抗IL-4R抗体-药物偶联物及医药用途的制作方法

抗il-4r抗体-药物偶联物及医药用途
技术领域
1.本公开涉及一种含有抗il-4r的抗体或其抗原结合片段的抗体-药物偶联物，以及其作为抗癌药物的用途。


背景技术：

2.恶性肿瘤(癌症)是全球第二位死因，仅排在心脏病之后。神经胶质母细胞瘤(gbm)是最常见的恶性原发性脑瘤，经历标准治疗的胶质母细胞瘤患者的中位生存期小于15个月。尽管相关研究在肿瘤生物学方面有进展，但并未实现转化使患者受益，因此有迫切需求去开发有效的方法用来治疗神经胶质母细胞瘤。
3.il-4r是白介素4受体，在脑胶质母细胞瘤肿瘤细胞以及浸润的免疫抑制细胞(如肿瘤相关巨噬细胞(tam)、髓系来源免疫抑制细胞(mdsc)等)上表达。靶向il-4r的治疗不仅可以杀伤肿瘤细胞，还可以改善肿瘤微环境。在脑胶质母细胞瘤临床前动物模型以及早期临床实验中，靶向il-4r的治疗均显示优于传统治疗的效果。
4.medicenna公司开发的mdna55是il-4与细菌毒素假单胞菌外毒素a(pe38kdel)形成的融合蛋白，在临床开发实验中显示了积极疗效(参见wo9527732、biochem.j.(1995)307,29-37、cancer research 55,3357-3363,august 1,1995)。
5.但是第一代的免疫毒素治疗存在与靶标亲和力不够强等问题。提高免疫毒素的靶向性和亲和力是肿瘤免疫毒素治疗研究的重点与难点之一(参见“中国肿瘤临床年鉴2009”，赵平主编，中国协和医科大学出版社，2010年07月，第61页)。
6.抗体-药物偶联物(adc)旨在将单克隆抗体(mabs)的选择性与化疗药物的细胞毒性潜力结合起来。抗体-药物偶联物由“抗体(antibody)”、“接头(linker)”和“药物分子(drug)”三个主要组件构成。和传统的完全或部分人源化抗体或抗体片段相比，抗体-药物偶联物因为能在肿瘤组织内释放高活性的细胞毒素从而理论上疗效更高；和融合蛋白相比，具有更高的耐受性或较低的副作用。抗体-药物偶联物与靶抗原的亲和力影响抗体-药物偶联物渗透到肿瘤组织与靶抗原结合过程，并直接影响抗体-药物偶联物的黏合效率(参见“生物技术制药”，冯美卿主编，中国医药科技出版社，2016年01月，第209-211页)。
7.设计抗体-药物偶联物时，最关键的因素之一就是抗体的选择，重要的是对抗原的高特异性。缺乏高特异性并与其他抗原发生交叉反应的抗体可能无法预期地发挥作用，例如，通过与健康组织相互作用而引起脱靶毒性，或在到达肿瘤部位之前引起机体的过早清除(参见：“introduction to antibody
–
drug conjugates(adcs)”，ilona pysz,paul j.m.jackson and david e.thurston,chapter 1:introduction to antibody
–
drug conjugates(adcs),in cytotoxic payloads for antibody
–
drug conjugates,2019)。
8.目前各国已有多家制药公司正在研发针对il-4r的单克隆抗体，相关专利申请如wo2010053751、wo2001092340、wo2008054606、wo2014031610等，本公开的发明人的在先申请wo2020038454也涉及一类新的抗il-4r抗体。但是，il-4r定向的抗体-药物偶联物鲜有明确报道，如wo2015188934、wo2014124227、wo2018217227等均仅泛泛提及抗体-药物偶联物
中抗体可选靶向il-4r，但均未披露具体的抗il-4r抗体-药物偶联物。
9.本发明利用高亲和力的抗il-4r抗体制备adc药物，达到强效杀伤癌细胞的目的，用于满足癌症治疗或延缓癌症进展的需求。


技术实现要素：

10.本公开涉及抗il-4r的抗体或其抗原结合片段与药物的偶联物(adc)及医药用途，其中提供与抗il-4r的抗体或其抗原结合片段与细胞毒性物质mmae或其衍生物、依喜替康或其衍生物、艾日布林或其衍生物偶联的adc药物。
11.抗体-药物偶联物
12.本公开提供了一种抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，包含：抗il-4r的抗体或其抗原结合片段以及一个或多个药物分子；其中药物选自mmae或其衍生物、依喜替康或其衍生物、和艾日布林或其衍生物。
13.在一些实施方案中，抗il-4r的抗体或其抗原结合片段可以是已知的，如在例如wo2010053751、wo2001092340、wo2008054606、wo2014031610、wo2020038454(其各自通过引用并入本文)中所描述的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段。
14.在一些实施方案中，抗il-4r的抗体或其抗原结合片段包括但不限于dupixent、prs-060、ak-120、63igg1、cbp201、amg-317或其抗原结合片段。
15.在一些实施方案中，抗il-4r的抗体或其抗原结合片段是抗人il-4r的抗体或其抗原结合片段。
16.在一些实施方案中，抗il-4r的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含：
17.(i)分别如seq id no：3、seq id no：4和seq id no：5所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
18.(ii)分别如seq id no：11、seq id no：12和seq id no：13所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
19.和/或抗体轻链可变区包含：
20.(i)分别如seq id no：6、seq id no：7和seq id no：8所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
21.(ii)分别如seq id no：14、seq id no：15和seq id no：16所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
22.(iii)分别如seq id no：38、seq id no：7和seq id no：40所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
23.(iv)分别如seq id no：42、seq id no：39和seq id no：8所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
24.表1示出了抗il-4r的抗体或其抗原结合片段的cdr序列。
25.表1抗il-4r的抗体或其抗原结合片段的cdr序列
26.名称序列编号hcdr1gftfsdygmhseq id no：3hcdr2fissgssiiyyadivkgseq id no：4
hcdr3gnkrgffdyseq id no：5lcdr1nasssvsymyseq id no：6lcdr2ltsnlasseq id no：7lcdr3qqwrsnppmltseq id no：8hcdr1gytftsywmhseq id no：11hcdr2lihpnsdttkfsenfktseq id no：12hcdr3skiittivarhwyfdvseq id no：13lcdr1kasqsvdyggdsymnseq id no：14lcdr2aasnlesseq id no：15lcdr3qhsnenpptseq id no：16lcdr1rasssvpymyseq id no：38lcdr2lassrpsseq id no：39lcdr3qqwrayppmltseq id no：40lcdr1raspgvpplaseq id no：42
27.在一些实施方案中，抗il-4r的抗体或其抗原结合片段包含选自以下(i)至(iv)中的任一项：
28.(i)重链可变区，其包含分别如seq id no：3、seq id no：4和seq id no：5所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和
29.轻链可变区，其包含分别如seq id no：6、seq id no：7和seq id no：8所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；
30.(ii)重链可变区，其包含分别如seq id no：11、seq id no：12和seq id no：13所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和
31.轻链可变区，其包含分别如seq id no：14、seq id no：15和seq id no：16所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；
32.(iii)重链可变区，其包含分别如seq id no：3、seq id no：4和seq id no：5所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和
33.轻链可变区，其包含分别如seq id no：38、seq id no：7和seq id no：40所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；
34.(iv)重链可变区，其包含分别如seq id no：3、seq id no：4和seq id no：5所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和
35.轻链可变区，其包含分别如seq id no：42、seq id no：39和seq id no：8所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
36.在一些实施方案中，所述的抗il-4r的抗体或抗原结合片段是鼠源抗体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体或其片段。在一些具体的实施方案中，所述抗il-4r的抗体或抗原结合片段是人源化的。
37.在一些实施方案中，所述的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段，包含来源于人种系轻链igkv3-11*01(seq id no：22，用于抗体25g7)的fr序列或与其至少有95％同一性的回复突变序列。在一些具体实施方案中，所述的回复突变选自l46p，l47w，f71y中的一个或多个。在一些实施方案中，所述的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段，包含来源于人种系重链
ighv3-48*01(seq id no：21，用于抗体25g7)的fr区序列或与其至少有95％同一性的回复突变序列。在一些具体实施方案中，所述的回复突变选自s94a，f67s，a93t中的一个或多个。在一些实施方案中，所述的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段，包含来源于人种系轻链igkv2d-29*01(seq id no：24，用于抗体7b10)的fr区序列或与其至少有95％同一性的回复突变序列。在一些具体实施方案中，所述的回复突变选自m4l和/或v58i。在一些实施方案中，所述的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段，包含来源于人种系重链ighv1-2*02(seq id no：23，用于抗体7b10)的fr区序列或与其至少有95％同一性的回复突变序列。在一些具体实施方案中，所述的回复突变选自m69l，r71i，t73k，r94k中的一个或多个。
38.人种系重链ighv3-48*01：
39.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssysmnwvrqapgkglewvsyissssstiyyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycar
40.seq id no：21
41.人种系轻链igkv3-11*01：
42.eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqrsnwp
43.seq id no：22
44.人种系重链ighv1-2*02：
45.qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyymhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycar
46.seq id no：23
47.人种系轻链igkv2d-29*01：
48.divmtqtplslsvtpgqpasisckssqsllhsdgktylywylqkpgqppqlliyevsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqsiqlp
49.seq id no：24
50.在一些实施方案中，抗il-4r的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
51.重链可变区包含：
52.(i)如seq id no：1所示或与seq id no：1具有至少70％、80％、90％、95％、98％、99％同一性的序列；或
53.(ii)如seq id no：9所示或与seq id no：9具有至少70％、80％、90％、95％、98％、99％同一性的序列；或
54.(iii)如seq id no：43所示或与seq id no：43具有至少70％、80％、90％、95％、98％、99％同一性的序列；或
55.和/或轻链可变区包含：
56.(i)如seq id no：2所示或与seq id no：2具有至少70％、80％、90％、95％、98％、99％同一性的序列；或
57.(ii)如seq id no：10所示或与seq id no：10具有至少70％、80％、90％、95％、98％、99％同一性的序列；或
58.(iii)如seq id no：37所示或与seq id no：37具有至少70％、80％、90％、95％、
98％、99％同一性的序列；或
59.(iv)如seq id no：41所示或与seq id no：41具有至少70％、80％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。
60.25g7 hcvr(25g7重链可变区)
61.evqlvesggglvkpggslklscaasgftfsdygmhwvrqapekglewvafissgssiiyyadivkgrstisrdnakntlflqmtslrsedtamyyctrgnkrgffdywgqgtiltvss
62.seq id no：1
63.25g7 lcvr(25g7轻链可变区)
64.qivltqspalmsaspgekvtmtcnasssvsymywyqrkprsspkpwiyltsnlasgvpvrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwrsnppmltfgsgtklevk
65.seq id no：2
66.7b10 hcvr(7b10重链可变区)
67.qvqlqqpgtellkpgasvslsckasgytftsywmhwvkqrpgqglewiglihpnsdttkfsenfktratltidkssstaymklssltsedsavyycakskiittivarhwyfdvwgtgttvtvss
68.seq id no：9
69.7b10 lcvr(7b10轻链可变区)
70.divltqsppslavslgqratisckasqsvdyggdsymnwyqqklgqppkvliyaasnlesgiparfsgsgsgtdftlnihpveeedvatyycqhsnenpptfgggtkleik
71.seq id no：10
72.hu25g7-a lcvr(hu25g7-a轻链可变区)
73.eivltqspatlslspgeratlscrasssvpymywyqqkpgqaprlliyltsnlasgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqwrayppmltfgggtkveik
74.seq id no：37
75.hu25g7-b lcvr(hu25g7-b轻链可变区)
76.eivltqspatlslspgeratlscraspgvpplawyqqkpgqaprlliylassrpsgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqwrsnppmltfgggtkveik
77.seq id no：41
78.hu25g7-vh(hu25g7重链可变区)
79.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdygmhwvrqapgkglewvafissgssiiyyadivkgrstisrdnakntlylqmnslraedtavyyctrgnkrgffdywgqgtlvtvss
80.seq id no：43
81.在至少一个实施方案中，所述抗il-4r的抗体或抗原结合片段的重链可变区如序列seq id no：1所示，轻链可变区如序列seq id no：2所示；或
82.重链可变区如序列seq id no：9所示，轻链可变区如序列seq id no：10所示；或
83.重链可变区如序列seq id no：43所示，轻链可变区如序列seq id no：37所示；或
84.重链可变区如序列seq id no：43所示，轻链可变区如序列seq id no：41所示。
85.在一些实施方案中，抗il-4r的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
86.重链可变区包含：
87.(i)如seq id no：25-27之一所示或与seq id no：25-27之一具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的序列；或
88.(ii)如seq id no：31-33之一所示或与seq id no：31-33之一具有至少70％、80％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列；
89.和/或轻链可变区包含：
90.(i)如seq id no：28-30之一所示或与seq id no：28-30之一具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的序列；或
91.(ii)如seq id no：34-36之一所示或与seq id no：34-36之一具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的序列。
92.hu25g7-vh-a：
