一种茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于医药领域，具体涉及一种茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肠道菌群是宿主肠道中的正常微生物，种类繁多。一般而言，健康的成年人，其肠道中的微生物约有10
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个，约为人体细胞个数的10倍，能在体内形成复杂而又独特系统，调节宿主的正常生理功能，而菌群的组成和代谢等也会受到宿主周围环境的影响。其中，肠道益生菌有乳酸杆菌和双歧杆菌等，是人体健康不可缺少的要素，可以合成各种维生素，参与食物的消化，促进肠道蠕动，抑制致病菌群的生长，分解有害、有毒物质等。通过调节肠道菌群，增加益生菌，可抑制多种致病菌所致的肠道疾病，并能调节人体代谢和免疫功能。
3.茶多糖具有调节肠道菌群的作用，cn106188323a公开了一种制备具有肠道益生功能的茯砖茶茶多糖的方法，该方法包括茯砖茶采用80％乙醇脱色后经干燥、粉碎、热水浸提、乙醇沉淀、复溶、deae sepharose fastflow树脂脱色、透析、浓缩、冷冻干燥得茯砖茶茶多糖，体外厌氧发酵实验表明茯砖茶茶多糖具有肠道益生功效。茶油也具有调节肠道菌群的作用， cn111329928a公开了一种含山茶油的组合物，具有降低血糖水平，降低胰岛素的抵抗能力，以及调节肠道菌群作用。然而单一多糖或茶油既不能为益生菌提供多种营养，又不能抑制有害细菌如大肠杆菌等有害菌的繁殖。
4.油茶籽中除了多糖和茶油外，还含有多种营养成分如茶皂苷、糖蛋白，在榨油后饼粕得不到有效利用导致资源浪费。虽然目前已有从中提取茶皂苷和糖蛋白的报道，但没有针对肠道菌群开展产品研发。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂。
6.本发明的另一目的在于提供所述茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂的制备方法。
7.本发明的再一目的在于提供所述茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂在制备肠道菌群调节药物中的应用。
8.一种茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂的制备方法，包括如下步骤：
9.(1)脱脂茶粕中加入其质量8～30倍的50～70℃ph5～10缓冲液提取1～3h后，过滤，滤液用大孔树脂吸附8～24h；
10.(2)将步骤(1)所得未被吸附液用截留分子量50～200kda的膜透析24～48h，截留液冷冻干燥24～48h，得油茶糖蛋白；将吸附后的大孔树脂用1～3倍大孔树脂质量的体积分数为50～70％的乙醇水溶液洗脱，洗脱液经50～70℃，0.01～0.1mpa干燥3～5h，得油茶皂
苷；
11.(3)茶油加入其质量5～10％脂肪酶和8～30倍的50～70℃ph5～10缓冲液反应1～3h 后，加入茶油质量5～10倍的有机溶剂和0.5～1.5倍的步骤(2)所得油茶糖蛋白，继续反应 1～3h后，静置8～24h，上层液经50～70℃、0.01～0.1mpa浓缩干燥3～5h，得茶油糖蛋白结合物；
12.(4)将步骤(2)所得油茶皂苷与其质量5～20倍的步骤(3)所得茶油糖蛋白结合物，分别用体积分数60～80％乙醇水溶液和ph5～10缓冲液配制成5～10％的溶液，在5000～ 20000转/min搅拌下，将油茶皂苷溶液加入到茶油糖蛋白结合物溶液中，搅拌10～60min后过0.1～0.5μm微孔滤膜，即得所述的茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂。
13.优选的，步骤(1)中所述的脱脂茶粕通过如下方法制备得到：将茶粕粉碎，过20～30 目筛，加入正已烷，搅拌，转速3000～4000转/min离心20～30min，所得固体物即为所述的脱脂茶粕。
14.优选的，步骤(1)中所述的大孔树脂为弱极性大孔树脂，包括但不限于ab-8、hpd100、 hpd400、d101、ykdh-2，其用量为脱脂茶粕质量的1～3倍。
15.优选的，步骤(3)中所述的有机溶剂为乙酸乙酯、叔戊醇和环已烷中的一种或多种组合。
16.优选的，步骤(1)、(3)和(4)中所述的缓冲液为醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、tris～hcl 缓冲液中的任意一种。
