用于治疗冠状病毒感染的人去泛素化酶抑制剂的制作方法

1.本技术涉及用于预防或治疗冠状病毒感染的人去泛素化酶的小分子抑制剂。特别地，其涉及usp7和usp47的小分子抑制剂。公开了药物组合物、各自有利的配制技术和治疗方法。


背景技术：

2.由于生态、气候和人口变化，所谓的'新兴'病毒越来越多地从它们的天然动物宿主向人类传播。由于全球化加速，它们承担着引发流行病的风险。新兴病毒可能会引起急性并且经常危及生命的疾病。冠状病毒科(coronaviridae)由于此类传播已变得臭名昭著。实例为严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，sars-cov)和中东呼吸综合征相关冠状病毒(middle east respiratory syndrome-related coronavirus，mers-cov)，以及最近爆发的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2；covid-19)。截至2021年2月4日，约翰霍普金斯大学冠状病毒资源中心已报告了全球总计超过1.04亿例sars-cov-2感染，其中超过200万人死亡。sars-cov-2的潜伏期在2天和2周之间，在一些情况下长达一个月。
3.sars-cov-2的典型症状为发热、咳嗽和呼吸急促。然而，感染也可能会引起严重的肺损伤，导致肺部进行性功能障碍的迅速发作，尤其是在摄氧能力方面。这通常与其它器官的功能障碍相关。这种急性肺部损伤(acute lung injury，ali)病况与广泛的肺部炎症和液体在肺泡中的积聚相关。其特征在于弥漫性肺微血管损伤，导致通透性增加，并且从而导致非心源性肺水肿。结果，这导致肺中的病理性低氧水平。与icu监护中的covid-19患者相关的其它常见症状为肺栓塞、血栓形成、静脉血栓栓塞和脑缺血。
4.冠状病毒主要通过密切接触、特别是通过由咳嗽和打喷嚏产生的呼吸道飞沫来传播。与sars-cov和mers-cov不同，sars-cov-2在潜伏期期间可以在人与人之间传播，而被感染的患者尚未显示出任何疾病症状。此外，sars-cov-2已经可以在咽喉中复制。相比之下，sars-cov和mers-cov的受体位于肺部深处。因此，与sars-cov和mers-cov相比，sars-cov-2可以更容易地在人与人之间传播，这使感染率大大提高。
5.通常，冠状病毒(冠状病毒科，冠状病毒组)形成一组相对多样化的大型、有包膜、正链rna病毒，其可以在人和动物中引起不同类型的腹泻和呼吸道疾病。它们具有非常窄的宿主范围并且在细胞培养中复制非常差。然而，可以成功地建立sars-cov-2的细胞培养体系。
6.sars-cov-2的测序显示由14个开放阅读框构成的约29.8kbp的基因组。此外，病毒在系统发育方面与sars-cov密切相关(89.1％的核苷酸相似性)(参见wu等人(2020)nature 579:265-269)。与其它冠状病毒一样，sars-cov-2通过内吞作用和膜融合进入细胞。病毒通过分泌途径从细胞中释放。病毒的天然储存宿主(reservoir)是未知的。
7.迄今为止，未建立用于治疗sars-cov-2感染或covid-19的特定治疗方案。可以用抗病毒药物瑞德西韦、阿维法韦(avifavir)和法匹拉韦以及用抗寄生虫药物伊维菌素
(ivermectin)取得一些成功。包含抗sars-cov-2刺突蛋白的纳米抗体的鼻喷雾剂是有前景的发展(aeronabs)。在重症covid-19患者中，给予糖皮质激素地塞米松显示有效。
8.一个主要问题是冠状病毒的高突变率。因此，对于特定冠状病毒感染的有效药物治疗，当病毒靶点受到抑制时，该冠状病毒很快变得部分或完全抵抗该治疗的可能性较高。一旦下一个冠状病毒通过种属屏障(species barrier)传给人类，将出现相同的问题，并且发展为另一种传染病。
9.因此，对于用于感染sars-cov-2或类似的冠状病毒的患者和用于限制目前该病毒的大规模流行传播的有效药物治疗存在较强的医学需要。理想地，此类药物治疗还应当解决高突变率并且至少为未来的冠状病毒爆发提供治疗方案。


技术实现要素：

10.令人惊讶的是，通过根据本公开的小分子人去泛素化酶抑制剂解决了该任务。特别地，人去泛素化酶usp7和/或usp47的小分子抑制剂在冠状病毒感染的治疗中显示良好的功效。
11.usp7和usp47在系统发育方面密切相关。usp7主要与肿瘤相关，这是因为其抑制会重新激活很多癌症中的肿瘤抑制基因p53。usp7也与免疫系统相关(参见antao等人(2020)cancers 12:1579)。就迄今为止进行的研究而言，对usp7显示抑制活性的化合物通常也抑制usp47。因此，似乎usp47起到usp7的组织特异性同工酶的作用。
12.因此，本公开涉及用于冠状病毒感染的预防或治疗的人去泛素化酶usp7和/或usp47的抑制剂及其药学上可接受的盐、水合物和溶剂化物。
具体实施方式
13.此类usp7和/或usp47抑制剂的优选实施方案为根据本公开的吡啶-3,5-(双)硫氰酸酯。
14.根据本公开的合适的吡啶-3,5-双(硫氰酸酯)为根据通式(i)的吡啶-3,5-(双)硫氰酸酯，
[0015][0016]
其中
[0017]
r1和r2各自彼此独立地为-h、-oh、-nhr3、-nr3r4、取代或未取代的线性或支化的具有1至3个碳原子的烷基残基、-co-och3、-co-oc2h5、-co-nh2、-nh2、-no2、-cl、-br、-f、或-so2h；并且
[0018]
r3和r4各自彼此独立地为-oh、-ch3、-c2h5、-ch2oh、-cho、-cooh、-co-ch3、或-co-nh2。
[0019]
特别地，2,6-二氨基吡啶-3,5-双(硫氰酸酯)显示有效。该化合物主要称为pr-619(式ii)并且是最优选的。
[0020][0021]
如实施例1所示，10μm pr-619能够广泛地抑制sars-cov-2在受感染的vero-b4细胞中的复制。该发现在实施例2的qrt-pcr实验中得以证实。如可以在实施例3中看出的，在该浓度下，pr-619不显示细胞毒性作用。此外，在酶试验中，pr-619表现出对sars-cov-2的木瓜蛋白酶样蛋白酶(plpro)的直接抑制作用，所述木瓜蛋白酶样蛋白酶对于sars-cov-2的复制是必不可少的(实施例4)。
[0022]
此类usp7和/或usp47抑制剂的其它优选实施方案为根据本公开的二取代的4-硝基-噻吩。
[0023]
根据本公开的合适的二取代的4-硝基-噻吩为根据通式(iii)的二取代的4-硝基-噻吩，
[0024][0025]
其中
[0026]
r1为苯基、2-氯苯基、3-氯苯基、4-氯苯基、2,3-二氯苯基、3,5-二氯苯基、2,4-二氯苯基或2,4-二氟苯基，并且
[0027]
r2为乙酰基、1-羟基乙基、乙基或正丁基。
[0028]
发现4-硝基-噻吩的具有这些取代基的化合物在抑制人去泛素化酶usp7方面是有效的(chauhan等人(2012)cancer cell 22:345-358)。
[0029]
特别地，1-[5-[(2,3-二氯苯基)硫代]-4-硝基-2-噻吩基]-乙酮显示有效。另一名称为1-[5-(2,3-二氯苯基)硫烷基-4-硝基-2-噻吩基]乙酮。该化合物主要称为p005091，或者称为p5091(参见式iv)，并且是最优选的。
[0030][0031]
在实施例5中，记载了5μm p5091几乎可以完全抑制sars-cov-2在受感染的vero-b4细胞中的复制。如实施例6中所示，在该浓度下，p5091不显示细胞毒性作用。此外，在酶试验中，p5091表现出对sars-cov-2的木瓜蛋白酶样蛋白酶(plpro)的直接抑制作用(实施例7)。
[0032]
usp7和/或usp47的其它合适的去泛素化酶抑制剂包括p22077、adc-01、adc-03、hbx41108、hbx19818、hbx 28258、nsc 632839、nsc 144303、gne-6640、gne-6776、ft671、ft827、xl188、xl177a、xl024、xl058、xl041、4-氰基-5-[(3,5-二氯-4-吡啶基)硫代]-n-[4-(甲基磺酰基)苯基]-2-噻吩甲酰胺和小白菊内酯。
[0033]
本公开还涉及用于冠状病毒感染的预防或治疗的前述usp7和/或usp47的去泛素化酶抑制剂。
[0034]
去泛素化酶抑制剂p22077(1-{5-[(2,4-二氟苯基)硫烷基]-4-硝基-2-噻吩基}乙烯酮)由progenra公司(malvern，usa)发现并且是商购可得的。在wo2010/114881中公开了p22077物质类别的合成的描述。p22077对于usp7和usp47具有特异性。对atxn3、bap1和usp1的亲和力小得多。p22077导致多聚泛素链的增多(altun等人(2011)chem biol 18:1401-1412)。可以显示自噬途径的激活(seiberlich等人(2013)cell biochem biophys 67:149-160)。截至目前，p22077的研究集中于肿瘤的治疗，而没有证明对p22077治疗上有用的抗增殖潜力。此外，p22077对于抑制hiv-1在原代t细胞和巨噬细胞以及离体制备物(ex vivo preparations)(人类淋巴样聚集培养物(human lymphoid aggregate culture，hlac))中的复制非常有效。hiv-1结构蛋白的mhc-i抗原呈递增加(参见wo 2016/004915)。
[0035]
almac discovery发现了一系列哌啶衍生物，其为特异性usp7抑制剂(wo 2018/073602 a1)。其中，adc-01和adc-03是最有前景的化合物(gavory等人(2015)cancer res 75:15)。应当将这些化合物进行治疗性开发用于肿瘤学用途和免疫肿瘤学用途。
[0036]
hbx41108(7-氯-9-氧代-9h-茚并[1,2-b]吡嗪-2,3-二甲腈)、hbx19818(n-(3-(苄基(甲基)氨基)丙基)-9-氯-5,6,7,8-四氢吖啶-2-甲酰胺)和hbx28258(9-氯-n-[3-[乙基(苯基甲基)氨基]丙基]-5,6,7,8-四氢-2-吖啶甲酰胺)特异性地抑制usp7。应当将这些相关化合物进行治疗性开发用于肿瘤学用途和免疫肿瘤学用途(reverdy等人(2012)chem biol 19:467-477)。
[0037]
gne-6640(cs 2824；4-[2-氨基-4-乙基-5-(1h-吲唑-5-基)-3-吡啶基]-苯酚)和gne-6776(cs2823；6'-氨基-4'-乙基-5'-(4-羟基苯基)-n-甲基-[3,3'-双吡啶]-6-甲酰胺)为usp7抑制剂。gne-6640还抑制usp43和ub-mdm2，而gne-6776对usp7具有高度特异性。这些化合物通过减弱泛素结合并且从而减弱usp7活性来诱导肿瘤细胞死亡和细胞毒性
(kategaya等人(2017)nature550:534-538)。
[0038]
ft671(5-[[1-[(3s)-4,4-二氟-3-(3-氟-1h-吡唑-1-基)-1-氧代丁基]-4-羟基-4-哌啶基]甲基]-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮)和ft827(n-[4'-[[4-[(1,4-二氢-1-甲基-4-氧代-5h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基]-4-羟基-1-哌啶基]羰基][1,1'-联苯]-2-基]-乙烯磺酰胺)以高亲和力和特异性抑制usp7。通过该机制，它们导致各种癌症中肿瘤抑制基因p53的重新激活(turnbull等人(2017)nature 550:481-486)。
[0039]
