一种生物3D打印组织工程气管及其构建方法与应用

本发明属于生物医学组织工程领域，尤其是涉及一种生物3d打印组织工程气管及其构建方法与应用。

背景技术：

1、功能性节段气管重建在临床上一直是一个巨大的挑战，主要是因为缺乏理想的气管移植物。近年来，组织工程技术的发展为气管缺损重建提供了一种全新的治疗手段。虽然，目前使用组织工程管状软骨构建的气管移植物在动物验证上已经取得了一定的修复效果，但是单一、均质的管状气管结构必然会导致力学缺陷(例如缺乏纵向拉伸、横向弯折能力等)，并且缺乏软骨环之间的血管化纤维组织为软骨再生提供必要的营养物质，不利于最终走向临床应用。值得注意的是，真实的气管结构是具有交替软骨环和血管化纤维组织环的异质结构，这对实现气管的力学和生理功能至关重要。

2、最近，文献报道了一种基于软骨环组装成管状结构气管的构建理念，是通过交替堆叠软骨环和高分子环(无细胞)形成管状结构实现的，能够在一定程度上模拟天然气管的生理结构(参考文献：biomimetic trachea regeneration using a modular ringstrategy based on poly(sebacoyl diglyceride)/polycaprolactone for segmentaltrachea defect repair；y.xu,y.guo,y.li,y.huo,y.she,h.li,z.jia,g.jiang,g.zhou,z.you,l.duan,adv.funct.mater.2020,30,2004276.)。但是，上述研究未能解决以下问题：1)合成材料缺乏理想的生物相容性和组织特异性微环境；2)需要长期的体外培养过程才能达到满意的软骨形成进行体内气管缺损重建；3)手工制备的管状结构无法实现细胞排布和交替结构的精确可控；4)血管化纤维组织再生依赖于随机细胞浸润，往往会导致组织形成不稳定及血管化较差；5)软骨环和血管化纤维环的界面整合设计不合理，容易脱落；6)缺乏对再生气管进行系统的功能评估。因此，本领域迫切需要提供一种新型的组织工程气管的构建方法。

技术实现思路

1、基于现有技术中组织工程管状软骨构建的气管移植物在力学、生理学等方面存在的性能缺陷，本发明提供一种生物3d打印组织工程气管及其构建方法与应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明首先提供一种生物3d打印组织工程气管，为一种由软骨环和血管化纤维环交替堆积成型的环形管状结构，

4、所述软骨环为由软骨组织特异性水凝胶包裹软骨细胞制备的软骨特异性生物墨水3d打印而成，

5、所述血管化纤维环为由纤维组织特异性水凝胶包裹成纤维细胞制备的纤维特异性生物墨水3d打印而成，

6、所述软骨环和血管化纤维环具有典型的组织特征，所述软骨环和血管化纤维环为一体化结构。

7、本发明中，所述软骨组织特异性水凝胶是指具有成软骨定向诱导功能的水凝胶，由软骨组织特异性水凝胶包裹软骨细胞制备的软骨特异性生物墨水是指具有成软骨定向诱导功能的生物墨水。

8、本发明中，所述纤维特异性水凝胶是指具有成纤维定向诱导功能的水凝胶；由纤维组织特异性水凝胶包裹成纤维细胞制备的纤维特异性生物墨水是指具有成纤维定向诱导功能的生物墨水。

9、本发明中，所述生物3d打印组织工程气管的结构特征在于：1)具有环形管状结构；2)软骨环和血管化纤维环的交替结构；3)软骨环和血管化纤维环具有典型的组织特征；4)软骨环和血管化纤维环实现一体化整合。

10、在本发明的一个实施方式中，所述环形管状结构的内径为0.1～40mm，外径为0.5～50mm，高为0.1～100mm，优选为内径2～5mm，外径4～10mm，高5～20mm。

11、在本发明的一个实施方式中，所述软骨环和血管化纤维环的厚度比例为10:1～1:10，优选为5:1～1:1，进一步优选为2:1～1.5:1。

12、在本发明的一个实施方式中，所述软骨环具有以下组织特征：再生软骨呈现典型的软骨陷窝结构，组织学上具有番红和二型胶原的软骨特异性染色。

13、在本发明的一个实施方式中，所述血管化纤维环具有以下组织特征：再生纤维组织中呈现清晰的血管结构，cd31的成血管特异性染色以及masson和一型胶原的成纤维特异性染色。

14、在本发明的一个实施方式中，所述软骨环和血管化纤维环的界面粘接力为1kpa～10mpa，优选为100kpa～1mpa。

15、在本发明的一个实施方式中，所述软骨组织特异性水凝胶是将水溶性高分子溶于生物相容性介质，并加入软骨组织特异性成分，经交联制备的软骨组织特异性水凝胶材料。

16、在本发明的一个实施方式中，所述纤维组织特异性水凝胶是将水溶性高分子溶于生物相容性介质，并加入纤维组织特异性成分，经交联制备的纤维组织特异性水凝胶材料。

17、在本发明的一个实施方式中，所述水溶性高分子选自天然高分子材料或合成高分子材料。

18、在本发明的一个实施方式中，所述天然高分子材料包括天然多糖类物质及其修饰物或降解物，蛋白及其修饰物或降解物。

19、在本发明的一个实施方式中，所述天然多糖类物质包括透明质酸、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、海藻酸、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖或壳聚糖季铵盐。

