一种多糖和病毒抗原共递送纳米疫苗、其制备方法及应用

1.本发明涉及治疗性或预防性纳米疫苗制剂技术领域，特别涉及一种多糖和病毒抗原共 递送纳米疫苗、其制备方法及应用。


背景技术：

2.疫苗是指接种机体后，能使机体对特定疾病产生免疫力的生物制品的统称。疫苗接种 是预防传染病的最重要、最有效的手段，现在已有20余种疫苗用于人类疾病预防，其中 半数以上是病毒疫苗。由于疫苗的广泛使用，使曾经严重危害人类生命与健康的急性传染 病如天花、脊髓灰质炎、麻疹、白喉等疾病的流行得到了有效控制。疫苗大多是由杀死的 或减毒的病原体制备而成，目前也开发了几种其他类型的疫苗，即基于病原体起免疫作用 成分制成的第二代疫苗，以及基于rna或dna的第三代疫苗，这些疫苗在免疫原性方面均 显示出令人鼓舞的结果。虽然疫苗接种显示出针对不同疾病的保护性免疫，但仍然存在一 些问题，从而限制了它们在临床应用中的有效性。例如减毒活疫苗存在毒力回复的可能性； 灭活苗免疫效果较差，维持时间短，需多次接种；亚单位疫苗仅有几种主要抗原，免疫原 性弱，预防接种效果稍差；用量较大dna和rna疫苗感染风险小，但易被降解，因此较难 靶向运输到目标部位。
3.在过去的十多年里，纳米技术在疫苗学中得到了广泛应用，由此研制的纳米疫苗在乙 肝、流感、艾滋病毒及肿瘤等传染病和重大疾病的预防和治疗中展现出了广阔的应用前景。 相比于纯抗原疫苗，纳米疫苗的优势主要包括：(1)纳米载体可避免抗原被快速降解，提 高了疫苗制剂的稳定性；(2)提供良好的佐剂性能，促进抗原提呈细胞的激活；(3)纳米 尺寸增强了抗原在淋巴结的富集，进一步提升其免疫应答能力。近年来，许多新型无机和 有机纳米颗粒(nps)(如金纳米颗粒、硅基纳米颗粒、脂蛋白纳米盘和纳米凝胶等)在纳 米疫苗的开发中取得了令人瞩目的成果。然而这些纳米疫苗制备技术都需使用化学合成方 法，或者需要进一步将合成方法与基于细胞的半生物合成步骤相结合，制备工艺较为繁琐， 抗原的活性无法有效保证。利用工程化的细菌或哺乳动物细胞只需一步即可实现蛋白质的 合成，由此开发的如病毒样颗粒、铁蛋白等生物合成的蛋白纳米疫苗不仅具有生产时间短、 成本低等优点，还具有更高的生物相容性和安全性。然而，该策略仍然面临抗原装载率低， 难以偶联具有复杂结构的多糖抗原等技术难点。


技术实现要素：

4.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在 本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说 明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
5.鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明一种多糖和病毒抗原共递送纳米疫苗、其制备方 法及应用，目的是提供了一种以多糖为佐剂和以病毒重组蛋白为抗原以维生素e聚乙
二醇 琥珀酸酯为载体的共递送纳米疫苗制备方法。该疫苗用于防治病毒性疾病具有显著的效果。 在畜牧养殖中，可以用于烈性传染性疾病如禽腺病毒等的防治，为畜牧养殖业带来巨大的 经济效益。
6.因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种多糖 和病毒抗原共递送纳米疫苗、其制备方法及应用。
7.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种多糖和病毒抗原共递送纳米 疫苗，其包括包括多糖、病毒抗原和维生素e聚乙二醇琥珀酸酯，所述多糖、病毒抗原和 维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的质量比为(0.5-2):1:(0.5-2)。
8.优选的，所述多糖包括益生菌胞外多糖、植物多糖中的一种或几种。
9.优选的，所述病毒抗原为腺病毒抗原
10.优选的，所述病毒抗原为腺病毒-4型penton重组蛋白
11.优选的，所述纳米疫苗的粒径大小范围为1～110nm
12.优选的，所述纳米疫苗的粒径大小范围为40～60nm。
13.作为本发明其中一个方面，本发明提供一种多糖和病毒抗原共递送纳米疫苗的制备方 法，其包括以下步骤，混合多糖、病毒抗原和维生素e聚乙二醇琥珀酸酯得到混合液，所 述混合液在400～1000rpm/min，25℃～37℃条件下进行自组装反应0.5h～2h。
14.优选的，所述进行自组装反应，其为匀速滴加所述混合液进行自组装反应，滴加速度 为2ml/min-4ml/min。
15.作为本发明其中一个方面，本发明提供一种多糖和病毒抗原共递送纳米疫苗在防治腺 病毒传染性疾病方面的应用。
16.优选的，所述腺病毒传染性疾病为禽腺病毒-4型js株感染引起的疾病。
17.本发明的有益效果：
18.本发明一方面提供了一种多糖和病毒抗原共递送纳米疫苗，由多糖、病毒抗原和维生 素e聚乙二醇琥珀酸酯组成。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