wo 2019/067503a1公开了许多相关usp7抑制剂与肿瘤抑制基因p53相互作用以用于肿瘤治疗：((r)-7-氯-3-((4-羟基-l-(3-苯基丁酰基)哌啶-4-基)甲基)喹唑啉-4(3h)-酮、(7-氯-3-((1-(3-苯基丙酰基)哌啶-4-基)甲基)喹唑啉-4(3h)-酮、4-((7-氯-4-氧代喹唑啉-3(4h)-基)甲基)-l-(3-苯基丙酰基)哌啶-4-甲腈、(7-氯-3-((4-羟基-1-(3-苯基丙基)哌啶-4-基)甲基)喹唑啉-4(3h)-酮、(7-氯-3-((3-羟基-1-(3-苯基丙酰基)吡咯烷-3-基)甲基)喹唑啉-4(3h)-酮、(3-((1-乙酰基-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-7-氯喹唑啉-4(3h)-酮、(7-氯-3-((4-羟基-1-(2-苯基乙酰基)哌啶-4-基)甲基)喹唑啉-4(3h)-酮、(7-氯-3-((4-羟基-1-(3-苯基丁酰基)哌啶-4-基)甲基)喹唑啉-4(3h)-酮、((s)-7-氯-3-((4-羟基-1-(3-苯基丁酰基)哌啶-4-基)甲基)喹唑啉-4(3h)-酮、((r)-n-(3-((4-羟基-1-(3-苯基丁酰基)哌啶-4-基)甲基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-7-基)-3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙烯酰胺、((s)-n-(3-((4-羟基-1-(3-苯基丁酰基)哌啶-4-基)甲基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-7-基)-3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙烯酰胺、(n-(3-((4-羟基-1-(3-苯基丁酰基)哌啶-4-基)甲基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-7-基)-3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙烯酰胺、(n-(3-((4-羟基-1-(4-甲基-3-苯基戊酰基)哌啶-4-基)甲基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-7-基)-3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙烯酰胺、((r)-n-(3-((4-羟基-1-(3-苯基丁酰基)哌啶-4-基)甲基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-7-基)-3-吗啉代丙酰胺、((r)-3-(二甲基氨基)-n-(3-((4-羟基-1-(3-苯基丁酰基)哌啶-4-基)甲基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-7-基)丙烯酰胺、(n-(3-((4-羟基-1-(3-苯基丁酰基)哌啶-4-基)甲基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-7-基)-3-(1h-咪唑-1-基)丙烯酰胺、((tst-(3-((4-羟基-1-(3-苯基丁酰基)哌啶-4-基)甲基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-7-基)-3-(哌啶-1-基)丙烯酰胺。
[0040]
((r)-n-(3-((4-羟基-1-(3-苯基丁酰基)哌啶-4-基)甲基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-7-基)-3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙烯酰胺也称为xl188(参见lamberto等人(2017)cell chem biol 24:1490-1500)。
[0041]
源自xl188的是xl177a((s)-n-(4-苄基-5-(4-羟基-4-((7-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙酰氨基)-4-氧代喹唑啉-3(4h)-基)甲基)哌啶-1-基)-5-氧代戊基)-9-氯-5,6,7,8-四氢吖啶-3-甲酰胺)。xl112、xl024(((s)-n-(4-苄基-5-(4-((7-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙酰氨基)-4-氧代喹唑啉-3(4h)-基)甲基)哌啶-1-基)-5-氧代戊基)-9-氯-5,6,7,8-四氢吖啶-3-甲酰胺)、xl058(((s)-n-(4-苄基-5-(4-羟基-4-((7-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙酰氨基)-4-氧代喹唑啉-3(4h)-基)甲基)哌啶-1-基)-5-氧代戊基)-5,6,7,8-四氢吖啶-3-甲酰胺)和xl041(((s)-n-(5-(4-羟基-4-((7-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙酰氨基)-4-氧代喹唑啉-3(4h)-基)甲基)哌啶-1-基)-5-氧代戊基)-9-氯-5,6,7,8-四氢吖啶-3-甲酰胺)也属于该组(参见schauer等人(2020)nature sci rep 10:5324)。
[0042]
发现nsc 632839(同义词：f6；4-哌啶二酮，3,5-双[(4-甲基苯基)亚甲基]-盐酸盐)和nsc 144303(4h-噻喃-4-酮-四氢-3,5-双[(4-硝基苯基)亚甲基]-1,1-二氧化物)在没有功能性半胱天冬酶-9的情况下维持半胱天冬酶3/半胱天冬酶7活性。这包括依赖bcl-2但不依赖凋亡体的线粒体途径。细胞凋亡似乎是由泛素-蛋白酶体系统引入的。这两种化合物抑制usp2、usp7和不影响蛋白酶体蛋白水解活性的senp2去sumo酶(senp2 desumoylase)。将它们开发为替代物用于癌症治疗(参见aleo等人(2006)cancer res 66:9235-9244；nicholson等人(2008)protein sci 17:1035-1043)。
[0043]
4-氰基-5-[(3,5-二氯-4-吡啶基)硫代]-n-[4-(甲基磺酰基)苯基]-2-噻吩甲酰胺是相对于usp2、usp5、usp8、usp21、usp28、半胱天冬酶-3和组织蛋白酶b对usp7和usp47具有特异性的去泛素化酶抑制剂。其抑制hct116细胞的生长(参见weinstock等人(2012)acs med chem lett 3:789-792)。
[0044]
小白菊内酯(1ar,4e,7as,10as,10br)-2,3,6,7,7a,8,10a,10b-八氢-1a,5-二甲基-8-亚甲基-环氧乙烷并[9,10]环癸[1,2-b]呋喃-9(1ah)-酮)是小白菊(tanacetum parthenium)中发现的倍半萜内酯。最初，将小白菊内酯分类为hdac1抑制剂和nf-κb调节剂。记载了抗炎特性和抗痛觉过敏特性以及对亚马逊利什曼原虫(leishmaniosis amazonensis)感染的作用。最近，发现小白菊内酯特异性地抑制usp7、wnt信号传导和结直肠癌细胞生长(li等人(2020)jbiol chem 295:3576-3589)。
[0045]
已知冠状病毒利用蛋白酶plpro或它们的功能类似物来干扰人类宿主细胞的蛋白酶体系统，从而使相应的细胞酶功能化，以用于它们的复制。
[0046]
蛋白酶体是多催化酶复合物，占总细胞蛋白的约1％。它代表细胞核和真核细胞的细胞溶质中的主要蛋白水解组分。蛋白酶体在细胞代谢中起到很多重要的作用。一个主要功能为错误折叠的非功能性蛋白的蛋白水解。另一重要功能为细胞蛋白和病毒蛋白的降解，用于t细胞介导的免疫应答，从而产生要装载至mhc-i分子(mhc＝主要组织相容性复合体)上的肽配体。一个亚型为在特定细胞类型中例如在脾脏、淋巴结和抗原呈递细胞中组成性表达的免疫蛋白酶体。
[0047]
通常借助泛素低聚物的附着来标记蛋白酶体的底物以用于降解。泛素(ub)为高度保守的76个氨基酸长度的蛋白，其与相应的靶蛋白共价偶联。泛素化为可逆过程。可以借助多种去泛素化酶(deubiquitinase)(去泛素化酶(deubiquitinating enzyme，dub))将ub分子从靶蛋白中除去。因此，ub分子再次成为细胞内可用的。该回收过程对于细胞稳态至关重要。靶蛋白泛素化和蛋白酶体蛋白水解的该调节系统通常称为泛素蛋白酶体系统(ups)。
[0048]
dub是一类广泛的ub水解酶并且是泛素e3连接酶的细胞内对手(intracellular opponent)。靶蛋白可以完全或部分去泛素化。在人类中，迄今为止已知超过100种dub，其细分为5个家族：
[0049]
泛素特异性蛋白酶家族(usp)
[0050]
泛素c-末端水解酶(uch)
[0051]
卵巢肿瘤蛋白酶(otu)
[0052]
josephin家族
[0053]
jab1/mpn/mov34家族(jamm)
[0054]
前四种为半胱氨酸蛋白酶而最后一种为锌金属蛋白酶。
(双)硫氰酸酯及其药学上可接受的盐、水合物和溶剂化物。
[0068]
特别地，本技术涉及用于冠状病毒感染的预防或治疗的pr-619。
[0069]
在cb-17小鼠中，使用dub抑制剂p5091导致多发性骨髓瘤细胞的细胞凋亡。因此可以逆转对蛋白酶体抑制剂硼替佐米产生的耐药性。记载了p5091在肿瘤细胞系中诱导细胞凋亡(chauhan等人(2012)cancer cell 22:345-358)。p5091有效且特异性地抑制密切相关的去泛素化酶usp7和usp47而不阻断蛋白酶体活性(chauhan等人(2012)cancer cell 22:345-358；weinstock等人(2012)acs med chem lett 3:789-792)。
[0070]
因此，本技术还涉及用于冠状病毒感染的预防或治疗的根据本公开的二取代的4-硝基-噻吩及其药学上可接受的盐、水合物和溶剂化物。
[0071]
特别地，本技术涉及用于冠状病毒感染的预防或治疗的p5091。
[0072]
可以用根据本公开的去泛素化酶抑制剂治疗的冠状病毒感染首先是高致病性sars-cov、mers-cov和sars-cov-2的感染。
[0073]
但是也可以因此治疗以下所列出的致病性较低的冠状病毒科的感染。术语“冠状病毒(coronavirus)”或“冠状病毒(coronaviral)”主要是指正冠状病毒亚科。它们细分为α冠状病毒属、β冠状病毒属、γ冠状病毒属和δ冠状病毒属。冠状病毒包括colacovirus亚属(种：蝙蝠冠状病毒cdphe15)、decavirus亚属(蝙蝠冠状病毒hku10、马铁菊头蝠α冠状病毒hub-2013)、duvinacovirus亚属(人冠状病毒229e)、luchacovirus亚属(鹿城褐家鼠冠状病毒)、minacovirus亚属(雪貂冠状病毒、水鼬冠状病毒1)、minunacovirus亚属(长翼蝠冠状病毒1、长翼蝠冠状病毒hku8)、myotacovirus亚属(大足鼠耳蝠α冠状病毒sax-2011)、nylactovirus亚属(绒山蝠α冠状病毒sc-2013)、pedacovirus亚属(猪流行性腹泻病毒、高头蝠冠状病毒512)、rhinacovirus亚属(菊头蝠冠状病毒hku2)、setracovirus亚属(人冠状病毒nl63、与nl63相关的蝙蝠冠状病毒株btkynm63-9b)和tegacovirus亚属(α冠状病毒1模式种)。β冠状病毒包括embecovirus亚属(β冠状病毒1(亚种：人冠状病毒oc43)、中国鼠冠状病毒hku24、人冠状病毒hku1、鼠冠状病毒模式种)、hibecovirus亚属(蹄蝠β冠状病毒浙江2013)、merbecovirus亚属(刺猬冠状病毒1、mers-cov、伏翼蝠冠状病毒hku5、扁颅蝠冠状病毒hku4)、nobecovirus亚属(果蝠冠状病毒gccdc1、果蝠冠状病毒hku9)和sarbecovirus亚属(与严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒(亚种：sars-cov、sars-cov-2))。γ冠状病毒包括cegacovirus亚属(鲸豚冠状病毒sw1)和igacovirus亚属(禽冠状病毒模式种)。δ冠状病毒包括andecovirus亚属(赤颈鸭冠状病毒hku20)、buldecovirus亚属(鹎冠状冠状病毒hku11模式种、猪冠状病毒hku15、文鸟冠状病毒hku13、绣眼鸟冠状病毒hku16)、herdecovirus亚属(夜鷺冠状病毒hku19)和moordecovirus亚属(黑水鸡冠状病毒hku21)。
[0074]
迄今为止，在人类中致病的冠状病毒为sars-cov、sars-cov-2、mers-cov、hcov-hku1、hcov-nl-63、hcov-oc43和hcov-229e。后四种仅引起相对轻微的症状(参见andersen等人：the proximal origin of sars-cov-2,on virologica.org，截至2020年2月17日)。
[0075]
因此，本技术特别涉及用于冠状病毒感染的预防或治疗的根据本公开的usp7和/或usp47的人去泛素化酶抑制剂或者其药学上可接受的盐中之一，其中所述冠状病毒感染选自包括sars-cov感染、sars-cov-2感染、mers-cov感染、hcov-hku1感染、hcov-nl-63感染、hcov-oc43感染和hcov-229e感染组成的组。
