一种改善皮肤微生态环境的组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及化妆品领域，具体是涉及一种改善皮肤微生态环境的组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.皮肤是人体抵御外界危害的第一道屏障，其直接同外界环境接触，具有保护、排泄、调节体温和感受外界刺激等作用，是人的身体器官中最大的器官。人类皮肤微生物群落具有丰富的多样性，其组成受年龄、躯体部位、性别等因素的影响。研究显示，皮肤菌群在不同部位的丰度和构成差异很大，与皮肤皮脂腺的分布及皮肤湿度等密切相关：皮肤油脂分泌旺盛部位(前额等)的菌群以丙酸杆菌属为主，潮湿部位(肘前窝等)以棒状杆菌属和葡萄球菌属为主，干性部位(前臂掌侧等)则菌群种属多样。表皮脂质的组成，特别是长链不饱和游离脂肪酸的水平与定植菌群的组成密切相关，如长链不饱和脂肪酸水平与丙酸杆菌和棒状杆菌的丰度呈显著正相关。这种正相关可能与细菌的亲脂性有关，菌群利用脂肪酶水解皮脂释放出的游离脂肪酸，有利于其在皮肤上的定植。皮肤表面定植着众多微生物，宿主与共生微生物菌群之间依赖免疫细胞和分子网络相互作用，建立并维持皮肤的健康稳态。
3.目前市面上有关皮肤微生态的产品研究主要是针对皮肤表面菌落状态的改善，增加有益菌的数目，减少有害菌的数目。但由于皮肤表面环境是随着外界环境的改变不断变化的，表面菌群的生长与活动也是在不断变化的，因此现有研究例如cn201811353397.7、cn201611027229.x只改变了皮肤菌群的架构，这种改善并不一定使皮肤达到健康状态，有可能使皮肤陷入另一种菌群失调的状态。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供一种改善皮肤微生态环境的组合物及其制备方法和应用。本发明改善皮肤微生态的组合物一方面影响菌群的架构使皮肤菌群趋向于健康皮肤的状态，另一方面影响皮肤细胞对菌落变化进行应答，提高皮肤细胞对有害菌的免疫力，使皮肤细胞处于能够稳定自我调节的状态。
5.本发明提供了一种能够有效改善皮肤微生态环境的面膜肌底液，所述改善皮肤微生态环境的面膜肌底液包含水、甘油、丁二醇、双丙甘醇、赤藓醇、双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯、对羟基苯乙酮、精氨酸、聚甲基硅倍半氧烷、丙烯酸(酯)类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、泛醇、乙基己基甘油、卡波姆、甘草酸二钾、edta二钠和改善皮肤微生态环境的组合物，其中所述改善皮肤微生态环境的组合物包含茉莉花提取物、菊苣根提取物和β-葡聚糖。
6.为达到本发明的目的，本发明提供的改善皮肤微生态环境的组合物包含茉莉花提取物、菊苣根提取物和β-葡聚糖，所述茉莉花提取物、菊苣根提取物、β-葡聚糖的质量比为1-6：1-3：1-3。
7.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述茉莉花提取物的制备方法为：将茉莉
花粉碎得茉莉花粉末，加入质量浓度为45-55％的丁二醇溶液提取，茉莉花粉末与丁二醇溶液质量比为1：5-20，40-50℃水浴3-5小时，加入纤维素酶，所加入的酶总质量占原料总质量的5-10％，搅拌，升温至40-60℃微波处理，超声水浴回流提取，将得到的提取液冷却至20-30℃，用100-200目纱布过滤，得茉莉花粗提液，再置于旋转蒸发仪中减压浓缩，温度为50-60℃，得流浸膏，用蒸馏水溶解浸膏，加入澄清剂，静置后离心，过滤取上清液，得滤液，再用微滤膜过滤，即得茉莉花提取物。
8.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述菊苣根提取物的制备方法为：将菊苣根粉碎得菊苣根粉末，将菊苣根粉末与去离子水以1：1-3的体积比混合，60-70℃水浴3-5小时，依次加入质量比3:1的纤维素酶和糖苷酶，所加入的酶总质量占原料总质量的5％-10％，超声水浴回流提取，得到的提取液冷却至室温，用100-200目纱布过滤，得菊苣根粗提液，再置于旋转蒸发仪中减压浓缩，温度为50-60℃，得流浸膏，用蒸馏水溶解浸膏，加入澄清剂，静置后离心，过滤取上清液，得滤液，再用微滤膜过滤，即得菊苣根提取物。
