基于等温压缩系数扰动对酶进行再设计的方法、应用及通过此方法筛选出的突变体

1.本发明涉及计算化学，生物信息学，基因工程以及蛋白质工程技术领域，尤其涉及一种基于等温压缩系数扰动对酶进行再设计的方法、应用及通过此方法筛选出的突变体。


背景技术：

2.天然存在的酶在实际工业应用中经常受到高温、有机溶剂等条件的胁迫，导致酶的稳定性降低，因此提高酶的稳定性一直是生产和科研关注的热点。目前已经有大量的关于酶热稳定性和活性改造的研究报道。如truongvan,n.等通过研究与来自曼德假单胞菌冷适应酯酶estk中的催化h307残基位于同一环中的保守d308-y309残基的作用，发现与野生型estk相比，d308a或y309a突变体通过扩大活性位点显示出增强的底物亲和力和催化速率，然而，所有突变型estk酶都表现出降低的热稳定性，并进一步指出estk活性位点的构象受到酶催化和热稳定性的灵活性-稳定性权衡的限制；weltz,j.s等指出，随着脂肪酶的热稳定性增加，如酶活性的最佳温度所示，脂肪酶的比活性降低，这种活性的降低归因于底物催化转化所需的折叠状态的基本运动的减少，而通过调整酶附着的程度可以平衡酶的活性保持和稳定性。可见，由于稳定性和活性之间的trade-off，传统的研究经常会出现稳定性提高而催化活性降低的结果，使得酶的应用价值大打折扣，同时，现有的提高酶稳定性和活性的方法往往针对的是一种酶，缺乏普适性，难以广泛应用。因此，在保证酶活性的同时提高稳定性的方法还有待进一步开发。
3.刚性化柔性位点是提高稳定性的有效方法，但对活性中心这种高灵活区域修饰，由于trade-off(酶的稳定性和活性之间呈负相关关系)会失去活性，因此，对于活性中心外的高波动区域，为稳定突变提供良好的靶点，合理的改造高波动区域，有望同时提高稳定性和催化活性。蛋白质弹性效应导致的可塑性区域通常被认为是位于蛋白质表面远离活性中心的高波动区域。因此，刚性化高波动区域可能会缓解酶的稳定性和活性的trade-off。但是，筛选有效的高波动区域也是一个研究挑战。以往的高波动区域筛选方法主要是通过rmsf分析氨基酸水平的波动来确定高度灵活位点所在区域，缺乏全局性。
4.从蛋白质整体出发，我们认为通过构成蛋白质骨架的二级结构的波动可以定位高波动区域，用等温压缩系数(β
t
)表征的压缩性作为衡量蛋白质高波动区域的指标。等温压缩系数是蛋白质最重要的热力学性质之一，它表征了蛋白质的平衡体积波动，从而决定了蛋白质的灵活性和动态特性。等温压缩系数是影响蛋白质稳定性的重要参数之一。随着压力的增加，等温压缩系数对吉布斯自由能变化的影响呈指数增加。此外，等温压缩系数是体积对压力的导数，反映了体积随压力的变化率，通过压力激活机制影响酶的催化活性。综上，等温压缩系数与蛋白质变性、稳定性和活性的变化相关。以往对等温压缩系数的研究主要集中在等温压缩系数的计算、蛋白质的结构波动、疏水作用等方面(moghaddam,m.s.；chan,h.s.pressure and temperature dependence of hydrophobic hydration:volumetric,compressibility,and thermodynamic signatures[j].j.chem.phys.2007,
126(11),114507.gekko,k.；tamura,y.；ohmae,e.；hayashi,h.；kagamiyama,h.；ueno,h.a large compressibility change of protein induced by a single amino acid substitution[j].protein sci.2010,5(3),542-545.persson,f.；halle,b.compressibility of the protein-water interface[j].j.chem.phys.2018,148(21),215102.)，然而，利用等温压缩系数对酶进行再设计的研究几乎没有。


技术实现要素：

[0005]
为解决上述技术问题，本发明提供了一种能够同时提高酶的稳定性和活性的方法，且该方法适用于多种酶系，具有普适性，同时克服了现有技术中确定高波动区域缺乏全局性的问题。
[0006]
本发明的一种基于等温压缩系数扰动对酶进行再设计的方法，包括以下步骤：通过等温压缩系数扰动筛选出位于蛋白质表面远离活性中心的高波动区域，对筛选出的高波动区域上的氨基酸进行虚拟饱和突变，筛选出突变后吉布斯自由能变小的突变体，得到再设计后的酶；其中，等温压缩系数的扰动模式为加压。
[0007]
进一步地，上述方法中还包括对得到的再设计后的酶进行组合突变的步骤。
[0008]
本发明利用等温压缩系数扰动对酶进行再设计，这是本发明的一大创新点，可用于同时提高酶的稳定性和活性。
[0009]
进一步地，通过等温压缩系数扰动筛选出位于蛋白质表面远离活性中心的高波动区域的方法是，对蛋白质体系施以梯度压力，通过分子动力学模拟或蒙特卡罗模拟计算不同压力下的等温压缩系数，选择等温压缩系数变化大的区域作为高波动区域。其中，等温压缩系数由公式＜δv2＞＝kbtvβ
t
计算得到，其中，＜δv2＞为待设计的酶的二级结构的体积，kb代表玻尔兹曼常数，t为绝对温度，v为系统的体积，β
t
为等温压缩系数。酶的二级结构的体积通过voronoi tessellation空间划分计算得到。等温压缩系数变化越大说明相应区域的波动越大，可塑性越强，构象越不稳定，因此，选择等温压缩系数变化大的区域作为高波动区域。
[0010]
进一步地，上述方法中，对蛋白质体系施以0-20000bar区间内的梯度压力。