93.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdygmhwvrqapgkglewvafissgssiiyyadivkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycargnkrgffdywgqgtlvtvss
94.seq id no：25
95.hu25g7-vh-b：
96.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdygmhwvrqapgkglewvafissgssiiyyadivkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyyctrgnkrgffdywgqgtlvtvss
97.seq id no：26
98.hu25g7-vh-c：
99.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdygmhwvrqapgkglewvafissgssiiyyadivkgrstisrdnaknslylqmnslraedtavyyctrgnkrgffdywgqgtlvtvss
100.seq id no：27
101.hu25g7-vl-a：
102.eivltqspatlslspgeratlscnasssvsymywyqqkpgqaprlliyltsnlasgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqwrsnppmltfgggtkveik
103.seq id no：28
104.hu25g7-vl-b：
105.eivltqspatlslspgeratlscnasssvsymywyqqkpgqaprlliyltsnlasgiparfsgsgsgtdytltisslepedfavyycqqwrsnppmltfgggtkveik
106.seq id no：29
107.hu25g7-vl-c：
108.eivltqspatlslspgeratlscnasssvsymywyqqkpgqaprpwiyltsnlasgiparfsgsgsgtdytltisslepedfavyycqqwrsnppmltfgggtkveik
109.seq id no：30
110.hu7b10-vh-a：
111.evqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewmglihpnsdttkfsenfktrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarskiittivarhwyfdvwgqgttvtvss
112.seq id no：31
113.hu7b10-vh-b：
114.evqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewmglihpnsdttkfsenfktrvt
mtidtsistaymelsrlrsddtavyycakskiittivarhwyfdvwgqgttvtvss
115.seq id no：32
116.hu7b10-vh-c：
117.evqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewmglihpnsdttkfsenfktrvtltidksistaymelsrlrsddtavyycakskiittivarhwyfdvwgqgttvtvss
118.seq id no：33
119.hu7b10-vl-a：
120.divmtqtplslsvtpgqpasisckasqsvdyggdsymnwylqkpgqppqlliyaasnlesgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycqhsnenpptfgggtkveik
121.seq id no：34
122.hu7b10-vl-b：
123.divltqtplslsvtpgqpasisckasqsvdyggdsymnwylqkpgqppqlliyaasnlesgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycqhsnenpptfgggtkveik
124.seq id no：35
125.hu7b10-vl-c：
126.divmtqtplslsvtpgqpasisckasqsvdyggdsymnwylqkpgqppqlliyaasnlesgipdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycqhsnenpptfgggtkveik
127.seq id no：36
128.在一些具体的实施方案中，重链可变区如序列seq id no：25-27之一所示，和轻链可变区如序列seq id no：28-30之一所示；
129.重链可变区如序列seq id no：31-33之一所示，和轻链可变区如序列seq id no：34-36之一所示。
130.在一些实施方案中，所述的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段包含选自人源igg1、igg2、igg3或igg4的重链恒定区或其变体。一些具体的方案中，包含人源igg1的重链恒定区或其变体。在一些实施方案中，所述的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段包含人源κ、λ链或其变体的恒定区。
131.在一些实施方案中，所述的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人源化抗体，重链序列如seq id no：17所示或与其具有至少85％序列同一性；轻链序列如seq id no：18所示或与其具有至少85％序列同一性。
132.在一些实施方案中，所述的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人源化抗体，重链序列如seq id no：19所示或与其具有至少85％序列同一性；轻链序列如seq id no：20所示或与其具有至少85％序列同一性。
133.在一些实施方案中，所述的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人源化抗体，重链序列如seq id no：44所示或与其具有至少85％序列同一性；轻链序列如seq id no：45所示或与其具有至少85％序列同一性。
134.在一些实施方案中，所述的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人源化抗体，重链序列如seq id no：44所示或与其具有至少85％序列同一性；轻链序列如seq id no：46所示或与其具有至少85％序列同一性。
135.在一些实施方案中，提供一种分离的抗il-4r抗体或其抗原结合片段，其特征在于
与如上所述的任一抗il-4r的抗体或其抗原结合片段竞争结合人il-4r或其表位。
136.在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体或多特异性抗体，其含有如上所述任一抗il-4r的抗体或其抗原结合片段轻链可变区和/或重链可变区。在另一些实施方案中，提供一种单链抗体，其含有如上所述任一抗il-4r的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和/或重链可变区。
137.在一些实施方案中，人源化抗il-4r抗体或其抗原结合片段，还包含人源igg1、igg2、igg3或igg4的重链恒定区或其变体。在至少一个实施方案中，包含的是人源igg2或igg4重链恒定区。因为igg2或igg4没有adcc毒性。在另一个实施方案中，使用氨基酸突变后无adcc(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的igg1。在至少一个实施方案中，变体包含adcc效应功能降低或缺失的重链恒定区突变，例如但不限于igg1的n297a、l234a、l235a。在一些实施方案中，igg1包含突变e239d和m241l。
138.除非另有说明，本公开的抗il-4r抗体或其抗原结合蛋白根据kabat编码。
139.在一些实施方案中，抗il-4r的抗体或其抗原结合片段的包含重链和轻链，其中重链包含：
140.(i)如seq id no：17所示或与seq id no：17具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的序列；或
141.(ii)如seq id no：19所示或与seq id no：19具有至少70％、80％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列；或
142.(iii)如seq id no：44所示或与seq id no：44具有至少70％、80％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列；
143.(iv如seq id no：47所示或与seq id no：47具有至少70％、80％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列；
144.和/或轻链包含：
145.(i)如seq id no：18所示或与seq id no：18具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的序列；或
146.(ii)如seq id no：20所示或与seq id no：20具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的序列；或
147.(iii)如seq id no：45所示或与seq id no：45具有至少90％、95％、98％或99％同一性的序列；或
148.(iv)如seq id no：46所示或与seq id no：46具有至少90％、95％、98％或99％同一性的序列。
149.hu25g7 hc
150.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdygmhwvrqapgkglewvafissgssiiyyadivkgrstisrdnaknslylqmnslraedtavyyctrgnkrgffdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytq kslslslgk
151.seq id no：17
152.hu25g7 lc
153.eivltqspatlslspgeratlscnasssvsymywyqqkpgqaprlliyltsnlasgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqwrsnppmltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
154.seq id no：18
155.hu7b10 hc
156.evqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewmglihpnsdttkfsenfktrvtmtidtsistaymelsrlrsddtavyycakskiittivarhwyfdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
157.seq id no：19
158.hu7b10 lc
159.divltqtplslsvtpgqpasisckasqsvdyggdsymnwylqkpgqppqlliyaasnlesgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycqhsnenpptfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
160.seq id no：20
161.hu25g7-igg4 hc
162.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdygmhwvrqapgkglewvafissgssiiyyadivkgrstisrdnakntlylqmnslraedtavyyctrgnkrgffdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
163.seq id no：44
164.hu25g7-a lc
165.eivltqspatlslspgeratlscrasssvpymywyqqkpgqaprlliyltsnlasgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqwrayppmltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
166.seq id no：45
167.hu25g7-b lc
168.eivltqspatlslspgeratlscraspgvpplawyqqkpgqaprlliylassrpsgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqwrsnppmltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
169.seq id no：46
170.hu25g7-24-igg1(e239d，m241l)hc
171.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdygmhwvrqapgkglewvafissgssiiyyadivkgrstisrdnakntlylqmnslraedtavyyctrgnkrgffdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
172.seq id no：47
173.在一些实施方案中，重链序列如seq id no：17所示，和轻链序列如seq id no：18所示；或
174.重链序列如seq id no：19所示，和轻链序列如seq id no：20所示；或
175.重链序列如seq id no：44所示，和轻链序列如seq id no：45所示；或
176.重链序列如seq id no：44所示，和轻链序列如seq id no：46所示；或
177.重链序列如seq id no：47所示，和轻链序列如seq id no：45所示。
178.在一些实施方案中，所述抗il-4r抗体或其抗原结合片段可以为抗体变体，所述变体在轻链有1至10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸变化，和/或重链有1至10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸变化。
179.在一些实施方案中，上述变体具有与亲本抗il-4r的抗体或其片段相同或相似的生物学功能或效果。
180.在一些实施方案中，抗原结合片段包括但不限于fab、fab’、fv、f(ab’)2、线性抗体、scfv(单链fv抗体)、串联二-scfv、串联三-scfv、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、sdab(单域抗体或纳米抗体)、sdfv、肽抗体(peptibody)、结构域抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体)、dsfv(二硫键稳定化的fv)、scdsfv(二硫键稳定化的单链fv抗体)。
181.在一些实施方案中，本公开的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物中的抗il-4r的抗体的抗原结合片段是与上述的抗il-4r的抗体的抗原结合片段结合相同的il-4r或其表位。
182.在一些实施方案中，提供编码如上所述的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，例如dna或rna。
183.在一些实施方案中，提供包含上述多核苷酸的表达载体，例如真核表达载体、原核表达载体、病毒载体。
184.在一些实施方案中，提供上述表达载体转化的宿主细胞，例如真核细胞、原核细胞。一些具体实施方案中，宿主细胞为细菌(例如大肠杆菌)、酵母菌(例如毕赤酵母)、哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞或人胚肾(hek)293细胞)。
185.在一些实施方案中，提供制备上述抗il-4r的抗体或其抗原结合片段的方法包括步骤：在如前所述的宿主细胞中表达该抗体或其抗原结合片段，并自该宿主细胞中分离该抗体或其抗原结合片段。
186.本公开中抗il-4r的抗体或其抗原结合片段中的氨基酸三字母代码和单字母代码如j.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
187.抗体-药物(依喜替康衍生物)的偶联物
188.本公开提供一种抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其如式(i)的通式(pc-l-y-d)所示：
[0189][0190]
其中：
[0191]
y选自-o-(crarb)
m-cr1r
2-c(o)-、-o-cr1r
2-(crarb)
m-、-o-cr1r
2-、-nh-(crarb)
m-cr1r
2-c(o)-和-s-(crarb)
m-cr1r
2-c(o)-；
[0192]
ra和rb相同或不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基、烷氧基、羟基、氨基、氰基、硝基、羟烷基、环烷基和杂环基；或者，ra和rb与其相连接的碳原子一起形成环烷基和杂环基；
[0193]
r1选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基和杂芳基；r2选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基和杂芳基；或者，r1和r2与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
[0194]
或者，ra和r2与其相连的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
[0195]
m为0至4的整数；
[0196]
n为1至10的小数或整数，例如n为2至8或5至9；
[0197]
l为接头单元；
[0198]
pc为前述本公开任意所述的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段。
[0199]
一些实施方案中，本公开的抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中-y-为-o-(crarb)m-cr1r
2-c(o)-；
[0200]
ra和rb相同或不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素或烷基；