9.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述β-葡聚糖为燕麦来源的β-葡聚糖粉末。
10.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述澄清剂为常见澄清剂，如壳聚糖、纤维素、明胶、果胶等中的一种或几种。
11.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述微滤膜孔径为0.1-1.0μm。
12.茉莉花是木犀科、素馨属直立或攀援灌木，高达3米，为著名的花茶原料及重要的香精原料。茉莉花含有大量芳香油、香叶醇、橙花椒醇、丁香酯等20多种化合物，除了有较好的抑菌抗炎作用外，对超氧自由基的消除、酪氨酸酶的抑制、脂肪细胞脂肪分解的促进也有明显功效。toll样受体(toll-like receptors,tlr)是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。近年来研究表明，黑素细胞在细胞免疫反应中发挥着重要作用，黑素细胞表达天然免疫受体tlr，并通过tlr直接感知环境刺激。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜等时，tlr可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子并激活机体产生免疫细胞应答，将炎症信号向t细胞进行呈递，升高细胞的炎症水平。因此可通过抑制黑素细胞对黑色素的分泌来减少tlr受体的表达，减弱由有害微生物造成的炎症反应。
13.菊苣根为菊科植物毛菊苣及菊苣干燥的根，是一种维吾尔族的传统中草药。主根呈圆锥形，有侧根及多数须根，长10～20cm，直径0.5～1.5cm，表面棕黄色，具细腻不规则纵皱纹。质硬，不易折断，断面外侧黄白色，中部类白色，有时有空心，气微，味苦。菊苣具有调血脂和降尿酸的功能，对高尿酸三酰甘油血症具有很好的调节作用，并且可明显改善由高嘌呤饮食引发的高尿酸血症及腹型肥胖。其作用机制可能是通过降低肝脏乙酰辅酶a羧化酶、脂肪酸合成酶以及黄嘌呤氧化酶活性，从而发挥综合调节尿酸及腹部脂肪堆积的作用。
14.葡聚糖是指以葡萄糖为单糖组成的同型多糖，葡萄糖单元之间以糖苷键连接。其中根据糖苷键的类型又可分为α-葡聚糖和β-葡聚糖。它能够活化巨噬细胞、嗜中性白血球等，因此能提高白细胞素、细胞分裂素和特殊抗体的含量，全面刺激机体的免疫系统。本发明中燕麦来源的β-葡聚糖属于植物胶聚糖，具有一定的抗敏、抗炎的功效，且能够与较多的原料相互配伍，不会出现过敏反应，相反还会提高保湿能力，因此成为化妆品中常用原料。
15.优选地，在本发明的一些实施方式中，所述茉莉花提取物、菊苣根提取物、β-葡聚
糖的质量比为1：1-1.5：1-1.5，例如2：3：2，1：1：1，2：2：3。
16.更优选地，在本发明的一些实施方式中，所述茉莉花提取物、菊苣根提取物、β-葡聚糖的质量比为1：1-1.5：1。
17.进一步地，本发明还提供了一种前述改善皮肤微生态环境的组合物的制备方法，所述方法包含以下步骤：
18.(1)将茉莉花和菊苣根分别粉碎得粉末；
19.(2)茉莉花粉末中加入质量浓度为45-55％的丁二醇溶液提取，茉莉花粉末与丁二醇溶液质量比为1：5-20，40-50℃水浴3-5小时，加入纤维素酶，所加入的酶总质量占原料总质量的5-10％，搅拌，升温至40-60℃微波处理，超声水浴回流提取1-3小时；
20.(3)将步骤(2)得到的提取液冷却至20-30℃，用100-200目纱布过滤，得茉莉花粗提液；
21.(4)将菊苣根粉末与去离子水以1：1-3的体积比混合，60-70℃水浴3-5小时，依次加入质量比为3:1的纤维素酶和糖苷酶，所加入的酶总质量占原料总质量的5％-10％，超声水浴回流提取1-3小时，