[0011]
进一步地，计算等温压缩系数时，本发明采用基于伞型分析的梯度高压模拟方式进行计算，具体包括以下步骤：采用不同初始原子速度的多重短时间的并行梯度高压的分子动力学模拟或蒙特卡罗模拟。原子指待再设计的酶中的原子，不同初始速度以随机方式产生，多重短时间是指在同一初始原子速度时，以1-100ns内的某一时间(优选为30-60ns)进行多次模拟，并行指以不同的初始原子速度模拟多次。本发明中，还针对传统的单次长时间分子动力学模拟或蒙特卡罗模拟进行了改进，这是本发明的又一创新点。
[0012]
分子动力学模拟是研究酶结构和功能物理基础的有效工具。通过分子动力学模拟计算的等温压缩系数与实验数据的相关性高达94％(dadarlat,v.m.；post,c.b.insights into protein compressibility from molecular dynamics simulations[j].j.phys.chem.b.2001,105,715-724.)。但是，由于酶的催化反应时间在微秒甚至毫秒级，为了完整的模拟酶的催化反应，往往需要进行长时间(微妙级甚至毫秒级)的分子动力学模拟，而单次长时间分子动力学模拟由于陷入局部能量极小而导致采样受限，影响结果的准确性，导致时间和计算资源的浪费。因此，基于伞型分析，采用随机初始原子速度的多重短
时间的并行梯度高压的分子动力学模拟，比单一长时间模拟更有利于相空间采样，节省计算资源。压力是一个基本的热力学变量，与酶的功能密切相关。在适当的温度下，高压可以提高20多种酶的稳定性和催化活性。因此，基于伞型分析的高压分子动力学模拟是研究提高酶稳定性和活性的有效工具。高压会引起蛋白质构象的变化，而蛋白质的不同区域对压力有不同的响应，具有不同的局部等温压缩系数。因此，利用等温压缩系数扰动作为筛选高波动区域的标准。另一方面，加压是一种温和的扰动模式，降低了蛋白质的振动幅度，保持了蛋白质结构的稳定性，避免了高温分子动力学模拟引起的蛋白质失活。因此，我们还提供了一种基于伞型分析的梯度高压模拟结合等温压缩系数扰动策略提高酶稳定性和活性的方法。
[0013]
进一步地，计算组成蛋白质的不同二级结构的等温压缩系数，选择波动较大的二级结构作为高波动区域，优选地，首先在包括α螺旋，β折叠，β转角和无规卷曲的二级结构中选择波动较大的其中一种二级结构，然后在该种二级结构中选择波动最大的结构作为高波动区域。
[0014]
进一步地，本发明基于等温压缩系数扰动对酶进行再设计的方法具体包括以下步骤：
[0015]
(1)以酶的晶体结构为初始模型，若无晶体结构，使用建模工具进行建模，不同压力梯度下分别进行分子动力学模拟或蒙特卡罗模拟，通过计算组成蛋白质的不同二级结构的等温压缩系数，筛选出等温压缩系数变化大的区域作为高波动区域；
[0016]
(2)对步骤(1)筛选得到的高波动区域上的氨基酸进行虚拟筛选，将高波动区域上的氨基酸进行虚拟饱和突变，分别使用基于算法互补的自由能计算软件预测上述虚拟突变体的稳定性，选择上述软件预测结果中的阳性突变体的交集，对突变体进行组合突变；其中，阳性突变体为突变后的自由能小于突变前的自由能的突变体；
[0017]
(3)将步骤(2)得到的单突变体或组合突变体通过重组菌进行表达，并分析表征酶学性质。
[0018]
进一步地，在步骤(1)中，当蛋白质没有晶体结构，从ncbi数据库下载该蛋白质的一级序列，利用基本局部对齐搜索工具blastp进行同源序列标识，然后选择模板，利用同源建模软件进行同源建模并对模型进行调整和优化；或者使用基于深度学习神经网络的软件直接预测蛋白质的三维结构。
[0019]
进一步地，在步骤(1)中，建模工具包括swiss-model，modeller，discovery studio，rosettafold，alphafold，alphafold2等。
[0020]
进一步地，在步骤(1)中，进行分子动力学模拟的工具包括gromacs、charmm、amber和namd等；进行蒙特卡罗模拟的工具包括oracle crystal ball等。
[0021]
进一步地，在步骤(1)中，以采用gromacs进行分子动力学模拟为例：应用amber99力场，将蛋白质放入一个装满水的立方体盒子中，且蛋白质距离盒子边缘最短为1.0nm，水模型采用tip4p，然后加入钠离子或氯离子平衡电荷。采用50000步的最速下降法最小化体系以保证结构正常、原子间距离合适、几何构型合理，然后在周期边界条件下，进行400ps的nvt平衡，采用berendsen温度耦合到313k，使用parrinell-rahman压力耦合逐渐从大气压升到预期高压。待体系平衡移除限制进行成品模拟，整个模拟过程中，采用leap-frog算法进行积分，利用pme方法计算远距离静电势能。限定约束算法选择lincs，精度设置1，4。邻近
搜索的截断方式为verlet，搜索方式为格子搜索grid。最终为了保证结果的可重复性与公正性，所有的模拟都以不同的初始速度进行了多次，每次的持续时间为30ns。
[0022]
进一步地，在步骤(1)中，蛋白质的二级结构由dssp计算所得，酶的结构分析和可视化采用pymol和vmd软件。
[0023]
进一步地，在步骤(2)中，虚拟饱和突变为利用软件将目标位点的某一氨基酸突变为另外19种氨基酸，如spdbviewer、vmd。
[0024]
进一步地，在步骤(2)中，对步骤(1)筛选得到的高波动区域上的氨基酸进行虚拟饱和突变，建立一个突变体文库，使用基于能量函数算法(物理有效能量函数、统计有效能量函数和经验有效能量函数)互补的吉布斯自由能计算软件(foldx(基于经验有效能量函数计算)、i-mutant 2.0(基于统计有效能量函数计算)和strum(基于物理有效能量函数计算))对虚拟突变体进行稳定性预测，筛选自由能差(δg