[0076]
更优选的是用于冠状病毒感染的预防或治疗的根据本公开的吡啶-3,5-(双)硫氰
酸酯或者其药学上可接受的盐中之一，其中所述冠状病毒感染为sars-cov-2。
[0077]
还更优选的是用于冠状病毒感染的预防或治疗的pr-619或者其药学上可接受的盐中之一，其中所述冠状病毒感染为sars-cov-2。
[0078]
更优选的是用于冠状病毒感染的预防或治疗的根据本公开的二取代的4-硝基-噻吩或者其药学上可接受的盐中之一，其中所述冠状病毒感染为sars-cov-2。
[0079]
还更优选的是用于冠状病毒感染的预防或治疗的p5091或者其药学上可接受的盐中之一，其中所述冠状病毒感染为sars-cov-2。
[0080]
其它上述动物冠状病毒尚未转移至人类(动物传染病(zoonosis))，但是这可能会在未来发生，具有无法预测的病理学。因此，本技术的范围还涉及用于动物和人类中的这些动物冠状病毒感染的预防或治疗的、根据本公开的人去泛素化酶的小分子抑制剂。
[0081]
在所有物种中治疗冠状病毒感染的概念基于冠状病毒的结构相似性。因此，可以假定可以将治疗和/或预防方案从一种冠状病毒转用至另一种。冠状病毒颗粒包含四种主要的结构蛋白：刺突(s)、膜(m)、包膜(e)和核衣壳(n)，所有这些蛋白均编码在病毒基因组3’端内。
[0082]
冠状病毒包含～30kb的非分段正义rna基因组。基因组包含5
′
帽结构以及3
′
多聚(a)尾部，使其起到用于复制酶多聚蛋白的翻译的mrna的作用。与仅占病毒基因组的约10kb的结构蛋白和辅助蛋白不同，编码非结构蛋白(nsp)的复制酶基因占据基因组的三分之二，约20kb。冠状病毒基因组的组成为5
′‑
前导序列-utr-复制酶-s(刺突)-e(包膜)-m(膜)-n(核衣壳)-3
′
utr-多聚(a)尾部，其中辅助基因散布在位于基因组的3
′
端的结构基因内。辅助蛋白几乎完全不是组织培养中的复制所必需的；然而，一些辅助蛋白已被证明在病毒发病机制中具有重要作用(参见zhao等人(2012)cell host microbe 11:607-616)。
[0083]
冠状病毒生命周期始于病毒粒子通过s蛋白与其受体之间的相互作用向宿主细胞的初始附着。冠状病毒s蛋白的s1区域内的受体结合域(rbd)的位点取决于病毒而变化。s-蛋白-受体相互作用是冠状病毒感染宿主物种的主要决定因素并且还控制病毒的组织嗜性(tissue tropism)。很多冠状病毒利用肽酶作为它们的细胞受体。尚不清楚为什么使用肽酶，这是因为，即使在不存在这些蛋白的酶结构域(enzymatic domain)的情况下也发生进入(entry)。很多α冠状病毒利用氨肽酶n(apn)作为它们的受体，很多β冠状病毒例如sars-cov、sars-cov-2和hcov-nl63使用血管紧张素转化酶ii(ace2)受体，mhv通过ceacam1进入，并且mers-cov结合至二肽基肽酶4(dpp4)以得以进入人细胞中。在受体结合之后，病毒接下来必须进入宿主细胞的细胞溶质。这通常通过借助组织蛋白酶、tmprrs2或另一蛋白酶使s蛋白酸依赖性蛋白水解性切割(acid-dependent proteolytic cleavage)、然后使病毒膜和细胞膜融合并且最终将病毒基因组释放至细胞质中来完成。
[0084]
冠状病毒编码两种或三种切割复制酶多聚蛋白的蛋白酶。它们是在nsp3内编码的木瓜蛋白酶样蛋白酶(plpro)以及一种丝氨酸型蛋白酶(由nsp5编码的主要蛋白酶或mpro)。除了仅表达一个plpro的γ冠状病毒sars-cov和mers-cov以外，大多数冠状病毒在nsp3内编码两个plpro(mielech等人(2014)virus res doi:10.1016)。
[0085]
该木瓜蛋白酶样蛋白酶(plpro)在sars-cov中被发现与人类细胞泛素蛋白酶体系统(ups)内的去泛素化酶的作用方式相同(参见raaben等人(2010)j virol 84:7869-7879)。sars-cov-2中的plpro与sars-cov具有非常高的同源性(96.1％，nguyen等人(2020)
https://doi:org/10:1101/2020.02.05.936013)。这些plpro是dub抑制剂的靶点。例如，发现grl0617(5-氨基-2-甲基-n-[(1r)-1-(1-萘基)乙基]苯甲酰胺)抑制sars-cov中的plpro。因此，可以将grl0617视为针对冠状病毒靶点的dub抑制剂(参见ratia等人(2008)pnas105:16119-16124)。
[0086]
氯喹((rs)-n'-(7-氯喹啉-4-基)-n,n-二乙基-戊烷-1,4-二胺)是熟知的疟疾药物，其作为自噬抑制剂起作用。氯喹与硼替佐米协同作用以在肿瘤模型中抑制细胞增殖并且诱导细胞凋亡(hui等人(2012)cancer 118:5560-5571)。已知氯喹通过提高病毒/细胞融合所需的核内体ph来阻断病毒感染，并且氯喹干扰sars-cov感染中ace ii受体的糖基化(vincent等人(2005)virol j 2,69)。最近，发现抗病毒药物瑞德西韦和氯喹的组合在体外抑制sars-cov-2(wang等人(2020)cell res 0:1-3)。
[0087]
被指定为由蛋白酶体降解的蛋白以泛素分子与这些蛋白的连续连接为标志。这通过连接酶e1-e3的级联来实现。泛素链越长，相应蛋白在蛋白酶体处被越好地识别，相应地，被标记的蛋白可被蛋白酶体降解的时间越长。
[0088]
连接酶的对应物(counterpart)是去泛素化酶。它们以底物特异性和组织特异性方式从该泛素链切割泛素分子。连接酶和去泛素化酶处于恒定平衡中并且从而调节细胞中的蛋白降解。
[0089]
如果标记有泛素链的蛋白被26s蛋白酶体识别，则其停靠在蛋白酶体入口处的泛素识别位点并且在连续的阶段被蛋白水解降解为氨基酸。最后，氨基酸和泛素分子离开蛋白酶体并且可供细胞回收。
[0090]
在一般情况下，可以将蛋白酶体比作协作组织的工厂，而连接酶和去泛素化酶如pr-619是供应链的一部分。蛋白酶体是很多蛋白的功能单元，因此相当大。相比之下，已经记载有超过一百种不同的细胞去泛素化酶，它们是独立的蛋白而不是蛋白酶体的一部分。
[0091]
蛋白酶体抑制剂抑制整个蛋白酶体，而连接酶或去泛素化酶则不会，反之亦然。总之，蛋白酶体抑制剂抑制蛋白的细胞降解。
[0092]
相比之下，去泛素化酶抑制剂以底物特异性和组织特异性方式防止特定的去泛素化酶从如此标记的蛋白切割泛素分子。结果，使泛素链相对延长。因此，相应的蛋白可用于蛋白酶体的时间更长并且被更好地识别。去泛素化酶抑制剂更特异性地起作用，因此在有效剂量范围内表现出小得多的细胞毒性。总之，去泛素化酶抑制剂促进蛋白的细胞降解。
[0093]
因此，蛋白酶体抑制剂和去泛素化酶抑制剂在机制上以相反的方向起作用。
[0094]
对于冠状病毒感染的有效治疗，通过将根据本公开的人去泛素化酶的抑制剂与至少一种抗病毒剂组合来向有需要的患者提供联合疗法会是有利的。
[0095]
例如，由hiv或者抗逆转录病毒疗法，已知以下类别：
[0096]
适合于此类联合疗法的逆转录酶抑制剂为核苷逆转录酶抑制剂(nrti)和非核苷逆转录酶抑制剂(nnrti)。nrti的实例包括但不限于阿巴卡韦(abacavir)、去羟肌苷(didanosine)、恩曲他滨、拉米夫定、司他夫定、替诺福韦、齐多夫定、扎西他滨、恩替卡韦、阿德福韦、艾夫他滨(elvucitabine)、磷夫定(磷夫定酯)(fosalvudine(-tidoxil))、fozivudintidoxil、拉昔洛韦(lagiciclovir)、阿拉福韦(alamifovir)、克拉夫定、帕拉德福韦(pradefovir)、替比夫定(telbivudine)。nnrti的实例包括但不限于依法韦伦、依曲韦林(etravirine)、奈韦拉平、利匹韦林(rilpivirine)、地拉韦定(delavirdine)、乙米韦林
(emivirine)、勒西韦林(lersivirine)。
[0097]
适合于根据本发明的联合疗法的是整合酶抑制剂例如拉替拉韦(raltegravir)、埃替拉韦(elvitegravir)、多替拉韦(dolutegravir)、mk-2048。
[0098]
适合于根据本发明的联合疗法的hiv蛋白酶抑制剂的实例为沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、奈非那韦、安普那韦、洛匹那韦、阿扎那韦、福沙那韦(fosamprenavir)、替拉那韦(tipranavir)、达芦那韦(darunavir)、布雷卡那韦(brecanavir)、莫泽那韦(mozenavir)、替拉那韦(tipranavir)。
[0099]
适合于根据本发明的联合疗法的进入抑制剂的实例为恩夫韦肽(enfuvirtide)和马拉韦罗(maraviroc)。
[0100]
此外，适合于根据本发明的联合疗法的一般病毒抑制剂可以选自包括以下的组：安立韦克(ancriviroc)、阿拉韦罗(aplaviroc)、西克里维罗(cenicriviroc)、恩夫韦肽、马拉韦罗、维立韦罗(vicriviroc)、金刚烷胺、金刚乙胺、普利康那利(pleconaril)、碘苷(idoxuridine)、阿昔洛韦、溴夫定(brivudine)、泛昔洛韦(famciclovir)、喷昔洛韦(penciclovir)、索立夫定(sorivudine)、伐昔洛韦(valaciclovir)、西多福韦(cidofovir)、更昔洛韦(ganciclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)、索非布韦(sofosbusvir)、膦甲酸、利巴韦林、他巴韦林(taribavirine)、非利布韦(filibuvir)、奈司布韦(nesbuvir)、替戈布韦(tegobuvir)、福地韦林(fosdevirine)、法匹拉韦、美泊地布(merimepodib)、阿舒瑞韦(asunaprevir)、巴拉匹韦(balapiravir)、波普瑞韦(boceprivir)、西鲁瑞韦(ciluprevir)、达诺瑞韦(danoprevir)、达拉他韦(daclatasvir)、那拉匹韦(narlaprevir)、特拉匹韦(telaprevir)、司美匹韦(simeprevir)、伐尼瑞韦(vanipevir)、鲁匹那韦(rupintrivir)、瑞德西韦、福米韦生(fomivirsen)、阿莫奈韦(amenamevir)、阿拉泊韦(alisporivir)、贝韦立马(bevirimat)、莱莫维韦(letermovir)、拉尼米韦(laninamavir)、奥司他韦(oseltamivir)、帕拉米韦(peramivir)、扎那米韦(zanamivir)。
[0101]
适合于根据本发明的联合疗法的一般免疫刺激剂可以选自包括以下的组：干扰素(α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、τ-干扰素)、白细胞介素、csf、pdgf、egf、igf、thf、左旋咪唑、二甲氨丙醇、肌苷。
[0102]
此外，根据本发明的可能组合包括例如可比司他(cobicistat)等佐剂。
[0103]
术语"医学(medicine)"或"医学的(medical)"包括人类医学和兽医学。
[0104]
术语"有机体"是指具有自我调节的免疫系统的生物(living being)，尤其是人或动物。
[0105]
就本技术而言，术语"宿主有机体"为在感染病毒、特别是本文中的逆转录病毒之后被所述病毒利用以进行复制的那些生物体。
[0106]
本技术中的术语"活性剂"是指用于根据本公开的用途的根据本公开的去泛素化酶抑制剂。此外，该术语可以包括现有技术已知的其它药剂。
[0107]
术语"组合物"和"药物组合物"包含任何药理学上适当限定的剂量和剂型的至少一种根据本公开的去泛素化酶抑制剂、以及至少一种合适的赋形剂或载体物质、以及作为前述成分的组合、累积物、复合物形成或晶体直接地或间接地产生或者由于其它反应或相互作用而形成的所有物质、以及任选地至少一种本领域已知的其它药剂。
[0108]
术语"赋形剂"在本技术中用于描述除了活性剂以外的药物组合物的各组分。合适的赋形剂的选择取决于例如剂型和剂量等因素以及赋形剂自身对组合物的溶解度和稳定性的影响。
[0109]
术语"作用"描述了本技术范围内的各药剂的固有特定作用模式。
[0110]
关于至少一种根据本发明的活性剂的术语"效果"、"治疗效果"、"作用"、"治疗作用"是指已被给予至少一种活性剂的有机体有原因地发生的有益结果。
