抗菌和抗氧化活性增强型黄芩苷酯衍生物的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及抗菌和抗氧化活性增强型黄芩苷酯衍生物的应用。


背景技术：

2.黄芩苷(baicalin)是从植物黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，具有多种显著的生物活性，包括抗菌活性、抗氧化活性、抗炎活性等。它们的化学反应性通常通过常规的体外试验来评估。例如，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(dpph)测定是评估黄酮类化合物清除自由基能力最常用的方法之一。然而，在这样的体外实验中，真实体系的复杂性并没有被考虑在内，因为这些黄酮类化合物经常被用作抗菌剂、细胞内的潜在药物或化妆品添加剂。真实体系可视为多相介质，其中的生物活性化合物的有效性不仅受其化学反应性的影响，还受其在不同相中的划分或定位于合适的位置才能发挥其最优的活性的影响。具体地，一种有效的抗菌剂是通过干扰目标微生物的细胞膜而起作用的，然而它的亲脂性会影响其穿过细胞膜的能力。与许多其它的黄酮糖苷一样，黄芩苷的低脂溶性导致其难以插入细胞膜磷脂双分子层的疏水区域，从而限制了其抗菌活性的发挥。此外，黄芩苷的亲水性质也会对它在保护亲脂性系统(如脂肪、油和脂类食品或化妆品配方和乳剂以及生物环境)中的有效性产生负面影响。
3.为了提高黄芩苷的亲脂性，宗颖等人利用化学法催化对黄芩苷的羧基进行酯化修饰，合成了脂溶性更高的黄芩苷酯衍生物(宗颖,杜锐,时坤,等.黄芩苷和黄芩苷衍生物在制备治疗牛病毒性腹泻病药物中的应用及黄芩苷衍生物,[p].)。但合成方法中所使用的催化剂为化学催化剂，对环境污染大，并且引入的碳链仅为直链饱和脂肪链。此外，研究者仅评估了合成的黄芩苷酯衍生物的抗病毒活性，并未对这些酯衍生物的抗菌活性和抗氧化活性及它们相关的机制进行研究。黄芩苷酯衍生物更高的亲脂性并不总是会导致更好的生物活性，并且它们之间的关系遵循非线性行为，即其生物活性随着脂肪链长度的增加而增加，直到达到某个阈值为止，超过此阈值，链的任何延伸都会导致生物活性的下降。这是因为长链酯由于过高的亲脂性而易于形成细胞外聚集体，导致其生物活性降低。然而，对于不同的母体化合物，引入的脂肪链的长度和类型对生物活性的影响都是不同的。因此，有必要对引入的有机醇对合成相应的黄芩苷酯衍生物的抗菌活性和抗氧化活性的影响进行研究。


技术实现要素：

[0004]
本发明所要解决的技术问题是黄芩苷的低脂溶性限制了其抗菌活性和亲脂性系统中的抗氧化活性的发挥，为此，本发明提供抗菌和抗氧化活性增强型黄芩苷酯衍生物的应用，与黄芩苷相比，所述黄芩苷酯衍生物有更显著的抗菌活性和抗氧化活性。
[0005]
本发明是通过下述的技术方案来解决上述技术问题的。
[0006]
抗菌和抗氧化活性增强型黄芩苷酯衍生物的应用，所述黄芩苷酯衍生物在制备抗菌药物和/或抗氧化药物中的应用，或与抗菌活性成分和/或抗氧化活性成分的组合使用。
[0007]
进一步地，所述黄芩苷酯衍生物和一种或多种药学上可接受的载体组合成药物组合物。
[0008]
进一步地，所述药学上可接受的载体可以包括但不限于下列中的一种或多种的组合：溶剂、分散介质、抗氧化剂、表面活性剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、着色剂、粘合剂、赋形剂、助悬剂、等渗剂、稀释剂、乳化剂、成粒剂、润湿剂、润滑剂、填充剂、吸收促进剂、可食用油、崩解剂、缓冲剂、螯合剂、胶凝剂、溶解抑制剂或此类的物质等。
[0009]
进一步地，所述抗菌和抗氧化活性增强型黄芩苷酯衍生物在制备抗菌和/或抗氧化食品添加剂、食品或饮品中的应用。
[0010]
进一步地，所述抗菌和抗氧化活性增强型黄芩苷酯衍生物在制备化妆品或皮肤外用的制剂中的应用。
[0011]
进一步地，黄芩苷酯衍生物具有增强的抗菌活性在于所述的黄芩苷酯衍生物以破坏微生物细胞膜完整性的作用模式抑制微生物的生长和繁殖。
[0012]
进一步地，所述黄芩苷酯衍生物的亲脂性的增加使它们更容易地进入细胞内清除自由基或在细胞膜表面形成保护膜以防止自由的攻击，从而表现出比黄芩苷更好的抗氧化活性。
[0013]
进一步地，所述药物组合物的目的在于有利于对有机体进行给药输送，在所述的药物组合物中，所述的黄芩苷酯衍生物的用量为治疗的有效量。
[0014]
进一步地，黄芩苷酯衍生物具有增强的抗菌活性是指与黄芩苷相比，所述黄芩苷酯衍生物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有更显著的抑制其生长和繁殖的作用，具有最优活性的黄芩苷酯衍生物的抑菌效果是黄芩苷的抑菌效果的大约4-16倍。