[0201]
r1为c
3-6
环烷基烷基或c
3-6
环烷基、氢原子；
[0202]
r2选自氢原子、卤代烷基或c
3-6
环烷基；例如氢原子；
[0203]
或者，r1和r2与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；
[0204]
m为0或1。
[0205]
一些实施方案中，本公开的抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中结构单元-y-为-o-(ch2)m-cr1r
2-c(o)-；
[0206]
r1为c
3-6
环烷基烷基或c
3-6
环烷基、氢原子；
[0207]
r2选自氢原子、卤代烷基或c
3-6
环烷基；
[0208]
或者，r1和r2与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；
[0209]
m为0或1。
[0210]
一些实施方案中，本公开的抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中结构单元-y-为-o-(ch2)m-cr1r
2-c(o)-；
[0211]
r1为c
3-6
环烷基烷基或c
3-6
环烷基、氢原子；
[0212]
r2为氢原子；
[0213]
或者，r1和r2与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；
[0214]
m为0或1。
[0215]
一些实施方案中，本公开的抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中结构单元-y-为-o-(ch2)m-cr1r
2-c(o)-；
[0216]
r1为c
3-6
环烷基烷基或c
3-6
环烷基、氢原子；
[0217]
r2为氢原子；
[0218]
或者，r1和r2与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；
[0219]
m为0。
[0220]
一些实施方案中，本公开的抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中结构单元-y-为-o-(ch2)m-cr1r
2-c(o)-；
[0221]
r1为氢原子；
[0222]
r2为氢原子；
[0223]
或者，r1和r2与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；
[0224]
m为0。
[0225]
一些实施方案中，本公开的抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，y选自：
[0226][0227]
其中y的o端与接头单元l相连。
[0228]
一些实施方案中，本公开的抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
[0229]
另一些实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其如式(ii)的通式(pc-l-d1)所示：
[0230][0231]
其中：
[0232]
r1为氢原子、c
3-6
环烷基烷基或c
3-6
环烷基；
[0233]
r2选自氢原子、卤代烷基或c
3-6
环烷基；例如氢原子；
[0234]
或者，r1和r2与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；
[0235]
m为0或1；
[0236]
n为1至10的整数或小数，例如n为1至8或1至6的小数或整数，例如n为1-5或2-4的小数或整数。
[0237]
在一些实施方案中，n可以为1-10，例如2-8，或2-6，或1-6，或4-6之间的任意值。在一些实施方案中，n为约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、。2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.4、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、或9.9。
[0238]
在一些具体实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中n为1至8的整数或小数；例如为1至6的整数或小数。
[0239]
一些实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中接头单元-l-为-l
1-l
2-l
3-l
4-，
[0240]
l1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-w-c(o)-、-ch
2-c(o)-nr
3-w-c(o)-或-c(o)-w-c(o)-，其中w选自c
1-8
烷基、c
1-8
烷基-环烷基或1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自n、o或s的杂原子，其中所述的c
1-8
烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；
[0241]
l2选自-nr4(ch2ch2o)p1ch2ch2c(o)-、-nr4(ch2ch2o)p1ch2c(o)-、-s(ch2)p1c(o)-或化学键，其中p1为1至20的整数；
[0242]
l3为由2至7个氨基酸构成的肽残基，其中所述的氨基酸选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸中的氨基酸形成的氨基酸残基，并任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代；
[0243]
l4选自-nr5(cr6r7)
t-、-c(o)nr5、-c(o)nr5(ch2)
t-或化学键，其中t为1至6的整数；
[0244]
r3、r4和r5相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
[0245]
r6和r7相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基。
[0246]
一些实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中接头单元l1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-(ch2)s
1-c(o)-、-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch
2-环己基-c(o)-、-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-(ch2ch2o)s
2-ch2ch
2-c(o)-、-ch
2-c(o)-nr
3-(ch2)s
3-c(o)-或-c(o)-(ch2)s4c(o)-，其中s1为2至8的整数，s2为1至3的整数，s3为1至8的整数，s4为1至8的整数；例如s1为5。
[0247]
一些具体实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中接头单元l2选自-nr4(ch2ch2o)p1ch2c(o)-或化学键，p1为6至12的整数。
[0248]
一些具体实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可
接受的盐或溶剂化物，其中l4选自-nr5(cr6r7)t-，r5选自氢原子或烷基，r6和r7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基，t为1或2，例如为2；例如l4为自-nr5cr6r
7-；例如l4为-nhch
2-。
[0249]
一些具体实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中接头单元-l-为-l
1-l
2-l
3-l
4-，
[0250]
l1为s1为2至8的整数；
[0251]
l2为化学键；
[0252]
l3为四肽残基；
[0253]
l4为-nr5(cr6r7)t-，r5选自氢原子或烷基，r6和r7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基，t为1或2。
[0254]
一些具体实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中接头单元-l-为-l
1-l
2-l
3-l
4-，
[0255]
l1为-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch
2-环己基-c(o)-；
[0256]
l2为-nr4(ch2ch2o)9ch2c(o)-；
[0257]
l3为四肽残基；
[0258]
l4为-nr5(cr6r7)t-，r5选自氢原子或烷基，r6和r7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基，t为1或2。
[0259]
一些具体实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述的l3的肽残基为由一个、两个或多个选自苯丙氨酸(e)、甘氨酸(g)、缬氨酸(v)、赖氨酸(k)、瓜氨酸、丝氨酸(s)、谷氨酸(e)、天冬氨酸(n)中的氨基酸形成的氨基酸残基；例如为由一个、两个或多个选自苯丙氨酸和甘氨酸的氨基酸形成的氨基酸残基；例如为四肽残基；例如为ggfg(甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸)的四肽残基。
[0260]
一些实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述的接头单元-l-，其l1端与抗体相连，l4端与y相连。
[0261]
一些实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述-l-y-为：
[0262][0263]
l1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-(ch2)s
1-c(o)-或-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch
2-环己基-c(o)-；
[0264]
l2为-nr4(ch2ch2o)p1ch2c(o)-或化学键，p1为6至12的整数；
[0265]
l3为ggfg的四肽残基；
[0266]
r1为氢原子、环烷基烷基或环烷基；例如c
3-6
环烷基烷基或c
3-6
环烷基；
[0267]
r2选自氢原子、卤代烷基或c
3-6
环烷基；例如氢原子；
[0268]
或者，r1和r2与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；
[0269]
r5选自氢原子或烷基，r6和r7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基；
[0270]
s1为2至8的整数；例如5；
[0271]
m为0至4的整数。
[0272]
一些实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
[0273]
其中所述-l-y-为：
[0274][0275]
例如：
[0276][0277]
l2为-nr4(ch2ch2o)9ch2c(o)-；
[0278]
l3为ggfg的四肽残基；
[0279]
r1为氢原子、环烷基烷基或环烷基；例如c
3-6
环烷基烷基或c
3-6
环烷基；
[0280]
r2选自氢原子、卤代烷基或c
3-6
环烷基；例如氢原子；
[0281]
或者，r1和r2与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；
[0282]
r5选自氢原子或烷基，r6和r7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基；
[0283]
m为0至4的整数。
[0284]
一些实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述抗体-依喜替康衍生物的偶联物包含式(iii)所示的结构：
[0285][0286]
其中：
[0287]
l2为化学键；
[0288]
l3为ggfg的四肽残基；
[0289]
r1为氢原子、c
3-6
环烷基烷基或c
3-6
环烷基；
[0290]
r2选自氢原子、卤代烷基或c
3-6
环烷基；
[0291]
或者，r1和r2与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；
[0292]
r5选自氢原子或烷基，r6和r7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基；
[0293]
s1为2至8的整数；
[0294]
m为0至4的整数。
[0295]
一些实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受
的盐或溶剂化物，其中所述抗体-依喜替康衍生物的偶联物包含式(-l-y-)所示的结构：
[0296][0297]
其可用于得到经由连接片段将药物与抗体连接而成抗体-药物偶联物；
[0298]
其中：
[0299]
l1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-(ch2)s
1-c(o)-或-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch
2-环己基-c(o)-；
[0300]
l2为-nr4(ch2ch2o)p1ch2c(o)-或化学键，p1为1至20的整数；
[0301]
l3为ggfg的四肽残基；
[0302]
r1为氢原子、环烷基烷基或环烷基；例如c
3-6
环烷基烷基或c
3-6
环烷基；
[0303]
r2选自氢原子、卤代烷基或c
3-6
环烷基；例如氢原子；
[0304]
或者，r1和r2与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；
[0305]
r5、r6或r7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基；
[0306]
s1为2至8的整数；
[0307]
m为0至4的整数。
[0308]
一些实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述抗体-依喜替康衍生物的偶联物包含式(-l-y-)所示的结构：
[0309][0310]
其中：
[0311]
l2为化学键；
[0312]
l3为ggfg的四肽残基；
[0313]
r1为氢原子、环烷基烷基或环烷基；例如c
3-6
环烷基烷基或c
3-6
环烷基；
[0314]
r2选自氢原子、卤代烷基或c
3-6
环烷基；例如氢原子；
[0315]
或者，r1和r2与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；
[0316]
r5选自氢原子或烷基，r6和r7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基；
[0317]
s1为2至8的整数；
[0318]
m为0至4的整数。
[0319]
一些实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其为式(iv)的通式(pc-l
a-y-dr)所示的抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
[0320][0321]
其中：
[0322]
w选自c
1-8
烷基、c
1-8
烷基-环烷基或1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自n、o或s的杂原子，其中所述的c
1-8
烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；
[0323]
l2选自-nr4(ch2ch2o)p1ch2ch2c(o)-、-nr4(ch2ch2o)p1ch2c(o)-、-s(ch2)p1c(o)-或化学键，p1为1至20的整数；
[0324]
l3为由2至7个氨基酸构成的肽残基，其中氨基酸任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代；
[0325]
r1选自氢原子、卤素、环烷基烷基、氘代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
[0326]
r2选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
[0327]
或者，r1和r2与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
[0328]
r4和r5相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
[0329]
r6和r7相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
[0330]
m为0至4的整数；
[0331]
n为1至10的整数或小数；
[0332]
pc为本公开提供的任意抗il-4r的抗体或其抗原结合片段。
[0333]
一些实施方案中，本公开提供抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其为式(v)的通式(pc-l
b-y-dr)所示的抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
[0334][0335]
其中：
[0336]
s1为2至8的整数；例如5；
[0337]
pc、r1、r2、r5～r7、m和n如式(iv)中所定义。
[0338]
一些实施方案中，本公开多的抗体-依喜替康衍生物的偶联物的连接单元-l-y-包括，但不限于：
[0339]
[0340][0341]
一些实施方案中，本公开提供的抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物包括但不限于：
[0342]
[0343]
[0344]
[0345][0346]
其中：
[0347]
n为1至10的整数或小数；
[0348]
pc为前述本公开的任意抗il-4r的抗体或其抗原结合片段。
[0349]
本公开提供了一种制备如通式(pc-l
a-y-d)所示的抗体-依喜替康衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的方法，其包括以下步骤：
[0350][0351]
pc还原后，与通式(l
a-y-d)偶联反应，得到通式(pc-l
a-y-d)所示的化合物；
[0352]