[0111]
就本技术而言，"治疗有效剂量"意指将足够剂量的至少一种根据本公开的去泛素化酶抑制剂给予生物或者给予需要此类治疗的患者。
[0112]
至少一种根据本公开的药剂和/或至少一种来自现有技术的药剂的术语"联合给药(joint administration)"、"组合给药(combined administration)"或"同时给药(simultaneous administration)"包括同时或在事实上彼此接近的时间点给予提及的药剂以及在连贯实验中在不同时间给予所述药剂。给予所述药剂的时间顺序不受这些术语限制。本领域技术人员由其知识和经验将不难推导出所述给药的时间顺序或局部顺序(chronological or local order)。
[0113]
术语"生物"是指每一种动物，尤其是脊椎动物，包括人。就本技术而言，"患者"是患有可确定且可诊断的疾病并且可以对其给予合适的活性剂的生物。
[0114]
术语"预防"、"治疗"和"疗法"包括将至少一种根据本公开的去泛素化酶抑制剂单独地或者与至少一种本领域已知的其它药剂组合给予至生物，从而预防某种疾病的发展、抑制和减轻症状、或者引发相应疾病的治愈过程。
[0115]
根据本公开的化合物可以作为有机酸和无机酸的药学上可接受的盐来提供。合适的实例为盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、水杨酸、对氨基水杨酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、抗坏血酸、马来酸、磺酸、膦酸、高氯酸、硝酸、甲酸、丙酸、葡萄糖酸、二葡萄糖酸、乳酸、酒石酸、羟基马来酸、丙酮酸、苯乙酸、苯甲酸、对氨基苯甲酸、对羟基苯甲酸、二硝基苯甲酸、氯苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、硝酸、羟基乙磺酸、乙烯磺酸、对甲苯甲酰基磺酸、萘磺酸、磺胺酸(sulfanilic acid)、樟脑磺酸、海藻酸、癸酸、马尿酸、果胶酸、邻苯二甲酸、奎尼酸、扁桃酸、邻甲基扁桃酸、氢苯磺酸、苦味酸、己二酸、环戊烷丙酸、d-邻甲苯甲酰基酒石酸、丙醇二酸(tartronic acid)、苯磺酸、α-甲基苯甲酸、(邻-、间-、对-)甲基苯甲酸、萘胺磺酸、以及与本领域技术人员公知的其它无机酸或碳酸的盐。这些盐是通过使游离碱与足量的相应酸接触而生成的，从而以常规的方式构建盐。
[0116]
就本技术而言，应当将药学上可接受的盐视为含有盐形式的根据本发明的化合物的活性剂，特别是如果该盐与活性剂的游离形式相比或与活性剂的另一种盐相比赋予特定或改善的药代动力学性质。活性剂的药学上可接受的盐还可以赋予活性剂在其处于游离形式时不具有的药代动力学特征。因此，它甚至可以积极地影响活性剂的在有机体中的治疗功效方面的药效学。
[0117]
根据本公开的化合物还可以作为水合物或溶剂化物来提供。就本技术而言，溶剂化物是指根据本发明的化合物通过与溶剂分子配位来构建配合物(complex)的形式。水合物是一种特定形式的溶剂化物，其中通过水分子来实现配位。
[0118]
在冠状病毒感染的预防和/或治疗中，可以将至少一种根据本公开的去泛素化酶抑制剂或根据本公开的药物组合通过任何医学上可接受的给药途径应用于有需要的患者。
此类医学上可接受的给药途径可以是例如通过吸入、通过插管、口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、肌内、局部、经皮、皮下、皮内、舌下、经结膜、阴道内、经直肠或经鼻。
[0119]
在本发明的另一方面，公开了用于冠状病毒感染的预防或治疗的药物组合物，其中所述组合物至少包含根据本公开的人去泛素化酶usp7和/或usp47的抑制剂或者其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物中的一种、载体和至少一种药学上可接受的赋形剂。
[0120]
术语“药学上可接受的赋形剂”是指与药物活性剂一起添加至药物制剂中的天然或合成的化合物。它们可以有助于使制剂增量(bulk up)，从而提高所需的制剂的药代动力学特性或稳定性以及有益于制造过程。根据本发明的有利类别的赋形剂包括载体、粘合剂、着色剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、包衣剂、甜味剂、增稠剂、ph调节剂、酸度调节剂、酸化剂、溶剂、等渗剂、渗透促进剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、乳化剂、增溶剂、稳定剂、稀释剂、抗结块剂(抗粘附剂)、吸附剂、发泡剂、消泡剂、遮光剂、加脂剂、稠度增强剂(consistency enhancer)、助水溶物(hydrotrope)、芳香物质和调味物质。
[0121]
通常，将一种或多种药学上可接受的载体添加至药物活性剂中。符合条件的是本领域已知的所有载体及其组合。在固体剂型中，它们可以为例如植物和动物脂肪、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌。对于液体剂型和乳剂，合适的载体为例如溶剂、增溶剂、乳化剂，例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、棉籽油、花生油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、脱水山梨糖醇的脂肪酸酯。根据本发明的混悬剂可以使用本领域已知的载体，例如稀释剂(例如水、乙醇或丙二醇)、乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、膨润土、琼脂、西黄蓍胶。
[0122]
术语粘合剂是指将粉末粘合或将它们胶粘在一起、通过颗粒形成使它们凝聚的物质。它们用作制剂的“胶水(glue)”。粘合剂使所提供的稀释剂或填料的凝聚强度增加。
[0123]
合适的粘合剂为例如来自小麦、玉米、大米或马铃薯的淀粉、明胶、例如葡萄糖、蔗糖或β-乳糖等天然存在的糖、来自玉米的甜味剂、例如阿拉伯树胶、西黄蓍胶等天然和合成树胶、海藻酸钙铵、海藻酸钠、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基羧甲基纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸铝镁、蜡和其它物质。组合物中的粘合剂的百分比的范围可以为1重量％-30重量％，优选2重量％-20重量％，更优选3重量％-10重量％并且最优选3重量％-6重量％。
[0124]
着色剂是对药物制剂赋予着色的赋形剂。这些赋形剂可以为食品着色剂。它们可以吸附在合适的吸附手段(adsorption means)例如粘土或氧化铝上。着色剂的其它优点为其可以使雾化器和/或吸嘴(mouthpiece)上溢出的水性溶液可视化以便于清洁。着色剂的量可以在药物组合物的0.01重量％和10重量％之间、优选在0.05重量％和6重量％之间、更优选在0.1重量％和4重量％之间、最优选在0.1重量％和1重量％之间变化。
[0125]
合适的药物着色剂为例如姜黄素、核黄素、核黄素-5
’‑
磷酸盐、酒石黄、紫草红(alkannin)、喹啉黄ws、坚牢黄ab、核黄素-5
’‑
磷酸钠、黄2g、日落黄fcf、橙ggn、胭脂虫红、胭脂红酸、柑橘红2、偶氮胭脂红(carmoisine)、苋菜红(amaranth)、丽春红4r、丽春红sx、丽春红6r、赤藓红、红2g、诱惑红ac、阴丹士林蓝rs、专利蓝v、靛蓝胭脂红、亮蓝fcf、叶绿素和叶绿酸、叶绿素和叶绿酸的铜络合物、绿s、坚牢绿fcf、普通焦糖(plain caramel)、苛性亚硫酸盐焦糖(caustic sulphite caramel)、氨焦糖(ammonia caramel)、亚硫酸铵焦糖
(sulphite ammonia caramel)、黑pn、炭黑、植物碳、棕fk、棕ht、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、胭脂树红(annatto)、红木素(bixin)、降红木素(norbixin)、辣椒红色素(paprika oleoresin)、辣椒黄素(capsanthin)、辣椒红素(capsorubin)、番茄红素、β-阿朴-8
’‑
胡萝卜醛、β-阿朴-8
’‑
胡萝卜酸乙酯、毛莨黄素(flavoxanthin)、叶黄素、隐黄质、玉红黄质(rubixanthin)、紫黄素(violaxanthin)、紫杉紫素(rhodoxanthin)、角黄素(canthaxanthin)、玉米黄质(zeaxanthin)、柠檬黄素(citranaxanthin)、虾青素(astaxanthin)、甜菜红(betanin)、花色素苷(anthocyanins)、藏红花、碳酸钙、二氧化钛、氧化铁、氢氧化铁、铝、银、金、颜料宝红(pigment rubine)、鞣酸、地衣红(orcein)、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁。
[0126]
此外，缓冲溶液对于液体制剂、特别是对于药物液体制剂是优选的。术语缓冲剂、缓冲系统和缓冲溶液特别是水性溶液是指通过添加酸或碱或者通过用溶剂稀释而使系统抵抗ph变化的能力。优选的缓冲系统可以选自包括以下的组：甲酸盐、乳酸盐、苯甲酸、草酸盐、富马酸盐、苯胺、乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、谷氨酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、琥珀酸盐、吡啶、邻苯二甲酸盐、组氨酸、mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸)、马来酸、卡可基酸盐(cacodylate)(二甲基砷酸盐)、碳酸、ada(n-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸、pipes(4-哌嗪-双-乙磺酸)、bis-tris丙烷(1,3-双[三(羟基甲基)甲基氨基]丙烷)、乙二胺、aces(2-[(氨基-2-氧代乙基)氨基]乙磺酸)、咪唑、mops(3-(n-吗啡啉)丙磺酸)、二乙基丙二酸、tes(2-[三(羟基甲基)甲基]氨基乙磺酸)、hepes(n-2-羟基乙基哌嗪-n
’‑
2-乙磺酸)、以及其它pka在3.8和7.7之间的缓冲剂。
[0127]
优选的是例如乙酸盐缓冲剂等碳酸缓冲剂、和例如富马酸盐、酒石酸盐和邻苯二甲酸盐等二羧酸缓冲剂、以及例如柠檬酸盐等三羧酸缓冲剂。
[0128]
另一组优选的缓冲剂为无机缓冲剂，例如硫酸盐氢氧化物、硼酸盐氢氧化物、碳酸盐氢氧化物、草酸盐氢氧化物、氢氧化钙和磷酸盐缓冲剂。另一组优选的缓冲剂为含氮缓冲剂，例如咪唑、二乙二胺和哌嗪。此外，优选磺酸缓冲剂，例如tes、hepes、aces、pipes、[(2-羟基-1,1-双-(羟基甲基)乙基)氨基]-1-丙磺酸(taps)、4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-丙磺酸(eeps)、mops和n,n-双-(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(bes)。另一组优选的缓冲剂为甘氨酸、甘氨酰-甘氨酸、甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸、n,n-双-(2-羟基乙基)甘氨酸和n-[2-羟基-1,1-双(羟基甲基)乙基]甘氨酸(tricine)。还优选氨基酸缓冲剂，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、4-羟基脯氨酸、n,n,n-三甲基赖氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基-赖氨酸、邻磷酸丝氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、ε-n-乙酰基赖氨酸、ω-n-甲基精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、以及它们的衍生物。
[0129]