[0015]
进一步地，对所述黄芩苷酯衍生物的油水分配系数(logp值)和它们的抗菌活性的关系进行分析，发现适当增加黄芩苷的亲脂性确实能增强其抗菌活性，但过高的亲脂性却使其衍生物的抗菌活性有所下降。
[0016]
进一步地，黄芩苷酯衍生物具有增强的抗氧化活性是指与黄芩苷相比，所述黄芩苷酯衍生物具有更好的细胞或亲脂性体系的抗氧化活性。
[0017]
进一步地，黄芩苷酯衍生物或其药物组合物的给药途径包括但不限于以下途径：口服、静脉、皮下、经皮、吸入、舌下、鼻腔、眼内、肌肉给药等中的一种以上。优选的给药途径是口服给药。
[0018]
进一步地，当口服给药时，所述黄芩苷酯衍生物可以采用以下形式：胶囊剂、片剂、糖衣剂、粉剂、锭剂、颗粒剂、滴丸、浆剂、凝胶剂、悬浮剂、微囊或脂肪乳剂等剂型中的一种以上。
[0019]
进一步地，黄芩苷酯衍生物的药物组合物可以通过本领域普通技术人员依据现有公开的内容使用任何已知的方法来制备，例如，常规的溶解、乳化、包埋、混合、造粒、磨细或冻干处理。
[0020]
进一步地，所述抗菌药物为针对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或真菌的抗菌药物。
[0021]
进一步地，所述革兰氏阴性菌包括但不限于大肠杆菌。
[0022]
进一步地，所述革兰氏阳性菌包括但不限于金黄色葡萄球菌。
[0023]
进一步地，所述真菌包括但不限于白色念珠菌。
[0024]
进一步地，所述黄芩苷酯衍生物可以和一种或多种化妆品可接受的载体组成化妆
品组合物。
[0025]
进一步地，化妆品组合物包括黄芩苷酯衍生物和一种或多种化妆品可接受的载体
[0026]
进一步地，化妆品可接受的载体是指与皮肤、粘膜和皮肤附件相容的介质。
[0027]
进一步地，当经皮给药时，所述黄芩苷酯衍生物可以采用以下形式：软膏剂、霜剂、溶液剂、凝胶剂、混悬剂、洗涤基料或喷雾剂等剂型。
[0028]
进一步地，所述增强型黄芩苷酯衍生物指所述的黄芩苷酯衍生物兼具增强的抗菌活性和增强的抗氧化活性。
[0029]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0030]
本发明所述黄芩苷酯衍生物比黄芩苷具有更显著的抗菌活性和抗氧化活性，可用于开发抗菌药物和/或抗氧化药物、食品添加剂、化妆品添加剂和保健品，具有很好的应用价值。
附图说明
[0031]
图1为黄芩苷及其酯衍生物分别的的clogp值与mics值的关系柱状图。
[0032]
图2分别为未经黄芩苷及其酯衍生物处理、经黄芩苷处理、经黄芩苷酯衍生物处理白色念珠菌细胞形态的扫描电子显微镜分析图。
[0033]
图3分别为黄芩苷及酯衍生物对细胞存活率的影响柱状图。
[0034]
图4为黄芩苷及酯衍生物分别的细胞抗氧化活性结果折线图。
[0035]
图5分别为黄芩苷及酯衍生物对aaph诱导红细胞氧化溶血的抑制作用柱状图。
[0036]
图6分别为黄芩苷及酯衍生物对溶血后脂质过氧化的影响柱状图。
具体实施方式
[0037]
以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的范围。
[0038]
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039]
以下实施例中所使用的试剂、材料等如无特殊说明，均可从商业途径购买。
[0040]
实施例1
[0041]
黄芩苷酯衍生物的合成
[0042]
将以底物摩尔比为1:30的黄芩苷分别与有机醇(乙醇、正丙醇、正丁醇、正己醇、正辛醇、正癸醇、香叶醇、香茅醇、正十一醇、10-十一烯醇或月桂醇)溶解于吡啶和环己烷组成的二元非水介质中，其中吡啶和环己烷的体积比为1:1，加入黄芩苷重量的4.2％的固定化脂肪酶(酶活为10000u/g)进行催化转化反应，hplc监测反应进程。反应结束后，反应物经离心分离回收脂肪酶，减压蒸馏除去有机溶剂，再通过薄层色谱柱洗脱和真空干燥得到一系列的黄色粉末状化合物，其结构鉴定结果如下：
[0043]
黄芩苷乙酯：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.59(s,1h),8.68(s,1h),8.06(d,j＝7.3hz,2h),7.63-7.58(m,3h),7.06(s,1h),6.99(s,1h),5.54-5.32(m,3h),5.30(d,j＝7.5hz,1h),4.20(d,j＝9.7hz,2h),4.14(d,j＝9.7hz,1h),3.48-3.35(m,3h),1.22(t,j＝7.0hz,3h).
