短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用。


背景技术：

2.肝损伤是临床常见的疾病，主要分为开放性肝损伤、病理性肝损伤、闭合性肝损伤和化学性肝损伤。随着社会发展，化学性肝损伤的发病人数日益增多，其中由长期或大量饮酒导致的酒精性肝损伤尤为高发，已经成为严重危害人类身体健康的常见疾病之一。酒精性肝损伤病程主要包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和肝硬化。在我国，酒精性肝损伤的发病率及与其相关的死亡率正在逐年上升，寻找有效预防和治疗酒精性肝损伤的方法至关重要。目前，酒精性肝损伤的发病机制较为复杂，是多种因素相互作用的结果。而肠道屏障功能受损引起的肠源性内毒素血症在酒精性肝损伤发生发展中发挥十分重要的作用，酒精改变肠道菌群组成，增加肠道通透性，造成细菌易位及其有害代谢产物，如内毒素，进入门静脉，激活肝脏内kupffer细胞膜受体tlr4，进一步活化nf-κb促进促炎因子的释放，最终导致肝脏炎症。因此，基于肠肝轴调控肠道屏障-炎症通路已成为防治酒精性肝损伤的有效措施。
3.当前，酒精性肝损伤防治药物多以中草药提取物、药物复合物、肠道益生菌为主。如专利cn111481588a公开了一种防治酒精性肝损伤的组合物及其制备方法与应用，防治酒精性肝损伤的组合物包括绞股蓝提取物和荷叶提取物。该技术方案通过绞股蓝和荷叶的提取物进行配伍制得防治酒精性肝损伤的组合物，对酒精性肝损伤具有一定的缓解、预防及治疗作用。但上述各组成成分提取方式繁琐，成本高，且成分复杂，效应分子不明确，保存条件要求高。


技术实现要素：

4.为解决以上技术问题，本发明提出短链脂肪酸在预防或/和治疗酒精性肝损伤中的应用。短链脂肪酸，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸和异戊酸，是由肠道菌群发酵膳食纤维产生，能有效改善肠道屏障功能，维持肠道稳态，并调控机体炎症状态。虽然乙酸、丁酸在治疗溃疡性结肠炎、预防1型糖尿病和结肠癌等方面研究广泛，但到目前为止，还未有报道指出直接补充丙酸和丁酸能够改善慢性酒精性肝损伤。
5.本发明提供的技术方案如下：
6.短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用。
7.优选地，所述肝损伤为化学性肝损伤。
8.更优选地，所述化学性肝损伤为酒精性肝损伤。
9.优选地，所述短链脂肪酸为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸或异戊酸中的一种或多种。
10.更优选地，所述短链脂肪酸为丙酸或/和丁酸。
11.优选地，短链脂肪酸给药形式包括前体药物、盐、酯或靶向释放制剂。
12.更优选地，前体药物为可以在生物代谢或者化学分解后释放特定短链脂肪酸的药物。
13.更优选地，靶向释放制剂包含与至少一种短链脂肪酸共价键合的载体分子。
14.更优选地，载体包括淀粉、树胶、寡糖或果胶类等碳水化合物或其他大分子材料。
15.优选地，短链脂肪酸给药方式为口服、舌下含服、口腔含服、皮下注射、肌肉注射、静脉内注射或动脉内注射。
16.本发明提供了丙酸和丁酸在预防或/和治疗酒精性肝损伤中的应用，且防治效果显著。通过直接补充丙酸和丁酸防治酒精性肝损伤的发明还未有报道。丙酸和丁酸为结构明确的小分子，是正常人群肠道菌群发酵膳食纤维产生的短链脂肪酸，无毒性，安全性高，获取方便，成本低廉，能够满足公众对安全、有效且简单的防治酒精性肝损伤手段的需求。