用于液体剂型和/或固体剂型的防腐剂可以根据需要来使用。它们可以选自但不限于包括如下的组：山梨酸、山梨酸钾、山梨酸钠、山梨酸钙、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金甲基乙酯(methyl ethyl paraben)、尼泊金丙酯、苯甲酸、苯甲酸钠、苯甲酸钾、苯甲酸钙、对羟基苯甲酸庚酯、对羟基苯甲酸甲酯钠、对羟基苯甲酸乙酯钠、对羟基苯甲酸丙酯钠、苯甲醇、苯扎氯铵、苯乙醇、甲酚、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、硫柳汞(2-(乙基汞硫)苯甲酸钠)、二氧化硫、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸钾、亚硫酸钙、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钾、联苯、邻苯基苯酚、邻苯基苯酚钠、噻苯达唑、乳酸链球菌素(nisin)、
游霉素、甲酸、甲酸钠、甲酸钙、六胺(hexamine)、甲醛、二碳酸二甲酯、亚硝酸钾、亚硝酸钠、硝酸钠、硝酸钾、乙酸、乙酸钾、乙酸钠、二乙酸钠、乙酸钙、乙酸铵、脱氢乙酸、脱氢乙酸钠、乳酸、丙酸、丙酸钠、丙酸钙、丙酸钾、硼酸、四硼酸钠、二氧化碳、苹果酸、富马酸、溶菌酶、硫酸铜(ii)、氯、二氧化氯、以及本领域技术人员已知的其它合适的物质或组合物。
[0130]
对于液体剂型和局部用剂型(topical dosage form)，添加足量的抗氧化剂是特别优选的。抗氧化剂的合适的实例包括焦亚硫酸钠、α-生育酚、抗坏血酸、马来酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、富马酸或没食子酸丙酯。优选使用焦亚硫酸钠、α-生育酚和抗坏血酸棕榈酸酯。
[0131]
片剂或丸剂通常是包衣的，即，包衣构成外层。这可以是薄膜包衣、具有糖类的糖衣和压制包衣(compression coating)。可以使用药学上可接受的清漆或蜡、hpmc(羟丙基甲基纤维素)、mc(甲基纤维素)或hpc(羟丙基纤维素)。此类包衣可以有助于掩饰味道、便于吞咽或识别。通常，包衣中包括增塑剂和颜料。胶囊通常具有包封活性物质的凝胶状包膜。该凝胶状层的具体组成和厚度决定了摄入胶囊后发生吸收的速度。特别感兴趣的是本领域已知的缓释制剂。
[0132]
合适的甜味剂可以选自包括以下的组：甘露糖醇、甘油、乙酰磺胺酸钾、阿斯巴甜、甜蜜素(cyclamate)、异麦芽酮糖醇、异麦芽糖醇、糖精及其钠盐、钾盐和钙盐、三氯蔗糖、阿力甜、奇异果甜蛋白、甘草甜素、新橙皮苷二氢查耳酮、甜菊糖苷、纽甜、阿斯巴甜-乙酰舒泛盐、麦芽糖醇、麦芽糖醇糖浆、乳糖醇、木糖醇、赤藓糖醇。
[0133]
合适的增稠剂可以选自但不限于包括以下的组：聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、糊精、聚葡萄糖、改性淀粉、碱性改性淀粉、漂白淀粉、氧化淀粉、酶处理淀粉、单淀粉磷酸酯、用三偏磷酸钠或磷酰氯酯化的二淀粉磷酸酯、磷酸化二淀粉磷酸酯、乙酰化二淀粉磷酸酯、用乙酸酐酯化的淀粉乙酸酯、用乙酸乙烯酯化的淀粉乙酸酯、乙酰化二淀粉己二酸酯、乙酰化二淀粉甘油酯、二淀粉甘油酯、羟丙基淀粉、羟丙基二淀粉甘油酯、羟丙基二淀粉磷酸酯、羟丙基二淀粉甘油酯、辛烯基琥珀酸淀粉钠、乙酰化氧化淀粉、羟乙基纤维素。
[0134]
用于液体剂型的合适的ph调节剂为例如氢氧化钠、盐酸、例如磷酸二氢钠或磷酸氢二钠等缓冲物质。
[0135]
合适的酸度调节剂可以选自包括以下的组：乙酸、乙酸钾、乙酸钠、二乙酸钠、乙酸钙、二氧化碳、苹果酸、富马酸、乳酸钠、乳酸钾、乳酸钙、乳酸铵、乳酸镁、柠檬酸、柠檬酸一钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠、柠檬酸一钾、柠檬酸二钾、柠檬酸三钾、柠檬酸一钙、柠檬酸二钙、柠檬酸三钙、酒石酸、酒石酸一钠、酒石酸二钠、酒石酸一钾、酒石酸二钾、酒石酸钾钠、正磷酸、柠檬酸卵磷脂(lecithin citrate)、柠檬酸镁、苹果酸铵、苹果酸钠、苹果酸氢钠、苹果酸钙、苹果酸氢钙、己二酸、己二酸钠、己二酸钾、己二酸铵、琥珀酸、富马酸钠、富马酸钾、富马酸钙、富马酸铵、1,4-庚内酯(1,4-heptonolactone)、柠檬酸三铵、柠檬酸铁铵、甘油磷酸钙、柠檬酸异丙酯、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铵、碳酸氢铵、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸亚铁、硫酸铵、硫酸铝钾、硫酸铝铵、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化镁、葡萄糖酸。
[0136]
使用的酸化剂为产生酸或成为酸的无机化学品。合适的实例为：氯化铵、氯化钙。
[0137]
合适的溶剂可以选自但不限于包括以下的组：水、碳酸水、注射用水、具有等渗剂的水、盐水、等渗盐水、醇类特别是乙醇和正丁醇、及其混合物。
[0138]
合适的等渗剂为例如药学上可接受的盐、特别是氯化钠和氯化钾，糖例如葡萄糖或乳糖，糖醇例如甘露糖醇和山梨糖醇，柠檬酸盐，磷酸盐，硼酸盐，及其混合物。
[0139]
渗透促进剂(penetration enhancer)(渗透促进剂(permeation enhancer)或渗透促进剂(permeability enhancer))是暂时地减弱皮肤屏障并且促进或加速美容剂(cosmetic agent)的吸收的物质。合适的渗透促进剂可以选自但不限于包括以下的组：二甲基异山梨醇二甲基亚砜(dmso)及其类似物，二甲基甲酰胺(dmf)，氮酮(1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮)，吡咯烷酮例如2-吡咯烷酮，脂肪酸例如油酸、月桂酸、肉豆蔻酸和癸酸，非离子表面活性剂例如聚氧乙烯-2-油基醚和聚氧乙烯-2-硬脂基醚，萜烯、萜类和倍半萜烯例如来自桉树、藜和依兰树的精油的那些，噁唑烷酮例如4-癸基噁唑烷-2-酮，松节油，松树油，薄荷醇。
[0140]
合适的崩解剂可以选自包括以下的组：淀粉，冷水溶性淀粉例如羧甲基淀粉，纤维素衍生物例如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠，微晶纤维素和交联微晶纤维素例如交联羧甲基纤维素钠，天然和合成树胶例如瓜尔胶、琼脂、刺梧桐胶(karaya)(印度黄蓍胶)、槐豆胶(locust bean gum)、西黄蓍胶，粘土例如膨润土，黄原胶，海藻酸盐如海藻酸和海藻酸钠，发泡组合物a.o.。水分膨胀(moisture expansion)由例如淀粉、纤维素衍生物、海藻酸盐、多糖、葡聚糖、交联聚乙烯吡咯烷酮支持。组合物中的崩解剂的量可以在1重量％和40重量％之间、优选在3重量％和20重量％之间、最优选在5重量％和10重量％之间变化。
[0141]
助流剂是防止各补充剂的结块并且改善颗粒的流动特性以使流动平滑且保持不变的材料。合适的助流剂包括二氧化硅、硬脂酸镁、硬脂酸钠、淀粉和滑石。组合物中的助流剂的量可以在0.01重量％和10重量％之间、优选在0.1重量％和7重量％之间、更优选在0.2重量％和5重量％之间、最优选在0.5重量％和2重量％之间变化。
[0142]
术语“润滑剂”是指添加至剂型中以促进片剂、颗粒等从压模或出口喷嘴脱模的物质。它们减少摩擦或磨耗。润滑剂通常在压制前不久添加，这是因为它们应当存在于颗粒的表面上以及颗粒与压模部件之间。组合物中的润滑剂的量可以在0.05重量％和15重量％之间、优选在0.2重量％和5重量％之间、更优选在0.3重量％和3重量％之间、最优选在0.3重量％和1.5重量％之间变化。合适的润滑剂为a.o.油酸钠，金属硬脂酸盐例如硬脂酸钠、硬脂酸钙、硬脂酸钾和硬脂酸镁，硬脂酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，硼酸，具有高熔点的蜡，聚乙二醇。
[0143]
乳化剂可以例如选自以下阴离子乳化剂和非离子乳化剂：阴离子乳化剂蜡、鲸蜡醇、鲸蜡基硬脂醇、硬脂酸、油酸、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物、2mol至60mol环氧乙烷与蓖麻油和/或硬化蓖麻油的加成产物、羊毛蜡油(羊毛脂)、脱水山梨糖醇酯、聚氧乙烯烷基酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯醇、偏酒石酸、酒石酸钙、海藻酸、海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸铵、海藻酸钙、丙烷-1,2-二醇海藻酸酯、角叉菜胶、经加工的麒麟菜海草(processed eucheuma seaweed)、槐豆胶、西黄蓍胶、阿拉伯树胶、刺梧桐树胶、结冷胶、印度树胶(gum ghatti)、葡甘露聚糖(glucomannane)、果胶、酰胺化果胶、磷脂酸铵(ammonium phosphatide)、溴化植物油、蔗糖乙酸异丁酸酯(sucrose acetate isobutyrate)、木松香的甘油酯、磷酸二钠、二磷酸三钠、二磷酸四钠、二磷酸二钙、二磷酸
二氢钙、三磷酸钠、三磷酸五钾、多磷酸钠、多磷酸钙钠、多磷酸钙、多磷酸铵、β-环糊精、粉末状纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基羟乙基纤维素、交联羧甲基纤维素、酶水解的羧甲基纤维素、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯、甘油单硬脂酸酯、甘油二硬脂酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的乙酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的乳酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的酒石酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的单乙酰基酒石酸酯和二乙酰基酒石酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的混合乙酸酯和酒石酸酯、琥珀酰化甘油单酯、脂肪酸的蔗糖酯、蔗糖甘油酯(sucroglyceride)、脂肪酸的聚甘油酯、聚甘油聚蓖麻醇酸酯(polyglycerol polyricinoleate)、脂肪酸的丙烷-1,2-二醇酯、脂肪酸的丙二醇酯、甘油和丙烷-1的乳酸化脂肪酸酯、与脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯相互作用的热氧化大豆油、二辛基磺基琥珀酸钠、硬脂酰-2-乳酸钠、硬脂酰-2-乳酸钙、酒石酸硬脂酯、柠檬酸硬脂酯、硬脂酰富马酸钠、硬脂酰富马酸钙、酒石酸硬脂酯、柠檬酸硬脂酯、硬脂酰富马酸钠、硬脂酰富马酸钙、月桂基硫酸钠、乙氧基化甘油单酯和甘油二酯、甲基葡萄糖苷-椰油酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、脱水山梨糖醇三油酸酯、多磷酸钠钙、多磷酸钙、多磷酸铵、胆酸、胆碱盐、二淀粉甘油酯、辛烯基琥珀酸淀粉钠、乙酰化氧化淀粉。优选的是单油酸甘油酯、硬脂酸、磷脂例如卵磷脂。
[0144]
适合作为表面活性增溶剂(surface-active solubilizing agent)(增溶剂(solubilizer))的是例如二甘醇单乙酯、聚乙二醇聚丙二醇共聚物(polyethyl propylene glycol co-polymer)、环糊精例如α-环糊精和β-环糊精、单硬脂酸甘油酯例如solutol hs 15(来自basf的聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯、peg 660-15羟基硬脂酸酯)、脱水山梨糖醇酯、聚氧乙烯二醇、聚氧乙烯脱水山梨糖酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯氧基硬脂酸甘油三酯、聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠、(阴离子)单油酸甘油酯。
[0145]
稳定剂是可以添加以防止不需要的变化的物质。虽然稳定剂不是真正的乳化剂，但是它们也可以有助于乳剂的稳定性。稳定剂的合适实例为氧化硬脂精(oxystearin)、黄原胶、琼脂、燕麦胶、瓜尔豆胶、塔拉胶、聚氧乙烯硬脂酸酯、阿斯巴甜-乙酰舒泛盐、淀粉酶、蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、转化酶、聚右旋糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯聚吡咯烷酮、柠檬酸三乙酯、麦芽糖醇、麦芽糖醇糖浆。
[0146]