13
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×
2,126.81
×
2,106.65,105.24,100.56,94.27,75.86,
75.60,73.30,71.78,61.23,14.40.lc-ms m/z calculated for c
23h22o11
[m+h]
+
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[0044]
黄芩苷丙酯：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.58(s,1h),8.67(s,1h),8.06(d,j＝7.1hz,2h),7.63-7.58(m,3h),7.05(s,1h),7.00(s,1h),5.54-5.32(m,3h),5.28(d,j＝7.5hz,1h),4.21(d,j＝9.7hz,1h),4.09-4.05(m,2h),3.49-3.34(m,3h),1.61(q,j＝7.0hz,2h),0.88(t,j＝7.4hz,3h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ182.99,169.07,163.98,151.67,149.61,147.27,132.51,131.30,131.13,129.58
×
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24h24o11
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+
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[0045]
黄芩苷丁酯：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.59(s,1h),8.69(s,1h),8.07(d,j＝7.0hz,2h),7.63-7.58(m,3h),7.04(s,1h),7.01(s,1h),5.55-5.33(m,3h),5.29(d,j＝7.6hz,1h),4.21(d,j＝9.7hz,1h),4.08(d,j＝6.4hz,2h),3.49-3.35(m,3h),1.58-1.54(m,2h),1.32(q,j＝7.5hz,2h),0.80(t,j＝7.4hz,3h).
13
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×
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25h26o11
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[0046]
黄芩苷己酯：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.59(s,1h),8.68(s,1h),8.07(d,j＝7.1hz,2h),7.64-7.58(m,3h),7.04(s,1h),7.02(s,1h),5.54-5.32(m,3h),5.30(d,j＝7.5hz,1h),4.21(d,j＝9.7hz,1h),4.07-4.03(m,2h),3.48-3.35(m,3h),1.58-1.53(m,2h),1.28-1.09(m,6h),0.71(t,j＝7.0hz,3h).
13
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×
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×
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27h30o11
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[0047]
黄芩苷辛酯：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.58(s,1h),8.67(s,1h),8.07(d,j＝6.9hz,2h),7.64-7.58(m,3h),7.04(s,1h),7.02(s,1h),5.54-5.32(m,3h),5.29(d,j＝7.5hz,1h),4.21(d,j＝9.7hz,1h),4.07-4.03(m,2h),3.51-3.34(m,3h),1.58-1.53(m,2h),1.41-0.90(m,10h),0.75(t,j＝7.2hz,3h).
13
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29h34o11
[m+h]
+
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[0048]
黄芩苷癸酯：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.56(s,1h),8.71(s,1h),8.03(d,j＝7.3hz,2h),7.61-7.55(m,3h),7.01(s,1h),6.98(s,1h),5.50-5.34(m,3h),5.27(d,j＝7.4hz,1h),4.21(d,j＝9.5hz,1h),4.05-4.01(m,2h),3.52-3.40(m,3h),1.56-1.51(m,2h),1.24-0.99(m,14h),0.77(t,j＝7.3hz,3h).
13
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×
2,126.62
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31h38o11
[m+h]
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[0049]
黄芩苷香叶酯：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.58(s,1h),8.72(s,1h),8.03(d,j＝7.1hz,2h),7.61-7.54(m,3h),7.02(s,1h),6.96(s,1h),5.52-5.30(m,3h),5.37(s,1h),5.27(d,j＝6.2hz,1h),4.93(s,1h),4.64(dd,j＝12.5,7.0hz,2h),4.21(d,j＝9.7hz,1h),3.51-3.39(m,3h),1.92-1.87(m,4h),1.60(s,3h),1.54(s,3h),1.44(s,3h).