其中，pc为本公开的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段；w、l2、l3、r1、r2、r5～r7、m和n如式(iv)中所定义。
[0353]
以上实施方式中，pc为本公开任意的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段；例如为实施例中抗il-4r的抗体或其抗原结合片段；例如为包含如seq id no：28所示的重链和如seq id no：29所示的轻链的抗体，或包含如seq id no：30所示的重链和如seq id no：31所示的轻链的抗体。
[0354]
一些具体实施方案中，本公开抗体-依喜替康衍生物的偶联物包括其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、氘代物、或其混合物形式。
[0355]
此处全文引入wo2020063673中化合物及其制备方法。
[0356]
抗体-药物(艾日布林或其衍生物)偶联物
[0357]
本公开提供一种抗体-艾日布林或其衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其如式(vi)的通式pc-(l-d)k所示：
[0358]
其中，抗体为pc，所述pc为本公开任意的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段，
[0359]
式(vi)中，l为将pc共价附接于d的连接子，且k为1至20(包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或任意两数值之间任意数值)，
[0360]-d如下式(vi)所示：
[0361][0362]
其中r
1a
选自氢、烷基(如c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、环烷基(如c
3-8
环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、芳基和杂芳基，所述的烷基、环烷基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自烷基(如c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如c
1-6
烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，例如甲基；r
1b
选自氢、烷基(如c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基、环烷基(如c
3-8
环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、芳基和杂芳基，所述的烷基、环烷基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自烷基(如c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如c
1-6
烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，例如氢；或者r
1a
与r
1b
与其相连接的原子一起形成c
5-8
杂环烷基，所述杂烷基任选被烷基(如c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如c
1-6
烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基(如c
3-8
环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，且r
1a
和r
1b
不同时为氢。
[0363]
一些实施方案中，抗体-艾日布林或其衍生物的偶联物中-d中r
1a
选自甲基。
[0364]
一些实施方案中，抗体-艾日布林或其衍生物的偶联物中-d为
甘氨酸-赖氨酸(gly-gly-lys)、缬氨酸-赖氨酸(val-lys)、缬氨酸-丙氨酸(val-ala)、缬氨酸-苯丙氨酸(val-phe)或甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(gly-gly-phe-gly)。
[0373]
在一些实施方案中，本公开抗体-艾日布林或其衍生物中包括氨基酸单元的连接子选自：
[0374]
[0375][0376]
在一些实施方案中，氨基酸单元包含缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)。在一些实施方案中，相对于包含替代氨基酸单元或替代可裂解部分的adc，包含val-cit的adc显示增加的稳定性，减少的脱靶细胞杀死，增加的靶向细胞杀死，较低的聚集水平，和/或较高的药物负载。
[0377]
另一方面，一些实施方案提供的连接子包含可裂解磺酰胺部分，所述连接子在还原条件下能够裂解。
[0378]
在一些实施方案中，所述连接子包含可裂解二硫化物部分，所述连接子在还原条件下能够裂解。
[0379]
另一方面，本公开抗体偶联物中连接子包含至少一种将艾日布林衍生物d附接于可裂解部分的间隔单元。在一些实施方案中，所述连接子包含附接于d的间隔单元。
[0380]
在一些实施方案中，所述间隔单元包含对氨基苯甲氧基羰基(pab)，
[0381][0382]
在一些实施方案中，所述间隔单元包含：
[0383][0384]
其中，z1～z5任选自碳原子或氮原子；r
14
选自烷基、环烷基、芳基和杂芳基，所述的烷基、环烷基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自烷基、烷氧基、卤素、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代；r
11
和r
12
各自独立选自氢、氘、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基，例如氢；或者，r
11
与r
12
与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；x选自-o-或-nh-；l选自1-4之间整数；
[0385]
q为v-e，v-e提供了可被位于胞内的糖苷酶切割的糖苷键，e选自-o-、-s-或-nr
13-，r
13
选自氢或甲基，进一步地，v选自其中r
15
选自-cooh或ch2oh。在一些实施方案中，v选自-cooh。
[0386]
在一些实施方案中，所述间隔单元包含：
[0387][0388]
在一些实施方案中，所述间隔单元选自以下部分：
[0389]-(crarb)
m1-o(crarb)
m2-cr8r
9-c(o)-，
[0390]-(crarb)
m1
nh-(crarb)
m2-cr8r
9-c(o)-，
[0391]-(crarb)
m1
o-cr8r9(crarb)
m2-，
[0392]-(crarb)
m1
ocr8r
9-c(o)-，
[0393]-(crarb)
m1-o-(crarb)
m2
c(o)-或-(crarb)
m1-s-(crarb)
m2-cr8r
9-c(o)-，
[0394]
其中ra和rb相同或不同，且各自独立地选自氢、氘原子、卤素或烷基；r8选自氢、c
3-6
环烷基烷基或c
3-6
环烷基；r9选自氢、卤代烷基或c
3-6
环烷基，例如氢；或者，r8和r9与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；m1和m2各自独立选自0、1、2或3。
[0395]
在一些实施方案中，所述间隔单元选自：
[0396]-(ch2)
3-c(o)-、-ch
2-o-ch
2-c(o)-、-(ch2)
2-o-ch
2-c(o)-、、
[0397]
另一方面，本公开抗体-艾日布林或其衍生物中l-d是由下式表示的化学部分：
[0398]-str-(pep)-sp-d
[0399]
str是与pc共价连接的伸展基单元，
[0400]
sp为间隔单元，
[0401]
pep选自氨基酸单元、二硫化物部分、磺酰胺部分或以下非肽化学部分：
[0402]
其中，w是-nh-杂环烷基-或杂环烷基；y是杂芳基、芳基、-c(o)c
1-6
亚烷基、c
2-6
烯基、c
1-6
亚烷基或-c
1-6
亚烷基-nh-；每个r2独立选自c
1-10
烷基、c
2-10
烯基、(c
1-10
烷基)nhc(nh)nh2或(c
1-10
烷基)nhc(o)nh2；r3和r4各自独立为h、c
1-10
烷基、c
2-10
烯基、芳基烷基、杂芳基烷基，或r3和r4一起可形成c
3-7
环烷基；r5和r6各自独立为c
1-10
烷基、c
2-10
烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、(c
1-10
烷基)och
2-，或r5和r6一起可形成c
3-7
环烷基环。
[0403]
在一些实施方案中，所述抗体-艾日布林或其衍生物中y选自以下部分：
[0404][0405]
另一方面，所述抗体-艾日布林或其衍生物中str选自下式表示的化学部分：
[0406]
其中r7选自-w1-c(o)-、-c(o)-w1-c(o)-、(ch2ch2o)
p1
c(o)-、(ch2ch2o)
p1
ch2c(o)-、(ch2ch2o)
p1
ch2ch2c(o)-，其中w1选自c
1-8
亚烷基、c
1-8
亚烷基-环烷基或1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自n、o或s的杂原子，其中所述的c
1-8
烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、氘、羟基、氰基、氨基、烷基、卤代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；
[0407]
l1选自-nr
10
(ch2ch2o)
p1
ch2ch2c(o)-、-nr
10
(ch2ch2o)
p1
ch2c(o)-、-s(ch2)
p1
c(o)-、-(ch2)
p1
c(o)-或化学键，其中p1为1至20的整数，例如化学键；p1为1至20的整数，r
10
选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基。
[0408]
在一些实施方案中，c
1-8
亚烷基-环烷基选自亚甲基-环已基亚乙
基-环已烷基亚甲基-环戊基
[0409]
在一些实施方案中，连接子可以包含至少一种聚乙二醇(peg)部分。peg部分可以例如包含-(peg)
p1-，其中p1为整数1至20，例如(peg)2；(peg)4；
[0410]
(peg)5。
[0411]
在一些实施方案中，连接子中的间隔子单元包含(peg)2。在一些实施方案中，尽管连接子长度较短，但相对于包含较长间隔子单元(例如(peg)8)的adc，包含较短间隔子单元(例如(peg)2)的adc显示较低的聚集水平和/或较高的药物负载。
[0412]
在一些实施方案中，所述抗体-艾日布林或其衍生物中str中r7选自c
1-6
亚烷基c(o)-、-(ch
2-ch2o)2c(o)-、-(ch
2-ch2o)2ch2c(o)-、-(ch
2-ch2o)2ch2ch2c(o)-、-(ch
2-ch2o)3c(o)-和-(ch
2-ch2o)4c(o)-。
[0413]
在一些实施方案中，所述抗体-艾日布林或其衍生物中连接子l包含：顺丁烯二酰亚胺-(peg)
2-val-cit、顺丁烯二酰亚胺-(peg)
6-val-cit、顺丁烯二酰亚胺-(peg)
8-val-cit、顺丁烯二酰亚胺-(peg)
4-ch2ch2c(o)-val-lys、顺丁烯二酰亚胺-(ch2)
5-val-cit、顺丁烯二酰亚胺-(ch2)
5-val-lys、顺丁烯二酰亚胺-(ch2)
5-gly-gly-phe-gly、顺丁烯二酰亚胺-(peg)
2-ala-ala-asn、顺丁烯二酰亚胺-(peg)
6-ala-ala-asn、顺丁烯二酰亚胺-(peg)
8-ala-ala-asn、顺丁烯二酰亚胺-(peg)
4-三唑-(peg)
3-磺酰胺、顺丁烯二酰亚胺-(peg)
2-ch2ch2c(o)-val-lys、顺丁烯二酰亚胺-(peg)
4-三唑-(peg)
3-磺酰胺或mal-(peg)
4-三唑-(peg)
3-二硫化物。
[0414]
另一方面，一些实施方案提供所述抗体-艾日布林或其衍生物中str选自下式表示的化学部分：
[0415]
其中r8选自c
1-10
亚烷基、c
2-10
烯基、(c
1-10
亚烷基)o-、n(rd)-(c
2-6
亚烷基)-n(rd)和n(rd)-(c
2-6
亚烷基)；且每个rd独立为h或c
1-c6烷基。
[0416]
在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物中l-d由选自以下的式表示：
[0417]
其中r2是c
1-c6烷基、(c
1-c6烷基)nhc(nh)nh2或(c
1-c6烷基)nhc(o)nh2；
[0418]
其中r2是c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、(c
1-c6烷基)
nhc(nh)nh2或(c
1-c6烷；
[0419]
其中r2是c
1-c6烷基、(c
1-c6烷基)nhc(nh)nh2或(c
1-c6烷基)nhc(o)nh2；且r4和r5一起形成c
3-c7环烷基环。
[0420]
在另一些实施方案中，本公开抗体-艾日布林或其衍生物由下式表示：
[0421]
其中r2选自c
1-c6烷基-nh2、(c
1-c6烷基)nhc(nh)nh2或(c
1-c6烷基)nhc(o)nh2，k选自1至10的整数或小数；p2选自2-6之间整数；
[0422]
其中r2是c
1-c6烷基-nh2、(c
1-c6烷基)nhc(nh)nh2或(c
1-c6烷基)nhc(o)nh2，且r5和r6形成c
3-c7环烷基环，k选自1至10的整数或小数；p2选自2-6之间整数。
[0423]
另一方面，一些实施方案提供的抗体-艾日布林或其衍生物由下式表示：
[0424]
其中r8选自氢、c
3-6
环烷基烷基或c
3-6
环烷基，例如氢；r9选自氢、卤代烷基或c
3-6
环烷基，例如氢；或者，r8和r9与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；k选自1至10的整数或小数；p2选自2-6之间整数；
[0425]
其中r8选自氢、c
3-6
环烷基烷基或c
3-6
环烷基，例如氢；r9选自氢、卤代烷基或c
3-6
环烷基，例如氢；或者，r8和r9与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；且k选自1至10的整数或小数；p1选自2、4、6或8；p3选自0、1或2；
[0426]
k选自1至10的整数或小数；p2选自2-6之间整数；
[0427]
k选自1至10的整数或小数；p1选自2、4、6或8；p3选自0、1或2；
[0428]
k选自1至10的整数或小数；p1选自2、4、6或8；
[0429]
k选自1至10的整数或小数；p1选自2、4、6或8；p3选自0、1或2；
[0430]
k选自1至10的整数或小数；p1选自2、4、6或8；
[0431]
k选自1至10的整数或小数；p1选自2、4、6或8；p3选自0、1或2；
[0432]
k选自1至10的整数或小数；p2选自2、4、6或8；
[0433]
k选自1至10的整数或小数；p2选自2、4、6或8；
[0434]
k选自1至10的整数或小数；p2选自2、4、6或8；
[0435]
k选自1至10的整数或小数；p2选自2、4、6或8；
[0436]
k选自1至10的整数或小数；p2选自2、4、6或8；
[0437]
k选自1至10的整数或小数；p1选自2、4、6或8；p3选自0、1或2；
[0438]
k选自1至10的整数或小数；p1选自2、4、6或8；p3选自0、1或2；
[0439]
其中r8选自氢、卤代烷基或c
3-6
环烷基，例如氢；r9选自氢、卤代烷基或c
3-6
环烷基，例如氢；或者，r8和r9与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；k选自1至10的整数或小数；p2选自2-6之间整数；
[0440]
其中r8选自氢、卤代烷基或c
3-6
环烷基，例如氢；r9选自氢、卤代烷基或c
3-6
环烷基，例如氢；或者，r8和r9与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；k选自1至10的整数或小数；p2选自2-6之间整数；
[0441]
其中r8选自氢、卤代烷基或c
3-6
环烷基，例如氢；r9选自氢、卤代烷基或c
3-6
环烷基，例如氢；或者，r8和r9与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；且k选自1至10的整数或小数；p1选自2、4、6或8；p3选自0、1或2；
[0442]
其中r8选自氢、卤代烷基或c
3-6
环烷基，例如氢；r9选自氢、卤代烷基或c
3-6
环烷基，例如氢；或者，r8和r9与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；且k选自1至10的整数或小数；p1选自2、4、6或8；p3选自0、1或2。
[0443]
在一些所述方案中，所述的抗体-艾日布林及其衍生物，由下式表示：
[0444]
[0445]
[0446]
[0447][0448]
其中k选自1至10的整数或小数；进一步地，d中r
1a
例如自甲基，r
1b
例如自氢。
[0449]
本公开还提供了式d(eribulin)所示化合物，
[0450]
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、氘代物、或其混合物形式，或其可药用的盐，
[0451]
其中，r
1a
选自氢、烷基(如c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、环烷基(如c
3-8
环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、芳基和杂芳基，所述的烷基、环烷基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自烷基(如c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如c
1-6
烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，例如甲基；r
1b
选自氢、烷基(如c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基、环烷基(如c
3-8
环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、芳基和杂芳基，所述的烷基、环烷基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自烷基(如c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如c