22.(5)将步骤(4)得到的提取液冷却至室温，用用100-200目纱布过滤，得菊苣根粗提液；
23.(6)将茉莉花粗提液和菊苣根粗提液分别置于旋转蒸发仪中减压浓缩，温度为50-60℃，得流浸膏；用1-3倍量的蒸馏水溶解浸膏，加入澄清剂，静置后离心30-60分钟，过滤取上清液，得滤液1和滤液2；
24.(7)向步骤(6)得到的滤液1和滤液2用微滤膜过滤后得到茉莉花提取物和菊苣根提取物；
25.(8)将茉莉花提取物和菊苣根提取物混合，加入燕麦来源的β-葡聚糖粉末，搅拌混合均匀充分溶解，于室温静置3-5h，即得改善皮肤微生态环境的提取物组合物。
26.另一方面，本发明还提供了一种前述改善皮肤微生态环境的组合物的应用，所述应用为将所述组合物用作化妆品或是化妆品助剂、添加剂。
27.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述组合物占化妆品的质量百分比为0.5-5％。
28.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述化妆品为水剂、乳剂、喷雾、膏霜、凝胶剂或面膜，但本发明所述化妆品并不限于上述这些。
29.与现有技术相比，本发明的优点如下：
30.(1)本发明通过组合发现，将本发明所得茉莉花提取物、菊苣根提取物和燕麦来源的β-葡聚糖三者组合后，具有三重功效，协同作用改善皮肤的微生态环境：一方面通过降低黑色素细胞的toll受体的表达，抑制菌群感染时细胞的炎症反应；另一方面，促进皮肤益生菌的生长且抑制致病菌增长，改善皮肤表面菌群的环境。
31.(2)现有的研究几乎没有提及到茉莉花、菊苣根、β-葡聚糖三者复配在化妆品领域的应用，而本发明以三者复配比例，以皮肤微生态环境为切入点进行相关测试，最终获得了一种能够有效改善皮肤微生态环境的提取组合物。
32.(3)本发明的组合物通过粉碎、提取、浓缩、配方、除菌等工艺制备所得，各组分协同效应良好，能够改善皮肤表面微生态环境，且性质温和、易于吸收、无刺激，特别符合人们
对化妆品安全有效、零负担的要求，可广泛应用于皮肤护理化妆品。
附图说明
33.图1是本发明中人黑素细胞的toll受体表达检测实验结果示意图；
34.图2是本发明中皮肤外植体β-防御素3检测实验结果示意图；
35.图3是本发明中hacat细胞中caspase-14的表达检测实验结果示意图；
36.图4是本发明中经皮水分流失实验结果示意图；
37.图5是本发明中红斑修复测试实验结果示意图；
38.图6是本发明中光泽度改善实验结果示意图。
具体实施方式
39.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
40.本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
41.当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
42.本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。
43.此外，下面所描述的术语“一个实施例”、“一些实施方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。而且，本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
44.实施例1-15与对比例1-3
45.在本发明的实施例1-15和对比例1-3中，改善皮肤微生态环境的提取物组合物的制备方法如下：
46.(1)将茉莉花和菊苣根分别粉碎；
47.(2)加入丁二醇溶液提取，茉莉花粉末与50％的丁二醇溶液质量比为1:10，48℃水浴3-5小时，加入纤维素酶，所加入的酶总质量占原料总质量的5％，搅拌30分钟，升温至56
℃微波处理15分钟，超声水浴回流提取3小时；
48.(3)将步骤(2)得到的提取液冷却至室温，用200目纱布过滤，得粗提液1；
49.(4)将菊苣根粉末与去离子水以1:1体积比混合，65℃水浴3小时，依次加入质量比3:1的纤维素酶和糖苷酶，所加入的酶总质量占原料总质量的5％，超声水浴回流提取3小时，