17.一种茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂，通过上述制备方法制备得到。所述益生菌促进剂是以茶油糖蛋白结合物为壳，油茶皂苷为核组成的纳米制剂。
18.上述茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂在制备肠道菌群调节药物中的应用。
19.优选的，所述的肠道菌群调节包括促进乳酸杆菌和/或双歧杆菌增殖，抑制大肠埃希菌增殖。所述益生菌促进剂可以在口服后抑制有害菌而促进肠道乳酸杆菌和双歧杆菌的显著增殖，从而可预防因肠道有害菌导致的疾病。
20.本发明的原理：脱脂茶粕经缓冲液提取为油茶糖蛋白和皂苷的混合液，经大孔树脂吸附分离得到油茶皂苷，未吸附液经透析分离得到油茶糖蛋白，茶油经脂肪酶水解后得到脂肪酸，与油茶糖蛋白发生在两相体系中发生酯化连接，形成茶油糖蛋白结合物。油茶皂苷与茶油糖蛋白结合物再经纳米乳化后，由于茶油糖蛋白结合物具有两亲性，其亲水性糖蛋白在外，疏水性脂肪酸基团在内与油茶皂苷相连，形成油茶糖蛋白为壳和油茶皂苷为核的纳米结构。油茶糖蛋白为酸性糖蛋白，在胃液中稳定，在肠道内水解而释放多糖、蛋白、脂肪酸和皂苷，不仅提供了肠道有益菌多种营养，而且皂苷对有害菌进行抑制，从而可促进肠道有益菌增殖，并保持人体健康。
21.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
22.(1)本发明制备了一种茶油糖蛋白皂苷纳米制剂，保持油茶皂苷在胃液中的稳定性。
23.(2)本发明提供的茶油糖蛋白皂苷纳米制剂，克服了茶多糖或茶油只能提供单一营养，且不能抑制有害菌的缺点，可同时实现肠道有效菌的增殖和有害菌的抑制。
24.(3)本发明提供的方法反应条件温和，易于工业化生产。
具体实施方式
25.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
26.下述实施例中所用脱酯茶粕为将茶粕粉碎，过20目筛，向其中加入正已烷试剂，搅拌，转速3000转/min离心20min分离所得。
27.实施例1
28.(1)脱脂茶粕1kg中加入8kg的50℃ph5醋酸缓冲液提取3h后，过滤，滤液用ab-8 大孔树脂1kg吸附8h；
29.(2)将上述未被吸附液用截留分子量50kda的膜透析24h，截留液冷冻干燥24h，得油茶糖蛋白170g；将吸附后的大孔树脂用1kg体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱，洗脱液经50℃、 0.01mpa干燥3h，得油茶皂苷90g；
30.(3)茶油100g加入5g脂肪酶和800g的50℃ph5醋酸缓冲液反应3h后，加入500g 乙酸乙酯和50g油茶糖蛋白，继续反应1h后，静置8h，上层液经50℃，0.01mpa浓缩干燥 3h，得茶油糖蛋白结合物110g；
31.(4)将油茶皂苷10g与50g的茶油糖蛋白结合物，分别用体积分数70％乙醇水溶液和 ph5醋酸缓冲液配制成5％的溶液，在5000转/min搅拌下，将油茶皂苷溶液加入到茶油糖蛋白结合物溶液中，搅拌10min后过0.1μm微孔滤膜，即得茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂。
32.实施例2
33.(1)脱脂茶粕1kg中加入30kg的70℃ph10磷酸缓冲液提取1h后，过滤，滤液用hpd100 大孔树脂3kg吸附24h；
34.(2)将上述未被吸附液用截留分子量200kda的膜透析48h，截留液冷冻干燥48h，得油茶糖蛋白240g；将吸附后的大孔树脂用9kg体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱，洗脱液经 70℃、0.1mpa干燥5h，得油茶皂苷125g；
35.(3)茶油100g加入10g脂肪酶和3000g的70℃、ph10磷酸缓冲液反应3h后，加入1000g 的叔戊醇和150g的油茶糖蛋白，继续反应3h后，静置24h，上层液经70℃、0.1mpa浓缩干燥5h，得茶油糖蛋白结合物180g；
36.(4)将油茶皂苷10g与200g的茶油糖蛋白结合物，分别用体积分数80％乙醇水溶液和 ph10磷酸缓冲液配制成10％的溶液，在20000转/min搅拌下，将油茶皂苷溶液加入到茶油糖蛋白结合物溶液中，搅拌60min后过0.5μm微孔滤膜，即得茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂。
37.实施例3
