弱。同时，基质金属蛋白酶-1(mmp-1)分泌增加，导致其加速降解胶原。这两种因素一同导致了皮肤中胶原蛋白的含量降低，进而导致皮肤的衰老。2.真皮-表皮连接层结构(dej)的改变。dej是真皮-表皮物质交换的生理屏障，同时也是皮肤中重要的支撑骨架。在衰老的皮肤中，dej逐渐松弛，结构趋于平缓，同时dej中重要的结构蛋白层粘连蛋白332(laminin-332)、collagenⅳ等表达量下降。
5.因此，寻找一种能通过促进胶原分泌、抑制胶原降解，从而增加总胶原蛋白含量，并且能增强真皮-表皮连接层(dej)结构功能的透明质酸组合物，对透明质酸在抗衰老方面的应用具有非常重要的意义。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供一种促抗皮肤衰老组合物及其用途和抗皮肤衰老产品。
7.具体来说，本发明涉及如下方面：
8.1.一种抗皮肤衰老组合物，其特征在于，所述组合物包括乙酰化透明质酸或其盐，以及低分子透明质酸或其盐。
9.2.根据项1所述的组合物，其特征在于，所述乙酰化透明质酸或其盐与低分子透明质酸或其盐的质量比为1:9-9:1。
10.3.根据项1所述的组合物，其特征在于，所述乙酰化透明质酸或其盐的分子量为10-100kda。
11.4.根据项1所述的组合物，其特征在于，所述低分子透明质酸或其盐的分子量为10-50kda。
12.5.根据项1所述的组合物，其特征在于，所述组合物由乙酰化透明质酸或其盐，以及低分子透明质酸或其盐组成。
13.6.根据项1所述的组合物，其特征在于，在所述组合物中，所述乙酰化透明质酸或其盐的质量含量大于等于10％。
14.7.根据项1所述的组合物，其特征在于，所述低分子透明质酸或其盐的质量含量为大于等于10％。
15.8.一种抗皮肤衰老产品，其特征在于，所述抗皮肤衰老产品包括项1-7中任一项所述的组合物。
16.9.根据项8所述的抗皮肤衰老产品，其特征在于，所述组合物在所述抗皮肤衰老产品中的质量含量为0.0002％-2％。
17.10.项1-7中任一项所述的组合物在制备抗皮肤衰老、促进胶原蛋白生成、稳定真皮-表皮连接层的组合物中的用途。
18.11.乙酰化透明质酸或其盐在制备促进胶原蛋白生成的组合物中的用途，优选地，所述乙酰化透明质酸或其盐的分子量为10-100kda。
19.本发明的透明质酸组合物分子量较小，可以显著促进真皮成纤维细胞胶原蛋白的生成，使真皮中的胶原蛋白含量增加，减少皱纹的产生。同时，其具有增强真皮-表皮连接层(dej)结构的作用；具有一定的抗衰老活性。胶原蛋白独有的三螺旋结构，能强力锁住30倍的水分，使皮肤持久水润、光泽、细嫩人体。本发明的透明质酸组合物可用于制备抗衰老和保湿的化妆品、医疗器械。
附图说明
20.图1为使用样品1、7、8、9、10后成纤维细胞分泌胶原蛋白ⅰ的含量。
21.图2为使用样品1-6后成纤维细胞分泌胶原蛋白ⅰ的含量。
22.图3为使用样品1-5、8后成纤维细胞分泌胶原蛋白ⅰ的含量。
23.图4为使用样品1-5、10后成纤维细胞分泌胶原蛋白ⅰ的含量。
24.图5显示使用样品1-1后3d全层皮肤模型的结构。
25.图6显示使用样品1-1后3d全层皮肤模型中胶原ⅰ的表达。
26.图7显示使用样品1-1后3d全层皮肤模型中laminin-332的表达。
具体实施方式
27.下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
28.除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
29.本发明为了实现皮肤抗衰老的作用，提供了一种抗皮肤衰老组合物，所述组合物包括乙酰化透明质酸或其盐，以及低分子透明质酸或其盐。