13
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×
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×
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31h34o11
[m+h]
+
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[0050]
黄芩苷香茅酯：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.57(s,1h),8.72(s,1h),8.03(d,j＝7.5hz,2h),7.60-7.54(m,3h),7.01(s,1h),6.97(s,1h),5.59-5.37(m,3h),5.29(d,j＝7.3hz,1h),4.89(d,j＝7.0hz,1h),4.20(d,j＝6.8hz,1h),4.07(ddt,j＝18.2,12.2,6.7hz,2h),3.51-3.45(m,3h),1.81-1.71(m,2h),1.62-0.95(m,5h),1.53(d,j＝5.1hz,3h),1.41(d,j＝19.3hz,3h),0.77(t,j＝7.0hz,3h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ182.95,169.01,163.96,151.59,149.60,147.23,132.45,131.23,131.10,130.85,129.53
×
2,126.71
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31h36o11
[m+h]
+
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[0051]
黄芩苷十一酯：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.58(s,1h),8.64(s,1h),8.05(d,j＝1.8hz,2h),7.60-7.56(m,3h),7.01(s,1h),6.99(s,1h),5.48-5.33(m,3h),5.24(d,j＝7.3hz,1h),4.19(d,j＝9.7hz,1h),4.08-4.03(m,2h),3.52-3.36(m,3h),1.70(s,1h),1.64(s,1h),1.58-1.56(m,2h),1.42-1.38(m,2h),1.27-1.21(m,12h),0.86-0.82(m,3h).
13
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×
2,126.66
×
2,106.68,105.13,100.88,94.23,75.78,75.55,73.29,71.57,61.22,33.06,31.83,29.66,29.60,29.57,29.53,29.26,26.03,22.59,14.24.lc-ms m/z calculated for c
32h40o11
[m+h]
+
601.2571,found:601.2617.
[0052]
黄芩苷十一烯酯：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.59(s,1h),8.63(s,1h),8.05(d,j＝6.7hz,2h),7.58-7.54(m,3h),6.99(s,1h),6.96(s,1h),5.76(ddt,j＝17.1,10.3,6.7hz,1h),5.48-5.34(m,3h),5.23(d,j＝7.6hz,1h),4.96(ddd,j＝17.1,3.7,1.5hz,1h),4.93-4.88(m,1h),4.19(d,j＝9.7hz,1h),4.19(d,j＝9.7hz,2h),3.49-3.38(m,3h),2.01-1.93(m,2h),1.70(s,1h),1.64(s,1h),1.41(p,j＝6.7hz,2h),1.35-1.24(m,10h).
13
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×
2,126.61
×
2,114.60,106.73,105.09,101.05,94.23,75.82,75.53,73.29,71.58,61.26,33.71,33.06,29.65,29.54,29.45,29.10,28.87,26.04.lc-ms m/z calculated for c
32h38o11
[m+h]
+
599.2414,found:599.2490.
[0053]
黄芩苷月桂酯：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.58(s,1h),8.62(s,1h),8.02(d,j＝8.2hz,2h),7.52(s,3h),6.97(s,1h),6.90(s,1h),5.47-5.36(m,3h),5.21(d,j＝7.5hz,1h),4.34(s,1h),4.18(d,j＝9.7hz,1h),3.95(t,j＝6.7hz,1h),3.51-3.38(m,3h),1.94(s,1h),1.62-1.54(m,1h),1.41(p,j＝6.8hz,6h),1.30-1.23(m,12h),0.84(t,j＝7.1hz,3h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ182.84,168.78,163.75,151.54,149.53,147.36,131.90,
131.37,131.28,129.20
×
2,126.53
×
2,106.75,105.03,101.18,94.24,75.81,75.50,73.28,71.59,61.30,33.07,31.93,29.80,29.75,29.74,29.70,29.65,29.38,26.09,22.63,14.03.lc-ms m/z calculated for c
33h42o11
[m+h]
+
615.2727,found:615.2811.