mutant
–
δg
wild-type
)小于0的突变体作为阳性突变体。选择上述软件预测结果的阳性突变体的交集。鉴于理性设计的单一突变对蛋白质的稳定性和活性提高幅度有限，因此组合阳性突变进一步提高酶的稳定性和活性。
[0025]
进一步地，使用foldx进行稳定性预测时，首先使用repairpdb工具优化酶的晶体结构，然后使用positionscan工具计算野生型和突变体之间的自由能变化。运行次数设置为3次，其他参数设为默认参数。
[0026]
进一步地，使用i-mutant 2.0进行稳定性预测时，选择“蛋白序列”，由蛋白序列预测蛋白质的稳定性变化，并遵循指令和要求。
[0027]
进一步地，使用strum进行稳定性预测时，选择i模式预测单点突变，上传蛋白序列，输入突变列表。
[0028]
进一步地，在步骤(3)中，将步骤(2)筛选出的阳性突变体交集中的突变体，利用定点突变技术，引入突变，利用基因工程菌表达突变体，测定经过分离纯化的酶的酶活、催化效率和温度稳定性，利用圆二色谱测定tm值，最终得到稳定性和活性最优的突变体。具体包括以下步骤：
[0029]
(3-1)以带有目标酶基因的重组质粒为模板，设计含有突变位点的引物，进行全质粒扩增，采用dpnⅰ限制性内切酶进行酶切消化，将消化产物转入e.coil jm109感受态细胞，挑选阳性转化子并测序验证，将突变正确的质粒转入大肠杆菌或枯草芽孢杆菌或酵母菌中进行诱导表达，得到单点突变或组合突变的蛋白质；
[0030]
(3-2)酶的分离纯化采用ni
2+
亲和层析或者离子交换层析和akta纯化仪，得到纯化酶；
[0031]
(3-3)将纯化酶用超滤管除盐，得到的酶液稀释至浓度为0.01-0.2mg
·
ml-1
，利用圆二色谱仪测定样品的半解折叠温度(tm)，将温度范围设置为20-90℃。
[0032]
上述基于等温压缩系数扰动对酶进行再设计的方法，可结合或不结合基于伞型分析的梯度高压模拟，都可用于同时提高酶的稳定性和活性。
[0033]
通过上述方法，本发明筛选出一种t1脂肪酶突变体，该t1脂肪酶突变体由氨基酸序列如seq id no.1所示的t1脂肪酶突变得到；其中，突变位点为：
[0034]
第186位的丙氨酸a突变为亮氨酸l、第188位的亮氨酸l突变为甲硫氨酸m以及第190位的丙氨酸a突变为亮氨酸l；
[0035]
或第186位的丙氨酸a突变为亮氨酸l、第188位的亮氨酸l突变为甲硫氨酸m以及第
190位的丙氨酸a突变为酪氨酸y。
[0036]
通过上述方法，本发明还筛选出一种蛋白质谷氨酰胺酶突变体，该蛋白质谷氨酰胺酶突变体由氨基酸序列如seq id no.2所示的蛋白质谷氨酰胺酶突变得到；其中，突变位点为：
[0037]
第9位的丙氨酸a突变为脯氨酸p；
[0038]
或第10位的苏氨酸t突变为甲硫氨酸m；
[0039]
或第16位的天冬酰胺n突变为甲硫氨酸m；
[0040]
或第9位的丙氨酸a突变为脯氨酸p、第10位的苏氨酸t突变为甲硫氨酸m以及第16位的天冬酰胺n突变为甲硫氨酸m。
[0041]
通过上述方法，本发明还筛选出一种木聚糖酶突变体，该木聚糖酶突变体由氨基酸序列如seq id no.3所示的木聚糖酶突变得到；其中，突变位点为：
[0042]
第143位的天冬酰胺n突变为苯丙氨酸f；
[0043]
或第146位的丝氨酸s突变为异亮氨酸i；
[0044]
或第147位的丝氨酸s突变为酪氨酸y；
[0045]
或第143位的天冬酰胺n突变为苯丙氨酸f、第146位的丝氨酸s突变为异亮氨酸i以及第147位的丝氨酸s突变为酪氨酸y。
[0046]
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
[0047]
本发明提供了一种基于等温压缩系数扰动对酶进行再设计的方法，首先通过等温压缩系数扰动筛选出酶表面高波动区域，然后对高波动区域的氨基酸进行虚拟饱和突变，使用自由能计算软件预测突变体的稳定性，筛选出高稳定性的突变体，并进行单点突变或组合突变进一步提高稳定性和活性。利用本发明方法筛选的突变体稳定性和活性均得到显著提升，满足工业应用的需求，同时节省时间和计算资源，能够有效降低筛选工作量。
[0048]
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
[0049]
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
[0050]
图1为不同压力下t1脂肪酶不同二级结构的等温压缩系数变化；
[0051]
图2为不同压力下t1脂肪酶不同二级结构的平均等温压缩系数；
[0052]
图3为t1脂肪酶组合突变体的温度稳定性；
[0053]
图4为t1脂肪酶组合突变体的rmsd随时间变化的演示图；
[0054]
图5为不同压力下蛋白质谷氨酰胺酶不同二级结构的等温压缩系数(多重短时间并行的分子动力学模拟)；
[0055]
图6为蛋白质谷氨酰胺酶野生型和突变体的温度稳定性；
[0056]
图7为不同压力下木聚糖酶loop环和α螺旋的等温压缩系数；
[0057]
图8为木聚糖酶野生型和突变体的温度稳定性；
[0058]
图9为不同压力下蛋白质谷氨酰胺酶α螺旋的等温压缩系数(单一长时间的分子动力学模拟)。
具体实施方式
[0059]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0060]
实施例1t1脂肪酶