17.本发明具有以下技术优势：
18.(1)丙酸和丁酸在体外促进酒精暴露下的肝细胞的增殖作用。
19.(2)丙酸和丁酸在体内降低肝脏指数的作用。
20.(3)丙酸和丁酸在体内改善肝脏功能，抑制alt和ast水平升高。
21.(4)丙酸和丁酸在体内抑制肝脏脂肪变性，降低肝脏tc和tg含量。
22.(5)丙酸和丁酸在体内针对性地增加肠道内容物中丙酸和丁酸的含量。
23.(6)丙酸在体内可进一步改善肠道上皮屏障、粘液屏障功能和肠道炎症。
24.(7)丙酸在体内可进一步抑制lps-tlr4-nf-κb信号通路的激活。
附图说明
25.图1为丙酸对酒精暴露下的肝细胞生存活力的影响图
26.图2为丙酸对酒精性肝损伤小鼠体重、肝脏指数和肝脏功能的影响图
27.图3为丙酸对酒精性肝损伤小鼠肝脏脂肪变性的影响图
28.图4为丙酸对酒精性肝损伤小鼠肠道内容物和肝脏组织中短链脂肪酸的影响图
29.图5为丙酸对酒精性肝损伤小鼠肠道上皮屏障功能的影响图
30.图6为丙酸对酒精性肝损伤小鼠肠道黏液屏障的影响图
31.图7为丙酸对酒精性肝损伤小鼠肠道炎症的缓解作用图
32.图8为丙酸对酒精性肝损伤小鼠肝脏中tlr4-nf-κb信号通路的影响图
33.图9为丁酸对酒精暴露下的肝细胞生存活力的影响图
34.图10为丁酸对酒精性肝损伤小鼠体重、肝脏指数和肝脏功能的影响图
35.图11为丁酸对酒精性肝损伤小鼠肝脏脂肪变性的影响图
36.图12为丁酸对酒精性肝损伤小鼠肠道内容物和肝脏组织中短链脂肪酸的影响图
具体实施方式
37.现结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明。
38.实施例1丙酸对酒精性肝损伤的影响
39.一、测定丙酸对酒精暴露下的肝细胞存活率的影响
40.需要说明的是，在本发明中，实验细胞为人肝癌细胞hepg2，细胞培养所用的培养
基为含10％胎牛血清和1％双抗(青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml)的hyclone高糖dmem培养基。
41.具体测定方法如下：
42.hepg2细胞复苏后，传代一次后，取对数生长期的细胞，以每孔5000个细胞的浓度接种于96孔板中，置于37℃、5％co2培养箱中培养过夜。实验设空白组，阴性对照组和给药组，每组5个复孔，吸弃原有培养基，空白对照组更换为新鲜的无血清dmem，阴性对照组更换为酒精浓度为800mm的无血清培养基，给药组更换为酒精浓度为800mm且丙酸钠浓度为0.2、0.4和0.8mm的无血清培养基。处理24h后，弃掉培养基，并用pbs缓冲液洗涤一遍后，每孔加入0.5mg/ml的mtt与培养基混合液100μl，孵育4h，吸弃培养基，每孔加入150μl dmso，放到摇床上快速摇晃，充分溶解紫色晶体，用酶标仪测定490nm下的吸光值。
43.二、测定丙酸对酒精性肝损伤模型小鼠的影响
44.2.1小鼠酒精性肝损伤模型构建(niaaa法)
45.取spf级8周龄雄性c57bl/6(体重＞20g)小鼠48只，随机分为4组，分别为：空白对照组(control)、酒精造模组(etoh)、补充100mm丙酸钠造模组(etoh+p-100)和补充200mm丙酸钠造模组(etoh+p-200)，每组12只。小鼠在温度为25
±
2℃、相对湿度为50
±
