一种双酶活性抑菌材料的制备方法及其应用

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1.本发明属于抑菌材料制备及应用技术领域，涉及一种双酶活性fe2(moo4)3@gox材料的制备方法及应用，通过水热法合成钼酸铁，利用静电吸附的方式负载葡萄糖氧化酶，通过协同葡萄糖氧化酶产生的饥饿疗法与钼酸铁产生的活性氧来达到高效抑菌的目的，抑菌效果良好且对人体无害。


背景技术：

2.糖尿病是目前全球流行的一种疾病，患者数量每年都在增加，已成为最突出的公共卫生威胁之一，影响着全世界约4.25亿人的健康。糖尿病足溃疡又称糖尿病肢体坏疽，是糖尿病最严重的慢性并发症之一，也是糖尿病患者致残和死亡的重要原因。糖尿病患者足溃疡是由周围神经病变、下肢动脉供血不足、细菌感染等因素引起的。其中，细菌感染是影响伤口愈合的重要因素，抗生素治疗往往不能起到有效的杀菌作用，但会引起耐药菌的出现，加重病情。
3.因此，寻找具有高效杀菌和抑制细菌耐药性产生的抗菌材料已迫在眉睫。纳米酶是一种具有酶催化性能的纳米材料，可以模拟天然酶产生有毒的活性氧用于灭菌，具有类过氧化物酶(如v2o5、co3o4、二维(2d)co-mof)可以将外源性过氧化氢转化为毒性的羟基自由基(
·
oh)来治疗细菌感染。然而，在实际的伤口消毒应用中，外源性过氧化氢的加入不可避免地会引起感染组织的继发性疼痛，并且添加的过氧化氢容易分解，而且添加量不易控制，在实际应用过程中非常麻烦。
4.研究表明糖尿病足伤口处的血糖浓度高于健康人。由于伤口中高浓度的葡萄糖是细菌的营养物质，因此更有利于细菌的繁殖，进而进一步恶化伤口。因此，如果伤口处细菌的营养来源能够被分解，细菌的生长速度就会在营养缺乏的环境中逐渐降低。葡萄糖氧化酶是一种内源性氧化还原酶，能催化葡萄糖生成过氧化氢和葡萄糖酸。由于葡萄糖氧化酶不仅消耗能量和营养物质(葡萄糖和氧气)，而且在催化部位产生过氧化氢，因此在前几年被广泛用作癌症的饥饿疗法。更幸运的是，葡萄糖氧化酶可以产生内源性过氧化氢，从而解决了外源性添加的问题。但是单一的葡萄糖氧化酶的抑菌效果并不理想，有必要寻求一种步骤简单、不用外源添加过氧化氢的双酶活性抑菌材料。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，提供一种钼酸铁负载葡萄糖氧化酶的双酶活性抑菌材料的制备方法及其应用，钼酸铁具有优异的过氧化物酶性质，利用静电吸附的方式负载葡萄糖氧化酶能够发生级联反应，葡萄糖氧化酶产生的饥饿疗法与钼酸铁产生的活性氧协同高效抑菌。
6.为了实现上述目的，本发明提供一种钼酸铁负载葡萄糖氧化酶的双酶活性抑菌材料的制备方法，具体工艺步骤包括：
7.将钼酸铁(fe2(moo4)3)分散在ph＝4的醋酸盐缓冲液中，加入葡萄糖氧化酶，常温
200～300r/min搅拌10分钟，然后离心，收集沉淀，冷冻干燥，得到钼酸铁负载葡萄糖氧化酶的双酶活性抑菌材料(fe2(moo4)3@gox)。
8.进一步地，钼酸铁与葡萄糖氧化酶的质量比为1：1。
9.进一步地，离心转速为5000～8000r/min，离心时间5～10min。
10.进一步地，冷冻干燥时间为24～36h；冷冻温度-40～-50℃。
11.进一步地，所述钼酸铁的制备方法为：
12.(1)将铁盐和钼酸盐分别溶解到两份相同体积的去离子水中，铁盐和钼酸盐的摩尔比为1：1将溶解，再将钼酸盐溶液逐滴加入铁盐溶液中，再将终反应体系用氢氧化钠调节到ph＝2.5～4,然后常温200～300r/min搅拌30min，转移到100ml反应釜中，150～200℃反应8～15h；
13.(2)将反应完的样品取出，在5000～10000r/min下离心5～10min，去除上清液，收集沉淀，加超纯水，重复离心，直至上清液无色，收集沉淀冷冻干燥24～48h，得到fe2(moo4)3。
14.进一步地，所述铁盐为fe2(no3)3；所述钼酸盐为na2moo4。
15.本发明制备的fe2(moo4)3@gox能够分解葡萄糖产生过氧化氢和葡萄糖酸，减少细菌的营养物质，产生饥饿疗法，抑制细菌生长；在不外加过氧化氢的情况下，能够将上级反应分解产生的过氧化氢转化成毒性羟基自由基，协同饥饿疗法，对细菌造成双重伤害。
16.本发明还提供所述双酶活性的fe2(moo4)3@gox作为抑菌材料的应用，具体为fe2(moo4)3@gox作为抑菌材料对伤口进行处理的应用。