[0061]
1基于等温压缩系数扰动的高波动区域筛选
[0062]
本实例以野生型t1脂肪酶(来自geobacillus zalihae strain t1来源的t1脂肪酶，t1 lipase)的晶体结构(pdb id:2dsn)为初始模型，采用gromacs(2019.06版)进行分子动力学模拟。模拟时应用amber99力场，将蛋白质放入一个装满水的立方体盒子中，且蛋白质距离盒子边缘最短为1.0nm，水模型采用tip4p，然后加入5个钠离子用以电荷平衡。采用50000步的最速下降法最小化体系以保证结构正常、原子间距离合适、几何构型合理，然后在周期边界条件下，进行400ps的nvt平衡，采用berendsen温度耦合到313k，使用parrinell-rahman压力耦合逐渐从大气压升到预期高压(100bar，500bar，1000bar，2000bar，4000bar)。待体系平衡移除限制进行成品模拟，整个模拟过程中，采用leap-frog算法进行积分，利用pme方法计算远距离静电势能。限定约束算法选择lincs，精度设置1，4。邻近搜索的截断方式为verlet，搜索方式为格子搜索grid，因为grid搜索比sample方式快很多。最终为了保证空间采样的广泛性，所有的模拟都以不同的初始速度进行了五次，持续时间为30ns。
[0063]
本实施例中蛋白质及其突变体的rmsd和rg统计均由gromacs的自带程序执行，蛋白质的二级结构由dssp计算所得，脂肪酶的结构分析和可视化采用pymol和vmd软件。
[0064]
图1反映了不同压力下t1脂肪酶不同二级结构的等温压缩系数，结果显示，不同的二级结构对压力变化的响应不同，反映了不同区域的可塑性。随后计算了二级结构在不同压力下的平均等温压缩系数(图2)，从全局来看，α螺旋的平均等温压缩系数在1.25-1.68
×
10-6
bar-1
范围内波动，在1bar处达到最大值1.68
×
10-6
bar-1
。β折叠的平均等温压缩系数最小，最小值为0.44
×
10-6
bar-1
。不同二级结构的平均等温压缩系数有以下关系：α螺旋》loop》β折叠。因此，我们选择α螺旋作为波动较大的二级结构进行下一步的筛选。对t1脂肪酶中的10个α螺旋(α1-α10螺旋)的等温压缩系数进行分析，选择等温压缩系数波动最大的α6螺旋作为高波动区域。
[0065]
2高稳定性和活性突变体的虚拟筛选
[0066]
将t1脂肪酶高波动区域(α6螺旋)上的氨基酸进行虚拟饱和突变。为避免破坏盐桥，将α6螺旋上的所有带电氨基酸(asp178、arg179、asp182、lys185、glu189)排除，对其余10个氨基酸进行虚拟饱和突变。使用foldx、i-mutant 2.0和strum三个软件预测突变体的稳定性，取预测结果的交集，最终得到四个阳性突变体a186l、l188m、a190l和a190y。
[0067]
3突变体的制备及酶学性质表征
[0068]
鉴于理性设计的单一突变对酶的稳定性和活性提高幅度有限，不能满足工业需求，因此组合阳性突变进一步提高酶的稳定性和活性，我们构建两个组合突变体a186l/l188m/a190l和a186l/l188m/a190y。
[0069]
将来自geobacillus zalihae strain t1的t1脂肪酶(t1 lipase)基因采用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达，t1脂肪酶基因的氨基酸序列见序列表(genbank：ay260764)，选用的质粒是pet-28a，以大肠杆菌宿主为e.coli jm109。
[0070]
①
首先构建重组质粒pet-28a-t1，作为后续构建t1脂肪酶突变体的模板。
[0071]
在t1脂肪酶基因的5’端和3’端分别添加bamh i和ecor i限制性酶切位点。用bamh i和ecor i分别对合成的t1脂肪酶全长基因和pet-28a载体进行双酶切，反应体系为50μl：t1脂肪酶基因(或pet-28a质粒)20μl；10xq buffer 5μl；bamh i和ecor i各2μl；dd h2o 21μl。酶切条件：37℃，2h。酶切结束后，将酶切产物进行核酸凝胶电泳验证，根据目的条带大小切胶，用dna胶回收试剂盒对t1脂肪酶基因及pet-28a质粒的双酶切产物作胶回收处理。用t4 dna连接酶对t1脂肪酶基因和载体pet-28a作连接反应，反应体系为10μl：目的片段6μl；pet-28a质粒2μl；10x t4dna ligase buffer 1μl；t4 dna ligase 1μl，置于16℃金属浴过夜连接10-12h。
[0072]
②
扩增重组质粒pet-28a-t1
[0073]
连接结束后，使用pcr产物纯化试剂盒对目的基因与载体的连接产物进行纯化，再转化大肠杆菌jm109，将转化液涂布于含有硫酸卡那霉素(50μg/ml)的lb平板，培养并获得单菌落。挑取单菌落转化子并接种于含卡那霉素的lb培养基中震荡培养6-8h，取菌液，进行菌液pcr验证和测序验证，验证正确的重组子用于后续的实验。
[0074]
③
单点突变体重组质粒的构建。
[0075]
设计表1所示的引物。以重组质粒pet-28a-t1为原始模板进行全质粒pcr扩增，构建得到突变体重组质粒。pcr反应体系为50μl：ddh2o 18μl；2x max buffer 25μl；dntp mix(10mm)1μl；pet-28a-t1模板1μl；上下游引物(10mm)各2μl；phanta max super-fidelity dna ploymerase 1μl。pcr反应条件：95℃ 30s；95℃ 15s，68℃ 15s，72℃ 5min，30个循环；72℃ 5min，4℃保存。反应结束后，利用dpn i酶对pcr产物进行消化，将消化产物转入e.coli jm109，最终将测序正确的重组子扩大培养并提取质粒，转入e.coli bl21(de3)于-20℃保存。