稀释剂或填充剂是添加至药物中以应对最小量的活性剂的非活性物质。合适的稀释剂的实例为水、甘露糖醇、预胶化淀粉、淀粉、微晶纤维素、粉末状纤维素、硅化微晶纤维素、磷酸氢钙二水合物、磷酸钙、碳酸钙、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇、黄原胶、阿拉伯树胶或其任意组合。
[0147]
可以将抗结块剂(抗粘附剂)添加至补充剂或补充剂组合物中，从而防止团块的形成并且便于包装、运输、从分配盖(dispensing cap)的至少一个腔室释放和消耗(consumption)。合适的实例包括磷酸三钙、粉末状纤维素、硬脂酸镁、碳酸氢钠、亚铁氰化钠、亚铁氰化钾、亚铁氰化钙、骨质磷酸盐(bone phosphate)、硅酸钠、二氧化硅、硅酸钙、三硅酸镁、滑石粉、铝硅酸钠、硅酸铝钾、铝硅酸钙、膨润土、硅酸铝、硬脂酸、聚二甲基硅氧烷。
[0148]
吸附剂是从水中吸收油的物质。合适的实例包括天然吸附剂例如泥炭藓(peat moss)、锯屑、羽毛和任何其它含有碳的天然物质以及合成吸附剂例如聚乙烯和尼龙。吸附
剂通过在干燥状态下限制流体吸附(通过吸附或通过吸收来吸收液体或气体)用于片剂/胶囊防潮。
[0149]
在一些盖仑制剂(galenic formulation)中，可能会期望液体口服剂型在溶解时产生一些泡沫。可以通过添加降低液体的表面张力从而促进气泡的形成或者通过抑制气泡的聚结来提高其胶体稳定性的发泡剂来支持此类效果。可选地，其可以使泡沫稳定。合适的实例包括矿物油、皂皮树提取物(quillaia extract)、柠檬酸三乙酯、月桂基醚硫酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸铵。
[0150]
可选地，一些液体口服剂型在制备时可能会出现轻微起泡。虽然这不会干扰所需的应用，但是这可能会在药物治疗的情况下影响患者依从性或者在膳食补充剂的情况下影响商业成功。因此，可能会期望添加药学上可接受的抗发泡剂(消泡剂)。实例为膳食补充剂中的聚二甲基硅氧烷或硅油或者药物中的二甲基硅油。
[0151]
遮光剂是根据需要使液体剂型不透明的物质。它们必须具有与溶剂(在大多数情况下为水)大幅不同的折射率。同时，它们对于组合物的其它组分应当是惰性的。合适的实例包括二氧化钛、滑石、碳酸钙、山嵛酸、鲸蜡醇或其混合物。
[0152]
合适的加脂剂为例如油酸癸酯、水合蓖麻油、轻质矿物油、矿物油、聚乙二醇、月桂基硫酸钠。
[0153]
稠度增强剂为例如鲸蜡醇、鲸蜡酯蜡、水合蓖麻油、微晶蜡、非离子乳化剂蜡、蜂蜡、石蜡或硬脂醇。
[0154]
合适的助水溶物为例如乙醇、异丙醇等醇或者例如甘油等多元醇。
[0155]
合适的芳香物质和调味物质首先包括可以用于该目的的精油。通常，该术语是指具有相应的特征性气味的来自植物或植物的一部分的挥发性提取物。可以通过蒸汽蒸馏将它们从植物或植物的一部分提取出来。
[0156]
合适的实例为来自以下物质的精油或芳香物质：鼠尾草、丁香、洋甘菊、茴香、八角茴香、百里香、茶树、薄荷、薄荷油、薄荷醇、桉树脑、冰片、姜油、桉叶油、芒果、无花果、薰衣草油、洋甘菊花、松针、柏树、柑桔、花梨木、李子、红醋栗、樱桃、桦树叶、肉桂、酸橙、葡萄柚、橘子、杜松、缬草、香蜂草、柠檬草、玫瑰草(palmarosa)、蔓越莓、石榴、迷迭香、生姜、菠萝、番石榴、紫锥菊、常春藤叶提取物、蓝莓、柿子、甜瓜等或其混合物、以及薄荷醇、薄荷和八角茴香油或者薄荷醇和樱桃香精的混合物。
[0157]
可以以相对于整个组合物为0.0001重量％至10重量％(特别是在组合物中)、优选0.001重量％至6重量％、更优选0.001重量％至4重量％、最优选0.01重量％至1重量％的范围包含这些芳香物质或调味物质。与用途或个案相关地，使用不同的量会是有利的。
[0158]
根据本公开，所有前述赋形剂和赋形剂的类别可以单独地或者以其任何可想到的组合来使用而没有限制，只要不阻碍本发明的用途、发生毒性作用或者违反各国法规即可。
[0159]
在本发明的另一方面，本技术涉及根据本公开的去泛素化酶抑制剂或者涉及根据本公开的组合，其以用于口服给药的制剂用于冠状病毒感染的预防或治疗。
[0160]
同样地，其涉及如上所述使用的药物组合物，其中所述药物组合物为用于口服给药的制剂。
[0161]
在本发明的另一方面，本公开涉及根据本公开的去泛素化酶抑制剂或者涉及根据本公开的组合，其以用于吸入给药的制剂用于冠状病毒感染的预防或治疗。
international manufactory ltd.，dongguan，china)，taidoc td-7001(taidoc technology co.，new taipei city，taiwan，china)，and hiflo miniheart circulaire ii(westmed medical group，purchase，usa)，kejian(xuzhou kejian hi-tech co.,ltd.，xuzhou，china)，ym-252、p&s-t45和p&s-360(tekceleo，valbonne，france)，maxwell ys-31(maxwell india，jaipur，india)，jln-mb001(kernmed，durmersheim，germany)。
[0165]
优选的是带有雾化过程的压电激活的筛网雾化器、或者振动筛网雾化器。
[0166]
可以将筛网雾化器根据患者互动分为两组：连续模式装置和触发激活装置。在连续模式筛网雾化器中，将雾化的气雾剂连续地释放至吸嘴中并且患者不得不吸入所提供的气雾剂。在触发激活装置中，仅在主动且深呼吸时释放一定量的气雾剂。这样，与使用连续模式装置相比，更大量的含有活性剂的气雾剂被吸入并且到达最低的气道。连续模式装置使大量的含有活性剂的气雾剂散失至周围环境中或者散失在上气道的通道上，这是因为气雾剂释放未连接至呼吸循环。
[0167]
因此，触发激活的筛网雾化器是优选的，特别是振动筛网雾化器。
[0168]
特别优选的是带有雾化过程的压电激活的触发激活的筛网雾化器。
[0169]
优选的是筛网雾化器型号pariphilips respironics i-neb、philips innospire go、dose
+
mesh nebulizer inhalation mn-300/8、hcmed deepro hcm-86c和hcm860、omron microair u100、solo、ktmed neplus ne-sm1、vectura fox、vectura bayer breelib
tm
。
[0170]
最优选的振动筛网雾化器型号为高端型号，例如paripari velox、philips respironics i-neb、dose
+
mesh nebulizer inhalation mn-300/8、solo、vectura fox、vectura bayer breelib
tm
。
[0171]
因此，在本发明的另一方面，本公开涉及根据本公开的去泛素化酶抑制剂或者根据本公开的组合，其以用于吸入给药的制剂用于冠状病毒感染的预防或治疗，其中吸入给药借助振动筛网雾化器来进行。
[0172]
还涉及如前所述的用于吸入给药的药物组合物，其中吸入给药借助振动筛网雾化器来进行。
[0173]
平均液滴尺寸通常以mmad(中位质量空气动力学直径(median mass aerodynamic diameter))来表征。单个液滴尺寸称为mad(质量空气动力学直径)。该值表示雾化颗粒(液滴)的直径，在此处，分别有50％更小或更大。mmad》10μm的颗粒通常不会到达下气道，它们经常卡在咽喉里。mmad》5μm且《10μm的颗粒通常会到达支气管而不是肺泡。mmad在100nm与1μm之间的颗粒不会沉积在肺泡中并且立即被呼出。因此，最佳范围为mmad在1μm与5μm之间。最近的出版物甚至支持在3.0μm与4.0μm之间的更窄的范围(参见amirav等人(2010)j allergy clin immunol 25:1206-1211；haidl等人(2012)pneumologie 66:356-360)。
[0174]
另一个普遍接受的质量参数为所生成的气雾剂中的直径在1μm至5μm范围内的颗粒的百分比(fpm；细颗粒质量)。fpm是颗粒分布的量度。通过从所生成的气雾剂中的直径在
《5μm范围内的颗粒的总百分比减去所生成的气雾剂中的直径在《1μm范围内的颗粒的百分比来计算(fpf；细颗粒分数)。
[0175]
在本发明的另一方面，本技术还涉及用于生产根据本发明的气雾剂的方法，其包括以下步骤：
[0176]
a)将0.1ml至5ml含有至少一种根据本公开的去泛素化酶抑制剂和任选至少一种药学上可接受的赋形剂的水溶液填充至筛网雾化器的雾化室中，
[0177]
b)以80khz至200khz的频率启动筛网雾化器的筛网的振动，并且
[0178]
c)在筛网雾化器的筛网的与雾化室相对的一侧排出所生成的气雾剂。
[0179]
振动筛网雾化器的振动频率通常在80khz至200khz、优选90khz至180khz、更优选100khz至160khz、最优选105khz至130khz的范围内(参见chen,the aerosol society:ddl2019；gardenshire等人(2017)a guide to aerosol delivery devices for respiratory therapists，第4版)。
[0180]
因此，前述方法也公开了所述振动频率范围。
[0181]
因此，根据本发明的方法的特征在于所述水溶液中包含的至少一种根据本公开的去泛素化酶抑制剂的至少80重量％、优选至少85重量％、最优选至少90重量％在所生成的气雾剂中雾化。
[0182]
本发明的方法在使高百分比的药物活性剂在短时间内从所提供的水溶液雾化方面是特别有效的。这对于患者依从性是重要的特征。相当大的百分比的患者群体发现吸入过程不舒服、令人疲倦并且对体力要求较高。另一方面，患者的积极配合对于有效且有针对性的吸入应用至关重要。因此，期望在尽可能短的时间段内施加治疗上足够的量。令人惊讶的是，显示在三分钟的时间跨度内可以使水溶液中提供的物质的95％雾化。这对于高的患者依从性是理想时间跨度。
[0183]
因此，根据本发明的方法的特征在于在筛网雾化器中启动雾化后三分钟期间产生至少80％、优选至少85％并且最优选至少90％的所生成的气雾剂。
[0184]
虽然药物活性剂通常在单剂量容器中提供以用于每个雾化程序，但是雾化器和/或吸嘴可以在特定时间段内使用并且必须以特定间隔更换。默认情况下，建议在每次雾化后清洁雾化器和吸嘴。但是在此不能合理地认为患者依从性是理所当然的。但是，即使在细致的清洁之后，在雾化室、出口和/或吸嘴中也总会存在一些气雾剂的沉积物。由于气雾剂是由水溶液产生的，因此这些沉积物具有产生可能会污染吸入的气雾剂的细菌生物负载的风险。沉积物还可能会堵塞筛网雾化器的筛网膜中的孔。通常，雾化器和/或吸嘴应当每一周或每两周更换一次。因此，将药物和雾化器作为组合产品来提供是方便的。
[0185]
因此，在本发明的另一方面，本技术还涉及一种试剂盒，其包括筛网雾化器和药学上可接受的容器，所述药学上可接受的容器具有包含至少一种根据本公开的去泛素化酶抑制剂和任选至少一种药学上可接受的赋形剂的水溶液。
[0186]
在可选的试剂盒中，至少一种根据本公开的去泛素化酶抑制剂不是以水溶液的形式提供，而是在两个分开的容器中提供，一个用于活性剂的固体形式并且另一个用于水溶液。通过将活性剂溶解于最终溶液中来新鲜制备最终水溶液。随后将最终水溶液填充至筛网雾化器的雾化室中。这两个容器可以是完全分开的容器，例如两个小瓶，或例如双室小瓶。为了溶解活性剂，例如将两个腔室之间的膜打孔以允许两个腔室的内容物的混合。
[0187]
因此，本技术还公开了一种试剂盒，其包括筛网雾化器、具有注射用水或生理盐水溶液的第一药学上可接受的容器、和具有至少一种根据本公开的去泛素化酶抑制剂的固体形式的第二药学上可接受的容器，其中任选至少一种药学上可接受的赋形剂包含在第一药学上可接受的容器和/或第二药学上可接受的容器中。
[0188]
借助吸嘴将通过根据本发明的方法生成的气雾剂进行给药或自行给药。任选地，前述试剂盒中可以额外地包括此类吸嘴。
[0189]
借助配备有注射针的注射器将所提供的水溶液或最终水溶液转移至筛网雾化器的雾化室中的常见方式。首先，将水溶液吸入至注射器中，然后注入雾化室。任选地，前述试剂盒中可以额外地包括此类注射器和/或注射针。在不受限制的情况下，可以使用由聚乙烯、聚丙烯或环状烯烃共聚物制成的典型注射器，并且不锈钢注射针的典型规格会在14至27的范围内。
[0190]
在本发明的又另一方面，本技术涉及根据本公开的去泛素化酶抑制剂或根据本公开的组合，其以用于舌下片的制剂用于冠状病毒感染的预防或治疗。