[0054]
实施例2
[0055]
黄芩苷酯衍生物抗菌活性的测定
[0056]
采用微量稀释法测定黄芩苷酯衍生物对指示菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentrations,mics)
[0057]
(1)菌种及其培养
[0058]
测试的菌株为：大肠杆菌(escherichia coli gim 1.707)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus atcc 6538)和白色念珠菌(candida albicans atcc 10231)。
[0059]
将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在胰酪大豆胨肉汤培养基(tsb)中于37℃恒温持续摇动(180rpm)培养24小时，然后接种于胰酪大豆胨琼脂培养基(tsa)上，并在4℃下保存。将白色念珠菌在沙氏葡萄糖肉汤培养基(sdb)中于35℃恒温持续摇动(180rpm)培养24小时，然后接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基(sda)在4℃下保存。在本发明中将它们用于评估黄芩苷及其衍生物的抗菌活性。
[0060]
(2)最小抑菌浓度的测定
[0061]
将每种细菌和酵母的单个菌落接种到4ml tsb或sdb中，在37℃或35℃下培养过夜，然后将其稀释100倍继续培养至生长对数中期。分别将黄芩苷及其酯衍生物(50μl)用tsb或sdb进行2倍系列稀释并添加到96孔板中，然后加入等体积的稀释的细菌悬液(1.0
×
106cfu/ml)或酵母悬液(5.0
×
103cfu/ml)加入到每个孔中。包含等浓度的二甲基亚砜的培养基作为空白对照组。所有抗菌测定重复三次。在37℃下细菌培养或35℃下酵母培养16小时后，使用微孔板读数器记录每个孔在600nm的光密度(od
600
)。mics定义为抗菌化合物完全抑制微生物生长的最低浓度。
[0062]
表1为黄芩苷及其酯衍生物各自的抑菌结果。黄芩苷对测试菌株的mics为6.4-12.8mm，均表现出中等的抗菌活性。有趣的是，表中的黄芩苷酯衍生物表现出比黄芩苷更好的抑菌活性。在这些衍生物中，抗菌活性最好的是黄芩苷香茅酯，其针对金黄色葡萄球菌的mics值是黄芩苷的16倍，针对大肠杆菌的mics值是黄芩苷的4倍，针对白色念珠菌的mics值是黄芩苷的16倍。黄芩苷及其衍生物对真菌和革兰氏阳性菌的抑菌效果要优于对革兰氏阴性菌的抑菌效果。总的来说，与黄芩苷相比，本发明的黄芩苷酯衍生物具有更显著的抗菌活性。
[0063]
表1黄芩苷及其酯衍生物各自的最小抑菌浓度
[0064][0065]
实施例3
[0066]
黄芩苷酯衍生物的脂溶性与抗菌活性的关系
[0067]
利用chembiodraw软件分别对黄芩苷及其酯衍生物的logp值进行预测，其结果为：黄芩苷(0.8)、黄芩苷丁酯(2.8)、黄芩苷己酯(3.8)、黄芩苷辛酯(4.9)、黄芩苷香叶酯(4.9)、黄芩苷香茅酯(5.2)、黄芩苷癸酯(5.9)、黄芩苷十一烯酯(6.0)、黄芩苷十一酯(6.5)和黄芩苷月桂酯(7.0)。然后分别对黄芩苷及其酯衍生物的logp值和针对三种目标菌株的mics值进行分析，结果如下：
[0068]
化合物的脂溶性可以用logp值表示，logp值越大表明该化合物的脂溶性越高。图1为黄芩苷及其酯衍生物分别的clogp值与mics值的关系柱状图。由图1可观察黄芩苷及其酯衍生物分别的脂溶性与抗菌活性的关系，黄芩苷酯衍生物的脂溶性与抗菌活性也存在非线性行为，即黄芩苷酯衍生物的抗菌活性起始随着其脂溶性的增加而增加，logp值为5.2时最优，后随脂溶性的继续增加而降低。这表明适当增强黄芩苷的脂溶性能使其更容易插入微生物膜磷脂双分子层的疏水区域，从而发挥出更好的抗菌活性。
[0069]
实施例4
[0070]
荧光染料双染色试验
[0071]
采用荧光染料碘化丙啶(pi)和4
′