[0076]
表1 pcr引物
[0077][0078]
④
单点突变体的制备、纯化、酶学性质表征
[0079]
挑取携带突变体重组质粒的e.coli bl21(de3)转化子进行小规模扩大培养，并进行菌液pcr和测序验证。验证正确后，分别将2个突变体重组质粒的e.coli bl21(de3)进行扩大培养，并诱导表达组合突变体t1脂肪酶，诱导培养结束后，收集菌体，先用20mm的磷酸盐缓冲液(ph 7.4)清洗一遍菌体，以尽量去除残留的培养基，再用该缓冲液重悬菌体，使用超声波破碎仪进行细胞破碎(450w，5s/5s，25min)。破碎完毕，将破碎液于4℃(10000r
·
min-1
)离心1h，收集上清，用0.22μm微孔过滤器对上清进行过滤，即得粗酶液。
[0080]
将2个组合突变体t1脂肪酶粗酶液使用填料为ni-nta的镍离子亲和层析柱(1ml his trap ff)以及akta蛋白质纯化仪进行纯化，纯化步骤如下：(1)平衡柱子：用超纯水平衡柱子(20个柱体积)，再用咪唑终浓度为20mm的结合液平衡柱子(20个柱体积)。(2)上样：采用进样泵自动进样的方式，将粗酶液以1ml/min的流速进行上样。(3)洗脱：先用咪唑终浓度为20mm的缓冲液冲洗10个柱体积，以去除部分杂蛋白，再用咪唑终浓度为500mm的洗脱液冲洗30个柱体积，收集目标峰型下的洗脱产物并作好标记。(4)柱子再生：由于纯化过程中镍离子的流失，纯化结束后，用预先配好的再生溶液对镍柱进行再生处理，方便下次使用。(5)将纯化收集到的酶液进行sds-page验证和酶活力检测。
[0081]
以棕榈酸对硝基苯酯为底物检测酶活，酶活力测定体系为3ml，测定步骤如下：(1)将1.8ml 50mmol
·
l-1
tris-hcl缓冲溶液与100μl底物混合，37℃保温10min。(2)样品管中加入纯化酶液100μl(稀释到合适浓度)，对照管中加入相应灭活的酶液100μl，立即混匀计时，37℃准确反应10min。(3)加入500μl 10％的三氯乙酸终止反应。(4)再加入500μl 10％的na2co3溶液显色，于405nm处测定吸光度。
[0082]
脂肪酶活力单位的定义：在某一温度和ph条件下，每分钟水解底物释放出1μmol游离脂肪酸所需的酶量，将其定义为一个酶活力单位(u)。本发明中，1u是指在37℃，ph为8.0时，野生型及突变体t1脂肪酶每分钟水解棕榈酸对硝基苯酯产生1μmol游离对硝基苯所需的酶量。
[0083]
使用购自法国biologic公司的mos-450圆二色光谱仪分析野生型t1脂肪酶及突变体的半解折叠温度(tm)和二级结构。测定前先对样品进行预处理，采用超滤管离心的方法尽量除去蛋白纯化液中的杂离子，主要为氯离子，以减少对实验结果造成干扰。透析结束，先用考马斯蓝染色法测定纯化酶液的浓度，再根据测得的蛋白浓度用ph 7.4磷酸盐缓冲液将纯化酶液稀释至0.01-0.2mg/ml，测定t1脂肪酶的半解折叠温度(tm)时，将温度范围设置为20-90℃。
[0084]
将2个组合突变体a186l/l188m/a190l和a186l/l188m/a190y测定比酶活和半解折叠温度，结果如表2所示，比酶活表征结果显示a186l/l188m/a190l和a186l/l188m/a190y比野生型t1脂肪酶(337u/mg)在65℃、ph 8.0条件下的比酶活更高，分别提高了25.22％和40.65％；催化效率分别提高45.94％和77.83％。圆二色光谱分析的tm值结果显示催化效率提高的突变体，热稳定性也有所提高，a186l/l188m/a190l和a186l/l188m/a190y的tm值分别比野生型t1脂肪酶提高6.14℃和8.55℃。图3显示突变体a186l/l188m/a190l和a186l/l188m/a190y的温度稳定性野生型均提高，与上述tm值变化趋势基本一致，图4展示的突变体a186l/l188m/a190l和a186l/l188m/a190y的rmsd小于野生型t1脂肪酶，表明组合突变体的结构更稳定，说明基于等温压缩系数扰动的方法提高了酶的稳定性和活性。
[0085]
表2突变体半解折叠温度
[0086][0087]
实施例2蛋白质谷氨酰胺酶
[0088]
1基于等温压缩系数扰动的高波动区域筛选
[0089]
本实例以野生型蛋白质谷氨酰胺酶(pg酶)(来自chryseobacterium proteolyticum)的晶体结构(pdb id:2zk9)为初始模型，采用gromacs(2019.06版)进行分子动力学模拟。模拟时应用amber99力场，将蛋白质放入一个装满水的立方体盒子中，且蛋白质距离盒子边缘最短为1.0nm，水模型采用tip4p，加入3个氯离子用以电荷平衡。采用50000步的最速下降法最小化体系，在周期边界条件下，进行400ps的nvt平衡，采用berendsen温度耦合到318k，使用parrinell-rahman压力耦合逐渐从大气压升到预期高压(100bar，500bar，1000bar，2000bar，4000bar)。待体系平衡移除限制进行成品模拟，整个模拟过程中，采用leap-frog算法进行积分，利用pme方法计算远距离静电势能。限定约束算法选择lincs，精度设置1，4。邻近搜索的截断方式为verlet，搜索方式为格子搜索grid。最终为了保证空间采样的广泛性，所有的模拟都以不同的初始速度进行了五次，持续时间为30ns。