38.(1)脱脂茶粕1kg中加入20kg的60℃ph8 tris～hcl缓冲液提取2h后，过滤，滤液用hpd400大孔树脂2kg吸附16h；
39.(2)将上述未被吸附液用截留分子量100kda的膜透析36h，截留液冷冻干燥36h，得油茶糖蛋白210g；将吸附后的大孔树脂用5kg体积分数为60％的乙醇水溶液洗脱，洗脱液经 60℃、0.05mpa干燥4h，得油茶皂苷110g；
40.(3)茶油100g加入8g脂肪酶和2000g的60℃ph8 tris～hcl缓冲液反应2h后，加入 800g的环已烷和120g的油茶糖蛋白，继续反应2h后，静置16h，上层液经60℃、0.05mpa 浓缩干燥4h，得茶油糖蛋白结合物140g；
41.(4)将油茶皂苷10g与100g的茶油糖蛋白结合物，分别用体积分数75％乙醇水溶液和 ph8 tris～hcl缓冲液配制成8％的溶液，在10000转/min搅拌下，将油茶皂苷溶液加入到茶油糖蛋白结合物溶液中，搅拌40min后过0.3μm微孔滤膜，即得茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂。
42.实施例4
43.(1)脱脂茶粕1kg中加入15kg的55℃ph6醋酸缓冲液提取1.5h后，过滤，滤液用d101 大孔树脂1.5kg吸附12h；
44.(2)将上述未被吸附液用截留分子量75kda的膜透析30h，截留液冷冻干燥30h，得油茶糖蛋白186g；将吸附后的大孔树脂用3kg体积分数为55％的乙醇水溶液洗脱，洗脱液经65℃、 0.1mpa干燥3.5h，得油茶皂苷96g；
45.(3)茶油100g加入7g脂肪酶和1000g的55℃ph5.5醋酸缓冲液反应1.5h后，加入600g 的叔戊醇和70g的油茶糖蛋白，继续反应1.5h后，静置12h，上层液经65℃、0.05mpa浓缩干燥3.5h，得茶油糖蛋白结合物135g；
46.(4)将油茶皂苷10g与80g的茶油糖蛋白结合物，分别用体积分数60％乙醇水溶液和 ph5.5醋酸缓冲液配制成6％的溶液，在6000转/min搅拌下，将油茶皂苷溶液加入到茶油糖蛋白结合物溶液中，搅拌30min后过0.2μm微孔滤膜，即得茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂。
47.实施例5
48.(1)脱脂茶粕1kg中加入25kg的65℃ph7.5磷酸缓冲液提取2.5h后，过滤，滤液用 ykdh-2大孔树脂2.5kg吸附20h；
49.(2)将上述未被吸附液用截留分子量150kda的膜透析40h，截留液冷冻干燥40h，得油茶糖蛋白213g；将吸附后的大孔树脂用5kg体积分数为65％的乙醇水溶液洗脱，洗脱液经 65℃、0.06mpa干燥4.5h，得油茶皂苷107g；
50.(3)茶油100g加入6g脂肪酶和1500g的65℃ph7.5磷酸缓冲液反应2.5h后，加入800g 的环已烷和100g的油茶糖蛋白，继续反应2.5h后，静置20h，上层液经65℃，0.06mpa浓缩干燥4.5h，得茶油糖蛋白结合物153g；
51.(4)将油茶皂苷10g与160g的茶油糖蛋白结合物，分别用体积分数65％乙醇水溶液和 ph7.5缓冲液配制成8％的溶液，在12000转/min搅拌下，将油茶皂苷溶液加入到茶油糖蛋白结合物溶液中，搅拌25min后过0.4μm微孔滤膜，即得茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂。
52.对比例1
53.按实施例1制备方法，但在步骤(3)中不加入油茶糖蛋白，所制得的产品为对照1。
54.对比例2
55.按实施例1制备方法，但在步骤(4)中将茶油糖蛋白结合物替换为卵磷脂，所制得的产品为对照2。
56.测试1：
57.实施例1～5制得的茶油糖蛋白结合物的组成分析
58.方法：将实施例1～5制得的茶油糖蛋白结合物，取适量按照中华人民共和国农业行业标准～食用菌中粗多糖含量的测定(ny/t1676～2008)测定样品中的糖含量，按照中华
人民共和国出入境检验检疫行业标准～出品乳、蛋、豆类食品中蛋白质含量的测定考马斯亮蓝法 (sn/t3926～2006)测定样品中的蛋白含量，按照食品安全国家标准～食品中脂肪酸的测定 (gb5009.168～2016)第一法测定样品中的脂肪酸含量。
59.结果：实施例1～5制得的茶油糖蛋白结合物中的糖、蛋白和脂肪酸含量见表1，每100g 产品中含糖8.4～11.6％、蛋白10.5～17.4％和脂肪酸67.9～78.7％，说明该结合物中同时含有糖、蛋白和脂肪酸三种营养成分。
60.表1茶油糖蛋白结合物的含量组成