5％、12h光照/12h黑暗的标准化动物房中完成1周的环境适应期。使用lieber decarli对照液体饲料适应性喂养5天后，空白对照组小鼠给予lieber decarli对照液体饲料配对喂养直至实验结束。造模组小鼠的饲料由lieber decarli液体对照饲料和lieber decarli酒精液体饲料按比例混合，使酒精浓度以每天增加1％的幅度递增，喂养过渡5天。过渡期结束后，进入造模期，酒精造模组和丙酸钠补充组给予酒精浓度为5％，热量为28％的lieber decarli酒精液体饲料，连续配对喂养30天。实验进行过程中，每周固定时间称重小鼠一次。造模期的最后一天早上7-9点，空白对照组小鼠灌胃糊精，造模组三组小鼠灌胃酒精，9h后收集小鼠肠道内容物，于-80℃超低温保存。麻醉小鼠，摘眼球取血后解剖小鼠收集完整肝脏组织和部分结肠组织，用pbs缓冲液冲洗干净，一部分组织样品于-80℃保存，一部分样品放入4％多聚甲醛中固定。
46.2.2肝脏指数测定
47.解剖小鼠，取出完整肝脏，滤纸吸取表面血水后，称重，计算小鼠肝脏指数(％)＝肝脏质量(g)/体重(g)
×
100％。
48.2.3肠道内容物和肝脏组织中短链脂肪酸的测定
49.利用气相色谱-质谱联用(gc-ms)技术检测各组肠道内容物中scfas含量：取收集的粪便0.015g，加入600μl预冷的超纯水，组织研磨仪研磨均匀后，室温下超声提取15min，4℃10000rpm离心10min后取100μl上清液于玻璃管中，加入10μl 2-乙基丁酸作为内标校正，然后加入44μl ph＝7的pbs缓冲液和280μl 100mm五氟溴苄，充分混匀后，置于60℃水浴加热1.5h，降温后加入200μl正己烷，涡旋3min，转移到1.5ml离心管，10000rpm，离心10min，取最上层液体进行gc-ms分析，根据标准工作液建立的线性回归方程进行定量分析。
50.2.4生化指标分析
51.血清中alt、ast测定：选取干净的96孔板，测定孔和对照孔加入20μl 37℃预温的基质液，之后在测定孔加入5μl待测样本，置于37℃恒温培养箱孵育30min，各孔加入20μl 2,4-二硝基苯肼液，对照孔加入5μl蒸馏水，37℃孵育20min，最后各孔加入200μl 0.4mol/l
氢氧化钠液，水平摇晃均匀后室温放置15min，酶标仪波长510nm下测定各孔吸光值。
52.肝脏中tc、tg测定：称取0.01-0.015g肝脏组织，按体重(g)：体积(ml)＝1:9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰上研磨成匀浆，2500rpm离心10min，取上清液2.5μl加入96孔板中作为样本孔，空白孔加入2.5μl蒸馏水，校准孔加入2.5μl标准品，之后所有孔加入250μl工作液，37℃孵育10min，波长510nm，酶标仪测定各孔吸光值。同时，取组织上清液测定总蛋白浓度，按照说明书上的计算公式计算各样本tc、tg含量。
53.2.5组织切片染色
54.油红o染色：肝脏组织冷冻切片，厚度为10-15μm，干燥后浸入50％乙醇稍洗，油红o染色稀释液浸染8-10min，50％乙醇分色，清水洗涤，harris苏木精染核30s，清水冲洗至变蓝，用甘油明胶固封，显微镜下观察并拍照。
55.he染色：肝脏和结肠组织石蜡包埋后进行切片，厚度在2-3μm左右，将切好的组织样本放入二甲苯中充分浸泡，重复一次，随后，将组织样本放入无水乙醇浸泡5min，最后用95％、85％、70％的酒精依次浸泡组织样本，充分水化。pbs清洗组织后，滴加苏木素染色液于样本组织中，染色10min，蒸馏水洗去多余染液后，使用1％的盐酸乙醇将过度染色的细胞核上多余的染液去除，随后使用促蓝液对细胞核复染，用蒸馏水冲洗干净。将伊红染液滴加到组织上，染色3min，之后使用80％、95％和100％乙醇进行梯度脱水，最后使用二甲苯浸泡组织样本，风干后使用中性树胶封片，显微镜观察并拍照留存。