30.其中，乙酰化透明质酸(acetylated hyaluronate，简称：acha)是由透明质酸钠经乙酰化反应得到。乙酰基的引入给透明质酸带来亲脂性，增强了透明质酸对皮肤的亲和性和吸附性，提高了透明质酸的保湿性能。
31.在一个具体的实施方式中，所述乙酰化透明质酸或其盐的分子量为10k-100kda，优选为30k-100kda。例如可以为10kda、20kda、30kda、35kda、40kda、45kda、50kda、55kda、60kda、65kda、70kda、75kda、80kda、85kda、90kda、95kda、100kda。
32.低分子透明质酸或其盐组成是指分子量较低的透明质酸或其盐。透明质酸发挥生理作用与其分子量的大小密切相关，不同分子质量的透明质酸具有不同的生物活性。分子量较小的透明质酸具有免疫活性、促进血管内皮细胞增殖和逆转肿瘤细胞多药耐药性等作用。同时水解透明质酸由于分子量较小，可以渗透至表皮内部。
33.在一个具体的实施方式中，所述低分子量透明质酸或其盐的分子量为10k-50kda，优选为30k-50kda。例如可以为10kda、20kda、30kda、35kda、40kda、45kda、50kda。
34.在所述抗皮肤衰老组合物中，乙酰化透明质酸或其盐和低分子透明质酸或其盐可以以任何质量比存在。
35.在一个具体的实施方式中，所述乙酰化透明质酸或其盐与低分子透明质酸或其盐的质量比为1:9-9:1，例如可以为1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9。
36.在一个具体的实施方式中，在所述组合物中，所述乙酰化透明质酸或其盐的质量含量大于等于10％，例如可以为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。
37.在一个具体的实施方式中，在所述组合物中，所述低分子透明质酸或其盐的质量含量大于等于10％，例如可以为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。
38.在一个具体的实施方式中，在所述组合物中，所述乙酰化透明质酸或其盐的质量含量大于等于10％，所述低分子透明质酸或其盐的质量含量大于等于10％。
39.在一个具体的实施方式中，所述组合物由乙酰化透明质酸或其盐，以及低分子透明质酸或其盐组成。
40.在一个具体的实施方式中，在所述组合物中，所述乙酰化透明质酸或其盐的质量含量为50％，所述低分子透明质酸或其盐的质量含量为50％。
41.在一个具体的实施方式中，在所述组合物中，所述乙酰化透明质酸或其盐的质量含量为10％，所述低分子透明质酸或其盐的质量含量为90％。
42.在一个具体的实施方式中，在所述组合物中，所述乙酰化透明质酸或其盐的质量含量为25％，所述低分子透明质酸或其盐的质量含量为75％。
43.在一个具体的实施方式中，在所述组合物中，所述乙酰化透明质酸或其盐的质量含量为75％，所述低分子透明质酸或其盐的质量含量为25％。
44.在一个具体的实施方式中，在所述组合物中，所述乙酰化透明质酸或其盐的质量含量为90％，所述低分子透明质酸或其盐的质量含量为10％。
45.在一个具体的实施方式中，在所述组合物中，所述乙酰化透明质酸或其盐的质量含量为50％，分子量为30kda，所述低分子透明质酸或其盐的质量含量为50％，分子量为
30kda。
46.在一个具体的实施方式中，在所述组合物中，所述乙酰化透明质酸或其盐的质量含量为10％，分子量为30kda，所述低分子透明质酸或其盐的质量含量为90％，分子量为30kda。