[0090]
本实施例中蛋白质的二级结构由dssp计算所得，蛋白质谷氨酰胺酶的结构分析和可视化采用pymol和vmd软件。
[0091]
图5反映了不同压力下蛋白质谷氨酰胺酶不同二级结构的等温压缩系数，结果显示，α1螺旋在不同压力下的等温压缩系数波动最大，因此，选择α1螺旋作为高波动区域。
[0092]
2高稳定性和活性突变体的虚拟筛选
[0093]
将蛋白质谷氨酰胺酶高波动区域(α1螺旋)上的氨基酸进行虚拟饱和突变。为避免破坏盐桥，将α1螺旋上的所有带电氨基酸(lys19)排除，对其余11个氨基酸进行虚拟饱和突变。使用foldx、i-mutant 2.0和strum三个软件预测突变体的稳定性，取预测结果的交集，最终得到3个阳性突变体a9p、t10m和n16m。
[0094]
3突变体的制备及酶学性质表征
[0095]
组合阳性突变进一步提高酶的稳定性和活性，我们构建一个组合突变体a9p/t10m/n16m。
[0096]
将来自chryseobacterium proteolyticum的蛋白质谷氨酰胺酶基因采用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达，蛋白质谷氨酰胺酶基因的氨基酸序列见序列表(genbank：ab046594)，选用的质粒是pet-28a，大肠杆菌宿主为e.coli jm109。
[0097]
①
首先构建重组质粒pet-28a-pg，作为后续构建蛋白质谷氨酰胺酶突变体的模
板。
[0098]
在蛋白质谷氨酰胺酶基因的5’端和3’端分别添加bamh i和ecor i限制性酶切位点。用bamh i和ecor i分别对合成的蛋白质谷氨酰胺酶基因和pet-28a载体进行双酶切，反应体系为50μl：蛋白质谷氨酰胺酶基因(或pet-28a质粒)20μl；10xq buffer 5μl；bamh i和ecor i各2μl；dd h2o 21μl。酶切条件：37℃，2h。酶切结束后，将酶切产物进行核酸凝胶电泳验证，根据目的条带大小切胶，用dna胶回收试剂盒对蛋白质谷氨酰胺酶基因及pet-28a质粒的双酶切产物作胶回收处理。用t4 dna连接酶对蛋白质谷氨酰胺酶基因和载体pet-28a作连接反应，反应体系为10μl：目的片段6μl；pet-28a质粒2μl；10x t4 dna ligase buffer 1μl；t4 dna ligase 1μl，置于16℃金属浴过夜连接10-12h。
[0099]
②
扩增重组质粒pet-28a-pg
[0100]
连接结束后，使用pcr产物纯化试剂盒对目的基因与载体的连接产物进行纯化，再转化大肠杆菌jm109，将转化液涂布于含有硫酸卡那霉素(50μg/ml)的lb平板，培养并获得单菌落。挑取单菌落转化子并接种于含卡那霉素的lb培养基中震荡培养6-8h，取菌液，进行菌液pcr验证和测序验证，验证正确的重组子用于后续的实验。
[0101]
③
单点突变体重组质粒的构建。
[0102]
设计表3所示的引物。以重组质粒pet-28a-pg为原始模板进行全质粒pcr扩增，构建得到突变体重组质粒。pcr反应体系为50μl：ddh2o 18μl；2x max buffer 25μl；dntp mix(10mm)1μl；pet-28a-pg模板1μl；上下游引物(10mm)各2μl；phanta max super-fidelity dna ploymerase 1μl。pcr反应条件：95℃ 30s；95℃ 15s，68℃ 15s，72℃ 5min，30个循环；72℃ 5min，4℃保存。反应结束后，利用dpn i酶对pcr产物进行消化，将消化产物转入e.coli jm109，最终将测序正确的重组子扩大培养并提取质粒，转入e.coli bl21(de3)于-20℃保存。
[0103]
表3 pcr引物
[0104][0105]
④
单点突变体的制备、纯化、酶学性质表征
[0106]
挑取携带突变体重组质粒的e.coli bl21(de3)转化子进行小规模扩大培养，并进行菌液pcr和测序验证。验证正确后，将突变体重组质粒的e.coli bl21(de3)进行扩大培养，并诱导表达组合突变体蛋白质谷氨酰胺酶，诱导培养结束后，收集菌体，先用20mm的
tris-hcl(ph 7.4)清洗一遍菌体，以尽量去除残留的培养基，再用该缓冲液重悬菌体，使用超声波破碎仪进行细胞破碎(450w，5s/5s，25min)。破碎完毕，将破碎液于4℃(8000r
·
min-1
)离心1h，收集上清，用0.22μm微孔过滤器对上清进行过滤，即得粗酶液。
[0107]
将组合突变体蛋白质谷氨酰胺酶粗酶液使用填料为ni-nta的镍离子亲和层析柱(1ml his trap ff)以及akta蛋白质纯化仪进行纯化，纯化步骤如下：(1)平衡柱子：用超纯水平衡柱子(20个柱体积)，再用咪唑终浓度为20mm的结合液平衡柱子(20个柱体积)。(2)上样：采用进样泵自动进样的方式，将粗酶液以1ml/min的流速进行上样。(3)洗脱：先用咪唑终浓度为20mm的缓冲液冲洗10个柱体积，以去除部分杂蛋白，再用咪唑终浓度为500mm的洗脱液冲洗30个柱体积，收集目标峰型下的洗脱产物并作好标记。(4)柱子再生：由于纯化过程中镍离子的流失，纯化结束后，用预先配好的再生溶液对镍柱进行再生处理，方便下次使用。(5)将纯化收集到的酶液进行sds-page验证和酶活力检测。以100μl酶液加入0.03mg/ml胰蛋白消化10min。
[0108]