19.1.本发明中的共递送纳米疫苗显著降低了禽腺病毒发病率和死亡率。各组试验鸡在免 疫后三周进行攻毒，攻毒后2天内对照组的鸡只全部死亡，各免疫组鸡只均正常采食和饮 水，精神状态也正常。将死亡鸡只进行剖检，对照组鸡剖检后可见明显的心包积液，颜色 呈浅黄色、较浓稠；肝脏肿大变性，触之易碎，外观呈土黄色，而免疫组鸡的肝脏和心脏 均正常。
20.2.本发明中的共递送纳米疫苗不仅能够降低禽腺病毒发病率和死亡率，还能够刺激机 体迅速产生更强的免疫应答，并维持机体较高水平的免疫应答。
21.3.本发明中的共递送纳米疫苗不仅能够降低禽腺病毒发病率和死亡率，刺激机体迅速 产生免疫应答，还能降低鸡只排毒，缓解器官损伤。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附 图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领 域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的 附图。其中：
23.图1为制备共递送纳米疫苗中自制的纳米混合仪；
24.图2为实施例1中益生菌胞外多糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋白共递送纳米疫苗的 透射电镜观察；
25.图3为实施例1中益生菌胞外多糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋白共递送纳米疫苗的 粒径分布检测；
26.图4为实施例2中白术多糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋白共递送纳米疫苗的透射电 镜观察；
27.图5为实施例2中白术多糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋白共递送纳米疫苗的粒径分 布检测；
28.图6为对照例1中所制备的18种纳米材料的粒径结果；
29.图7为对照例1中所制备的18种纳米材料的包封率结果；
30.图8为对照例3中所制备的没有自组装的益生菌胞外多糖和禽腺病毒-4型penton重组 蛋白共递送纳米疫苗的电镜观察；
31.图9为实施例3中各试验组鸡只血清中抗体水平的elisa检测；
32.图10为实施例3中各试验组鸡只在免疫后第二天的血清中细胞因子表达检测；
33.图11为实施例3中各试验组鸡只排毒情况检测；
34.图12为实施例3中共递送纳米疫苗对禽腺病毒-4型感染鸡只脏器损伤的影响，攻毒组 的鸡死亡后即解剖，免疫组的鸡在实验周期(35天)内都没死亡，所以第35天解剖，其中 图12a为剖检的鸡只的心包积液等损伤情况，图12b为鸡只心脏、肝脏和脾脏中心包积液 综合征的特征性组织学迹象。
具体实施方式
35.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发 明的具体实施方式做详细的说明。
36.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用 其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况 下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
37.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方 式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均 指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
38.实施例1：一种益生菌胞外多糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋白共递送纳米疫苗
39.一种益生菌胞外多糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋白共递送纳米疫苗，使用益生菌胞 外多糖、禽腺病毒-4型penton重组蛋白、维生素e聚乙二醇琥珀酸酯制备而成。其中，
40.益生菌胞外多糖：将益生菌菌株(菌株编号：accc 03956)按照有机溶剂沉淀法(参 考：产胞外多糖植物乳杆菌的分离筛选、分子表征及其应用研究[d].王辑.吉林大学,2015) 提取其胞外多糖，经检测，胞外多糖分子量约100k da，其由盐酸氨基半乳糖、阿拉伯糖、 半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸组成，各组分比例为0.152:0.364:0.479:0.258:0.137；
[0041]
禽腺病毒-4型penton重组蛋白：禽腺病毒-4型penton重组蛋白表达纯化：构建pet32a (+)-penton重组质粒
→