,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)双染色法分别测定了经黄芩苷及其酯衍生物处理的微生物细胞膜的完整性。dapi是一种能够与dna强力结合的荧光染料。不管细胞活力如何，dapi均可以穿透微生物的细胞膜与dna结合而显示蓝色荧光。相反，pi仅能穿过破损的细胞膜而对核染色，从而显示出红色荧光。
[0072]
将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌培养至生长对数中期后，分别稀释至1.0
×
106cfu/ml制备成菌悬液。将稀释的菌悬液分别与2
×
mics浓度的黄芩苷及酯衍生物混合恒温(37℃)孵育4h后，离心(5000rpm，15分钟)收集沉淀，并用磷酸缓冲盐溶液(pbs)洗涤数次。将5μg/ml的pi染料与沉淀物混合，冰浴15min后，通过离心和洗涤除去过量的pi。然
后再次收集沉淀细胞与dapi(10μg/ml)混合孵育。以未经黄芩苷及其酯衍生物处理的微生物细胞作为空白对照。最后，将细胞沉淀物用pbs稀释，吸取10μl悬浮液置于洁净的载玻片上，并在荧光显微镜下进行观察。
[0073]
分别以黄芩苷及其酯衍生物对白色念珠菌细胞膜完整性的影响为例，通过荧光染料双染色法试验，在空白对照组的dapi通道中，在没有药物处理的情况下，白色念珠菌呈蓝色荧光，但pi通道未显示红色荧光，表明白色念珠菌细胞膜完整。用黄芩苷或黄芩苷丁酯孵育后，pi通道仍然未见红色荧光，表明黄芩苷和黄芩苷丁酯均不是通过破坏细胞膜而抑制微生物的生长和繁殖，而黄芩苷丁酯的抗菌活性优于黄芩苷主要是脂溶性的增加使黄芩苷丁酯更多地进入胞内并通过如抑制核酸和蛋白质合成等的其他机制发挥其抗菌活性。当用黄芩苷辛酯、黄芩苷香叶酯或黄芩苷香茅酯处理菌体时，与空白对照组相比，dapi和pi通道均显示荧光，表明白色念珠菌的细胞膜受损。此外，黄芩苷香茅酯处理导致白色念珠菌显著的聚集，这可能是膜损伤时膜电位丧失导致的。这表明含有中等长度(c6-c10)脂肪链的黄芩苷酯酯衍生物具有破坏微生物膜的特性。
[0074]
实施例5
[0075]
电镜观察实验
[0076]
利用扫描电子显微镜(sem)分别分析了未经黄芩苷及其酯衍生物处理、经黄芩苷处理、经黄芩苷酯衍生物处理后微生物细胞的形态变化。收集生长对数期的菌悬液，用pbs洗涤多次，然后用pbs稀释至od
600
值为0.2的浓度。随后，将菌悬液与2
×
mics的黄芩苷或其酯衍生物在37℃下孵育4h。孵育后，5000rpm离心15min收集微生物细胞，经pbs洗涤，然后用2.5％(w/v，g/ml)戊二醛在4℃下固定4h。将样品在不同体积百分比浓度(50％、70％、90％和100％)的乙醇中连续脱水10min，最后转移到乙醇和无水叔丁醇(1:1,v/v)的混合物中持续脱水15min。将标本冻干，然后在微生物细胞表面镀金，进行扫描电子显微镜观察。
[0077]
分别以黄芩苷及其酯衍生物对白色念珠菌细胞形态的影响为例，通过扫描电镜观察试验，如图2所示，未经药物处理作为空白对照，图2中a是在未经药物处理的情况下，生长对数中期的微生物细胞形态典型、规则，表面光滑饱满，大小均匀。图2中d是经黄芩苷香茅酯处理4h后，白色念珠菌细胞形态受到严重损伤，出现不规则褶皱、粗糙表面，甚至细胞塌陷。此外，黄芩苷香茅酯处理产生的微生物细胞大小不均匀，如较小或较长的白色念珠菌。然而，图2中b黄芩苷和图2中c黄芩苷丁酯只对微生物形态有轻微的改变，部分的大小不均匀，表面变形，有轻微褶皱。这与香茅醇本身的抑菌机制有关，研究表明，香茅醇是通过破坏微生物细胞膜而其抑菌作用的。这些结果证实了具有中等长度(c6-c10)脂肪链的黄芩苷酯衍生物改变了测试菌株的外部结构，破坏了它们的细胞膜。
[0078]
综上结果所述，只有引入的脂肪链具有适当的亲脂性，才能最大限度地发挥黄芩苷的抗菌活性，而本身具有抗菌活性的疏水基团可以优先考虑。
[0079]
实施例6
[0080]
黄芩苷酯衍生物的细胞抗氧化活性试验
[0081]
(1)细胞的培养
[0082]
将人体肝癌细胞(hepg2)接种于含有10％(v/v)的胎牛血清、100μg/ml的链霉素和100u/ml的青霉素的dmem培养基中，轻轻吹打均匀后，在37℃、含有5％(v/v)co2的条件下培养。