20、在本发明的一个实施方式中，所述蛋白包括各种亲水或水溶性动植物蛋白、胶原蛋白、血清蛋白、丝素蛋白、弹性蛋白。

21、在本发明的一个实施方式中，所述蛋白降解物包括明胶或多肽。

22、在本发明的一个实施方式中，所述合成高分子材料包括两臂或多臂聚乙二醇、聚乙烯亚胺、树枝体、合成多肽、聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮。

23、在本发明的一个实施方式中，所述水凝胶材料优选为天然多糖类或蛋白类高分子，进一步优选为透明质酸、明胶。

24、在本发明的一个实施方式中，所述生物相容性介质选自蒸馏水、生理盐水、缓冲液或细胞培养基溶液。根据不同的应用，可选取不同的生物相容性介质。

25、在本发明的一个实施方式中，所述水溶性高分子溶于生物相容性介质后，所述水溶性高分子的浓度为0.1％w/v-60％w/v，优选为1％w/v-20％w/v。

26、在本发明的一个实施方式中，所述软骨组织特异性成分包括：软骨脱细胞基质、促软骨分化的生长因子等。

27、在本发明的一个实施方式中，所述软骨脱细胞基质来源于动物体内各种含软骨的组织，优选为耳软骨、关节软骨、半月板软骨、肋软骨等。

28、在本发明的一个实施方式中，所述动物包括猪、牛、羊、狗、兔子、老鼠等，优选为猪、牛、羊、狗。

29、在本发明的一个实施方式中，所述促软骨分化的生长因子包括tgf-β，vegf，fgf等。

30、在本发明的一个实施方式中，所述纤维组织特异性成分包括：成纤维脱细胞基质，促成纤维分化的生长因子等。

31、在本发明的一个实施方式中，所述成纤维脱细胞基质来源于动物体内各种含纤维的组织，优选为皮肤、真皮、肌肉等。

32、在本发明的一个实施方式中，所述动物包括猪、牛、羊、狗、兔子、老鼠等，优选为猪、牛、羊、狗。

33、在本发明的一个实施方式中，所述促成纤维分化的生长因子包括tgf-β，vegf，fgf，bmp-2～9等。

34、在本发明的一个实施方式中，制备所述软骨组织特异性水凝胶或所述纤维组织特异性水凝胶时，交联方式选择物理交联或化学交联或光交联中的一种或多种交联方式，或单一交联方式的多种材料组合交联形成。

35、在本发明的一个实施方式中，所述物理交联是通过高分子链间的缠结或非共价键交联(参考文献xiangyu liang,pingguo duan,jingming gao,et al.acsbiomater.sci.eng.2018,4,3506.)。所述物理交联反应包括热缩合(温敏性)：聚异丙基丙烯酰胺(pnipaam)、嵌段共聚物(peo-ppo-peo、plga-peg-plga、peg-plla-peg、pcl-peg-pcl等)；自组装作用：亲疏水作用、氢键作用、主客体相互作用；离子交联：海藻酸与钙离子；静电相互作用：壳聚糖与磷酸类物质。

36、在本发明的一个实施方式中，所述化学交联是通过高分子链间的共价键交联(参考文献luping cao,bin cao,chengjiao lu,et al.j.mater.chem.b 2015,3,1268.)。所述化学交联反应包括巯基-迈克尔加成反应、酰胺缩合反应、席夫碱反应等。

37、在本发明的一个实施方式中，所述光交联是通过发生光化学反应形成共价键交联(参考文献huitang xia,dandan zhao,hailin zhu,et al.acs appl.mater.interfaces2018,10,31704.)。

38、在本发明的一个实施方式中，所述光交联构建的水凝胶材料是通过光引发聚合交联反应制备，即光引发剂在光源照射下生成的自由基，引发含甲基丙烯酸酯基的高分子衍生物上双键官能团的聚合反应，从而制备光交联水凝胶。

39、在本发明的一个实施方式中，所述光交联水凝胶可实现的实施方式：将含甲基丙烯酸酯基的高分子衍生物和光引发剂溶于生物相容性介质，配成一定浓度的水凝胶前体溶液，在254nm-450nm(优选为365nm或405nm)波长的光源照射下，即可获得光交联水凝胶。

