一种组织工程生物材料制备装置的制作方法

1.本实用新型涉及生物材料脱细胞技术领域，尤其是一种组织工程生物材料制备装置。
技术背景
2.组织工程生物材料是一种天然生物支架材料，利用生物化学方法去除异种组织/器官的细胞成分，从而去除异种组织/器官的免疫原性，保留细胞外基质的主要成分和结构，为其植入人体内修复缺损组织提供了物质基础，具有较好的生物相容性和组织诱导能力，已有脱细胞基质应用于临床治疗表皮组织损伤、骨损伤及眼角膜损伤等。
3.有研究发现异种组织生物材料中的抗原主要来源于组织中有核细胞、血管、神经、脂肪等，如果抗原物质去除不完全则会因剧烈的免疫排斥反应导致植入失败。现有的脱细胞技术主要是物理方法与化学试剂法联合使用，即将生物材料与化学试剂于摇床中震荡实现脱细胞。但是此种方法存在以下缺点：(1)组织与化学试剂处理时混合不均匀，不充分，在组织内残留本该去除的成分，影响性能。(2)在处理过程中温度无法保证均衡，导致保存下来的生物活性物质减少，不利于生物材料发挥应有的组织诱导作用。(3)现有的方法其处理时间靠人工方法粗略控制，处理过程中的化学试剂靠人工粗略控制，使其每次处理时工艺流程的控制参数有很大的差异，不利于实现产品制作的标准化。
4.目前，超声生物技术在细胞破碎、超声洗涤等生物研究领域得到了越来越广泛的应用。超声生物技术主要是通过其机械作用、热效应和空化效应等对生物组织的细胞产生破坏作用，达到脱细胞的目的，从而更彻底地去除组织中的抗原成分，且保留了天然生物材料的三维结构，有利于细胞黏附生长，具有良好的生物相容性。而超声产生热量使组织所在环境温度升高，从而破坏组织内活性成分。为避免发生温度过高导致的产品活性降低，应用二阶程序控温技术将温度控制在极小范围内波动，增高产品的有效性与稳定性。
5.应用超声生物技术来制备异种生物材料，简化了制作工艺、缩短制作流程、降低制作费用，也大量减少了生物化学试剂的使用与残留，使脱细胞材料质量更稳定，实现批量生产。


技术实现要素：

6.本实用新型针对现有技术的不足，提出了一种组织工程生物材料制备装置。
7.一种组织工程生物材料的制备装置，包括超声处理槽、流量调控计、过滤器、水泵、第一电磁阀、第二电磁阀、第三电磁阀；所述的第三电磁阀的入口接纯化水、第三电磁阀的出口接水泵的进水口，水泵的出水口依次接过滤器和流量调控计，再通过冲击注液孔和旋转注液孔接超声处理槽，所述的冲击注液孔在超声处理槽底部周向分布，实现冲击注液使聚集在一起的组织分散开，所述的旋转注液孔在超声处理槽外侧壁不同高度周向分布，进行侧边注液，使组织跟随水流沿一个方向旋转；所述的超声处理槽中间设有圆柱型循环冷却系统，循环冷却系统上底面开有圆柱型通孔，通孔内设有出口管；出水管的高度与循环冷
却系统的高度一致且低于超声处理槽的外侧壁高度；所述的出水管的出口接第一电磁阀的入口和第二电磁阀的入口，第一电磁阀的出口接排水管，第三电磁阀的出口接水泵的进入口；所述的超声处理槽的外侧壁设有超声处理系统。
8.作为优选，所述的超声处理槽内设有温度传感器，所述的温度传感器与控温系统及循环冷却系统连接。
9.作为优选，还包括收集槽，所述的收集槽通过管道与超声处理槽连接；所述的收集槽内设有过滤网；真空泵通过管路与收集槽连接，用于抽取超声处理槽内的试剂及处理后的组织或器官；所述的收集槽底部还设有排液口和回液口。
10.作为优选，所述的超声处理系统的超声频率在20-130khz。
11.作为优选，还包括控制面板，控制面板一键控制真空泵的运转，设定超声处理槽的温度、运行模式、运行时间，控制三个电磁阀的开关实现内循环脱细胞和外循环脱毒的转换；实时监测和记录超声处理槽内的实际温度和电导率，确保产品的稳定性和可追溯性。
12.作为优选，所述的控温系统为二阶程序控温系统，实时监控作业槽内温度变化，并可设置温度变化的最大浮动范围，当处理槽内的液体温度超出波动范围即强制开启/关闭温度控制系统，达到均匀控温的效果。
13.本实用新型相对现有技术具有的效果：本实用新型通过采用超声生物技术和化学试剂法相结合，提高脱细胞效率，同时实现稳定、可控的组织脱细胞生产；本脱细胞装置具有实时过滤及动态循环系统，保证试剂的均一稳定性，减少产品性能波动；本脱细胞装置配备二阶程序控温系统，监测化学试剂的温度并在线调节，大幅缩小加工温度波动范围，保障脱细胞的稳定性。