1-6
烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，例如氢、甲基；或者r
1a
与r
1b
与其相连接的碳原子一起形成c
5-8
杂环烷基，所述杂烷基任选被烷基(如c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如c
1-6
烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基(如c
3-8
环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，且r
1a
和r
1b
不同时为氢。
[0452]
在一些实施方案中，式d(eribulin)所示化合物中r
1a
与r
1b
各自独立选自c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基。
[0453]
在一些实施方案中，式d(eribulin)所示化合物中r
1a
选自c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基；r
1b
选自氢。
[0454]
在一些实施方案中，式d(eribulin)所示化合物中r
1a
与r
1b
与其相连接的碳原子一起形成c
6-8
杂环烷基。
[0455]
在一些实施方案中，式d(eribulin)所示化合物为：
[0456][0457]
在一些实施方案中，式d(eribulin)所示化合物为：
[0458][0459]
在一些实施方案中，式d(eribulin)所示化合物为：
[0460][0461]
本公开还提供式dz(eribulin)所示化合物，
[0462]
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，
[0463]
其中，r
1a
选自氢、烷基(如c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、环烷基(如c3-8
环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、芳基和杂芳基，所述的烷基、环烷基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自烷基(如c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如c
1-6
烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，例如甲基；r
1b
选自氢、烷基(如c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、环烷基(如c
3-8
环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、烷氧基、芳基和杂芳基，所述的烷基、环烷基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自烷基(如c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如c
1-6
烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，例如氢；或者r
1a
与r
1b
与其相连接的碳原子一起形成c
5-8
杂环烷基，所述杂烷基任选被烷基(如c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如c
1-6
烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基(如c
3-8
环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代；且r
1a
和r
1b
不同时为氢；
[0464]
y选自-o(crarb)
m2-cr8r
9-c(o)-、-nh-(crarb)
m2-cr8r
9-c(o)-、-o-cr8r9(crarb)
m2-、-ocr8r
9-c(o)-、-o(crarb)
m2
c(o)-或-s-(crarb)
m2-cr8r
9-c(o)-，其中ra和rb相同或不同，且各自独立地选自氢、氘原子、卤素或烷基；r8选自氢、c
3-6
环烷基烷基或c
3-6
环烷基；r9选自氢、卤代烷基或c
3-6
环烷基，例如氢；或者，r8和r9与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；m2选自0、1、2或3。
[0465]
在一些实施方案中，式dz(eribulin)所示化合物中r
1a
与r
1b
各自独立选自c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基。
[0466]
在一些实施方案中，式dz(eribulin)所示化合物中r
1a
选自c
1-6
烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基；r
1b
选自氢。
[0467]
在一些实施方案中，式dz(eribulin)所示化合物中r
1a
与r
1b
与其相连接的碳原子一起形成c
6-8
杂环烷基。
[0468]
在一些实施方案中，dz(eribulin)所示化合物为：
[0469]
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，
[0470]
其中：r8选自氢、c
3-6
环烷基烷基或c
3-6
环烷基；r9选自氢、卤代烷基或c
3-6
环烷基，例如氢；或者，r8和r9与其相连接的碳原子一起形成c
3-6
环烷基；m2选自0、1、2或3。
[0471]
在一些实施方案中，dz(eribulin)所示化合物选自：
[0472][0473]
另一方面，一些实施方案提供的dz(eribulin)所示化合物可以含有一个或多个不对称中心，如可以为
[0474][0475]
以上实施方式中，pc为本公开任意的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段；例如为实施例中的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段；例如为包含如seq id no：28所示的重链和如seq id no：29所示的轻链的抗体，或包含如seq id no：30所示的重链和如seq id no：31所示的轻链的抗体。
[0476]
一些具体实施方案中，本公开的抗体-艾日布林或其衍生物的偶联物包括其互变
异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、氘代物、或其混合物形式。
[0477]
此处全文引入cn202010073671.6中化合物及其制备方法。
[0478]
抗体-药物(mmae或其衍生物)的偶联物
[0479]
本公开提供一种新的mmae类似物/衍生物，其为如通式(d(mmae))所示的化合物：
[0480][0481]
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，其中：
[0482]r1-r6选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；
[0483]
r7选自氢原子、烷基、烷氧基和环烷基；
[0484]r8-r
11
之中的任意两个形成环烷基，余下的两个基团任选自氢原子、烷基和环烷基；
[0485]r12
选自氢原子或烷基；
[0486]r13-r
15
选自氢原子、羟基、烷基、烷氧基或卤素；
[0487]r16
选自芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选进一步被选自氢原子、卤素、羟基、烷基、烷氧基和环烷基的取代基所取代。
[0488]
在本公开的一些实施方案中，所述的通式(d(mmae))所示的化合物，其为通式(d(mmae)1)所示的化合物：
[0489][0490]
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，
[0491]
r9与r
10
形成环烷基；
[0492]r2-r8，r
11-r
16
如通式(d)中所定义。
[0493]
在本公开的一些实施方案中，所述的通式(d(mmae))所示的化合物，其为：
[0494][0495]
本公开的另一方面涉及一种抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述抗体-药物偶联物包含式(-d(mmae))所示的结构：
[0496][0497]
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，其中：
[0498]r2-r6选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；
[0499]
r7选自氢原子、烷基、烷氧基和环烷基；
[0500]r8-r
11
之中的任意两个形成环烷基，余下的两个基团任选自氢原子、烷基和环烷基；
[0501]r12
选自氢原子或烷基；
[0502]r13-r
15
选自氢原子、羟基、烷基、烷氧基或卤素；
[0503]r16
选自芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选进一步被选自氢原子、卤素、羟基、烷基、烷氧基和环烷基的取代基所取代；
[0504]
波浪线表示氢原子，或与接头单元或与结合靶细胞所表达抗原的抗体共价连接。
[0505]
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体-mmae或其衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述抗体-药物偶联物包含式(-d(mmae)1)所示的结构：
[0506][0507]
其中：
[0508]
r9与r
10
形成环烷基；
[0509]
波浪线，r
2-r8，r
11-r
16
如通式(d(mmae))中所定义。
[0510]
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体-mmae或其衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述抗体-mmae或其衍生物的偶联物包含式如下所示的结构：
[0511][0512]
波浪线表示氢原子，或与接头单元或与结合靶细胞所表达抗原的抗体共价连接。
[0513]
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体-mmae或其衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其为通式(pc-l-d(mmae))所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
[0514][0515]
其中：
[0516]r2-r
16
如通式(d(mmae))中所定义；
[0517]
n为1至10的整数或小数；
[0518]
pc为本公开的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段；l为接头单元。
[0519]
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体-mmae或其衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其为通式(pc-l-d1)所示的抗体-mmae或其衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
[0520][0521]
其中：
[0522]r2-r
16
如通式(-d(mmae))中所定义；
[0523]
pc，l，n如通式(pc-l-d(mmae))中所定义。
[0524]
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体-mmae或其衍生物的偶联物或其药学上
可接受的盐或溶剂化物，其为通式下所示的抗体-mmae或其衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
[0525][0526]
pc，l，n如通式(pc-l-d(mmae))中所定义。
[0527]
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体-mmae或其衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中n为1至8的整数或小数；例如为1至6的整数或小数。
[0528]
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体-mmae或其衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中接头单元-l-为-y-l
1-l
2-l
3-l4，
[0529]
y为拉伸单元，选自或化学健，x1选自氢原子、烷基，烷氧基，芳基或卤素，x2选自亚烷基，所述的亚烷基任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；
[0530]
l1为拉伸单元，选自-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-w-c(o)-、-ch
2-c(o)-nr
17-w-c(o)-或-c(o)-w-c(o)-，其中w选自c
1-8
烷基、c
1-8
烷基-环烷基或1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自n、o或s的杂原子，其中所述的c
1-8
烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；
[0531]
l2选自-nr
18
(ch2ch2o)p1ch2ch2c(o)-、-nr
18
(ch2ch2o)p1ch2c(o)-、-s(ch2)p1c(o)-或化学键，其中p1为1至20的整数；例如为化学键；
[0532]
l3为由2至7个氨基酸构成的肽残基，所述的氨基酸例如自缬氨酸、瓜氨酸，甲基缬氨酸；其中氨基酸任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代；
[0533]r17
和r
18
相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
[0534]
l4为延伸单元，例如为pab。
[0535]
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体-mmae或其衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中y为选自
[0536]
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体-mmae或其衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中l1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-(ch2)s
1-c(o)-，其中s1为2至8的整数；例如为
[0537]
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体-mmae或其衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中l3为二肽氨基酸单元，例如自缬氨酸-瓜氨酸。
[0538]
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体-mmae或其衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中接头单元-l-选自：
[0539][0540]
其中a端连着抗体，b端连着药物。
[0541]
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体-mmae或其衍生物的偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其选自以下结构式：
[0542][0543]
其中：
[0544]
n为1至10的整数或小数；
[0545]
pc为本公开的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段；例如为实施例中的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段，例如为包含如seq id no：17所示的重链和如seq id no：18所示的轻
链的抗体，或包含如seq id no：47所示的重链和如seq id no：45所示的轻链的抗体。
[0546]
本公开的另一方面涉及一种制备如通式(d(mmae))所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐的方法，其包括以下步骤：
[0547][0548]
通式(da(mmae))脱保护反应，得到通式(d(mmae))所示的化合物，
[0549]
其中：r
2-r
16
如通式(d)中所定义。
[0550]
本公开的另一方面涉及一种如下所示的化合物：
[0551][0552]
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，可做为制备本公开抗体-药物偶联物的中间体。
[0553]
本公开的另一方面涉及一种制备化合物2(mmae)或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐的方法，其包括以下步骤：
[0554][0555]
化合物1(mmae)和化合物2a(mmae)进行缩合反应，得到化合物2(mmae)。
[0556]
本公开的另一方面涉及一种制备如通式(pc-l-d(mmae))所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的方法，其包括以下步骤：
[0557][0558]
还原pc后，与化合物偶联反应，得到通式(adc(mmae)-1)所示的化合物；
[0559]
其中，pc、n如通式(pc-l-d(mmae))中所定义。
[0560]
为了完成本公开的mmae及其衍射物合成目的，本公开采用如下的合成技术方案：
[0561]
方案一：
[0562]
本公开通式(d(mmae))所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐的方法，其包括以下步骤：
[0563][0564]
通式(da(mmae))在碱性条件下进行脱保护反应，得到通式(d(mmae))所示的化合物，
[0565]
其中：r
2-r
16
如通式(d(mmae))中所定义。
[0566]