40、在本发明的一个实施方式中，所述含甲基丙烯酸酯基的高分子衍生物选用甲基丙烯酰化明胶(gelma)，甲基丙烯酰化透明质酸(hama)，甲基丙烯酰化硫酸软骨素(csma)，甲基丙烯酰化弹性蛋白(elama),甲基丙烯酰化肝素(hepma)，甲基丙烯酰化葡聚糖(dexma)，甲基丙烯酰化壳聚糖(chma)，甲基丙烯酰化纤维素(celma)等。

41、在本发明的一个实施方式中，所述光引发剂可以选用i 2959(2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮)或lap(苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂)。

42、本发明中，所述水凝胶材料除了通过单一交联方式构建，还可以由水溶性高分子通过物理交联或化学交联或光交联的一种或多种交联方式，或单一交联方式的多种材料组合交联形成。

43、在本发明的一个实施方式中，所述水凝胶材料可以是由单一交联方式形成的水凝胶材料，称为单网络水凝胶；或者是由两种或两种以上交联方式形成的水凝胶材料，称为互穿网络水凝胶，或双网络水凝胶；或者是由同一交联方式的多种材料复合交联而成，称为复合交联水凝胶。

44、在本发明的一个实施方式中，所述软骨细胞在软骨组织特异性水凝胶中的细胞密度为104～1010/ml，优选为107～108/ml。

45、在本发明的一个实施方式中，所述成纤维细胞在纤维组织特异性水凝胶中细胞密度为104～1010/ml，优选为107～108/ml。

46、本发明还提供所述生物3d打印组织工程气管的制备方法，为一种基于生物3d打印构建组织工程气管的方法，包括以下步骤：

47、由软骨组织特异性水凝胶包裹软骨细胞制备软骨特异性生物墨水；

48、由纤维组织特异性水凝胶包裹成纤维细胞制备纤维特异性生物墨水；

49、利用软骨特异性生物墨水和纤维特异性生物墨水为材料，通过双针头挤出式生物3d打印技术，交替式打印成型软骨环和血管化纤维环，软骨环和血管化纤维环交替堆积成型得到环形管状结构；

50、对所得环形管状结构进行培养，实现纤维组织的血管化，得到成熟的所述生物3d打印组织工程气管。

51、在本发明的一个实施方式中，所述培养方式包括：体外诱导分化、培养；或体内皮下植入培养，或体外/体内联合培养方式。

52、在本发明的一个实施方式中，所述体外诱导分化、培养方式可以为静态培养或动态培养，静态培养方式即将3d打印的组织工程气管放置于培养皿中培养，动态培养方式即将3d打印的组织工程气管放置于生物反应器中搅拌或加压培养，以促进水凝胶中的营养物质交换。

53、在本发明的一个实施方式中，所述体内皮下植入培养是将不经过或经过体外培养的组织工程气管植入动物体的皮下培养。所述动物体可以为裸鼠、sd大鼠、兔子、羊、狗、猪，优选为裸鼠、羊。

54、本发明提供的生物3d打印组织工程气管的组织学特征在于：1)再生软骨呈现典型的软骨陷窝结构，组织学上具有番红和二型胶原的软骨特异性染色；2)再生纤维组织中呈现清晰的血管结构，cd31的成血管特异性染色以及masson和一型胶原的成纤维特异性染色。

55、本发明提供的生物3d打印组织工程气管的结构特征在于：1)具有环形管状结构；2)软骨环和血管化纤维环的交替结构；3)软骨环和血管化纤维环具有典型的组织特征；4)软骨环和血管化纤维环实现一体化整合。

56、本发明基于生物3d打印构建的组织工程气管实现了力学和生理学功能恢复：1)力学功能重建，例如纵向拉伸、横向弯折能力等；2)生理学功能重建，软骨环之间的血管化纤维组织为软骨再生提供了必要的营养物质。

57、本发明还提供所述生物3d打印构建的组织工程气管的应用。

58、本发明提供了生物3d打印构建的组织工程气管在作为气管缺损修复材料或组织工程气管移植物中的应用。

59、生物3d打印构建的组织工程气管在作为气管缺损修复材料可应用场景包括补片修复手术、节段性气管重建手术等。

60、为了实现仿生气管——软骨/血管化纤维组织交替的组织工程气管的构建，本发明结合生物3d打印的优势(个性化、精准化、速度快等)，提出了一种生物3d打印构建的组织工程气管的制备方法及应用。

61、与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

62、(1)天然水凝胶材料具备理想的生物相容性和组织特异性微环境，能够有效促进特异性组织再生；

63、(2)3d打印的组织工程气管不需要经过长期的体外培养过程，就能达到满意的软骨形成，并进行体内气管缺损重建；

64、(3)结合生物3d打印技术制备的环形管状结构能够实现细胞排布和交替结构的精确可控；

65、(4)血管化纤维组织再生依赖于精准的三维细胞排布(3d打印)，能够促进组织再生及血管化形成；

66、(5)软骨环和血管化纤维环的界面整合能够通过3d打印实现一体化整合，不容易脱落；

67、(6)再生的组织工程气管实现了力学和生理性功能恢复。