一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液及其制备方法与流程

1.本发明涉及化妆品生物技术领域，尤其涉及到一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液的制备方法。


背景技术：

2.透明质酸又叫玻尿酸(hyaluronan,hyaluronic acid,ha)是一种天然存在于生物体内的糖胺聚糖。天然透明质酸的双糖单元由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰-d
‑ꢀ
葡萄糖胺构成，分子量最低约800da，最高可达107da。不同分子量的透明质酸其作用也不同，寡聚透明质酸是分子量小于10kda的透明质酸分子，小于 50个单糖结构，只有寡聚透明质酸才可进入真皮层内部，发挥全方位的保湿效果，长期使用具有抗衰老和去除皱纹的作用。
3.人脐带间充质干细胞来源的外泌体(human umbilical cord mesenchymalstem cell-exosomes，hucmsc-exos)是由人脐带间充质干细胞分泌的细胞内多胞体和细胞膜融合后释放到细胞外基质的，直径在30-120nm，带有多蛋白标记物的膜囊泡。外泌体中含有多种生物活性蛋白质，dna和rna是细胞和细胞信传递的主要载体，在细胞间通信过程中发挥重要作用。同时，大量的生物活性分子的脂质双分子层囊泡物质具有类似信号分子的功能，能引起一系列的生物反应，渗透入皮肤深层可以促进组织损伤修复，抗炎症反应调节，免疫抑制以及神经保护作用等。
4.现有的透明质酸复合外泌体技术中，涉及到透明质酸分子量的添加组成方面鲜有介绍，更加侧重于透明质酸的化学改性以及作为包裹性材料去缓释外泌体，未有研究不同分子量透明质酸对外泌体的透皮促吸收作用，以及二者对皮肤抗衰性的协同作用。
5.存在的缺点及原因：
6.1、经过化学改性的透明质酸，虽然在应用中性质有所提升，但是带来的化学试剂残留也是无法避免的，会存在明显的安全问题或潜在的安全隐患。并且改性的透明质酸在结构上不同于天然透明质酸，可能会存在皮肤相容性问题。
7.2、粗糙的透明质酸添加，未考虑到不同分子量的配比，在透皮吸收作用上以及对皮肤的修复作用上无法发挥其最佳效果。
8.3、透明质酸复配外泌体的研究很多都停留在损伤修复的层面上，鲜有在皮肤除皱上的应用。


技术实现要素：

9.为解决上述存在的问题，本发明提供一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液及其制备方法，能显著提高小麦对除草剂的耐药性，扩大其应用范围和效力。具体技术方案如下：
10.一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液，包括包括组分一和组分二；
11.所述组分一为透明质酸溶液；
12.所述组分二为人脐带间充质干细胞外泌体；
13.所述组分一的重量份为99.75～99.85份；
14.所述组分二的重量份为0.15～0.25份。
15.作为进一步优选的技术方案的，所述透明质酸溶液为多种分子量的透明质酸溶解于pbs-nacl缓冲液制得，该透明质酸溶液按重量份包括：
16.分子量为5kda～10kda的透明质酸：0.1～1.0份；
17.分子量为10kda～200kda的透明质酸：0.05～0.5份；
18.分子量为200kda～500kda的透明质酸：0.01～0.2份；
19.分子量为500kda～2000kda的透明质酸：0.01～0.1份
20.pbs-nacl缓冲液98.2～99.83份。
21.作为进一步优选的技术方案的，所述透明质酸溶解于pbs-nacl缓冲液，各分子量透明质酸与pbs-nacl缓冲液的比例为5kda～10kda：10kda～200kda： 200kda～500kda：500kda～2000kda：pbs-nacl缓冲液为0.1～1.0份：0.05～0.5 份：0.01～0.2份：0.01～0.1份：99.83～98.2份。