61.样品来源糖含量％蛋白质含量％脂肪酸含量％实施例19.711.876.4实施例210.315.373.2实施例38.410.578.7实施例49.212.671.5实施例511.617.467.9
62.测试2：
63.实施例1～5制得的茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂中纳米粒径和油茶皂苷载药量的测定
64.方法：将实施例1～5制得的茶油糖蛋白皂苷纳米制剂、对照1和对照2，采用马尔文纳米粒度仪测定其粒径，并取适量通过微柱离心法除去游离皂苷，按照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准～出口茶皂素中皂甙含量的测定(sn/t1852～2006)测定茶皂苷的含量，计算载药量。
65.结果：实施例1～5制得的茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂的粒径和油茶皂苷含量见表2，其粒径为219～284nm，载药量为3.7～12.6％，说明该产品为负载了茶皂苷的纳米制剂。对照1无载药，说明茶油脂肪酸不具备包载能力；对照2有少量载药，说明脂质体可包载油茶皂苷，但载药量低。
66.表2茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂的粒径和茶皂苷载药量
[0067][0068][0069]
测试3实施例1-5制得的茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂在模拟胃肠液中的稳定性测定
[0070]
方法：采用模拟人工胃液(含1％胃蛋白酶，ph＝1.2)和模拟人工肠液(含1％胰蛋白酶， ph＝6.8)对甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米制剂进行稳定性评价。将1ml实施例1-5制得的茶油糖蛋白皂苷纳米制剂、对照2加入到4ml模拟人工胃液或肠液中，于37℃、100rpm振荡孵育，每隔2h时间间隔取样200μl，通过微柱离心法除去渗出的游离皂苷，将得到的滤液转移至5 ml容量瓶中，甲醇定容，超声破乳。采用中华人民共和国出入境检验检疫行业标准～出口茶皂素中皂甙含量的测定(sn/t1852～2006)测定皂苷的含量，以0时刻的药物浓度为100％，计算该制剂各时间点残存皂苷的百分率。
[0071]
结果：实施例1-5制得的茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂在模拟胃液中4h内皂苷仍保留了80％以上，而在肠液中降解较快，结果见表3。说明该产品具有提高胃液稳定性作用，而在肠道中能够快速释放皂苷。对照2在胃肠液中均释药快，表明该脂质体在胃肠液中不稳定。
[0072]
表3茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂在模拟胃肠液中皂苷的保留率(％)
[0073][0074]
测试4
[0075]
实施例1制得的茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂的作用效果
[0076]
方法：取250
±
25g雄性sd大鼠40只，随机分为8组，每组5只。第1组给予正常大鼠饲料，第2组给予高脂饲料(87.6％标准饲料、2％胆固醇、0.2％胆酸钠、10％猪油)，第3～ 8组在给予高脂饲料，再分别灌胃茶油、实施例1制得的油茶糖蛋白、茶皂苷、茶油糖蛋白结合物、茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂、对照2，每1g/100g体重剂量，一日两次。分别于15天和30天，取大鼠粪便，对其进行肠道菌群及益生菌(如双歧杆菌和乳酸杆菌) 的16srna宏基因组测序，并对各种益生菌和大肠杆菌的丰度分析(相对百分比)。
[0077]
结果：结果见表4，显示第2组模型大鼠益生菌较正常组显著下降，但大肠埃希菌增加，第3～5组和第8组较第二组有所改善，但与正常组差异不大；第6组有显著增加，而第7组最优，说明茶油糖蛋白结合物能提供肠道益生菌较全面的营养，促进它们增殖，而茶油糖蛋白皂苷纳米肠道益生菌促进剂不仅能提供全面营养，而且可通过茶皂苷对有害菌群大肠埃希菌的抑制，更好地促进了肠道益生菌的增殖。
[0078]
表4大鼠粪便中益生菌的相对丰度(％)
[0079][0080]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。