pet32a(+)-penton重组质粒诱导表达
→
禽腺病毒-4型
多糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋白共递送纳米疫苗，图4为100nm比例尺下反应产物的 tem图，从图中可知，分散均匀的颗粒是自组装的白术多糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋 白共递送纳米疫苗，由图5可知该疫苗的粒径大小范围为1～110nm，主要分布在100nm(65％)。 白术多糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋白共递送纳米疫苗的包封率为达90％。总之，经本 方法制得的白术糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋白共递送纳米疫苗仍保持了较小的粒径以 及较高的包封率，但是其粒径要大于益生菌胞外多糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋白共递 送纳米疫苗。
[0052]
对照例1：制备步骤优选的实验过程。
[0053]
根据多糖、病毒抗原和维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的配比(2:1:2，1:1:1，0.5:1:0.5)， 组装时间(0.5h,1h，2h),组装温度(25℃～37℃)优化制备方法，得到18种纳米材料 如表1。分别检测18种纳米材料的粒径(图6)和包封率(图7)，结果显示13号纳米材料 具有较低的粒径(50nm)和较高的包封率(95％)，而此时的制备方法下多糖、病毒抗原和 维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的配比为2:1:2，组装时间0.5h，组装温度25℃。
[0054]
表1.益生菌胞外多糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋白共递送纳米疫苗制备优化。
[0055][0056]
*注：载体为维生素e聚乙二醇琥珀酸酯。
[0057]
对照例2：使用实施例1益生菌胞外多糖、禽腺病毒-4型penton重组蛋白、维生素e 聚乙二醇琥珀酸酯直接混合获得的疫苗(eps+penton+tpgs)。
[0058]
将0.6mg/ml的益生菌胞外多糖、0.3mg/ml的禽腺病毒-4型penton重组蛋白、0.6 mg/ml的维生素e聚乙二醇琥珀酸酯各7ml混匀。
[0059]
对照例3：没有自组装的益生菌胞外多糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋白共递送
纳米 疫苗
[0060]
将0.6mg/ml的益生菌胞外多糖、0.3mg/ml的禽腺病毒-4型penton重组蛋白、0.6 mg/ml的维生素e聚乙二醇琥珀酸酯各7ml混匀，400rpm/min，25℃条件下搅拌30min。 电镜结果如图8所示，没有观察到有序的纳米形态。
[0061]
实施例3：益生菌胞外多糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋白共递送纳米疫苗应用
[0062]
本发明还提供了一种防治禽腺病毒的益生菌胞外多糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋白 共递送纳米疫苗的应用，采用无禽腺病毒免疫史和感染史1日龄健康spf鸡60只，由江 苏南京某鸡场实验室提供，在南京农业大学实验动物中心养殖7天后进行分组，每组10只。 将疫苗注射至7日龄的spf雏鸡中，注射剂量为0.2ml(0.1mg/ml)。免疫3周后，肌肉注 射禽腺病毒-4型js株，攻毒剂量为2
×
10
6.5
tcid
50
。疫苗应用实验分组及流程如下：
[0063]
1组为注射pbs对照组(pbs)；
[0064]
2组为重组蛋白penton单独免疫组(penton)：选取10只spf鸡，颈部皮下接种重组 penton亚单位疫苗，疫苗注射剂量为0.2ml/只，疫苗中重组penton蛋白用量为20μg/ 只；
[0065]
3组为重组蛋白penton联合益生菌胞外多糖佐剂联合免疫组(penton+eps)：选取10 只spf鸡，颈部皮下接种penton蛋白与益生菌胞外多糖组合的亚单位疫苗，疫苗注射剂量 为0.2ml/只，疫苗中重组penton蛋白用量为10μg/只，益生菌胞外多糖用量为20μg/ 只；
[0066]
4组为益生菌胞外多糖和禽腺病毒-4型penton重组蛋白共递送纳米疫苗组 (eps-penton-np，实施例1)：选取10只spf鸡，颈部皮下接种益生菌胞外多糖和禽腺 病毒-4型penton重组蛋白共递送纳米疫苗，疫苗注射剂量为0.2ml/只，疫苗中重组penton 蛋白用量为10μg/只，益生菌胞外多糖用量为20μg/只。
[0067]