17.本发明与现有技术相比，利用静电吸附法将天然的葡萄糖氧化酶(gox)吸附到钼酸铁表面得到具有两种酶性质的材料(fe2(moo4)3@gox)；基于fe2(moo4)3@gox具有出色的过氧化物酶和葡萄糖氧化酶活性，在抑菌应用中能够减少外源过氧化氢对组织造成的伤害，且减少了额外添加的繁琐步骤，此双酶活性材料能够自发发生级联反应，葡萄糖氧化酶产生的饥饿疗法能够协同钼酸铁产生的活性氧高效抗菌，因此利用该双酶体系进行抑菌是具有非常重要的意义和应用前景的；其制备方法简单、制备设备易得、制备过程简单，且具有高效的抗菌性能，整个过程绿色、环保、无污染，应用前景广阔。
附图说明：
18.图1为本发明涉及的双酶活性fe2(moo4)3@gox的抑菌原理示意图。
19.图2为本发明实施例1制备的钼酸铁和fe2(moo4)3@gox的表征电镜图，其中a为钼酸铁的扫描电镜图；b为钼酸铁的高分辨透射电镜图；c为fe2(moo4)3@gox的扫描电镜图。
20.图3为本发明的fe2(moo4)3@gox的过氧化物酶和葡萄糖氧化酶性质检测示意图和活性氧类型检测示意图，其中，a图是fe2(moo4)3@gox的过氧化物酶性质检测；b图是fe2(moo4)3@gox的葡萄糖氧化酶性质检测；c图是级联酶fe2(moo4)3@gox产生羟基自由基的esr检测结果。
21.图4为本发明涉及的实施例3fe2(moo4)3@gox体外抑菌实验结果照片图。
22.图5为本发明涉及的实施例4fe2(moo4)3@gox体内抑菌实验结果照片图。
23.图6为本发明涉及的实施例5经fe2(moo4)3@gox处理的小鼠主要器官结果示意图。
24.图7为本发明涉及的实施例5fe2(moo4)3@gox的细胞毒性测试结果示意图。
具体实施方式：
25.下面通过具体实施例并结合附图对本发明进行详细说明。
26.实施例1：
27.本实施例涉及的fe2(moo4)3@gox双酶活性抑菌材料的制备方法，具体工艺步骤为：
28.将钼酸铁(fe2(moo4)3)1.0mg分散在ph＝4的醋酸盐缓冲液中，加入1mg葡萄糖氧化酶，常温200r/min搅拌10分钟，然后在转速5000r/min下离心5min，收集沉淀，-40℃下冷冻干燥24h，得到钼酸铁负载葡萄糖氧化酶的双酶活性抑菌材料(fe2(moo4)3@gox)。
29.本实施例涉及的钼酸铁的制备方法为：
30.(1)将铁盐和钼酸盐分别溶解到两份相同体积的去离子水中，铁盐和钼酸盐的摩尔比为1：1.5，再将钼酸盐溶液逐滴加入铁盐溶液中，再将终反应体系用氢氧化钠调节到ph＝3,然后常温200r/min搅拌30min，转移到100ml反应釜中，150℃反应15h；所述铁盐为fe2(no3)3；所述钼酸盐为na2moo4。
31.(2)将反应完的样品取出，在5000r/min下离心10min，去除上清液，收集沉淀，加超纯水，重复离心，直至上清液无色，收集沉淀冷冻干燥24h，得到fe2(moo4)3。
32.本实施例用扫描电镜和高分辨透射电镜对制备的fe2(moo4)3进行表征，结果如图2a和图2b所示，fe2(moo4)3具有花样多层结构，分散性良好，平均直径为15
±
4.75μm，比表面积大，活性位点多，且具有较强的负电位，使其更有效的负载葡萄糖氧化酶。用扫描电镜对所制备的fe2(moo4)3@gox进行表征，结果如图2c所示，从图中看fe2(moo4)3@gox形貌均匀。
33.然后将制备的双酶活性抑菌材料进行酶活性质表征，图3a和3b分别表示fe2(moo4)3@gox优异的过氧化物酶和葡萄糖氧化酶性质。fe2(moo4)3@gox进行电子自旋共振(esr)以进一步验证活性氧的形式。如图3c所示，fe2(moo4)3@gox出现特征峰1:2:2:1，说明fe2(moo4)3@gox的过氧化酶能够将过氧化氢转化为毒性的羟基自由基。
34.实施例2：
35.本实施例涉及的fe2(moo4)3@gox双酶活性抑菌材料的制备方法，具体工艺步骤为：
36.将钼酸铁(fe2(moo4)3)1.0mg分散在ph＝4的醋酸盐缓冲液中，再加入1.0mg葡萄糖氧化酶，常温300r/min搅拌十分钟，然后在转速8000r/min下离心10min，收集沉淀，-50℃下冷冻干燥36h，得到钼酸铁负载葡萄糖氧化酶的双酶活性抑菌材料(fe2(moo4)3@gox)。