蛋白质谷氨酰胺酶活性的测定方法如下：取1ml二肽cbz-gln-gly溶液，滴加蛋白质谷氨酰胺酶样品(或100μl蒸馏水，作为对照)，混匀后置于37℃恒温箱中孵育1h，滴加1ml 0.4m三氯乙酸溶液，混匀并终止反应。取60μl反应液与240μl蒸馏水、300μl显色试剂a、150μl显色试剂b和300μl显色试剂c充分混匀，置于37℃恒温箱中孵育20min，冷却，测量体系在630nm处的光吸收值。显色试剂a：称取2.023g苯酚和7.5mg亚硝基铁氰化钠，溶于蒸馏水并定容至50ml，避光、冷藏备用。显色试剂b：称取2.5g koh溶于蒸馏水并定容至50ml，4℃冷藏备用。显色试剂c：称取10.2g无水k2co3溶于蒸馏水，滴加417μl naclo溶液，加水定容至50ml，4℃冷藏备用。蛋白质谷氨酰胺酶酶活定义：100μl液体酶在37℃，每分钟水解二肽cbz-gln-gly释放1μmol氨为一个酶活力单位(u/ml)。将组合突变体a9p/t10m/n16m测定酶活，结果如表4所示，蛋白质谷氨酰胺酶组合突变体a9p/t10m/n16m的酶活比野生型提高了56.58％。
[0109]
测定温度稳定性时，，将野生型和突变体在40-80℃条件下分别保温2h，将未保温酶液在37℃条件下的酶活定义为100％，计算野生型和突变体在各个温度下的相对酶活。图6显示突变体a9p/t10m/n16m的温度稳定性提高，表明组合突变体的结构更稳定，说明基于等温压缩系数扰动的方法提高了蛋白质谷氨酰胺酶的稳定性和活性。
[0110]
表4蛋白质谷氨酰胺酶突变体酶活
[0111][0112]
实施例3木聚糖酶
[0113]
1基于等温压缩系数扰动的高波动区域筛选
[0114]
本实例以野生型木聚糖酶(xylanase)(来自trichoderma reesei)的晶体结构(pdb id:2dfc)为初始模型，基于随机生成变量的蒙特卡罗采样算法，使用函数的采样均值来近似估计目标函数的期望。将初始构象放入系统，初始结构被rotamertrialmover()随机扰动，蒙特卡罗采样算法使用了一个在区间[0，1]内符合均匀分布的随机数。该算法得到一系列预测构象，这些构象的的能量平均值作为对该蛋白平均能量的估计，所有的模拟重复进行了五次。
[0115]
本实施例中蛋白质的二级结构由dssp计算所得，木聚糖酶的结构分析和可视化采用pymol和vmd软件。
[0116]
图7反映了不同压力下木聚糖酶不同柔性二级结构(α螺旋和loop环)的等温压缩系数，通常，螺旋和loop环的柔性大于β-折叠，在此，我们分析比较了柔性二级结构(α螺旋和loop环)的等温压缩系数，结果显示，不同的二级结构对压力变化的响应不同，反映了不同区域的可塑性，从全局来看，loop12(arg142-ser147)的等温压缩系数波动最大，因此，我们选择loop12作为高波动区域。
[0117]
2高稳定性和活性突变体的虚拟筛选
[0118]
将木聚糖酶高波动区域(loop12)上的氨基酸进行虚拟饱和突变。为避免破坏盐桥，将loop12上的所有带电氨基酸(arg142、his 144、arg145)排除，对其余3个氨基酸进行虚拟饱和突变。使用foldx、i-mutant 2.0和strum三个软件预测突变体的稳定性，取预测结果的交集，最终得到3个阳性突变体n143f、s146i和s147y。
[0119]
3突变体的制备及酶学性质表征
[0120]
鉴于理性设计的单一突变对酶的稳定性和活性提高幅度有限，不能满足工业需求，因此组合阳性突变进一步提高酶的稳定性和活性，我们构建一个组合突变体n143f/s146i/s147y。
[0121]
将来自trichoderma reesei的木聚糖酶基因采用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达，木聚糖酶基因的氨基酸序列见序列表，选用的质粒是pet-28a，以大肠杆菌宿主为e.coli jm109。
[0122]
①
首先构建重组质粒pet-28a-xy，作为后续构建木聚糖酶突变体的模板。
[0123]
在木聚糖酶基因的5’端和3’端分别添加bamh i和ecor i限制性酶切位点。用bamh i和ecor i分别对合成的木聚糖酶全长基因和pet-28a载体进行双酶切，反应体系为50μl：木聚糖酶基因(或pet-28a质粒)20μl；10xq buffer 5μl；bamh i和ecor i各2μl；dd h2o 21μl。酶切条件：37℃，2h。酶切结束后，将酶切产物进行核酸凝胶电泳验证，根据目的条带大小切胶，用dna胶回收试剂盒对木聚糖酶基因及pet-28a质粒的双酶切产物作胶回收处理。用t4 dna连接酶对木聚糖酶基因和载体pet-28a作连接反应，反应体系为10μl：目的片段6μl；pet-28a质粒2μl；10x t4 dna ligase buffer 1μl；t4 dna ligase 1μl，置于16℃金属浴过夜连接10-12h。
[0124]
②
扩增重组质粒pet-28a-xy
[0125]
连接结束后，使用pcr产物纯化试剂盒对目的基因与载体的连接产物进行纯化，再转化大肠杆菌jm109，将转化液涂布于含有硫酸卡那霉素(50μg/ml)的lb平板，培养并获得单菌落。挑取单菌落转化子并接种于含卡那霉素的lb培养基中震荡培养6-8h，取菌液，进行菌液pcr验证和测序验证，验证正确的重组子用于后续的实验。
[0126]
③
单点突变体重组质粒的构建。
[0127]