附图说明
14.图1-1为本实用新型实施例提供的一种组织脱细胞装置的俯视图；
15.图1-2为本实用新型实施例提供的一种组织脱细胞装置的结构示意图；
16.图2为本实用新型实施例提供的组织脱细胞装置实时循环过滤系统的结构示意图；
17.图3为本实用新型实施例提供的组织脱细胞装置超声处理槽的结构示意图；
18.图4为本实用新型实施例提供的组织脱细胞装置真空槽的结构示意图。
具体实施方式
19.以下是结合附图对本实用新型实施例提供的一种组织脱细胞装置的详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创新性劳动前提下所获得的所有其他实施例都包括在本实用新型保护的范围内。
20.在本实用新型的描述中，所需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“内”、“外”、“顶部”、“底部”等指示位置关系的为基于附图所示的位置关系，仅为便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制，在本实用新型的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
21.参见图1-1、图1-2所示，为本实用新型实施例提供的一种组织脱细胞装置的一个具体实施例，本实施例的组织脱细胞装置包括外层箱体1、实时循环过滤系统2、多个超声处理系统、循环冷却系统、真空系统、二阶程序控温系统、电子控制系统6、控制面板6-1和收集槽4-2；
22.本实用新型实施例提供了一种组织脱细胞装置，其中：
23.外层箱体1包括万向轮1-1、底座1-2，方便装置移动且防止漏液而污染地面。
24.如图2所示，实时循环过滤系统包括循环水泵2-3、循环管道2-2、过滤器2-1、流量调控计2-4、排液管2-5、注水管2-6、电磁阀2d。将化学试剂倒入超声处理槽3后，打开第二电磁阀2d-2，关闭第一电磁阀2d-1和第三电磁阀2d-3，可进行内循环。打开电磁阀2d-1和2d-3，关闭2d-2，可进行外循环。两者皆通过循环水泵将液体泵入超声处理槽3中。
25.为了减少脱细胞液的使用，在循环管道2-2上串联过滤器2-1，使得超声处理槽3中带有杂质的脱细胞液经过过滤器2-1滤过后由循环水泵2-3再次泵入超声处理槽3，由此实现超声处理槽3中脱细胞液的循环，降低工艺成本的同时保障产品的稳定性。
26.为使组织在超声处理时分散开来而得到充分的脱细胞和脱毒，设置流量调控计2-4，控制液体流量与压力大小，实现冲击注液，利用水流的冲击力冲散聚集在一起的组织从而与脱细胞液充分接触，达到稳定的脱细胞去抗原和脱毒减少化学试剂残留的效果。
27.如图3所示，超声处理槽包括槽体3-1、循环冷却系统3-2、排液口3-3、冲击注液孔3-5、旋转注液孔3-7。
28.所述的冲击注液孔3-5位于槽体3-1底部，可进行底部注液，实现冲击注液使聚集在一起的组织分散开。所述的旋转注液孔3-7在超声处理槽外侧壁不同高度周向分布，进行侧边注液，使组织跟随水流沿一个方向旋转，与化学试剂或纯化水充分接触；
29.循环冷却系统3-2装有冷却水，上端封闭，下端通过管道与冷却槽相连。
30.温度传感器5-1置于超声处理槽3中，与plc相连，通过二阶程序控温机制调控清洗槽中脱细胞液的温度在极小范围内波动，保障产品有效性。
31.如图4所示，所述的真空系统包括真空泵、收集槽；收集槽底部还设有排液口和回液口。为了方便组织的取出，利用真空泵将液体和组织吸入设有滤网的收集槽内，沥干清洗或漂洗后的组织，回液口收集滤液用于检测。
32.相较于摇床脱细胞，本实用新型提供的组织脱细胞方法工艺更简单，制备周期缩短，且具有更高的脱细胞效果。以上操作中，所述电磁阀、真空泵、流量调控计、循环水泵皆通过所述控制面板进行控制并设定工作时间，脱细胞和脱毒过程可实现自动化，降低人力的投入。所述二阶程序控温机制可控制所述超声处理槽内温度波动在2℃以内。所述内循环系统可大大减少脱细胞化学试剂的使用量，降低生产成本。所述超声处理槽可设置多个并同时进行工作，可容纳1-25l液体，大大提高了生产效率，实现批量化生产。