37.本实施例涉及的钼酸铁的制备方法为：
38.(1)将铁盐和钼酸盐分别溶解到两份相同体积的去离子水中，铁盐和钼酸盐的摩尔比为1：1.5，再将钼酸盐溶液逐滴加入铁盐溶液中，再将终反应体系用氢氧化钠调节到ph＝3,然后常温300r/min搅拌30min，转移到100ml反应釜中，200℃反应8h；所述铁盐为fe2(no3)3；所述钼酸盐为na2moo4。
39.(2)将反应完的样品取出，在10000r/min下离心5min，去除上清液，收集沉淀，加超纯水，重复离心，直至上清液无色，收集沉淀冷冻干燥24h，得到fe2(moo4)3。
40.实施例3：
41.本实施例涉及fe2(moo4)3@gox在体外抑菌方面的应用实验，将实施例1制备的fe2(moo4)3@gox应用到体外抗菌实验，将固体lb培养基上的单菌落抗药性细菌(耐药大肠杆菌和耐药金黄色葡萄球菌)接种到50ml无菌液体lb培养基(含有胰蛋白胨(0.5g)、酵母提取物(0.25g)和nacl(0.5g))，然后将抗药性细菌的悬浮液置于旋转振荡器上以180r/min在37℃
下培养过夜；随后用无菌pbs将细菌稀释至106cfu/ml，将获得的细菌溶液(100微升)与200微升质量浓度为60μg
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ml-1
的fe2(moo4)3@gox水溶液和700微升的pbs缓冲液在37℃孵育30min，之后取50微升的上述混合溶液均匀涂布在固体lb培养基上，将固体lb培养基放在37℃的保温箱中培养12个小时，用cfu法计数细菌菌落数；使用pbs作为空白对照，单独用钼酸铁或葡萄糖氧化酶处理细菌进行平行对照试验。测量结果如图4所示，与单独使用gox或fe2(moo4)3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌率46.2％-59.404％相比，fe2(moo4)3@gox组分别为98.396％和98.776％，表明钼酸铁与葡萄糖氧化酶协同作用发挥出较强的抑菌效果。
42.实施例4：
43.本实施例为fe2(moo4)3@gox在体内抑菌方面的应用实验，具体为：将实施例1制备的fe2(moo4)3@gox应用到体内抗菌实验方面，通过使用雄性和雌性混合dbdb小鼠(六周，30～34g，共12只)建立小鼠伤口感染模型，在所有小鼠的背部上制造了直径约l cm的圆形皮肤损伤，小鼠被mrsa(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)感染后，将其分成4组，每组3只。每组接受不同的治疗药物,分别为pbs、fe2(moo4)3+h2o2、gox、fe2(moo4)3@gox；并将整个治疗过程定为10天，每隔2天收集伤口的照片，结果如图5所示。由图5可知，fe2(moo4)3@gox组处理的伤口最小，愈合效果最明显，表明fe2(moo4)3@gox对耐药性细菌具有明显的抗菌性能，能够促使小鼠伤口快速愈合。
44.实施例5：
45.本实施例为fe2(moo4)3@gox在生物毒性测试方面的应用实验，实验用细胞为小鼠l929细胞，将细胞分别由不同浓度(0,10,20,30,45,50,60μg/ml)的100微升fe2(moo4)3@gox水溶液分别和150微升dmem溶液混合的7种混合液进行孵育24小时，然后分别加入10ml浓度为5mg/ml的mtt水溶液，然后继续在通5％co2和37℃条件下孵育4小时，最后用100微升二甲基亚砜使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值，测量结果如图7所示，未经过fe2(moo4)3@gox溶液孵育的细胞活性设定为100％，结果显示分别经不同浓度(10,20,30,45,50,60μg/ml)的fe2(moo4)3@gox水溶液孵育后，细胞活性均能保持99％以上。此外，分别用pbs和质量体积浓度为60μg/ml的fe2(moo4)3@gox水溶液处理小鼠的主要器官(肝脏,心脏,肺,脾脏和肾脏)，结果如图6所示，肝脏,心脏,肺，脾脏和肾脏均没有明显的损伤或组织异常，证明了所制备的fe2(moo4)3@gox双酶活性抑菌材料，具有良好的生物相容性和低细胞毒性。