50.(5)将步骤(4)得到的提取液冷却至室温，用用200目纱布过滤，得粗提液2；
51.(6)将粗提液1和粗提液2，分别置于旋转蒸发仪中减压浓缩，温度为55℃，得流浸膏；用3倍量的蒸馏水溶解浸膏，加入澄清剂，静置后离心30分钟，过滤取上清液，得滤液1和滤液2；
52.(7)向步骤(6)得到的滤液1和滤液2用微滤膜过滤后得到茉莉花提取物和菊苣根提取物；
53.(8)将茉莉花提取物和菊苣根提取物混合，按质量比加入燕麦来源的β-葡聚糖粉末，搅拌混合均匀充分溶解，于室温静置3h，得到一种改善皮肤微生态环境的提取物组合物。
54.实施例1-15和对比例1-3中原料组成配比如表1所示。
55.表1实施例1-15和对比例1-3中原料组成配比
56.[0057][0058]
菌群生长实验
[0059]
实验方法：在含有5％不同组合物的培养介质中，同时接种益生菌和病原菌，观察24小时后菌群的细胞数目，各组初始浓度均为106(细胞/ml)。
[0060]
实验结果如表2所示。
[0061]
表2菌群生长实验结果
[0062]
[0063][0064]
上述试验结果表明，测试例1-15组合物相对空白组，都具有增强益生菌生长、抑制有害菌生长的效果，但相同条件下组合物比例不同，对微生物的效果也会有所不同，且这种不同是显著的，预料不到的，其中组合物6、8、10的效果相对较好。
[0065]
人黑素细胞的toll受体表达检测
[0066]
用无菌管收集培养的黑色素细胞，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。用pbs(ph7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成分，离心20分钟左右(2000-3000转/分)，收集上清。
[0067]
(1)标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。
[0068]
稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml。
[0069]
(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
[0070]
(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
[0071]
(4)配液：将30(48t的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48t的20倍)倍稀释后备用。
[0072]
(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
[0073]
(6)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
[0074]
(7)温育：操作同(3)。
[0075]
(8)洗涤：操作同(5)。
[0076]
(9)显色：每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
[0077]
(10)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
[0078]
(11)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)，测定应在加
终止液后15分钟以内进行。
[0079]
(12)以各组吸光度的变化率为实验数据制作表格，最终实验结果如附图1所示。
[0080]
实验数据表明，各组合物都能提高黑素细胞中toll受体的表达，但差异较大，其中以组合物6/8/10效果最好，因此能够判断该组合能够增强细胞内的免疫反应进程，增强皮肤的抵抗力。
[0081]
皮肤外植体β-防御素3检测
[0082]
防御素是一类富含二硫键的阳离子型多肽，广泛分布于真菌、植物与动物中，是生物免疫系统中的重要调节分子，具有直接的杀菌功能，是一类重要的抗菌肽。