提供碱性条件的试剂包括有机碱和无机碱类，所述的有机碱类包括但不限于三乙胺、二乙胺、n-甲基吗啉、吡啶、六氢吡啶、n,n-二异丙基乙胺、正丁基锂、二异丙基氨基锂、醋酸钾、叔丁醇钠或叔丁醇钾，所述的无机碱类包括但不限于氢化钠、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化锂；例如二乙胺。
[0567]
方案二：
[0568]
本公开的化合物2(mmae)或其可药用盐或溶剂合物的制备方法，该方法包括：
[0569][0570]
化合物(1(mmae))和化合物(2a(mmae))在碱性条件下，加入缩合剂，进行缩合反
应，得到化合物2。
[0571]
提供碱性条件的试剂包括有机碱和无机碱类，所述的有机碱类包括但不限于三乙胺、二乙胺、n-甲基吗啉、吡啶、六氢吡啶、n,n-二异丙基乙胺、正丁基锂、二异丙基氨基锂、醋酸钾、叔丁醇钠或叔丁醇钾，所述的无机碱类包括但不限于氢化钠、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化锂，例如n,n-二异丙基乙胺。
[0572]
缩合剂选自4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐、1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n,n'-二环己基碳化二亚胺、n,n'-二异丙基碳二酰亚胺、o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，例如4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐或1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，例如1-羟基苯并三唑。
[0573]
方案三：
[0574]
本公开通式(pc-l-d)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的方法，其包括以下步骤：
[0575][0576]
还原pc后，与化合物2(mmae)偶联反应，得到通式(adc(mmae)-1)所示的化合物；还原剂例如tcep，特别地，例如还原抗体上的二硫键；
[0577]
其中，pc、n如通式(pc-l-d(mmae))中所定义。
[0578]
实施例化合物
[0579]
本公开提供配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，选自：
[0580][0581]
[0582]
其中，pc为本公开任意抗il-4r的抗体或其抗原结合片段，n为1至10的整数或小数。
[0583]
一些具体实施方案中，pc为本公开实施例中的抗il-4r的抗体或其抗原结合片段，例如为包含如seq id no：17所示的重链和如seq id no：18所示的轻链的抗体，或包含如seq id no：47所示的重链和如seq id no：45所示的轻链的抗体，n为1至6之间的整数或小数。
[0584]
在一些实施方案中，药物是一个或多个小分子细胞毒剂。细胞毒剂，又称细胞毒性药物，是指能在肿瘤细胞内具有较强破坏其正常生长的化学分子。细胞毒剂的实例包括但不限于毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素；生物碱类，例如紫杉醇、长春瑞宾、多西他塞、喜树碱类；代谢类，例如吉西他宾、阿糖胞苷、替加氟、甲氨蝶呤；抗生素类，例如表柔比星、吡柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌；烷化剂类，例如异环磷酰胺、达卡巴嗪；铂剂类，例如顺铂、奥沙利铂；放射性同位素(例如at
211
、i
131
、i
125
、y
90
、re
186
、re
188
、sm
153
、bi
212
、p
32
和lu的放射性同位素)；核溶酶。
[0585]
药物组合物
[0586]
本公开进一步提供一种药物组合物，其活性成分含有如上所述的抗il-4r抗体或其抗原结合片段的药物偶联物，或化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其用作药物。
[0587]
本公开的药物组合物除活性成分外，可含有一种或多种可药用的赋形剂、稀释剂或载体(vehicle)。药物组合物可含有0.1至99重量％的活性成分。
[0588]
本公开进一步提供选自以下的任一项或组合在制备药物中的用途：根据本公开的抗il-4r抗体或其抗原结合片段、抗il-4r抗体或其抗原结合片段的抗体-药物偶联物、根据本公开的药物组合物；其中，所述抗体或其抗原结合片段或其药物偶联物用于治疗和/或预防增殖性疾病或延缓增殖性疾病进展；所述增殖性病症可以是癌症或肿瘤；例如其中所述的癌症或肿瘤为与il-4r表达相关的癌症或肿瘤。所述癌症或肿瘤选自前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或复发性间变性大细胞淋巴瘤)、肺癌、肾癌、肝癌(例如，小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、结直肠癌、胰腺癌、胃癌、白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)和脑癌、中枢神经系统肿瘤。
[0589]
在一些实施方案中，所述中枢神经系统肿瘤包括神经胶质瘤、神经胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质瘤、血管瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、成年母细胞瘤。
[0590]
在一些实施方案中，所述中枢神经系统肿瘤是神经胶质母细胞瘤。
[0591]
在一些实施方案中，所述神经胶质母细胞瘤是复发性或难治性胶质母细胞瘤。
[0592]
在一些实施方案中，所述神经胶质母细胞瘤中o6-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移酶(o6-methylguanine-dna methyhransferase,mgmt)表达为阳性或阴性。
[0593]
本公开治疗和/或预防中所用化合物(如本公开的抗体-药物偶联物或组合物)的剂量通常将随疾病的严重性、受试者的体重和化合物的相对功效而改变。作为一般性指导，合适的单位剂量可以是0.1mg至1000mg。
[0594]
如本领域技术人员所熟知的，药物的给药剂量依赖于多种因素，包括但并非限定
于以下因素：所用具体化合物的活性、受试者的年龄、受试者的体重、受试者的健康状况、受试者的行为、受试者的饮食、给药时间、给药方式、排泄的速率、药物的组合等，可以根据公知的治疗方案来验证。
附图说明：
[0595]
图1.示例性抗体药物偶联物25g7-c1(抗il-4r抗体25g7+依喜替康类似物)的结构示意图。
[0596]
图2.流式细胞法检测神经胶质母细胞瘤(gbm)细胞系il-4r表达水平。利用慢病毒系统构建人源il-4r稳转ln229、u251、u87脑胶质瘤细胞株，用流式细胞法检测il-4r过表达水平，对照为未转染人源il-4r构建体的相应细胞。
[0597]
图3. 25g7-c1对ln229-il4r、u251-il4r以及对照神经胶质瘤细胞的体外细胞毒性检测结果。
[0598]
图4.不同dar值的(dar3.52、dar5.86)25g7-c1在hek293-il4r(过表达il4r的hek293细胞)以及对照细胞的体外细胞毒性检测结果。
[0599]
图5. 25g7-c1在u87-mg皮下接种的裸鼠肿瘤模型中体内药效比较结果。给药剂量为1、3mpk(i.t.)或1mpk静脉给药(i.v.)。
[0600]
图6. 25g7-c1在ln229-il4r(过表达il-4r的ln229细胞)皮下接种裸鼠肿瘤模型中的体内药效比较结果。给药剂量为1、3mpk(i.t.)或1mpk静脉给药(i.v.)。
[0601]
发明详述
[0602]
术语
[0603]
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
[0604]
本公开将专利文本wo2020/038454a1的内容全部引入本公开。
[0605]“人il4r”(hil-4r)意指与白细胞介素-4(il-4)、il-4rα特异性结合的人细胞因子受体。hil-4r旨在涵盖il-4r在体内各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于il-4r基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如前体il-4r、成熟il-4r、天然存在的il-4r剪接变体、修饰的il-4r、或其片段。
[0606]“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即igm，igd，igg，iga和ige，其相应的重链分别为μ链，δ链，γ链，α链和ε链。同一类ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如igg可分为igg1，igg2，igg3，igg4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类ig中每类ig都可以有κ链或λ链。
[0607]
抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链轻链恒定区或其变体。
[0608]
抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的igg1，igg2，igg3，igg4重链恒定区或其变体。
[0609]
抗体重链和轻链靠近n端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(v区)；靠近
c端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(c区)。可变区包括3个高变区(hvr)和4个序列相对保守的骨架区(fr)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(cdr)。每条轻链可变区(lcvr)和重链可变区(hcvr)由3个cdr区4个fr区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。轻链的3个cdr区指轻链互补决定区1(lcdr1)，轻链互补决定区2(lcdr2)，和轻链互补决定区3(lcdr3)；重链的3个cdr区指重链互补决定区1(hcdr1)，重链互补决定区2(hcdr2)和重链互补决定区3(hcdr3)。
[0610]
抗体包括鼠源抗体，嵌合抗体，人源化抗体，全人抗体，其可以是重组获得的，例如可以是亲和力成熟得到的重组全人抗体。
[0611]“重组全人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创建或分离的全人抗体，所涉及的技术和方法在本领域中是熟知的，诸如(1)从人免疫球蛋白基因的转基因、转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；(2)从经转化以表达抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体；(3)从重组组合人抗体文库中分离的抗体；以及(4)通过将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他dna序列等方法制备、表达、创建或分离的抗体。此类重组人抗体包含可变区和恒定区，这些区域利用特定的由种系基因编码的人种系免疫球蛋白序列，但也包括随后诸如在抗体成熟过程中发生的重排和突变。
[0612]
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(escherichia coli)或沙门氏菌(salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)；肺炎球菌(pneumococcus)；链球菌(streptococcus)和流感嗜血菌(haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括cho(中国仓鼠卵巢细胞系)和ns0细胞。
[0613]“鼠源抗体”在本文中为根据本领域知识和技能制备的对人il-4r的单克隆抗体。制备时用il-4r抗原(或包含表位的多肽)注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在一些实施方案中，所述的鼠源结合人il-4r的抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源igg1，igg2，igg3或igg4或其变体的重链恒定区。
[0614]“全人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本文的全人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。然而，术语“全人抗体”不包括这样的抗体，即其中已将衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的cdr序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗体”)。
[0615]“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为cdr移植抗体(cdr-grafted antibody)，是指将非人cdr序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量异源蛋白成分，从而诱导的强烈的免疫应答反应。为避免在免疫原性下降的同时引起活性的下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。
[0616]“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要据需要克隆
人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。人抗体的恒定区可选自人源igg1，igg2，igg3或igg4或其变体的重链恒定区，例如包含人源igg2或igg4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无adcc(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的igg1。
[0617]“抗原结合片段”指具有抗原结合活性的fab片段，fab’片段，f(ab’)2片段，与人il-4r结合的fv片段、scfv片段，以及，包含所述片段的多肽或蛋白。所述“抗原结合片段”包含本文所述抗体的一个或多个cdr区。fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，fv抗体还包含在vh和vl结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链fv(scfv)。
[0618]
术语“单链抗体”、“单链fv”或“scfv”意指包含通过接头(或连接肽)连接的抗体重链可变结构域(或区域；vh)和抗体轻链可变结构域(或区域；vl)的分子。此类scfv分子可具有一般结构：nh2-vl-接头-vh-cooh或nh2-vh-接头-vl-cooh。合适的现有技术接头由重复的ggggs氨基酸序列或其变体组成，例如包含1-4个重复的变体(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)。可用于本公开的其他接头由alfthan等人(1995)，protein eng.8:725-731，choi等人(2001)，eur.j.immuno l.31:94-106，hu等人(1996)，cancer res.56:3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41-56和roovers等人(2001)，cancer immunol.描述。
[0619]
术语“抗体框架”，是指可变结构域vl或vh的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(cdr)的支架。从本质上讲，其是不具有cdr的可变结构域。
[0620]“与il-4r结合”，指能与人il-4r(或其表位、片段)相互作用。本文的术语“抗原结合位点”指由本文抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
[0621]“表位”是指抗原上与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸形成、或不相邻的氨基酸通过蛋白质的三级折叠而形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3-15个氨基酸。确定什么表位由给定的抗体结合的方法在本领域中是熟知的，包括免疫印迹和免疫沉淀检测分析等。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文所述的技术，例如x射线晶体分析法和二维核磁共振等。
[0622]“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体与预定的抗原上的表位结合。通常，当使用重组人il-4r作为分析物并使用抗体作为抗体，在仪器中通过表面等离子体共振(spr)技术测定时，抗体以大约低于10-7
m或甚至更小的平衡解离常数(kd)与预定的抗原结合，并且其与预定抗原结合的亲和力是其与预定抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(如bsa等)结合的亲和力的至少两倍。术语“识别抗原的抗体”在本文中可以与术语“特异性结合的抗体”互换使用。
[0623]“交叉反应”是指本文的抗体与来自不同物种的il-4r结合的能力。例如，结合人il-4r的本文的抗体也可以结合另一物种的il-4r。交叉反应性是通过在结合测定(例如spr和elisa)中检测与纯化抗原的特异性反应性，或与生理表达il-4r的细胞的结合或功能性相互作用来测量。确定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如表面等离
子体共振(spr)分析，或流式细胞术。
[0624]“中和”或“阻断”抗体意指其与hil-4r的结合造成对hil-4和/或hil-13生物活性抑制的抗体。这种hil-4和/或il-13生物活性的抑制可通过测量本领域众所周知的一个或多个hil-4/或hil-13生物活性指标，如hll-4/或hil-13诱导的细胞活化和hil-4与hil-4r的结合等指标来评估。例如参见cn103739711a中的。“抑制生长”(例如涉及细胞)旨在包括细胞生长任何可测量的降低。
[0625]“诱导免疫应答”和“增强免疫应答”可互换使用，并指免疫应答对特定抗原的刺激(即，被动或适应性的)。针对诱导cdc或adcc的术语“诱导”是指刺激特定的直接细胞杀伤机制。