47.在一个具体的实施方式中，在所述组合物中，所述乙酰化透明质酸或其盐的质量含量为25％，分子量为30kda，所述低分子透明质酸或其盐的质量含量为75％，分子量为30kda。
48.在一个具体的实施方式中，在所述组合物中，所述乙酰化透明质酸或其盐的质量含量为75％，分子量为30kda，所述低分子透明质酸或其盐的质量含量为25％，分子量为30kda。
49.在一个具体的实施方式中，在所述组合物中，所述乙酰化透明质酸或其盐的质量含量为90％，分子量为30kda，所述低分子透明质酸或其盐的质量含量为10％，分子量为30kda。
50.本发明还提供包括上述组合物的抗皮肤衰老产品。保湿产品除了包括本文所述的抗皮肤衰老组合物，还可以根据不同的需求和应用而添加其它成分。
51.在一个具体的实施方式中，所述组合物在所述抗皮肤衰老产品中的质量含量为0.0002％-2％，例如可以为0.0002％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％。
52.本发明还提供上述组合物在制备保湿组合物中的用途。
53.本发明还提供上述组合物在制备抗皮肤衰老、促进胶原蛋白生成、稳定真皮-表皮连接层的组合物中的用途。其中，促进胶原蛋白生成是指促进胶原蛋白总量的积累或促进胶原蛋白含量的增加。
54.本发明还提供乙酰化透明质酸或其盐在制备促进胶原蛋白生成的组合物中的用途。其中，所述乙酰化透明质酸或其盐的分子量为10-100kda，优选为30k-100kda。
55.如上所述，在所述用途中，促进胶原蛋白生成是指促进胶原蛋白总量的积累或促进胶原蛋白含量的增加。
56.本发明组合物可显著促进胶原蛋白ⅰ的分泌，同时使真皮-表皮连接层(dej)结构更加稳定，具有一定的抗衰老作用。本发明组合物中的低分子量透明质酸或其盐和乙酰化透明质酸或其盐在促进胶原蛋白分泌方面具有协同增效的作用，尤其是当乙酰化透明质酸或其盐与低分子透明质酸或其盐的质量比为1:9-9:1时，组合物促进胶原蛋白ⅰ分泌的效果更加显著。
57.实施例
58.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。
59.下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，所使用的乙酰化透明质酸钠和低分子透明质酸钠均购自华熙生物科技股份有限公司。
60.实施例1
61.称取分子量为30kda的低分子量透明质酸钠(商品名：hybloom
tm
低分子透明质酸钠)50g，分子量为30kda的乙酰化透明质酸钠(商品名：hymagic
tm-acha)50g。
62.将上述称取的组分搅拌均匀，即得到透明质酸组合物。
63.实施例2
64.称取分子量为30kda的低分子量透明质酸钠(商品名：hybloom
tm
低分子透明质酸钠)10g，分子量为30kda的乙酰化透明质酸钠(商品名：hymagic
tm-acha)90g。将上述组分搅拌均匀，即得到透明质酸组合物。
65.实施例3
66.称取分子量为30kda的低分子量透明质酸钠(商品名：hybloom
tm
低分子透明质酸钠)25g，分子量为30kda的乙酰化透明质酸钠(商品名：hymagic
tm-acha)75g。将上述组分搅拌均匀，即得到透明质酸组合物。
67.实施例4
68.称取分子量为30kda的低分子量透明质酸钠(商品名：hybloom
tm
低分子透明质酸钠)75g，分子量为30kda的乙酰化透明质酸钠(商品名：hymagic
tm-acha)25g。将上述组分搅拌均匀，即得到透明质酸组合物。
69.实施例5
70.称取分子量为30kda的低分子量透明质酸钠(商品名：hybloom
tm
低分子透明质酸钠)90g，分子量为30kda的乙酰化透明质酸钠(商品名：hymagic