[0083]
用5.00％各组合物处理的皮肤外植体在培养基中进行体外研究(与未处理对照组对比)。在第7天，通过免疫标记对β-防御素3进行定量。对照组未做任何处理，实验结果如附图2所示。
[0084]
实验结果表明，各组合物能够有效升高皮肤细胞中β-防御素3的含量，有效改善皮肤细胞对外界微生物环境变化的适应能力，有效改善皮肤微生态环境。其中，组合物6/8/10改善效果最好。
[0085]
hacat细胞中caspase-14的表达检测
[0086]
采用人表皮角质形成细胞系hacat细胞，用已知的角质形成细胞分化诱导剂cacl2诱导hacat细胞表达flg和caspase-14，采用实时定量pcr法定量细胞内的flg和caspase-14的mrna表达水平，结果如附图3所示。
[0087]
flg(丝聚蛋白)和caspase-14(半胱氨酸蛋白酶)是反映皮肤屏障功能的两个重要因子，可作为内源性保湿策略的重要靶标，而nmf主要由角质细胞在分化过程中表达的flg降解生成。本发明实验结果表明，各组合物能够有效升高hacat细胞中caspase-14的表达，促进nmf的生成，促进内源性保湿，维持皮肤屏障健康，增强皮肤细胞的免疫能力和修复能力，使皮肤细胞能够很好的抵抗外界环境的变化。其中，组合物6/8/10改善效果最好。
[0088]
人体功效测评
[0089]
本发明提供了一种能够有效改善皮肤微生态环境的面膜肌底液，具体配方如表3所示。
[0090]
表3面膜肌底液
[0091]
[0092][0093]
将本发明组合物6、8、10加入上表面膜肌底液配方中，添加量为1％，制得面膜肌底液，记为样品1、样品2、样品3，进行试验。
[0094]
(1)安全性测试(人体皮肤斑贴试验)
[0095]
选取15名年龄为20-50岁之间的无皮肤病过敏史的健康受试者，选用合格的斑试器，以封闭式斑贴试验方式，取约15μl样品1-3的样品滴于斑试器内，外用专用胶带贴覆于受试者背部，每个受试者贴20个斑试器，分别贴试样品1-3的肌底液样品，24小时后除去受试物，去除后分别于0.5、6、12、24、48小时观察皮肤反应，按照《护肤品卫生规范》中皮肤反应等级标准记录其结果。试验结果显示所有受试者通过斑贴试验，在0.5、6、12、24、48小时观察皮肤反应，其中0例出现皮肤红斑、丘疹、水疱等不良反应，说明本发明的产品安全，无刺激。
[0096]
(2)皮肤水分流失及红斑修复测试
[0097]
测试人数：共27人；分为3组，每组9人。
[0098]
受试部位：受试人员前臂屈侧柔弱的皮肤处。
[0099]
将要进行试验的部位用70％酒精进行消毒，待酒精完全蒸发后，测定皮肤skin color红斑值(erythema)和tewl值；在受试人员前臂屈侧较为柔弱的皮肤处选定1*1cm2的区域。试验组采用0.075％辣椒素刺激记录数据，再给予上述优选组合物6、8、10(20μl，
10mg/ml)保护，30min后进行skin color红斑值和tewl值的测定，评价修复状况。
[0100]
实验结果：结果如附图4-5所示，所述各提取组合物可有效缓解由于辣椒素刺激所产生的经皮水分散失(tewl)升高和红斑(erythema)的增加。
[0101]
(3)光泽度改善
[0102]
受试样品：以不添加植物提取物的面膜肌底液为对照组，样品1-3为实验组。
[0103]
受试人群27人，年龄18-35岁之间，面部都有明显的暗黄，粗糙，皱纹等不良状态，无皮肤过敏史，符合受试者志愿入选标准，分成3组，每组9人。
[0104]
测试方法：取适量受试样品于涂在已清洁的患处，每天2次，早晚各1次，持续4周。受试者在使用期间保持良好作息时间和饮食习惯，4周后统计受试者的反馈情况，以光泽度的变化量为实验数据，制作表格，实验数据如附图6所示。
[0105]
实验结果表明，三组样品能够均改善皮肤光泽度，减少皮肤暗黄粗糙皱纹等不良状况，且使用两周后就能具有很好的改善效果。
[0106]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。