设计表5所示的引物。以重组质粒pet-28a-xy为原始模板进行全质粒pcr扩增，构建得到突变体重组质粒。pcr反应体系为50μl：ddh2o 18μl；2x max buffer 25μl；dntp mix(10mm)1μl；pet-28a-xy模板1μl；上下游引物(10mm)各2μl；phanta max super-fidelity dna ploymerase 1μl。pcr反应条件：95℃ 30s；95℃ 15s，68℃ 15s，72℃ 5min，30个循环；72℃ 5min，4℃保存。反应结束后，利用dpn i酶对pcr产物进行消化，将消化产物转入e.coli jm109，最终将测序正确的重组子扩大培养并提取质粒，转入e.coli bl21(de3)于-20℃保存。
[0128]
表5 pcr引物
[0129][0130]
④
单点突变体的制备、纯化、酶学性质表征
[0131]
挑取携带突变体重组质粒的e.coli bl21(de3)转化子进行小规模扩大培养，并进行菌液pcr和测序验证。验证正确后，将带有突变体重组质粒的e.coli bl21(de3)进行扩大培养，并诱导表达组合突变体木聚糖酶，诱导培养结束后，收集菌体，先用50mm的tris(ph 8.0)清洗一遍菌体，以尽量去除残留的培养基，再用该缓冲液重悬菌体，使用超声波破碎仪进行细胞破碎(450w，5s/5s，25min)。破碎完毕，将破碎液于4℃(10000r
·
min-1
)离心1h，收集上清，用0.22μm微孔过滤器对上清进行过滤，即得粗酶液。
[0132]
将组合突变体木聚糖酶的粗酶液使用填料为ni-nta的镍离子亲和层析柱(1ml his trap ff)以及akta蛋白质纯化仪进行纯化，纯化步骤如下：(1)平衡柱子：用50mm的tris(ph 8.0)平衡柱子(20个柱体积)，再用咪唑终浓度为20mm的结合液平衡柱子(20个柱体积)。(2)上样：采用进样泵自动进样的方式，将粗酶液以1ml/min的流速进行上样。(3)洗脱：先用咪唑终浓度为20mm的缓冲液冲洗10个柱体积，以去除部分杂蛋白，再用咪唑终浓度为500mm的洗脱液冲洗30个柱体积，收集目标峰型下的洗脱产物并作好标记。(4)柱子再生：由于纯化过程中镍离子的流失，纯化结束后，用预先配好的再生溶液对镍柱进行再生处理，方便下次使用。(5)将纯化收集到的酶液进行sds-page验证和酶活力检测。
[0133]
以棕榈酸对硝基苯酯为底物检测酶活，测定步骤如下：
[0134]
取4.9ml 0.2％木聚糖酶溶液(ph 5.0)于10ml ep管中，60℃水浴5min，加入100μl 0.005mg/ml木聚糖酶，反应5min，空白加100μl蒸馏水做为对照；反应结束后，加入1ml dns
溶液，沸水浴10min,冷却。540nm下测吸光度。
[0135]
木聚糖酶活力单位的定义：在60℃，ph 5.0条件下，每分钟水解底物释放出1μmol还原糖所需的酶量，将其定义为一个酶活力单位(u)。将组合突变体n143f/s146i/s147y测定酶活，结果如表6所示，木聚糖酶组合突变体n143f/s146i/s147y比野生型提高了19.29％。
[0136]
测定温度稳定性时，，将野生型和突变体在40-80℃条件下分别保温2h，将未保温酶液在37℃条件下的酶活定义为100％，计算野生型和突变体在各个温度下的相对酶活。图8显示突变体n143f/s146i/s147y的温度稳定性提高，表明组合突变体的结构更稳定，说明基于等温压缩系数扰动的方法提高了木聚糖酶的稳定性和活性。
[0137]
表6木聚糖酶突变体酶活
[0138][0139]
实施例4多重短时间的并行分子动力学模拟、单一长时间的分子动力学模拟
[0140]
本实例以野生型蛋白质谷氨酰胺酶(pg酶)(来自chryseobacterium proteolyticum)的晶体结构(pdb id:2zk9)为初始模型，采用gromacs(2019.06版)进行分子动力学模拟。模拟时应用amber99力场，将蛋白质放入一个装满水的立方体盒子中，且蛋白质距离盒子边缘最短为1.0nm，水模型采用tip4p，加入3个氯离子用以电荷平衡。采用50000步的最速下降法最小化体系，在周期边界条件下，进行400ps的nvt平衡，采用berendsen温度耦合到318k，使用parrinell-rahman压力耦合逐渐从大气压升到预期高压(100bar，500bar，1000bar，2000bar，4000bar)。待体系平衡移除限制进行成品模拟，整个模拟过程中，采用leap-frog算法进行积分，利用pme方法计算远距离静电势能。限定约束算法选择lincs，精度设置1，4。邻近搜索的截断方式为verlet，搜索方式为格子搜索grid。进行随机初始原子速度的短时间(30ns)的分子动力学模拟五次，同时进行了一个随机初始原子速度的长时间(150ns)的分子动力学模拟1次。
[0141]
图9反映了长时间模拟后不同压力下蛋白质谷氨酰胺酶不同二级结构的等温压缩系数，通过比较长时间分子动力学和多重短时间并行的分子动力学模拟，结果发现长时间模拟后，不同区域的等温压缩系数变化差异小，α1螺旋、α2螺旋和loop6在不同压力下的等温压缩系数波动基本一致，不利于筛选高波动区域，原因可能由于单一的长时间模拟对空间构象的采样不足(陷入局部能量最小值)导致收敛时间过长。而多重短时间的并行分子动力学模拟更有效地探索空间的不同区域，促进空间更大的采样，有利于高波动区域的筛选。
[0142]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变
动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
[0143]
[0144]
[0145]