tm-acha)10g。将上述组分搅拌均匀，即得到透明质酸组合物。
71.实施例6
72.称取分子量为30kda的低分子量透明质酸钠(商品名：hybloom
tm
低分子透明质酸钠)95g，分子量为30kda的乙酰化透明质酸钠(商品名：hymagic
tm-acha)5g。将上述组分搅拌均匀，即得到透明质酸组合物。
73.对比例1
74.分子量为30kda的低分子量透明质酸钠(商品名：hybloom
tm
低分子透明质酸钠)100g。
75.对比例2
76.称取分子量为30kda的乙酰化透明质酸钠(商品名：hymagic
tm-acha)100g。
77.上述各实施例和对比例的条件如表1所示。
78.表1不同实施例和对比例的组成及含量(g)
[0079][0080][0081]
试验例1
[0082]
真皮中的胶原蛋白主要由成纤维细胞分泌。皮肤衰老后，成纤维细胞分泌胶原蛋白的能力下降，会引起皮肤缺乏弹性，产生皱纹。因此，通过评估成纤维细胞分泌胶原的含量可以检测活性物的抗衰老作用。
[0083]
1、样品准备
[0084]
称取实施例1、2、3、4、5和6的透明质酸组合物各20mg、对比例1、2的透明质酸组合物各10mg以及20mg，分别分散于100ml的dmem培养基中，0.22μm滤膜除菌过滤。再分别取过滤后的溶液100μl分散于9.9ml的dmem培养基中，分别得到质量浓度为0.0002％的样品1(对应于实施例1)、样品2(对应于实施例2)、样品3(对应于实施例3)、样品4(对应于实施例4)、样品5(对应于实施例5)、样品6(对应于实施例6)和质量浓度为0.0001％的样品7(对应于对比例1)、样品8(对应对比例2)和质量浓度为0.0002％的样品9(对应对比例1)和样品10(对应对比例2)。
[0085]
2、人成纤维细胞胶原ⅰ(胶原蛋白ⅰ)分泌实验
[0086]
将人成纤维细胞以1万/孔的密度铺于96孔板中，置于培养箱中培养24h。弃上清，将样品1-10加入孔板中，每孔200μl。置于培养箱中孵育48h。收集上清，将上清用dmem培养基稀释十倍后，使用human colⅰelisa kit对上清中的胶原ⅰ进行定量。结果如图1、图2、图3、图4所示。其中，对照组为不加入任何样品的试验组。
[0087]
3、统计分析
[0088]
各组间比较采用t-test统计分析，*为p《0.05被认为有统计学差异。**为p《0.01被认为具有显著统计学差异，***为p《0.001被认为有极显著统计学差异。
[0089]
4、结果显示
[0090]
如图1所示，样品7、样品9与对照组无统计学差异，胶原ⅰ分泌量无增加。样品8、样品10和样品1胶原ⅰ的分泌量均显著增加。将样品8、样品10分别和样品1进行组间t-test，得出样品8、样品10均和样品1的数据间存在统计学差异。说明样品1促进胶原ⅰ分泌的能力更强。
[0091]
如图2、3、4所示，样品1-5的促胶原ⅰ分泌量组间无统计学差异。
[0092]
如图2所示，样品1-5与样品6的促胶原ⅰ分泌量组间存在显著统计学差异。
[0093]
如图3、4所示，样品1-5与样品8、10的促胶原ⅰ分泌量组间均存在统计学或显著统计学差异。
[0094]
综上所有结果，说明本技术的组合物具有很好的促胶原ⅰ分泌的能力，即在低分子透明质酸钠：乙酰化透明质酸钠＝1：9-9：1时促进胶原ⅰ分泌的效果更加显著。
[0095]
5、金氏公式检验
[0096]
5.1计算相对胶原ⅰ分泌量
[0097]
根据各组的胶原ⅰ分泌量利用下述公式计算出相对胶原分泌量(％)计算相对胶原分泌量，结果如表2。
[0098][0099]
表2相对胶原ⅰ分泌量(％)
[0100] 样品7样品8样品1