56.2.6western blot检测
57.首先进行蛋白提取，取适量冻存的肝组织和回肠组织，加入含1mm pmsf的ripa裂解液置于冰上裂解6min。待组织全部裂解，收集裂解液于1.5ml离心管中并于12000rpm，4℃离心15min，之后收集上清液于干净的离心管中。使用bca试剂盒检测蛋白浓度，计算各组上样量，加入适量的5
×
蛋白上样缓冲液混匀后于95℃金属浴中煮10min。置于-20℃冰箱中贮藏备用。使用8％的分离胶将蛋白进行分离，浓缩胶电流设为40ma,分离胶电流设为60ma。随后将分离后的蛋白转移到pvdf膜上，转膜完成后，将pvdf膜用5％的脱脂牛奶室温封闭1h。按要求用1
×
tbst稀释相应抗体，裁剪所需蛋白的膜条带，将条带和相应抗体稀释液置于抗体孵育盒中，4℃轻摇过夜。然后，使用1
×
tbst缓冲液洗膜三次，每次5min。随后用1
×
tbst缓冲液按比例稀释二抗，于室温孵育1h。1
×
tbst缓冲液洗膜三次，每次5min。最后使用ecl发光液和biorad凝胶成像系统检测目标蛋白。
58.2.7实时荧光定量pcr
59.(1)利用trizol提取肝组织和回肠组织rna，提取步骤如下：取50-100mg组织样本于ep管中，加入500μl trizol试剂，用depc水浸泡后的电动研磨仪钢头研磨。补齐trizol至1ml对组织进行裂解。在15-30℃下孵化匀浆后的样品5min以使核酸蛋白复合体完全裂解，12000rpm 4℃离心5min，将上清移入新离心管中，重复离心一次，取上清。在上述ep管中，加入0.2ml氯仿，盖上ep管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下放置5min后，12000rpm 4℃离心15min；离心结束后，离心管内混合液分为3层，去上层rna水样于无rnase的离心管中。在加入等体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置4小时后，12000rpm4℃离心15min，弃上清，加入1ml 75％乙醇并涡旋震荡，4℃条件下7500rpm离心5min，重复本步骤1次后，弃上清，空气风干rna沉淀。用20μl depc水溶解rna沉淀，紫外分光光度计检测rna的浓度和纯度。
60.(2)使用sparkscriptⅱrt plus kit合成cdna，首先进行去基因组dna反应，反应
体系如下：
[0061][0062]
移液器轻轻吹打混匀，42℃孵育5min。控温步骤在pcr仪器上进行，反应结束后置于冰上放置。继续直接在同一管加入如下成分：
[0063][0064]
轻轻混匀，离心，50℃孵育15min，85℃加热5min，得到cdna产物。
[0065]
(2)使用sybr green qpcr mix对样品dna进行扩增，反应体系如下：
[0066][0067]
扩增程序为：
[0068][0069]
以β-actin的表达量作为参照进行相对表达量的计算，计算方法使用2
‑△△
ct
法。
[0070]
目的基因的引物序列见下表。
[0071][0072]
三、结果分析
[0073]
结果用均数
±
离均差表示。用spss 17.0单因素方差分析比较多组间差异性，p＜0.05被认为差异显著。
[0074]
3.1丙酸对酒精暴露下的肝细胞生存活力的影响
[0075]