[0191]
还涉及如上所述使用的药物组合物，其中所述药物组合物为用于舌下片的制剂。
[0192]
在本发明的又另一方面，本公开涉及根据本公开的去泛素化酶抑制剂或根据本公开的组合，其以液体剂型用于冠状病毒感染的预防或治疗。
[0193]
同样地，本公开涉及如上所述使用的药物组合物，其中所述药物组合物为液体剂型。
[0194]
通常，水溶液或生理盐水溶液是优选的。在根据本发明的难溶性药剂的情况下，也可以使用乙醇或乙醇/水混合物。
[0195]
合适的液体剂型包括滴剂、滴眼剂、滴耳剂或注射溶液。
[0196]
虽然sars-cov和mers-cov主要感染下气道，但是sars-cov-2首先感染咽/喉区域。这些患者中仅有一小部分随后发展为肺部感染和肺炎。虽然这些咽部感染通常仅引起与感冒一样的轻微的症状或者根本不引起症状，但是这些患者对他们的环境具有高度传染性。在大多数情况下，他们不知道自己已成为感染的传播者。因此，存在当冠状病毒感染仍处于咽部阶段时就对其进行治疗的医学需要，这不仅是为了治疗此类患者，而且也是出于流行病学原因，以防止流行病的传播。对于具有咽部感染的患者，在使用也可能会引起不良副作用的高效药物或药物组合的情况下，只有全身给药途径例如静脉内或口服是不理想的。因此，期望提供局部治疗受感染的咽部组织的给药途径。
[0197]
因此，在本发明的又另一方面，本技术涉及根据本公开的去泛素化酶抑制剂或根据本公开的组合，其以用于咽部给药的制剂用于冠状病毒感染的预防或治疗。
[0198]
对咽部给药可以通过局部给药来实现，例如用合适的液体剂型如滴剂、洗剂或酊剂、或者用粘性剂型例如凝胶或水凝胶来冲洗喉咙/咽部区域、用漱口水含漱、舌下片、锭剂、咽喉喷雾剂或咽后壁注射剂。
[0199]
洗剂是旨在应用于皮肤或黏膜的低粘度局部制剂。用裸手、刷子、干净的布或脱脂棉将洗剂应用于皮肤或黏膜。
[0200]
洗剂的优点在于其可以较薄地铺展并且可以覆盖大面积的皮肤或黏膜。典型的可以以洗剂的形式给药的药物包括抗生素、防腐剂、抗真菌剂、皮质类固醇、抗痤疮剂、舒缓剂(soothing agent)、平滑剂、保湿剂或保护剂、或抗过敏药(anti-allergen)。
[0201]
大多数洗剂是使用例如鲸蜡硬脂醇等物质使乳液保持在一起的水包油乳液，但是也配制油包水洗剂。关键组分是水相和油相、防止这两相与药物分离的乳化剂。通常将很多种赋形剂例如香料、甘油、凡士林、染料、防腐剂、蛋白质和稳定剂添加至洗剂中。
[0202]
可以在制造期间调整洗剂的浓稠度(thickness)、稠度(consistency)和粘度。制造洗剂可以分两个周期(cycle)进行：a)将润肤剂和润滑剂与配混剂和增稠剂分散在油中。b)将香精、色素和防腐剂分散在水相中。药学上有活性的成分在两个周期中均被裂解(broken up)，这取决于所涉及的原材料和期望的洗剂特性。
[0203]
酊剂通常是酒精提取物或制剂。25％
–
60％(或甚至90％)的溶剂浓度是常见的。其它用于生产酊剂的溶剂包括醋、甘油、乙醚和丙二醇。乙醇具有对于酸性成分和碱性成分二者均为优异溶剂的优点。使用甘油的酊剂称为甘油剂(glycerite)。甘油通常是比乙醇差的溶剂。酸性的醋对于获得生物碱是较好的溶剂但是对于酸性组分是较差的溶剂。
[0204]
凝胶是一种胶体，其中固体分散相与流体连续相结合形成网络得到粘性半刚性溶胶。凝胶特性的范围为从柔软且脆弱至坚硬且坚韧。将它们定义为大幅稀释的交联体系，其在稳态下不表现出流动。按重量计算，凝胶主要是液体，但是它们由于液体中的三维交联网络而表现为类似于固体。正是流体内的交联赋予凝胶稠度并且有助于粘合。凝胶是液体分子在固体介质内的分散体。
[0205]
水凝胶是亲水性的聚合物链的网络，有时发现为其中水为分散介质的胶态凝胶。由于亲水性聚合物链通过交联结合在一起而得到三维固体。由于内在的交联，水凝胶网络的结构完整性不会在高浓度的水中解散。水凝胶是高吸收性(它们可以包含超过90％的水)的天然或合成聚合物网络。水凝胶由于其较大的水含量还具有与天然组织非常相似的柔韧度。在药物中，水凝胶可以包封化学体系，其在受到外部因素例如ph的变化的刺激时可能会导致特定的药物活性剂释放至环境中，在大多数情况下通过凝胶-溶胶转变为液态。
[0206]
合适的凝胶形成剂可以选自但不限于包括以下的组：琼脂、藻胶、海藻酸、膨润土、卡波姆、角叉菜胶、锂蒙脱石、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆钠。
[0207]
漱口水是通过口周肌肉的收缩和/或头部的移动被动地含在口中或者围绕口腔冲洗的液体，并且可以含漱，在该情况下，头部向后倾斜并且液体在口腔的后部起泡。因此，可以配制根据本公开的去泛素化酶抑制剂的水溶液或醇溶液并且将其给药至咽部。
[0208]
当与口服药物递送相比时，舌下药物递送可以为替代方案，这是因为舌下给药的剂型绕过肝脏代谢。对于一些药物、尤其是用于治疗急性病症的那些，经常期望药理作用的快速起效。舌下片迅速地崩解，并且存在的少量唾液通常足以实现剂型的崩解以及更好的溶出和提高的生物利用度。
[0209]
药物必须具有足够的亲脂性从而能够通过脂质双层进行分配，但是不能过于亲脂以至于一旦其进入脂质双层就不会再分配出来。根据吸收的扩散模型，通过脂质双层的通量与浓度梯度成正比。因此，较低的唾液溶解度导致较低的吸收率，反之亦然。通常，配制为用于舌下的药物应当理想地具有小于500的分子量以促进其扩散。口腔具有在5.0至7.0之间的窄ph范围。在配制可电离药物期间包含合适的缓冲剂使得可以控制水性唾液的ph。
[0210]
为了避免药物的可能令人不快的味道或气味，需要掩味。甜味剂、调味剂和其它掩味剂是必不可少的组分。糖基赋形剂快速溶解在唾液中并且产生溶解吸热。它们在口中产
生令人愉悦的感觉并且最适合与其它调味剂一起用于舌下片。
[0211]
制造舌下片的典型技术包括直接压缩、压缩成型、冷冻干燥和热熔挤出(khan等人(2017)j pharmaceut res 16:257-267)。
[0212]
当避免吞咽时，借助舌下片给予药物活性剂也可以局部到达咽/喉。药物活性剂的吸收大部分经由咽部粘膜发生。
[0213]
锭剂(lozenge)(锭剂(troche))是小的圆盘形体或菱形体，其由包含收敛剂、防腐剂或缓和剂(demulcent drug)的固化糊剂(solidifying paste)构成，用于口腔或咽喉的局部治疗，将锭剂含在口中直至溶解。锭剂的载体(vehicle)或基质通常是糖，通过与阿拉伯树胶或西黄蓍胶、由黑醋栗或红醋栗、玫瑰蜜饯或吐鲁香胶(balsam of tolu)制成的果泥(fruit paste)混合而使其具有粘性。
[0214]
特别地，本技术涉及根据本公开的去泛素化酶抑制剂或根据本公开的组合，其以用于咽部给药的制剂用于冠状病毒感染的预防或治疗，其中咽部给药借助咽喉喷雾剂来进行。
[0215]
咽喉喷雾剂是作为喷雾剂给药至咽喉的药液，通常用于治疗咽喉痛或咳嗽。
[0216]
咽喉喷雾剂通常可以包含局部麻醉剂(例如利多卡因、苯佐卡因)、防腐剂(例如氯己定、氯化十六烷基吡啶)、草药提取物或其组合。无论何种配方都不应当含有过多的进一步刺激黏膜的糖或乙醇。最后，使用者不应当体验到任何令人不快的回味。
[0217]
目前，咽喉喷雾剂的标准是连接至含有10ml至30ml的液体制剂的瓶的计量泵。将制剂填充至玻璃瓶或塑料瓶中，通过夹压在瓶颈上或简单地卡在瓶颈上的螺纹盖来固定泵。无论选择何种固定选项，体系应当是密闭的，在使用者携带或操作期间没有观察到泄漏。通常，容器由玻璃或塑料制成。
[0218]
通常，咽喉喷雾泵每次启动将递送在50μl至200μl的范围内的剂量。对于靶向给药，泵将配备有具有延长喷嘴的致动器(actuator)。喷嘴长度可以在30mm至70mm的范围内。使用此类长固定喷嘴更容易靶向受影响的区域，但是这对于使用者而言可能会太笨重而无法携带，这是优选具有可折叠或旋转安装的喷嘴的致动器的原因。
[0219]
可选地，装置使用连续阀(continuous valve)。连续阀递送靶向治疗但不提供精确的剂量，这是因为在按下致动器时制剂将雾化。一种技术方案为具有加压顶部空间的锡罐或铝罐。当启动阀门时，只要阀杆被按下，升高的内部压力将会将制剂从罐中挤出。
[0220]
相关但更复杂的系统为阀上袋(bag-on-valve，bov)系统。将产品置于袋内部，而将抛射剂(propellant)(在大多数情况下为压缩空气)填充在袋与外罐之间的空间中。当启动连续阀时，借助压缩空气将产品从袋中挤出。bov系统将适用于任何360
°
方向。
[0221]
应当小心，这是因为咽喉喷雾制剂可能会包含非常具有侵蚀性的(aggressive)并且可以降低表面张力的成分。对喷雾性能的简单测试将确保可以借助系统使制剂雾化并且提供的喷雾模式和粒径适合预期用途。
[0222]
喷雾模式和液滴尺寸分布是咽喉喷雾剂最重要的参数。喷雾模式是用于描述完全展开的喷雾的喷雾角度和羽流形状(shape of the plume)的术语。一旦喷雾完全展开，就可以使用激光衍射法来表征液滴尺寸。细颗粒(平均动力学直径(mean dynamic diameter)小于10μm的液滴)应当尽可能低，以避免下气道中的液滴沉积。
[0223]
最近，出现了一些基于卡拉胶的咽喉喷雾剂，声称防护病毒引起的上呼吸道感染。
该平台的第一种聚合物是用于治疗呼吸疾病的广泛活性的抗病毒化合物。除了润湿作用以外，该化合物还防止病毒结合在黏膜细胞上。
[0224]
可选地，可以使用具有高输出速率和用于在上气道中沉积的经调整的液滴尺寸的便携式雾化器。通过面罩呼吸可以使液滴沉积在整个上气道的黏膜上(参见marx and nadler(2018)drug development&delivery)。
[0225]
特别地，本技术涉及根据本公开的去泛素化酶抑制剂或根据本公开的组合，其以用于咽部给药的制剂用于冠状病毒感染的预防或治疗，其中咽部给药借助咽后壁注射剂来进行。
[0226]
该技术用于通过注射羟基磷灰石钙和整形手术中的其它方法来进行的咽部成形术。然而，也可以对咽部组织进行局部注射以给予药物活性剂。注射溶液可以与静脉内注射剂或肌内注射剂大致相同。优选水溶液、生理盐水溶液，或者在相当亲脂的药物活性剂的情况下，优选乙醇/水混合物。
[0227]
在本发明的另一方面，本技术涉及根据本公开的去泛素化酶抑制剂，其以用于经鼻给药的制剂用于冠状病毒感染的预防或治疗。
[0228]
特别地，经鼻给药借助鼻喷雾剂或滴鼻剂来进行。
[0229]
用于鼻喷雾剂产品的常见制剂类型为溶液剂、混悬剂和乳剂。鼻喷雾制剂可以是水基的、水醇基的或非水基的。取决于体系的类型，制剂将包括一系列功能性赋形剂，包括溶剂和助溶剂；黏膜粘附剂；ph缓冲剂；抗氧化剂；防腐剂；渗透压剂和张度剂(osmolality and tonicity agents)；渗透促进剂；助悬剂；和表面活性剂。制剂类型的选择和所选择的赋形剂将由根据本公开的各去泛素化酶抑制剂的溶解度和稳定性以及在典型的100μl喷雾剂中递送有效剂量所需的浓度来决定(参见kulkarni和shaw(2016)，在essential chemistry for formulators of semisolid and liquid dosages,elsevier中)。前述技术也用于鼻喷雾剂。
[0230]
滴鼻剂以相似的配方给药，但是为滴加而不是按压分配器。
[0231]
特别地，本技术涉及根据本公开的去泛素化酶抑制剂，其以用于经鼻给药的制剂用于冠状病毒感染的预防或治疗，其中经鼻给药借助鼻喷雾剂或滴鼻剂来进行。
[0232]
已知眼黏膜是sars-cov-2进入有机体的另一个切入点，例如一个人在揉眼睛时手上携带病毒。
[0233]
因此，本技术还涉及根据本公开的去泛素化酶抑制剂，其中根据本公开的去泛素化酶抑制剂以滴眼剂的制剂提供。
[0234]
滴眼剂大多为含有药物活性剂的水溶液。通常将ph调整为7.1至7.5。常见的滴眼剂用缓冲剂为硼酸和磷酸二氢钠。应当借助0.9％盐水(或者另一等渗剂例如硝酸钾、硼酸、乙酸钠、乙酸钠磷酸盐缓冲液或甘露糖醇)将张度(tonicity)调整至与角膜上皮等渗的渗透压(225-430mosm/kg)。合适的防腐剂包括硫柳汞、例如苯基汞等有机汞化合物、苯扎氯铵、氯己定和苯甲醇。为了延长接触时间，可以添加增粘物质(增稠剂)例如纤维素衍生物(羟丙甲纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、透明质酸、邻苯二甲酸乙酸纤维素、聚乙二醇、聚乙烯醇或泊洛沙姆。可以包括润湿剂或表面活性剂例如苯扎氯铵、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、二辛基磺基琥珀酸钠。如果需要，一些氨基酸单独或与透明质酸钠组合可以