[0083]
(2)细胞毒性分析
[0084]
取100μl以4
×
104个/孔的hepg2细胞接种于96孔板中，并在37℃、5％(v/v)co2的条件下培养24h。培养结束后，弃掉培养基，加入100μl黄芩苷或其酯衍生物溶液(12.5-100μm)，然后继续于细胞培养箱中恒温培养24h。培养结束后，将细胞板取出并向每孔加入10μl cck-8溶液，在细胞培养箱继续培养1h后，于450nm处测定吸光值as。每板设定空白孔(含培养基和cck-8溶液，不含细胞和药物，ab)和对照组(含培养基、细胞和cck-8溶液，不含药物，ac)。与对照组相比，当样品组的吸光值下降幅度低于10％时可以认为样品在此浓度下对细胞没有毒性，可以用该浓度进行细胞抗氧化的实验。细胞存活率的计算公式如下：
[0085][0086]
(3)细胞抗氧化活性测定
[0087]
用dmem培养基(含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)链霉素-青霉素抗体)将处于对数生长期的hepg2细胞配成密度为6
×
105个/ml的细胞悬液并取100μl细胞悬液接种于96孔板中，在细胞培养箱中孵育24h后弃去培养液，pbs洗涤三次，样品组加入100μl待测样品(含有25μmol/l dcfh-da)，空白孔和对照孔加入含25μmol/l dcfh-da的抗氧化培养基，在培养箱继续培养1h后，弃掉培养液，pbs洗板三次，空白孔加入100μl氧化培养基，其余孔加入100μl aaph溶液(浓度为600μmol/l)。将细胞培养板置于酶标仪，37℃测定荧光强度值(激发波长485nm，发射波长538nm)，每5min记录数据，共计60min。
[0088]
在进行细胞抗氧化活性试验之前，需要对药物不同浓度下的细胞毒性进行分析。由图3可知，与对照组相比，黄芩苷己酯、黄芩苷辛酯和黄芩苷癸酯在50μmol/l时，hepg2细胞存活率均低于80％，显著低于对照组(p《0.05)，且下降的幅度大于10％，认为它们在此浓度下对细胞有轻微毒性作用。黄芩苷及其衍生物在25μmol/l时其细胞存活率与对照组均没有显著差异，表明黄芩苷及其衍生物在25μmol/l时对hepg2均无毒性。因此，以25μmol/l为终浓度进行细胞抗氧化活性的试验。
[0089]
细胞抗氧化试验的原理是探针2’,7
’‑
二氯荧光素二乙酸酯(dcfh-da)进入细胞后在胞内酯酶的作用下脱乙酰基生成非荧光的2’,7
’‑
二氯二氢荧光素(dcfh)。2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(aaph)诱导产生过氧自由基可以使dcfh-da氧化，生成2’,7
’‑
二氯荧光素(dcf)而发出荧光。荧光强度与氧化程度呈正比。而抗氧化活性成分进入细胞内可以有效清除过氧自由基从而抑制荧光的产生。图4为黄芩苷及其酯衍生物分别的细胞抗氧化活性的结果折线图。黄芩苷及其酯衍生物分别的细胞抗氧化能力的大小为：黄芩苷丁酯》黄芩苷丙酯》黄芩苷乙酯》黄芩苷己酯》黄芩苷癸酯≈黄芩苷辛酯》黄芩苷，说明黄芩苷酯衍生物的细胞抗氧化活性均优于黄芩苷的细胞抗氧化活性，这是因为黄芩苷酯衍生物脂溶性的增加使它们更多地进入细胞内清除自由基从而抑制荧光的产生。
[0090]
实施例7
[0091]
黄芩苷酯衍生物对aaph诱导的红细胞溶血的抑制试验
[0092]
吸取10ml新鲜的抗凝羊血，在1200g，4℃下离心10min去除血清，用pbs洗涤数次至上层溶液澄清。加入4倍体积的pbs溶解沉淀细胞配制成20％(v/v)的红细胞悬浮液。用pbs分别将黄芩苷及其酯衍生物配成100μmol/l的储备液。取400μl红细胞悬浮液与等量的药物储备液混匀，使药物终浓度为50μmol/l。37℃恒温孵育30min后，加入800μl 200mmol/l的
aaph溶液继续孵育2h。孵育结束后，加入8ml pbs稀释样品，并于1200g，4℃条件下离心收集上清液，在540nm处测定其光度值as。用去离子水代替pbs制备全溶血，光度值记为a
all
。设定毒性对照组(含红细胞和待测样品，不含aaph，a
t