由图1可知，丙酸钠能够减少酒精导致的肝细胞死亡，对酒精暴露下的肝细胞产生保护作用，呈剂量依赖性，这一结果表明丙酸具有预防或/和治疗酒精性肝损伤的潜力。*代表与单纯酒精暴露组相比差异显著(p《0.05)；**代表与单纯酒精暴露组相比差异极显著(p《0.01)。
[0076]
3.2丙酸对酒精性肝损伤小鼠体重、肝脏指数和肝脏功能的影响
[0077]
由图2a可知，由于喂养过程中一直遵循等热量喂养(配对喂养)，因此各组小鼠在实验过程中摄入热量相等，实验各组间无显著性差异(p＞0.05)，说明补充丙酸不影响小鼠体重变化。而各组小鼠的肝脏指数(如图2b)显示，相比空白对照组(control)，单纯的酒精喂养组(etoh)肝脏指数显著升高，而在酒精喂养过程中添加丙酸组(etoh+p)的小鼠肝脏指数有明显的改善，说明丙酸可有效改善酒精对小鼠肝脏重量的影响。小鼠血清中谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)含量检测结果如图2c和2d所示，etoh组的alt和ast含量较control组显著上升，肝脏功能受损严重，但在etoh+p-100和etoh+p-200组，alt和ast水平显著低于etoh组，肝脏损伤减轻。说明饮食中添加丙酸可以大幅度减轻酒精长期暴露对肝脏细胞造成的损伤，改善肝脏功能。*代表与酒精组小鼠相比差异显著(p《0.05)；**代表与酒精组小鼠相比差异极显著(p《0.01)。
[0078]
3.3丙酸对酒精性肝损伤小鼠肝脏脂肪变性的影响
[0079]
酒精性肝损伤早期常见的症状之一便是肝脏脂肪变性。由图3a和3b所示的肝脏he染色和油红o染色结果可见，与control组相比，etoh组肝脏形成了大量的脂滴，数量多且形态大，脂肪堆积严重，而etoh+p-100组和etoh+p-200组脂滴数量减少，形态变小。肝脏中的总胆固醇(tc)和甘油三酯(tg)的含量变化与组织学结果一致，如图3c和3d所示，慢性酒精暴露的小鼠(etoh组)肝脏中tc和tg的水平均明显升高(p＜0.01)，为对照组的4.3倍和3.2倍，但是血清中的tc和tg水平未发生变化。相比于etoh组，在酒精暴露过程中给予丙酸则会显著降低小鼠肝脏中的tc和tg水平(p＜0.01)，抑制肝脏中脂质的形成，但对血清中的tc和tg水平不产生影响。以上结果表明，补充丙酸可以显著减轻酒精诱导的肝脏脂肪变性程度。
此外，为进一步确认丙酸缓解酒精性肝损伤小鼠肝脏脂肪变性的机制，对与脂肪变性相关的蛋白和基因进行了检测。结果显示长期酒精摄入可以显著增加小鼠肝脏中与脂肪酸从头合成有关的蛋白acc1,fas和srebp-1的表达量，补充丙酸可以显著下调这些蛋白的表达(图3e和3f)。同时，酒精暴露也会明显上调小鼠肝脏中与脂质转运相关的基因cd36和pparγ基因的表达，补充丙酸后同样会对这些基因的表达产生明显的抑制作用(图3g)。*代表与酒精组小鼠相比差异显著(p《0.05)；**代表与酒精组小鼠相比差异极显著(p《0.01)。
[0080]
3.4丙酸对酒精性肝损伤小鼠肠道内容物和肝脏组织中短链脂肪酸含量的影响
[0081]
为了明确丙酸在酒精性肝损伤小鼠中的作用部位，分别对小鼠肠道内容物和肝脏中的短链脂肪酸含量进行了分析。肠道内容物分析结果显示(图4a)，长期酒精暴露(etoh)会造成小鼠肠道中的丙酸和丁酸含量显著降低(p＜0.05)，相比于酒精组，直接补充丙酸除了能够显著提高肠道内容物中丙酸水平还可显著提高丁酸的水平。而肝脏组织分析结果显示(图4b)，酒精暴露会显著降低肝脏中乙酸、丙酸和丁酸的水平，补充丙酸后并不会增加酒精性肝损伤小鼠肝脏中丙酸的含量，对乙酸和丁酸的含量也没有影响。因此我们推测补充丙酸可以通过针对性地恢复肠道中丙酸的含量发挥改善酒精性肝损伤的作用。*代表与酒精组小鼠相比差异显著(p《0.05)；**代表与酒精组小鼠相比差异极显著(p《0.01)。