5组为益生菌胞外多糖、禽腺病毒-4型penton重组蛋白、维生素e聚乙二醇琥珀酸酯 混合疫苗组(eps+pento+tpgs，对照例2)：选取10只spf鸡，颈部皮下接种益生菌胞外 多糖、禽腺病毒-4型penton重组蛋白、维生素e聚乙二醇琥珀酸混合液，疫苗注射剂量为0.2ml/只，疫苗中重组penton蛋白用量为10μg/只，益生菌胞外多糖用量为20μg/ 只。
[0068]
免疫28日龄(即接种后第21天)spf鸡经肌内注射fadv-4js毒株攻毒，病毒含 量≥106tcid
50
/ml，每只注射0.2ml，攻毒后观察记录死亡及病变情况。将各试验组鸡分 别于免疫后2、7、14、28和35天采血分离血清，通过酶联免疫吸附试验(elisa)对抗体 水平进行监测。并取免疫后第2天的血清提取rna，反转录后应用荧光定量pcr方法检测细 胞因子表达变化。于攻毒后3和7天采集各试验组鸡的泄殖腔拭子，处理后使用超纯dna 提取试剂盒提取dna，应用实时荧光定量pcr的方法，对攻毒后各试验组鸡的排毒情况进行 监测。
[0069]
试验结果：
[0070]
1、共递送纳米疫苗免疫攻毒保护结果
[0071]
免疫攻毒保护结果见表2。与对照组相比，接种重组penton抗原后，免疫保护率有所 提高，20μg/只penton对spf鸡的保护率为40％，表明重组penton亚单位疫苗具有一定 的免疫保护效果。添加益生菌胞外多糖佐剂后，疫苗的免疫保护效果提高至70％，而共递送 纳米疫苗组可以在低剂量penton(10μg/只)免疫中，疫苗保护率为100％，说明纳米化 佐剂和蛋白显著提高了亚单位疫苗的免疫保护效果。相比之下，直接将益生菌胞外多糖、 禽腺病毒-4型penton重组蛋白、维生素e聚乙二醇琥珀酸混合的保护效果仅为80％。
[0072]
表2.各试验组对禽腺病毒-4型js毒株的免疫保护试验结果。
[0073][0074]
2、共递送纳米疫苗对鸡只抗体水平的影响
[0075]
血清中抗体elisa检测结果显示(图9)，三个疫苗免疫组随着免疫时间的延长，鸡体 内抗体水平持续升高，在免疫后第28天(攻毒后第7d)达到顶峰，随后逐渐下降。其中， 共递送纳米疫苗组较快的产生抗体且水平很高，免疫后28天共递送纳米疫苗免疫组的鸡只 抗体水平最高，其次是联合免疫组，单独免疫组。尤其地，共递送纳米疫苗组在免疫后第 二天的血清中细胞因子(il-2，ifn-β，tnf-α，g-csf)表达显著增加(p《0.001)，表明 机体产生强烈的细胞免疫，以提高机体的抗病毒能力(图10)。
[0076]
3、共递送纳米疫苗对鸡只排毒情况的监测
[0077]
图11可以看出病毒经消化道排毒情况。从各试验组鸡只的排毒量上来看，共递送纳米 疫苗免疫组鸡只由于强烈的抗病毒免疫，其病毒排毒量最低，其次是混合液免疫组，联合 免疫组，而penton单独免疫组鸡只排毒量较高。
[0078]
4、共递送纳米疫苗对禽腺病毒-4型感染鸡只脏器损伤的影响
[0079]
剖检可见免疫组的鸡只无明显的心包积液等损伤(图12a)，因此我们使用组织病理学 检测来进一步分析鸡只组织是否在微观水平上受损。攻毒对照组的鸡只心脏、肝脏和脾脏 中观察到心包积液综合征的特征性组织学迹象(图12b)。如部分心肌纤维断裂，心肌间质 充血；肝小叶结构消失，肝细胞出现核内包涵体，坏死充血，核碎裂；脾脏淋巴细胞严重 减少和坏死，尤其是白髓。用20μg penton蛋白免疫或益生菌胞外多糖、penton重组蛋 白、维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的混合液免疫组的鸡表现出轻微的病理变化。如肝小叶结 构不清，肝细胞出血坏死；心肌纤维间隙增宽；脾脏淋巴细胞有少量坏死。相比之下，共 递送纳米疫苗组和阴性对照鸡的组织切片均未观察到明显的组织学病变(图12b)。
[0080]
上述实施例表明本专利制备的共递送纳米疫苗可以降低应用病毒抗原的用量，并具有 的很高保护效果。该共递送纳米疫苗的应用可以大大降低疫苗的使用成本，简化免疫程序， 对烈性传染性疾病提供高效保护，进而为养殖场提高经济效益。
[0081]
本发明涉及治疗性或预防性纳米疫苗制剂技术领域，特别涉及一种以多糖为佐剂和以 病毒重组蛋白为抗原的共递送纳米疫苗制备与应用。本发明提供的多糖和病毒抗原共递送 纳米疫苗通过多糖、病毒抗原和维生素e聚已二醇琥珀酸酯在自制的纳米混合仪中通过自 组装的方法制备而成；该制剂大大提高了机体的体液免疫和细胞免疫，并使机体维持较高 的免疫能力，显著降低断了病毒的发病率和死亡率，大大提高机体的存活率。此外该制剂 使用能够减少病毒抗原的使用量，简化免疫程序，降低养殖成本，极具推广意义。
[0082]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施 例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案 进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发
明的 权利要求范围当中。