22.前所述的一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液的制备方法，包括的步骤为：
23.步骤(a)、制备透明质酸溶液；
24.步骤(b)、处理人脐带间充质干细胞外泌体，得到处理后的人脐带间充质干细胞外泌体；
25.步骤(c)、复配抗衰原液。
26.作为进一步优选的技术方案的，步骤(a)、制备透明质酸溶液的具体步骤如下，
27.步骤(a1)、制备pbs-nacl缓冲液；
28.步骤(a11)、称取氯化钠、氯化钾、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾；
29.步骤(a12)、加水搅拌溶解；
30.步骤(a13)、加入1m盐酸调节ph至6.5～7.5，定容即可；
31.步骤(a2)、将多种分子量的透明质酸溶解于pbs-nacl缓冲液中，得到透明质酸溶液。
32.作为进一步优选的技术方案的，步骤(b)、处理人脐带间充质干细胞外泌体，将其多次离心的具体步骤如下，
33.步骤(b1)、取培养好的人脐带间充质干细胞培养液并将其进行离心，取上清液，得到第一次离心的细胞培养液；
34.步骤(b2)、将步骤(b1)中第一次离心后的细胞培养液进行离心，取上清液，得到第二次离心的细胞培养液；
35.步骤(b3)、将步骤(b2)中第二次离心后的细胞培养液进行离心，取上清液，得到第三次离心的细胞培养液；
36.步骤(b4)、将步骤(b3)中第三次离心后的细胞培养液进行离心，取沉淀；
37.步骤(b5)、将步骤(b4)中得到的沉淀用pbs-nacl缓冲液进行清洗并离心，此时取底部沉淀，该沉淀即为制得的外泌体。
38.作为进一步优选的技术方案的，所述处理后的人脐带间充质干细胞外泌体处理方法，包括以下步骤：
39.步骤(c)、复配抗衰原液的具体步骤如下，
40.步骤(c1)、将步骤(b)中得到的处理后的人脐带间充质干细胞外泌体用pbs-nacl缓冲液复溶再进行超声破碎，得到离心超声后的外泌体；
41.步骤(c2)、将步骤(c1)中离心超声制得的外泌体加入到透明质酸溶液中，得到透明质酸-外泌体混合溶液，对该溶液进行无菌化处理，得到透明质酸与外泌体复配的抗衰原液。
42.作为进一步优选的技术方案的，所述氯化钠：氯化钾：十二水合磷酸氢二钠：磷酸二氢钾：水的比例为0.8份：0.02份：0.363份：0.024份：98.793 份。
43.作为进一步优选的技术方案的，(步骤b1)中离心力为250～350
×
g，离心时间为5～15min；步骤(b2)中离心力为1500～2500
×
g，离心时间为5～15min；步骤(b3)中离心力为8000～12000
×
g，离心时间为25～35min；步骤(b4) 中的离心力为8000～12000
×
g，离心时间为60～80min；步骤(b5)中的离心力为80000～120000
×
g，离心时间为60～80min。
44.作为进一步优选的技术方案的，步骤(c1)中超声条件中的功率为 600～800w，超声时间为4.5～5.5s，超声间隔为1.5～2.5s，持续时长为15～25min。
45.作为进一步优选的技术方案的，步骤(c2)中无菌化处理是用0.2微米滤膜进行处理的，透明质酸-外泌体混合溶液中外泌体浓度为1.5～2.5mg/ml
46.本发明的有益效果是：
47.1.本发明的抗衰产品通过科学配比透明质酸与经破碎外泌体，小分子透明质酸可以渗透吸收，中分子及大分子易形成保护膜，锁住水分及有效成分从而增强吸收作用，二者可以互相显著增效透过皮肤屏障。经超声破碎外泌体中富含油脂，包括磷脂膜，胆固醇，鞘脂类等，这些脂质成分与小分子透明质酸相互融合，与透明质酸水溶液形成微乳化体系，增加了复合溶液的亲肤性及透过性。
48.2.透明质酸和人脐带间充质干细胞外泌体的复配产品可以有效持续地改善人体皮肤的紧致程度，起到更好的协同抗衰作用。由于人脐带间充质干细胞外泌体经破碎后包含多种脂质成分，细胞因子及信号肽，脂质成分和小分子透明质酸的透过和吸收填充了真皮及皮下组织，细胞因子起到了刺激细胞再生，信号肽则调节细胞分泌。
附图说明