33.另一方面，本实用新型提供了一种组织脱细胞方法，应用于如上所述的脱细胞装置，包括：
34.实施例1.一种组织工程材料制作方法:将生物组织、器官经过分离，切割获得想要的形状，放置于生物材料制备中，加入处理试剂进行处理，处理过程包括：(1)初步清洗去除杂质、血液；(2)去除脂肪；(3)在30℃以下，将步骤(2)得到的组织或器官放入清洗槽中用30℃以下用乙醇和甲醇萃取脂肪多次，再脱脂；(4)将步骤(3)得到的组织或器官放入清洗槽
中在30℃以下用胰蛋白酶、胶原蛋白酶、triton x-100、sds脱细胞；去除脂蛋白、糖蛋白、组织中的细胞以及细胞内外抗原性蛋白质；将步骤(4)得到的组织或器官放入清洗槽中用纯化水清洗，去除残留在组织中的试剂，从而获得具有完整细胞外基质结构、去除抗原性的组织工程生物材料；在-35℃条件下在冷冻干燥机中干燥48小时。
35.生物材料处理、脱脂清洗、脱蛋白清洗的工艺条件分别列表如下
36.步骤1)将组织放入超声处理槽中，倒入脱细胞液，盖上槽盖，在控制面板6-1上设置好温度、超声模式与时间进行组织脱细胞，此时为内循环。
37.步骤2)脱细胞完成后，启动真空泵4-1，将超声处理槽3中的脱细胞液和组织吸入收集槽4-2内，同时将吸入收集槽内的废液排出，打开收集槽4-2，取出沥干后的组织。
38.步骤3)组织放回超声处理槽3中，盖上槽盖，在控制面板6-1上设置好温度、超声模式与时间进行组织脱毒，去除组织内残留的化学试剂，此时为外循环。
39.步骤4)脱毒完成后，启动真空泵4-1，将超声处理槽3中的脱细胞液和组织吸入收集槽4-2内，同时将吸入收集槽内的废液排出，打开收集槽4-2，取出沥干后的组织。
40.实施例2.生物脱细胞脱钙松质骨的制作。取新鲜屠宰的猪后腿股骨20千克，剖开后去除软组织和骨髓，加工成直径6mm厚度为2mm的骨粒。置于生物材料制备装置超声清洗槽中，用纯化水动态清洗1-24小时，去除表面脂肪和其它杂质；用乙醇30℃动态循环处理1-24小时，脱去松质骨中的脂肪，用石油醚分离脂肪；用生理盐水液清洗3次；然后triton x-100、sds脱细胞，结束后纯化水动态清洗1-12小时，加入edta-2na超声脱钙10分钟-2小时，最终使用注射用水超声动态清洗12-120小时；最后获得生物脱细胞脱钙松质骨，在-45℃条件下在冷冻干燥机中干燥48小时，冻干后密封储于低温冰箱中。
41.实施例3.生物脱细胞肌腱的制作。取新鲜屠宰的猪肌腱0.5千克，去除表面腱膜，制成4厘米的长段。用纯化水动态清洗1-24小时，去除表面脂肪和其它杂质；用甲醇：氯仿(1：3)30℃动态循环处理1-24小时，脱去猪肌腱中的脂肪，用石油醚分离脂肪；用生理盐水液清洗3次；然后胰蛋白酶、胶原蛋白酶、sds脱细胞，结束后纯化水动态清洗2小时，用氯仿一甲醇(3:1)4升于37℃条件下动态循环处理24小时，进一步脱去肌腱中的细胞和脂肪，用生理盐水液清洗3次；最后获得生物衍生肌腱，在-55℃条件下在冷冻干燥机中干燥48小时，冻干后密封储于低温冰箱中
42.实施例4.生物脱细胞膀胱的制作。取新鲜屠宰的猪膀胱一个，从中纬线剖开，取上半部分，撕掉粘膜后，将其置于生物材料制备装置超声清洗槽中，用含10％食品清洗剂的生理盐水液1升动态清洗1小时，去除表面脂肪和其它杂质；用乙醇30℃动态循环处理1-24小时，脱去膀胱中的脂肪，用石油醚分离脂肪；用生理盐水液清洗3次；然后胰蛋白酶、胶原蛋白酶、triton x-100、sds脱细胞；用生理盐水液清洗3次；然后用含1mol/lnacl和dna酶的溶液于37℃条件下动态循环处理24小时，进一步溶解细胞并去除所有细胞内成份；接着用含4％脱氧胆酸钠(含0.1％叠氮化钠)溶液继续动态循环处理12小时，以去除细胞膜脂双层及胞内膜脂。最终使用注射用水超声动态清洗6-12小时，在-65℃条件下在冷冻干燥机中干燥48小时，冻干后密封储于低温冰箱中。
43.以上所述，仅为本实用新型的具体实施方式，但本实用新型的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本实用新型揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。因此，本实用新型的保护范围应以所述权
利要求的保护范围为准。