相对胶原ⅰ分泌量0.981.21.37
[0101]
5.2检验公式及原则
[0102]
q＝e
a+b
/(ea+e
b-ea×
eb)
[0103]
其中，ea为样品7的相对胶原ⅰ分泌量(％)，eb为样品8的相对胶原ⅰ分泌量(％)，e
a+b
为样品1的相对胶原分泌量(％)。
[0104]
当q值为0.85-1.15时为单纯相加；大于1.15-20时为协同增效。
[0105]
5.3检验结果
[0106]
将各组相对胶原分泌量(％)带入金氏公式，计算出q值为1.36，根据金氏公式及检验原则得出结论：低分子量透明质酸钠和乙酰化透明质酸钠在促进胶原蛋白分泌方面具有协同增效的作用。
[0107]
试验例2
[0108]
本发明通过评估透明质酸组合物对3d全层皮肤模型的组织结构影响来评估真皮层胶原含量及dej结构中laminin-332的含量。
[0109]
1、样品准备
[0110]
将实施例1制备的组合物溶于一定量的dmem培养基中得到质量终浓度为0.1％的样品1-1。
[0111]
2、3d全层皮肤模型的构建
[0112]
通过将胶原与人真皮成纤维细胞组合构建成3d全层皮肤模型的真皮层，再于真皮层上接种人角质形成细胞形成表皮层，得到完整的具有真皮-表皮结构的皮肤模型。再加入样品1-1对其进行处理，其中对照组为不经过任何处理。
[0113]
3、3d全层皮肤模型石蜡组织切片
[0114]
将组织放入包埋盒中，分别放入4％多聚甲醛、70％乙醇-水溶液、80％乙醇-水溶液、90％乙醇-水溶液、95％乙醇-水溶液、无水乙醇ⅰ、无水乙醇ⅱ、甲基环己烷ⅰ、甲基环己烷ⅱ中进行梯度脱水，每缸溶液1h。脱水完毕，将组织放入石蜡中包埋，修片，切成厚度为5μm的石蜡切片。
[0115]
4、3d全层皮肤模型苏木精-伊红染色
[0116]
将石蜡切片分别放入甲基环己烷ⅰ、甲基环己烷ⅱ、无水乙醇、95％乙醇-水溶液、80％乙醇-水溶液、70％乙醇-水溶液、蒸馏水中浸泡10min进行脱蜡、复水后。放入苏木精染液中染色8min后，依次放入盐酸-乙醇溶液中分化2s、氨水溶液中复蓝1min。接着用伊红溶液染色1min，最后放入70％乙醇-水溶液、95％乙醇-水溶液、无水乙醇、甲基环己烷溶液中脱水，中性树胶封片。显微镜下拍照。结果见图5。
[0117]
5、3d全层皮肤模型冰冻组织切片
[0118]
将3d全层皮肤模型放置于oct组织包埋剂中，加入液氮迅速冷却。将包埋的组织块放入冷冻切片机中，切成厚度为5μm的切片。
[0119]
6、3d全层皮肤模型冰切组织切片免疫荧光染色
[0120]
用冰甲醇于-20℃下固定切片，用pbs洗三遍后，用封闭液于室温孵育1h。孵育完毕，加入对应的一抗(collagenⅰ、laminin-332)，4℃孵育过夜，第二天用pbs洗三遍，加入对应的二抗后避光室温孵育1.5小时，最后用dapi染核封片，随后在荧光显微镜下观察拍摄照片。结果见图6、图7。
[0121]
7、结果显示
[0122]
如图5所示，与对照组相比，在加入样品1-1后，3d全层皮肤模型基底层细胞连接紧密，表皮层分化良好、结构完整，棘层和颗粒层结构清晰。
[0123]
如图6所示，真皮层荧光表达即为胶原ⅰ的表达。与对照组相比，在加入样品1-1后，3d全层皮肤模型真皮层的胶原ⅰ含量上升。
[0124]
如图7所示，白色方框内箭头所指的连续荧光表达即为dej中laminin-332的表达。从图片可以看出，对照组中laminin-332的表达弱，且结构不连续，在加入样品1-1后，dej结构中laminin-332的表达较强、结构连续。
[0125]
以上结果说明样品1-1可促进真皮层胶原ⅰ的含量增加，同时使真皮-表皮连接层(dej)结构更加稳定，具有一定的抗衰老作用。