[0626]“adcc(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)”，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，是指表达fc受体的细胞通过识别抗体的fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞。可通过对igg上fc段的修饰，降低或消除抗体的adcc效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变，如选自igg1的n297a，l234a，l235a；igg2/4嵌合体，igg4的f235e，或l234a/e235a突变。
[0627]
生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。如，小鼠可以用人il-4r或其片段免疫，所得到的抗体能被复性，纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。本文所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的cdr区加上一个或多个人fr。人fr种系序列可以从immunogenetics(imgt)的网站得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001isbn012441351上获得。
[0628]
工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。作为一个示例，编码重链和轻链的cdna序列，可以克隆并重组至gs表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染cho细胞。利用分子克隆技术将本文的人源化抗体的序列插入到相应的表达载体中，利用hek293细胞表达系统表达生产，即可获得相应的人源化抗体。作为一个示例，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在fc区的高度保守n端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛，离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
[0629]
抗体可以是单克隆抗体(mab)，是指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术(如cdr-grafting)，或其它现有技术进行重组得到。
[0630]
抗体可以是单特异、双特异或多特异抗体。多特异性抗体可对靶标肽的不同表位显示特异性，或也可包含对一个以上靶标肽显示特异性的抗原结合域。人抗il-4r抗体可被连接到另一个功能分子(如另一个肽或蛋白质)上，或与之共表达。例如，抗体或其片段可功能性地(如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)与一个或多个其他分子(如另一个抗体或抗原结合片段)连接，以产生具有至少一种结合特异性的双特异或多特异抗体。
[0631]“施用”、“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物
流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
[0632]“治疗”意指给予受试者内用或外用治疗剂，诸如包含本文的任一种抗体-药物偶联物的组合物，所述受试者具有(疑似具有、易感于)一种或多种疾病症状，而所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗受试者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如受试者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在受试者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本本的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解单个受试者的目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如student t检验、卡方检验、依据mann和whitney的u检验、kruskal-wallis检验(h检验)、jonckheere-terpstra检验和wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的受试者中应当减轻目标疾病症状。
[0633]
应用于某个对象的术语“天然存在的”是指这样的事实，即该对象可在自然界中发现。例如存在于可从自然界来源分离得到的生物体(包括病毒)、且未经人工有意修饰的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
[0634]“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定受试者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、受试者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
[0635]“外源性”指根据背景在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据背景在生物、细胞或人体内产生的物质。
[0636]“同源性”或“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个dna分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数
×
100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。本文所述“至少85％序列同一性”是指变体与亲本序列相比，两序列具有至少85％同源，在一些方案中，其具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同源；在一些具体的方案中，其具有90％、95％或99％以上；在另一些具体的方案中，其具有至少95％序列同源。所述具有至少85％序列同一性的氨基酸序列包括通过对亲本序列进行一个或者多个氨基酸缺失、插入或替换突变获得。
[0637]
本文使用的术语“细胞”、“细胞系”、“细胞株”和“细胞培养物”可互换使用，并且所
有这类术语都包括其后代。因此，术语“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑传代次数。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在dna含量方面不可能精确相同。该术语包括具有与亲本细胞相同的功能或生物学活性的突变后代，其中亲本细胞是从初始转化的细胞中筛选所得。
[0638]“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着抗体重链可变区可以但不必须存在。
[0639]“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他组分的混合物，以及其他组分是例如生理学/可药用的载体(vehicle)或赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
[0640]
术语“载体(vector)”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的dna区段连接至其中的环状双链dna环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的dna区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。
[0641]
术语“赋形剂”是在药物制剂中除活性成分以外的附加物，如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。
[0642]
术语“稀释剂”又称填充剂，其主要用途是增加片剂的重量和体积。稀释剂的加入不仅保证一定的体积大小，而且减少主要成分的剂量偏差，改善药物的压缩成型性等。当片剂的药物含有油性组分时，需加入吸收剂吸收油性物，使保持“干燥”状态，以利于制成片剂。如淀粉、乳糖、钙的无机盐、微晶纤维素等。
[0643]
术语“药学上可接受的盐”或“可药用盐”是指本公开抗体-药物偶联物的盐，或本公开中所述的化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性，本公开抗体-抗体药物偶联化合物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐，可药用盐的非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。
[0644]
术语“溶剂化物”指本公开的抗体-药物偶联化合物与一种或多种溶剂分子形成可药用的溶剂化物，溶剂分子的非限制性实例包括水、乙醇、乙腈、异丙醇、dmso、乙酸乙酯。
[0645]
本公开中化合物可以含有一个或多个不对称中心，因此可以产生对映异构体、非对映异构体、及可以根据绝对立体化学定义为(r)-或(s)-或用于氨基酸的(d)-或(l)-的其它立体异构形式。本公开包括所有可能异构体以及其外消旋的和光学纯的形式。光学活性的(+)和(-)、(r)-和(s)-或(d)-和(l)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或者可以使用常规方法例如色谱法和分级结晶制备。用于制备/分离各个对映体的常规方法包括从合适的的光学纯前体手性合成或使用例如手性高压液相色谱法(hplc)的外消旋物(或盐或衍生物的外消旋物)拆分。当本文描述的化合物含有烯双键或其它几何不对称性中心，
除非另有说明，否则其意味着所述化合物包括e和z几何异构体。而且，所有的互变异构形式也意味着包括在内。
[0646]“立体异构体”指通过相同的键键合但具有不同的三维结构的相同原子组成的化合物，其不可互换。本公开中预期各种立体异构体及其混合物，并且包括“对映异构体”，其指其分子彼此为不能重叠的镜像的两种立体异构体。
[0647]“互变异构体”指质子从分子的一个原子转移到同一分子的另一个原子。本公开中包括任何所述化合物的互变异构体。
[0648]
术语“连接子、接头单元、接头或连接片段”是指一端与配体连接而另一端与药物相连的化学结构片段或键，也可以连接其他接头后再与药物相连。
[0649]
接头可以包含一种或多种接头构件。例示性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基(“mc”)、马来酰亚氨基丙酰基(“mp”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“pab”)、及那样源自与接头试剂的偶联的：n-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“spp”)、n-琥珀酰亚氨基4-(n-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(“smcc”，在本文中也称作“mcc”)和n-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“siab”)。接头可以包括拉伸单元、间隔单元、氨基酸单元和延伸单元，可以通过本领域已知方法合成，诸如us2005-0238649a1中所记载的。接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(chari等,cancer research 52:127-131(1992)；美国专利no.5,208,020)。
[0650]
术语“氨基酸单元”是指如果存在延伸单元的情况下，可以将以下结构式yr中的羰基与延伸单元相连，如果没有延伸单元的情况下，可以将yr直接连接在细胞毒性药物上的氨基酸，在本公开实施方式中，氨基酸单元表示为-k
k-：
[0651][0652]-k
k-是二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽或十肽，-k-单元各自独立地具有以下结构式ka或kb，k是0-10之间的一个整数：
[0653][0654]
其中：
[0655]
上述氨基酸单元中的r
23
为-h或甲基；
[0656]r24
为h、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、对羟基苄基、-ch2oh、-ch(oh)ch3、-ch2ch2sch3、-ch2conh2、-ch2cooh、-ch2ch2conh2、-ch2ch2cooh、-(ch2)3nhc(＝nh)nh2、-(ch2)3nh2、-(ch2)3nhcoch3、-(ch2)3nhcho、-(ch2)4nhc(＝nh)nh2、-(ch2)4nh2、-(ch2)4nhcoch3、-(ch2)4nhcho、-(ch2)3nhconh2、-(ch2)4nhconh2、-ch2ch2ch(oh)ch2nh2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基，
[0657][0658]r25
为-芳基-、-烷基-芳基-、-环烷基-、-烷基-环烷基-、-环烷基-烷基-、-烷基-环烷基-烷基-、-杂环基-，-烷基-杂环基-、-杂环基-烷基-、-烷基-杂环基-烷基-、-芳基-、-烷基-芳基-、-芳基-烷基-、-烷基-芳基-烷基-、-杂芳基-、-烷基-杂芳基-、-杂芳基-烷基-、-烷基-杂芳基-烷基-。
[0659]
在一个实施方案中，-k
k-为二肽，优选为-缬氨酸-瓜氨酸-、-苯丙氨酸-赖氨酸-或-n-甲基缬氨酸-瓜氨酸-，进一步优选为-缬氨酸-瓜氨酸-。
[0660]
术语“拉伸单元”指一端通过碳原子与配体共价连接而另一端通过硫原子与细胞毒性药物相连的化学结构片段。
[0661]
术语“间隔单元”是一种双功能化合结构片段，可用于偶联连接单元和细胞毒性药物最终形成配体-细胞毒性药物偶联物，这种偶联方式可以将细胞毒性药物选择性的连接到连接单元上。
[0662]
术语“氨基酸”是指分子结构中含有氨基和羧基、并且氨基和羧基都直接连接在-ch-结构上的有机化合物。通式是h2nchrcooh。根据氨基连结在羧酸中碳原子的位置，可分为α、β、γ、δ、ε
……‑
氨基酸。在生物界中，构成天然蛋白质的氨基酸具有其特定的结构特点，即其氨基直接连接在α-碳原子上，即α-氨基酸，包括甘氨酸(glycine)、丙氨酸(alanine)、缬氨酸(valine)、亮氨酸(leucine)、异亮氨酸(isoleucine)、苯丙氨酸(phenylalanine)、色氨酸(tryptophan)、酪氨酸(tyrosine)、天冬氨酸(aspartic acid)、组氨酸(histidine)、天冬酰胺(asparagine)、谷氨酸(glutamic acid)、赖氨酸(lysine)、谷氨酰胺(glutamine)、甲硫氨酸(methionine)、精氨酸(arginine)、丝氨酸(serine)、苏氨酸(threonine)、半胱氨酸(cysteine)、脯氨酸(proline)等。
[0663]
[0664][0665]
术语“延伸单元”是指当氨基酸单元存在的情况下，可以将氨基酸单元与细胞毒性药物偶联，或当氨基酸单元不存在时，可通过与yr上羰基与细胞毒性药物偶联的化学结构。在本公开实施方式中，延伸单元表示为-q
q-，q选自0，1，2。
[0666]
本公开中延伸单元为pab，结构如4-亚氨基苄基氨甲酰基片段，其结构如式下式所示，连接在d上，
[0667][0668]
缩写
[0669]
接头组件包括但不限于：
[0670]
mc＝6-马来酰亚氨基己酰基，结构如下：
[0671][0672]
val-cit或“vc”＝缬氨酸-瓜氨酸(蛋白酶可切割接头中的例示二肽)
[0673]
瓜氨酸＝2-氨基-5-脲基戊酸
[0674]
pab＝对氨基苄氧羰基(“自我牺牲”接头组件的例示)
[0675]
me-val-cit＝n-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(其中接头肽键已经修饰以防止其受到组织蛋白酶b的切割)
[0676]
mc(peg)6-oh＝马来酰亚氨基己酰基-聚乙二醇(可附着于抗体半胱氨酸)
[0677]
spp＝n-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯
[0678]
spdp＝n-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯
[0679]
smcc＝琥珀酰亚氨基-4-(n-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯
[0680]
it＝亚氨基硫烷
[0681]
pbs＝磷酸缓冲盐溶液
[0682]
术语“抗体-药物偶联物”，指配体通过稳定的连接单元与具有生物活性的药物相连。在本公开中“抗体-药物偶联物”(antibody drug conjugate，adc)，指把单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的连接单元与具有生物活性的毒性药物相连。
[0683]
术语“载药量”是指adc中每个配体上加载的细胞毒性药物平均数量，也可以表示为药物量和抗体量的比值，药物载量的范围可以是每个抗体(pc)连接1-20个，优选1-10个细胞毒性药物(d)。在本公开的实施方式中，载药量表示为n或k，示例性的为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或任意两数值之间数值的均值。优选1-10，更优选1-8，或1-8，或1-7，或2-8，或2-7，或2-6，或2-5，或2-3，或1-2，或2-4，或1-4，或1-5，或1-6，或3-8，或3-7，或3-6，或4-7，或4-6，或4-5的均值。可用常规方法如uv/可见光光谱法，质谱，elisa试验、单抗分子大小变异体测定法(ce-sds)和hplc特征鉴定偶联反应后每个adc分子的药物品均数量。
[0684]
本公开单抗分子大小变异体测定法(ce-sds)可采用十二烷基硫酸钠毛细管电泳(ce-sds)紫外检测方法，在还原和非还原条件下，依据分子量大小，按毛电泳法(2015年版《中国药典》0542)，定量测定重组单克隆抗体产品的纯度。
[0685]
本公开的一个实施方式中，细胞毒性药物通过连接单元偶联在配体的n端氨基和/或赖氨酸残基的ε-氨基上，一般地，偶联反应中能与抗体偶联的药物分子数将小于理论上的最大值。
[0686]
可以用以下非限制性方法控制配体细胞毒性药物偶联物的载量，包括：
[0687]
(1)控制连接试剂和单抗的摩尔比，
[0688]