[0082]
3.5丙酸对酒精性肝损伤小鼠肠道上皮屏障的影响
[0083]
基于以上结果，对小鼠的肠粘膜屏障功能进行了评估。肠粘膜屏障主要分为上皮屏障、粘液屏障和免疫屏障。肠上皮屏障功能受损引起的肠源性内毒素血症是酒精性肝损伤的主要发病机制，由图5a可见，与control组相比，etoh组小鼠外周血清中脂多糖(lps)的水平显著升高，丙酸干预后，lps水平明显降低，表明丙酸可以修复由酒精造成的上皮屏障损伤。此外，回肠组织h&e染色结果显示(图5b)，长期酒精摄入可以使小鼠回肠形态发生异常，表现为绒毛脱落，杯装细胞减少，且对绒毛高度/隐窝深度比值进行计算发现(图5c)，酒精可以显著破坏绒毛和隐窝的连接，而这些病理性转变在丙酸补充后均有明显的改善。此外，采用western blot和ihc法对肠上皮紧密连接蛋白的表达进行检测发现(图5d-5f)，酒精可以显著降低紧密连接蛋白claudin-1,occludin,e-cadherin和zo-1的表达，补充丙酸后，这些蛋白的表达均有明显的回升。以上结果表明，丙酸干预可显著改善酒精性肝损伤小鼠的肠道上皮屏障功能障碍。*代表与酒精组小鼠相比差异显著(p《0.05)；**代表与酒精组小鼠相比差异极显著(p《0.01)。
[0084]
3.6丙酸对酒精性肝损伤小鼠肠道粘液屏障的影响
[0085]
粘液屏障是由粘蛋白和抗菌肽构成的一道不可逾越的防线。如图6所示，酒精摄入导致小鼠肠道粘蛋白muc-1显著升高，muc-2显著降低，抗菌肽reg 3β和reg 3γ显著降低。然而，在摄入酒精的同时补充丙酸，可以明显减少muc-1，增加muc-2，reg 3β和reg 3γ的水平，说明丙酸对酒精性肝损伤小鼠的肠道粘液层恶化有一定改善作用。*代表与酒精组小鼠相比差异显著(p《0.05)；**代表与酒精组小鼠相比差异极显著(p《0.01)。
[0086]
3.7丙酸对酒精性肝损伤小鼠肠道炎症的影响
[0087]
肠道粘膜免疫紊乱而造成的肠道炎症是造成肠道屏障功能障碍的原因之一，由图7可知，酒精可造成小鼠肠道明显的炎症反应，促炎因子il-1β,il-6,tnf-α和il-17均呈明显上升趋势，而丙酸可显著降低il-1β,il-6,tnf-α和il-17的水平。这一结果表明，丙酸可抑制酒精导致的肠道炎症，从而避免肠道屏障受损。*代表与酒精组小鼠相比差异显著(p《
0.05)；**代表与酒精组小鼠相比差异极显著(p《0.01)。
[0088]
3.8丙酸对酒精性肝损伤小鼠肝脏tlr4-nf-κb通路的影响
[0089]
酒精造成的肠道上皮屏障功能障碍可导致肠源性lps移位，进入肝门静脉，从而激活肝脏tlr4-nf-κb通路，最终造成肝脏炎症。因此，如图8所示，相比control组，etoh组小鼠肝脏中除myd88外，tlr4,p-nf-κb和p-iκbα蛋白的表达均明显增加，说明该组小鼠肝脏中的tlr4-nf-κb通路被激活，而在etoh+p-100和etoh+p-200两组小鼠肝脏中，tlr4,p-nf-κb和p-iκbα蛋白的表达都有明显降低，说明丙酸干预可通过抑制tlr4-nf-κb通路防止肝脏炎症性反应的发生。
[0090]
实施例2丁酸对酒精性肝损伤的影响
[0091]
一、测定丁酸对酒精暴露下的肝细胞存活率的影响