49.图1为本发明实施例的抗衰效果对比示意图。
具体实施方式
50.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例1～3为配制透明质酸与外泌体复配的抗衰原液，实施例4为效果例。
51.实施例1
52.在容器中，加入氯化钠8克、氯化钾0.24克、十二水合磷酸氢二钠1.44 克、磷酸二氢钾0.24克，加800ml水溶解，以1m盐酸调节ph至7，定容至 1000ml，制得pbs-nacl缓冲液备用；
53.依次称取5克、3克、0.8克和0.6克分子量分别为5kda～10kda、 10kda～200kda、200kda～500kda和500kda～2000kda的透明质酸，将其加入至pbs-nacl缓冲液中，充分混匀
搅拌直至完全溶解程透明状，得到透明质酸溶液；
54.取2.3g培养好的人脐带间充质干细胞培养液并将其进行离心，离心力为 300
×
g，离心时间为10min，取上清液，得到第一次离心的细胞培养液；将第一次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为2000
×
g，离心时间为10min，取上清液，得到第二次离心的细胞培养液；将第二次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为10000
×
g，离心时间为30min，取上清液，得到第三次离心的细胞培养液；将第三次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为10000
ꢀ×
g，离心时间为70min，取沉淀并用pbs缓冲液进行清洗，再次离心，离心力为100000
×
g，离心时间为70min，此时取底部沉淀，该沉淀即为处理后的人脐带间充质干细胞外泌体；
55.将处理后的人脐带间充质干细胞外泌体用pbs-nacl缓冲液复溶再进行超声破碎，超声条件中的功率为600w，超声时间为4.5s，超声间隔为0.5s，持续时长为15min，得到离心超声后的外泌体；
56.将离心超声后的外泌体加入到透明质酸溶液中，得到透明质酸-外泌体混合溶液，用0.2微米滤膜对该溶液进行无菌化处理，使得外泌体浓度为 1.5mg/ml，得到透明质酸与外泌体复配的抗衰原液。
57.实施例2
58.在容器中，加入氯化钠8克、氯化钾0.24克、十二水合磷酸氢二钠1.44 克、磷酸二氢钾0.24克，加800ml水溶解，以1m盐酸调节ph至7，定容至 1000ml，制得pbs-nacl缓冲液备用；
59.依次称取4.5克、2.5克、0.8克和0.6克分子量分别为5kda～10kda、 10kda～200kda、200kda～500kda和500kda～2000kda的透明质酸，将其加入至pbs-nacl缓冲液中，充分混匀搅拌直至完全溶解程透明状，得到透明质酸溶液；
60.取2.0培养好的人脐带间充质干细胞培养液并将其进行离心，离心力为 260
×
g，离心时间为6min，取上清液，得到第一次离心的细胞培养液；将第一次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为1600
×
g，离心时间为6min，取上清液，得到第二次离心的细胞培养液；将第二次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为9000
×
g，离心时间为26min，取上清液，得到第三次离心的细胞培养液；将第三次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为9000
×
g，离心时间为66min，取沉淀并用pbs缓冲液进行清洗，再次离心，离心力为90000
×
g，离心时间为66min，此时取底部沉淀，该沉淀即为处理后的人脐带间充质干细胞外泌体；
61.将处理后的人脐带间充质干细胞外泌体用pbs-nacl缓冲液复溶再进行超声破碎，超声条件中的功率为700w，超声时间为5s，超声间隔为2s，持续时长为20min，得到离心超声后的外泌体；