(2)控制反应时间和温度，
[0689]
(3)选择不同的反应试剂。
[0690]
虽然对于特定缀合物分子而言，药物对抗体比率具有确切值(例如，在式(i)中为n)，但是应理解当用来描述含有许多分子的样品时，该值将经常是平均值，这归因于典型地与缀合步骤相关的某种程度的非均匀性。免疫缀合物(抗体-药物偶联物)的平均载量在本文中称为药物对抗体比率或“dar”，用n表示，即每个抗体分子所偶联的药物分子的平均数
量。在一些实施方案中，n可以为1-10，例如2-8，或2-6，或1-6，或4-6之间的任意值。在一些实施方式中，dar为约1至约6，例如是约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7.0、7.5、8.0。在一些实施方式中，按重量计至少50％的样品是具有平均dar
±
2的化合物，一些具体实施方式中，至少50％的样品是含有平均dar
±
1的缀合物。在一些实施方式中，“约为数值x”的dar意指dar的测量值可以在数值x的
±
20％以内变化。在一些实施方案中，本公开的抗体-药物偶联物包括与前述一定范围内的抗体-药物偶联物的集合。
[0691]
dar的检测方法例如，从还原和去糖基化样品的lc-ms数据外推出dar值。lc/ms允许定量adc中连接至抗体的有效负载(药物部分)分子的平均数。hplc将抗体分离成轻链和重链，并且还根据每条链的接头-有效负载基团的数量分离重链(hc)和轻链(lc)。质谱数据能够鉴定混合物中的组分种类，例如lc、lc+1、lc+2、hc、hc+1、hc+2等。根据lc和hc链的平均负载量，可以计算adc的平均dar。给定免疫缀合物样品的dar表示连接至含有两条轻链和两条重链的四聚体抗体的药物(有效负载)分子的平均数。例如wo2018142322中的dar检测方法。
[0692]
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，例如含有1至12个碳原子的烷基，例如含有1至10个碳原子的烷基，例如含有1至6个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。例如的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基例如为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基。
[0693]
术语“杂烷基”指含有一个或多个选自n、o或s的杂原子的烷基，其中烷基如上所定义。
[0694]
术语“亚烷基”指饱和的直链或支链脂肪族烃基，其具有2个从母体烷的相同碳原子或两个不同的碳原子上除去两个氢原子所衍生的残基，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，例如含有1至12个碳原子，例如含有1至6个碳原子的亚烷基。亚烷基的非限制性实例包括但不限于亚甲基(-ch
2-)、1,1-亚乙基(-ch(ch3)-)、1,2-亚乙基(-ch2ch2)-、1,
1-亚丙基(-ch(ch2ch3)-)、1,2-亚丙基(-ch2ch(ch3)-)、1,3-亚丙基(-ch2ch2ch
2-)、1,4-亚丁基(-ch2ch2ch2ch
2-)和1,5-亚丁基(-ch2ch2ch2ch2ch
2-)等。亚烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基例如独立地任选选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个取代基所取代。
[0695]
术语“烷氧基”指-o-(烷基)和-o-(非取代的环烷基)，其中烷基或环烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基例如为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
[0696]
术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3至20个碳原子，例如包含3至12个碳原子，例如包含3至10个碳原子，例如包含3至8个碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。
[0697]
术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或s(o)m(其中m是整数0至2)的杂原子，但不包括-o-o-、-o-s-或-s-s-的环部分，其余环原子为碳。例如包含3至12个环原子，其中1～4个是杂原子；例如环烷基环包含3至10个环原子。单环杂环基的非限制性实例包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。
[0698]
术语“螺杂环基”指5至20元的单环之间共用一个原子(称螺原子)的多环杂环基团，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或s(o)m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。例如为6至14元，例如为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺杂环基分为单螺杂环基、双螺杂环基或多螺杂环基，例如为单螺杂环基和双螺杂环基。例如为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元单螺杂环基。螺杂环基的非限制性实例包括：
[0699][0700]
术语“稠杂环基”指5至20元，系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对原子的多环杂环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或s(o)m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。例如为6至14元，例如为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠杂环基，例如为双环或三环，例如为5元/5元或5元/6元双环稠杂环基。稠杂环基的非限制性实例包括：
[0701][0702]
术语“桥杂环基”指5至14元，任意两个环共用两个不直接连接的原子的多环杂环基团，其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或s(o)m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。例如为6至14元，例如为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥杂环基，例如为双环、三环或四环，例如为双环或三环。桥杂环基的非限制性实例包括：
[0703][0704]
所述杂环基环可以稠合于芳基、杂芳基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂环基，其非限制性实例包括：
[0705]
等。
[0706]
杂环基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基例如为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基。
[0707]
术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，例如为6至10元，例如苯基和萘基，例如苯基。所述芳基环可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环，其非限制性实例包括：
[0708]
[0709]
芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基例如为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
[0710]
术语“杂芳基”指包含1至4个杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基例如为5至10元，例如为5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、n-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，其非限制性实例包括：
[0711][0711][0712]
杂芳基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基例如为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
[0713]
术语“氨基保护基”是为了使分子其它部位进行反应时氨基保持不变，用易于脱去的基团对氨基进行保护。非限制性实施例包含9-芴甲氧羰基、叔丁氧羰基、乙酰基、苄基、烯丙基和对甲氧苄基等。这些基团可任选地被选自卤素、烷氧基或硝基中的1-3个取代基所取代。所述氨基保护基例如为9-芴甲氧羰基。
[0714]
术语“环烷基烷基”指烷基被一个或多个环烷基取代，例如被一个环烷基取代，其中烷基如上所定义，其中环烷基如上所定义。
[0715]
术语“卤代烷基”指烷基被一个或多个卤素取代，其中烷基如上所定义。
[0716]
术语“氘代烷基”指烷基被一个或多个氘原子取代，其中烷基如上所定义。
[0717]
术语“羟基”指-oh基团。
[0718]
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
[0719]
术语“氨基”指-nh2。
[0720]
术语“硝基”指-no2。
[0721]
术语“酰胺基”指-c(o)n(烷基)或(环烷基)，其中烷基、环烷基如上所定义。
[0722]
术语“羧酸酯基”指-c(o)o(烷基)或(环烷基)，其中烷基、环烷基如上所定义。
[0723]
本公开还包括各种氘化形式的式(i)化合物。与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换。本领域技术人员能够参考相关文献合成氘化形式的式(i)化合物。在制备氘代形式的式(i)化合物时可使用市售的氘代起始物质，或它们可使用常规技术采用氘代试剂合成，氘代试剂包括但不限于氘代硼烷、三氘代硼烷四氢呋喃溶液、氘代氢化锂铝、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。
[0724]
本公开所述化合物的化学结构中，键表示未指定构型，即如果化学结构中存在手性异构体，键可以为或或者同时包含和两种构型。本公开所述化合物的化学结构中，键并未指定构型，即键的构型可以为e型或z
型，或者同时包含e和z两种构型。
[0725]“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
[0726]“免疫组织化学评分”是处理免疫组化结果的一种组织学评分方法，将每张切片内阳性的细胞数量及其染色强度转化为相应的数值，达到对组织染色半定量的目的。评分0表示未观察到染色或在小于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色；评分+1表示在大于10％的肿瘤细胞中检测到微弱/勉强可觉察的膜染色；对于评分+2，在大于10％的肿瘤细胞中观察到中等完全膜染色；评分+3表示在大于10％的肿瘤细胞中观察到强的完全膜染色。在本公开中，il-4r表达为0或+1评分的那些样品可以视为不过表达il-4r，而+2或+3评分的那些样品可以视为过表达il-4r。
具体实施方式
[0727]
以下结合实施例用于进一步描述，但这些实施例并非限制的范围。
[0728]
实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。参见sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室；当代分子生物学方法，ausubel等著，greene出版协会，wiley interscience，ny。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
[0729]
实施例1.示例性adc的制备
[0730]
根据wo2020038454a1中描述的方法表达和纯化抗体，抗体25g7重链序列如seq id no：47所示，轻链序列如seq id no：45所示。根据wo2020063676a1描述的方法制备依喜替康类似物与25g7的adc(又称25g7-c1)(药物抗体比例dar＝4)，25g7-c1的结构为：
[0731]
n为1-10的整数或小数，例如实施例5中合成了n为3.52和5.86的25g7-c1。图1是25g7-c1的结构示意图。前述专利申请通过引用将其全文并入本文中。
[0732]
实施例2.gbm靶细胞中的体外杀伤效率测定
[0733]
为测定25g7-c1在gbm靶细胞中的体外杀伤效率，在gbm细胞系u87、u251、ln229中内源性il-4r表达比较低的情况下，我们利用慢病毒系统在这三株gbm细胞系中过表达人源il-4r，经过g418筛选后，我们利用流式细胞技术鉴定il-4r过表达的效果(图2)，结果显示il-4r在这三株细胞系中稳定过表达。
[0734]
通过ctg(cell titer-glo)法测试小分子药物-抗体偶联物25g7-c1对il-4r过表
达的ln229、u251神经胶质瘤细胞的体外杀伤毒性。利用dmem培养基，加入10％fbs和1％青霉素/链霉素制备成完全培养基，在37℃含5％co2的培养箱中，培养u251-il4r、ln229-il4r稳转细胞株和u251、ln229对照细胞。在96孔板中按照每孔4000个细胞以及130ul培养基的密度进行铺板。过夜后，待细胞完全贴壁，加入20ul分别含25g7-c1的梯度浓度药物，在培养箱中培养3天。三天后，将96孔板拿出培养箱并平衡到室温，在细胞悬液中加入50ul的ctg试剂(celltiter-glo luminescent，promega，#g7573)，用摇床混匀2分钟后，室温静置10分钟，用envision2105 multimode plate reader(perkinelmer)中内置的luminescence模式检测细胞活率。将吸光度结果换算成百分比后用prism 8分析结果。实验结果如图3所示，与对照il-4r裸抗(未连接小分子药物的抗体)相比，在il-4r高表达的ln229、u251中，25g7-c1有良好的体外杀伤活性；与裸毒素相比，25g7-c1对il-4r高表达的ln229、u251呈现出特异性杀伤活性。
[0735]
另外，我们合成了目标dar(药物抗体比例)值为4或6，实际检测值为3.52和5.86的小分子毒素抗体偶联药物25g7-c1，并在hek293中过表达人il-4r，并比较了不同dar值25g7-c1在hek293-il4r细胞以及对照细胞中的体外毒性。实验结果如图4所示，dar＝5.86的25g7-c1药物在hek293-il4r中的ic50为0.458nm，而同时dar＝3.52的药物ic50为3.289nm，表明在一定范围内对于25g7-c1药物，提高dar值可用增加对靶细胞的杀伤效率。
[0736]
实施例3.靶向il-4r药物在gbm肿瘤模型中的体内药效
[0737]
为测定25g7-c1在gbm肿瘤模型中的体内药效，我们首先构建了il-4r表达为1+(免疫组织化学评分)的u87-mg皮下接种的模型。在实验小鼠于右侧背部皮下接种2
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106u87-mg细胞，细胞重悬在1:1的pbs与基质胶中(0.1ml/只)，定期观察肿瘤生长情况。当皮下接种肿瘤的平均大小达到约100-150mm3时，进行分组，每组8只小鼠。多位点瘤内给药，25g7-c1药剂量为1mpk(i.t.)、3mpk(i.t.)或者1mpk(i.v.)，每周给药一次，总共给药四次。开始给药后，每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大小，肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm3)＝1/2
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(a
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b2)(其中a表示长径，b表示短径)。
[0738]
如图5和表2所示，25g7-c1在各给药剂量下均显示出抑瘤效果，其中瘤内给药3mpk的药效显著更优，肿瘤生长抑制率tgi＝65.4％。
[0739]
表2.靶向il-4r药物在小鼠胶质瘤模型中的体内药效总结
[0740][0741]
注：s.c.:皮下；mpk:mg/kg(毫克每千克)；i.t.:瘤内注射；i.v.:静脉注射；qw:每周一次。**表示p《0.01，***表示p《0.001，ns表示不显著。
[0742]
实施例4.靶向il-4r药物在gbm肿瘤模型(il-4r 3+)体内药效
[0743]
为进一步测定25g7-c1在gbm肿瘤模型中的体内药效，我们利用il-4r过表达的
ln229细胞系(标注为ln229-il4r，免疫组织化学评分为3+)建立了皮下接种的模型。在实验小鼠于右侧背部皮下接种1
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107ln229-il4r细胞，细胞重悬在1:1的pbs(0.1ml/只)，定期观察肿瘤生长情况。当皮下接种肿瘤的平均大小达到约100-150mm3时，进行分组，每组6-7只小鼠。25g7-c1给药剂量为1mpk(i.t.)、3mpk(i.t.)或者1mpk(i.v.)，每周给药一次，总共给药四次，对照组不给药；肿瘤生长监测和计算同实施例3。
[0744]
实验结果如图6和表3显示，在il-4r高表达的ln229-il4r肿瘤模型中(免疫组织化学评分为3+)，25g7-c1给药剂量3mpk(i.t.)时tgi达到99％，25g7-c1给药剂量1mpk(i.t.)时tgi为75％，25g7-c1给药剂量1mpk(i.v.)时tgi为55.6％，该结果表明25g7-c1药物在il-4r 3+的神经胶质瘤模型中呈现剂量效应，而且瘤内给药效果优于静脉给药。
[0745]
表3.靶向il-4r药物在小鼠胶质瘤模型中的体内药效总结
[0746][0747]
注：s.c.:皮下；mpk:mg/kg(毫克每千克)；i.t.:瘤内注射；i.v.:静脉注射；qw:每周一次。**表示p《0.01，***表示p《0.001，ns表示不显著。
[0748]
本公开中实验动物的使用及福利遵照“国际实验动物评估和认可委员会(aaalac)”的规定执行。每天监测动物的健康状况及死亡情况，例行检查包括观察受试物和药物对动物日常行为表现的影响如行为活动，体重变化，外观体征等。
[0749]
虽然以上描述了本公开的具体实施方案，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方案做出多种变更或修改。因此，本公开的保护范围由所附权利要求书限定。