[0092]
具体测定方法同实施例1所述。
[0093]
二、测定丁酸对酒精性肝损伤模型小鼠的影响
[0094]
2.1小鼠酒精性肝损伤模型构建(niaaa法)
[0095]
取spf级8周龄雄性c57bl/6(体重＞20g)小鼠48只，随机分为3组，分别为：空白对照组(control)、酒精造模组(etoh)、补充100mm丁酸钠造模组(etoh+b)，每组12只。具体造模和取样方法同实施例1所述。
[0096]
2.2肝脏指数测定
[0097]
具体测定方法同实施例1所述。
[0098]
2.3肠道内容物和肝脏组织中短链脂肪酸的测定
[0099]
具体测定方法同实施例1所述。
[0100]
2.4生化指标分析
[0101]
具体测定方法同实施例1所述。
[0102]
2.5组织切片染色
[0103]
具体测定方法同实施例1所述。
[0104]
三、结果分析
[0105]
结果用均数
±
离均差表示。用spss 17.0单因素方差分析比较多组间差异性，p＜0.05被认为差异显著。
[0106]
3.1丁酸对酒精暴露下的肝细胞生存活力的影响
[0107]
由图9可知，与丙酸类似，丁酸同样具有一定的肝脏保护活性，可以降低酒精对肝细胞的毒性，减少酒精导致的肝脏死亡，并呈剂量依赖性，证明丁酸同样具有预防或/和治疗酒精性肝损伤的潜力。*代表与单纯酒精暴露组相比差异显著(p《0.05)；**代表与单纯酒精暴露组相比差异极显著(p《0.01)。
[0108]
3.2丁酸对酒精性肝损伤小鼠体重、肝脏指数和肝脏功能的影响
[0109]
如图10所示，实验各组间小鼠的体重无显著差异，但是相比对照组(control)小鼠，酒精喂养组(etoh)小鼠的肝脏重量显著增加，导致该组小鼠肝脏指数升高，提示肝脏功能发生异常。进一步对小鼠外周血清中的alt和ast水平进行测定后发现，酒精喂养组(etoh)小鼠alt和ast水平显著升高，证实酒精可使小鼠肝脏功能受损。然而，丁酸干预后，虽然小鼠的肝脏指数未有明显降低，但小鼠血清中alt和ast水平显著下降，说明丁酸同样能够改善酒精性肝损伤小鼠的肝脏功能。*代表与单纯酒精暴露组相比差异显著(p《
0.05)；**代表与单纯酒精暴露组相比差异极显著(p《0.01)。
[0110]
3.3丁酸对酒精性肝损伤小鼠肝脏脂肪变性的影响
[0111]
采用h&e染色和油红o染色来直观反映小鼠肝脏脂肪变性情况。如图11所示，对照组小鼠肝脏结构正常，未有脂肪空泡出现和脂质堆积，而酒精摄入组小鼠肝脏脂肪空泡增多，脂肪含量增加，为典型的肝脏脂肪变性特征，在饮食中添加丁酸后，该病理变化有明显的改善。此外，肝脏脂质水平测定结果表明，相比对照组，酒精组小鼠肝脏中的tg和tc水平显著增加，而丁酸的补充可显著抑制tg和tc水平的增加。这些结果表明丁酸可防止酒精导致的肝脏脂肪变性，抑制脂质堆积。*代表与单纯酒精暴露组相比差异显著(p《0.05)；**代表与单纯酒精暴露组相比差异极显著(p《0.01)。
[0112]
3.4丁酸对酒精性肝损伤小鼠肠道内容物和肝脏组织中短链脂肪酸含量的影响
[0113]
如图12所示，与丙酸补充类似，在肠道内容物中，补充丁酸后，不仅可以针对性的增加由酒精暴露所降低的丁酸水平，还可一定程度恢复酒精导致的丙酸水平的下降；但在肝脏组织中，补充丁酸不仅没有增加肝脏组织中丁酸的水平，反而还会引起丁酸水平的降低，对丙酸水平也无影响。因此，可认为丁酸与丙酸一致以肠道为主要作用部位。
[0114]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。