)和阴性对照组(含红细胞，不含待测样品，ac)，溶血率的计算公式如下：
[0093][0094][0095][0096]
aaph可通过热分解产生自由基，进而可以攻击细胞膜，诱发脂质过氧化，损伤细胞膜结构从而导致红细胞溶血。因此，可以通过检测药物对红细胞溶血的抑制能力来评价其抗氧化活性。图5分别是黄芩苷及其酯衍生物对aaph诱导红细胞氧化溶血的抑制结果柱状图。如图5所示，当分别只用50μmol/l黄芩苷及其酯衍生物处理红细胞时，其溶血率与不添加样品和aaph的空白对照组没有显著的差异，表明这样药物在50μmol/l时不会对红细胞造成损伤。当仅用aaph处理红细胞后发生了严重的溶血，溶血率达到60％左右。加入50μmol/l的黄芩苷后，黄芩苷虽然可降低溶血率(58％)，但与aaph处理组没有显著差异。当加入黄芩苷酯衍生物后，溶血率显著下降(p《0.05)，表明这些黄芩苷酯衍生物抑制红细胞溶血的能力均优于黄芩苷本身。而这些黄芩苷酯衍生物抑制红细胞溶血的能力大小为：黄芩苷丙酯≈黄芩苷丁酯≈黄芩苷己酯≈黄芩苷辛酯》黄芩苷乙酯≈黄芩苷癸酯。
[0097]
实施例8
[0098]
黄芩苷酯衍生物抑制红细胞溶血的机制
[0099]
基于实施例7的结果，本发明人推测黄芩苷酯衍生物对aaph氧化溶血的抑制作用要强于黄芩苷的主要原因是：亲脂性的衍生物分子分布在红细胞周围，将细胞的磷脂双分子层与自由基分离，并清除接近红细胞的自由基。为了验证这一作用，我们利用超纯水对红细胞进行溶血处理，完全破坏其细胞膜结构。裂解液用aaph和黄芩苷或其衍生物处理。aaph诱导活性氧的产生，可引起细胞膜的脂质过氧化，从而导致丙二醛(mda)的产生。利用试剂盒检测产生的mda的含量判断药物的抗氧化能力，mda越少其抗氧化能力越强。
[0100]
图6(不同字母a、b、c、d、e、f、g表示多区间分析差异显著(p《0.05)，每个实验重复3次)分别为黄芩苷及酯衍生物对溶血后脂质过氧化的影响柱状图，分别是黄芩苷及其酯衍生物处理后mda的释放水平及膜脂质过氧化的抑制能力，其大小为：黄芩苷≈黄芩苷乙酯》黄芩苷丙酯》黄芩苷丁酯》黄芩苷己酯》黄芩苷辛酯≈黄芩苷癸酯，这与抑制aaph诱导红细胞氧化溶血的结果不一致，说明黄芩苷酯衍生物对膜的脂质过氧化的抑制作用依赖于细胞膜的完整结构。当细胞膜结构被破坏时，高亲脂性的黄芩苷酯衍生物无法在细胞膜周围形成保护膜，反而由于其高脂溶性使得这些黄芩苷酯衍生物在水溶液中聚集，在溶液体系中的不均匀分布导致了差的抗氧化活性。
[0101]
实施例9
[0102]
黄芩苷辛酯片的制备
[0103]
将25g黄芩苷辛酯与80g淀粉、95g蔗糖粉混合均匀、过筛，得到混合粉末，加入含2％(w/v,g/ml)羧基甲基纤维素钠的75％(v/v)乙醇水溶液100ml作为粘合剂，制备软材，过
18目尼龙筛，获得的颗粒在50℃下干燥1小时，整粒，加入1％(wt.％)的硬脂酸镁，混合均匀，压制片芯制成1000黄芩苷辛酯片，片重约0.2g/片。口服，一次两片，一日3次。黄芩苷辛酯片可作为抗菌药物和/或抗氧化药物。
[0104]
实施例10
[0105]
黄芩苷辛酯脂质体颗粒的制备
[0106]
将卵磷脂和胆固醇溶解在含有黄芩苷辛酯的乙醇溶液中。其中卵磷脂与胆固醇的摩尔比为2:1，而黄芩苷辛酯与卵磷脂的摩尔比为1:6(mol/mol)。将所得的乙醇混合液滴入45℃的去离子水中搅拌数小时以蒸发残留乙醇。最初的黄芩苷辛酯脂质体在温和的搅拌下通过自组装形成。然后通过真空冷冻干燥把水除去获得黄芩苷辛酯脂质体颗粒。黄芩苷辛酯脂质体颗粒可添加在食品或化妆品、皮肤外用的制剂中，作为抗菌和/或抗氧化的活性成分。
[0107]
基于上述结果，黄芩苷酯衍生物由于其亲脂性的增加，使其能更容易进入胞内清除自由基或者在细胞表面聚集形成保护膜防止自由基的攻击，从而发挥更好的抗氧化活性。
[0108]
本发明的上述实施例仅仅是为了清晰地说明本发明而作出的举例，并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以作出其他不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。