62.将离心超声后的外泌体加入到透明质酸溶液中，得到透明质酸-外泌体混合溶液，用0.2微米滤膜对该溶液进行无菌化处理，使得外泌体浓度为 2mg/ml，得到透明质酸与外泌体复配的抗衰原液。
63.实施例3
64.在容器中，加入氯化钠8克、氯化钾0.24克、十二水合磷酸氢二钠1.44 克、磷酸二氢钾0.24克，加800ml水溶解，以1m盐酸调节ph至7，定容至 1000ml，制得pbs-nacl缓冲液备用；
65.依次称取4克、3.2克、0.7克和0.5克分子量分别为5kda～10kda、 10kda～200kda、200kda～500kda和500kda～2000kda的透明质酸，将其加入至pbs-nacl缓冲液中，充分混匀搅拌直至完全溶解程透明状，得到透明质酸溶液；
66.取1.8g培养好的人脐带间充质干细胞培养液并将其进行离心，离心力为 340
×
g，离心时间为14min，取上清液，得到第一次离心的细胞培养液；将第一次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为2400
×
g，离心时间为14min，取上清液，得到第二次离心的细胞培养液；将第二次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为11000
×
g，离心时间为34min，取上清液，得到第三次离心的细胞培养液；将第三次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为11000
ꢀ×
g，离心时间为77min，取沉淀并用pbs缓冲液进行清洗，再次离心，离心力为110000
×
g，离心时间为76min，此时取底部沉淀，该沉淀即为处理后的人脐带间充质干细胞外泌体；
67.将处理后的人脐带间充质干细胞外泌体用pbs-nacl缓冲液复溶再进行超声破碎，超声条件中的功率为800w，超声时间为5.5s，超声间隔为2.5s，持续时长为25min，得到离心超声后的外泌体；
68.将离心超声后的外泌体加入到透明质酸溶液中，得到透明质酸-外泌体混合溶液，用0.2微米滤膜对该溶液进行无菌化处理，使得外泌体浓度为 2.5mg/ml，得到透明质酸与外泌体复配的抗衰原液。
69.实施例4效果例
70.本实施例是对实施例1～3配制的透明质酸与外泌体复配的抗衰原液通过 franz扩散池法，测定透明质酸及外泌体特征蛋白在乳猪腹部皮肤的透过率，来评价复配产品的透皮吸收效果，猪皮经去毛洗净，剪成2.5cm正方形于ph7.4 磷酸盐缓冲液中平衡30smin，角质层朝上放入franz扩散池，将扩散池转移至透皮扩散仪中，32℃，250r/min搅拌30min，测定接收液中和猪皮中的透明质酸及外泌体特征蛋白含量，计算透过率。
71.透明质酸水解后生产葡萄糖醛酸与咔唑试剂发生显色反应，故测定葡萄糖醛酸(ga)含量来计算透明质酸含量；经破碎外泌体则检测其中胆固醇含量来反映外泌体中脂质的透过效果。
72.franz扩散池法，模拟复配溶液在猪皮中的透皮吸收效果，结果如下如表 1所示：
73.表1复配样品中透明质酸在franz扩散池中的透过率
[0074][0075]
[0076]
表2复配样品中外泌体在franz扩散池中的透过率
[0077][0078]
由表1和表2数据看出，透明质酸对照吸收率为33.7％，外泌体溶液对照吸收率为30.7％，而复配溶液中透明质酸平均吸收率为39.4％，复配溶液中外泌体的平均吸收率为56.9％。复配溶液中组分吸收率要明显高出单独组分对照，且复配溶液中外泌体的吸收率得到大幅提高，说明透明质酸可促进人脐带间充质干细胞外泌体超声破碎液的吸收效果。
[0079]
经临床测试，每天局部涂抹0.2ml，总共涂抹56天，第0/14/28/56天拍摄抗衰效果图片，结果如图1所示，由图1可以看出，复配溶液具有显著的抗衰效果。
[0080]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含一个的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。