有助于促进组织重建。合适的氨基酸为甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸(参见ep 1940381 b1)。
[0235]
因此，本公开还涉及如上所述使用的药物组合物，其中所述药物组合物为用于咽喉喷雾剂、鼻喷雾剂或滴眼剂的制剂。
[0236]
在本发明的另一方面，公开了治疗冠状病毒感染的方法，其中将有效剂量的根据本公开的去泛素化酶抑制剂给予至有需要的患者。
[0237]
互变异构涉及有机化合物的快速内部转化(intraconversion)，其中氢原子或质子在形式上在化合物内部迁移。这伴有单键和相邻双键的转换。单一形式称为互变异构体。因此，本专利申请还涉及至少一种根据本公开的去泛素化酶抑制剂的所有互变异构体的用途。
[0238]
异构体是具有相同的化学式但是具有不同的化学结构的分子的通用术语。它们可以区分为构造(结构)异构体(其中发生原子的交换或官能团的交换)和立体异构体。立体异构体可以细分为对映异构体(同一分子的不可重叠的镜像)和非对映异构体(同一分子在一个或多个立体中心处具有不同的构型)。非对映异构体可以细分为顺式/反式异构体(是指分子内官能团的相对方向)，并且另一方面可以细分为构象异构体(围绕形式上的单键转动)和旋转异构体(围绕单键不同的旋转定位)。因此，本专利申请还涉及至少一种根据本公开的去泛素化酶抑制剂的所有异构体的用途。
[0239]
对于一些应用，可能会期望使用同位素富集形式的本发明的化合物，例如用于诊断目的。因此，本专利申请还涉及此类同位素富集形式的本发明的化合物。
[0240]
从药代动力学的观点或生产原理来看，使用前药作为剂型可能会是优选的。前药以在药理学上无活性的形式给药并且在体内代谢转化为活性形式。该转化可以全身地或者局部地发生。因此，本专利申请还涉及本发明的化合物的前药。
[0241]
如贯穿本技术所使用的，除非另有说明，否则术语“至少一种根据本公开的去泛素化酶抑制剂”应当涵盖所有前述分子变体。
[0242]
实施例
[0243]
实施例1：pr-619抑制sars-cov-2在受感染的vero-b4细胞中的复制
[0244]
为了研究pr-619是否对病毒感染的传播具有影响，进行了蛋白质印迹(wb)分析。将vero-b4细胞(meyer等人(2015)emerg infect dis 21:181-182)用sars-cov-2感染2小时。然后用pbs(磷酸盐缓冲盐水)洗涤细胞，提供以无细胞毒性的浓度(10μm)包含pr-619的新鲜培养基。在整个实验过程中进行使用pr-619的处理。感染后3天(dpi)，收获细胞和含有病毒的上清液。然后，借助离心来分离为细胞部分和病毒部分。通过20％蔗糖垫(sucrose cushion)从细胞培养上清液中纯化病毒粒子。将细胞用pbs洗涤并且用ripa缓冲液裂解。蛋白质浓度借助bradford蛋白质分析来确定并且针对各自的裂解物进行同化(assimilate)。使细胞裂解物的细胞质部分在sds(十二烷基硫酸钠)样品缓冲液中变性、通过sds凝胶电泳分离并且转移至硝酸纤维素膜。使用恢复期血清和辣根过氧化物酶偶联的第二试剂、借助电化学发光反应来使sars-cov-2可视化。本文中，在vero-b4细胞中显示对sars-cov-2复制的抑制。在10μm的浓度下，在病毒部分中(图1a)和在细胞部分中(图1b)，pr-619均显示sars-cov-2蛋白的明显减少。使用10μm氯喹(cqn)和10μm羟基氯喹(h-cqn)(已知降低sars-cov-2载量的化合物)作为阳性对照。
[0245]
使用分析程序进行病毒部分中的sars-cov-2核蛋白和细胞部分中的刺突蛋白s1的光密度评价。光密度评价允许对蛋白质印迹中的信号强度进行定量并且从而得出关于样品中的某种蛋白的量的结论。该评价清楚地表明，在添加pr-619之后，sars-cov-2蛋白的生成显著地受到抑制，甚至达到比相同浓度的氯喹或羟基氯喹更高的百分比(图2；图2a病毒部分，图2b细胞部分，3次独立实验的结果)。
[0246]
实施例2：qrt-pcr证实了sars-cov-2复制在受感染的vero-b4细胞中受到抑制
[0247]
为了进一步证实pr-619对sars-cov-2的活性，进行了qrt-pcr(定量实时聚合酶链反应)实验。因此，借助允许在单一步骤中进行逆转录、cdna合成和pcr扩增的来自ambion的实时pcr agpath-id one-step rt-pcr试剂盒(目录号：4387424)来对含有病毒的样品进行定量。通过7500软件v2.3(applied bioscience)来分析样品。根据44：rdrp_fwd：5
′‑
gtg-ara-tgg-tca-tgt-gtg-gcg-g-3
′
和rdrp_rev5
′‑
car-atg-tta-aas-aca-cta-tta-gca-ta-c-3
′
使用pcr引物。探针为5
′‑‑
cag-gtg-gaa-/zen/cct-cat-cag-gag-atg-c-3
′
(标签：fam/ibfq iowa black fq)。作为阳性对照，使用针对sars-cov2的e和rdrp基因的特异性靶标，其由integrated dna technologies制造。对照：5
′‑
taa-tac-gac-tca-cta-tag-ggt-att-gag-tga-aat-ggt-cat-gtg-tgg-cgg-ttc-act-ata-tgt-taa-acc-agg-tgg-aac-ctc-atc-agg-aga-tgc-cac-aac-tgc-tta-tgc-taa-tag-tgt-ttt-taa-cat-ttg-gaa-gag-aca-ggt-acg-tta-ata-gtt-aat-agc-gta-ctt-ctt-ttt-ctt-gct-ttc-gtg-gta-ttc-ttg-cta-gtt-aca-cta-gcc-atc-ctt-act-gcg-ctt-cga-ttg-tgt-gcg-tac-tgc-tgc-aat-att-gtt-3
′
。退火温度为60℃。包含感染、处理和病毒粒子的分离的实验过程与针对蛋白质印迹分析所描述的实验过程相同。qrt-pcr分析的评价清楚地证实了蛋白质印迹实验的结果。在添加pr-619之后，使病毒rna的量显著减少，甚至达到比相同浓度的氯喹或羟基氯喹更高的百分比(图3，3次独立实验的结果)。
[0248]
实施例3：在有效浓度下，pr-619在vero-b4细胞培养物中没有细胞毒性
[0249]
为了解决pr-619在上述体系中是否显示细胞毒性作用的问题，与蛋白质印迹研究平行地处理未感染的vero-b4细胞，使用递增的pr-619浓度(2.5μm、5μm、10μm、20μm)。用wst试验来评价毒性。本文中，具有完整线粒体的琥珀酸盐-四唑脱氢酶体系的活细胞影响微红色的四唑盐wst-1(4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2h-5-四唑]-1,3-苯二磺酸盐)向暗红色甲臜的酶转化。该颜色变化可以在分光光度计中光度测量(measured photometrically)。因此，wst试验是非常灵敏的用于测量物质对细胞代谢的毒性的方法。
[0250]
在图4a(3次独立实验的结果)中，相对于未处理细胞来描绘活细胞的百分比。将未处理细胞的值设定为100％。出于比较的原因，用氯喹(图4b，3次独立实验的结果)和羟基氯喹(图4c，3次独立实验的结果)(分别为2.5μm、5μm、10μm、20μm)进行相同的实验。使用1μm十字孢碱(staurosporine)(来自链霉菌属十字孢碱(streptomyces staurosporeus)的吲哚并咔唑化合物，一种细胞凋亡诱导剂)作为阳性对照。
[0251]
可以显示，在3天的观察期期间，pr-619在vero-b4细胞中在抗病毒有效浓度下没有表现出任何显著的毒性作用。仅在超过20μm的浓度下，出现明显的毒性作用。
[0252]
因此，可以说pr-619的抗病毒作用不是由于非特异性的细胞毒性作用。
[0253]
实施例4：pr-619直接抑制sars-cov-2的木瓜蛋白酶样蛋白酶(plpro)
[0254]
公知的是，plpro可以起到病毒去泛素化酶的作用。据报道，该病毒编码的去泛素
化酶的抑制干扰严重急性呼吸综合征(sars)-冠状病毒的复制。此外，数据表明sars-cov-2plpro不仅在病毒蛋白的加工和病毒增殖中起作用，而且对先天免疫也具有重大影响。由于sars-cov的plpro与sars-cov-2的蛋白酶具有高度同源性，因此可以假定两种蛋白酶均具有去泛素化功能并且因此可以被去泛素化酶的抑制剂靶向。因此，有趣的是假设pr-619通过阻断plpro的活性而直接与sars cov-2潜在地相互作用。为了评价该假设，使用重组sars-cov-2plpro和特异性的缀合有amc的底物(ub样蛋白干扰素刺激基因15(isg-15))。在i型干扰素刺激之后，isg-15被激活并且显示通过ifn-γ和细胞因子产生来调节免疫应答，并且由此介导对各种各样的病毒的保护，所述病毒包括甲型和乙型流感病毒、乙型和丙型肝炎病毒、hiv-1和hpv-16。然而，病毒已经进化出拮抗isg-15的对策(countermeasure)从而逃避先天免疫应答。sars-cov plpro对isg-15的拮抗活性阻断针对病毒感染的先天免疫应答的激活中涉及的各种细胞因子例如i型干扰素-β(ifnb)和趋化因子如cxcl10和ccl5的产生。
[0255]
为了验证pr-619直接阻断来自sars-cov-2的plpro的活性的假设，将重组plpro(20nm；r&d biosystems#e-611-050)与isg15-酰氨基-4-甲基香豆素(amc；r&d biosystems#ul-553-050)底物(400nmol)在具有黑色底部的96孔板中混合。不久之后，使用victor-reader(激发：380nm；发射：460nm)测定蛋白酶活性120min。在用pr-619处理的情况下，将plpro预处理30分钟。结果清楚地表明，pr-619引起对sars-cov-2plpro显著且剂量依赖性的抑制作用(图5a)。
[0256]
为了分析该观察结果的统计相关性，针对pr-619的各浓度，计算表示三个独立进行的实验中的每一者中的sars-cov-2plpro活性的曲线下面积(auc)(图5b)。由此，在添加越来越多的量的pr-619之后，测量sars-cov-2plpro活性的剂量依赖性降低。
[0257]
实施例5：p5091(usp7和usp47的特异性抑制剂)阻断sars-cov-2的复制
[0258]
本发明人分析了特异性usp7/usp47抑制剂p5091对sars-cov-2的复制的影响。因此，蛋白质印迹(wb)分析根据实施例1中记载的实验过程来进行。
[0259]
这些分析的结果清楚地显示了在用p5091处理之后病毒蛋白释放的剂量依赖性降低(图6a)。3次独立实验的光密度分析显示使用1.25μm p5091使sars-cov-2蛋白的释放显著减少90％并且使用5μm p5091会完全阻断(图6b)。
[0260]
实施例6：在有效浓度下，p5091在vero-b4细胞培养物中没有细胞毒性
[0261]
根据实施例4来进行细胞毒性实验。在实施例5的剂量范围内，p5091不显示细胞毒性作用(图7)。这些结果清楚地证明usp7或usp47是sars-cov-2的复制循环中的重要细胞因子。
[0262]
实施例7：p5091抑制sars-cov-2plpro的活性
[0263]
由于usp7表现出与来自sars的plpro的结构相似性并且来自sars-cov-2的plpro与来自sars的plpro具有超过90％的同源性，因此本发明人假设p5091也抑制来自sars-cov-2的plpro的活性。
[0264]
为了检验该假设，根据实施例4的实验方案来进行实验。图8a显示在用p5091处理之后sars-cov-2plpro的活性的剂量依赖性降低。auc的计算清楚地表明，在用6μm p5091处理之后，来自sars-cov-2的plpro的活性降低了80％(图8b)。因此，可以得出如下结论：除了抑制细胞usp7以外，p5091还通过抑制sars-cov-2plpro而具有直接的抗病毒活性。
[0265]
附图
[0266]
在所有附图中，
*
表示p《0.05，
**
表示p《0.01，
***
表示p《0.001并且
****
表示p《0.0001。
[0267]
图1：分别用10μm pr-619、10μm氯喹或10μm羟基氯喹处理3d之后的蛋白质印迹条带，相对于未处理细胞
[0268]
a：病毒部分(核蛋白)
[0269]
b：细胞部分(刺突蛋白s1)
[0270]
图2：在用10μm pr-619、10μm氯喹或10μm羟基氯喹处理3d之后(分别地，n＝3)在蛋白质印迹条带中检测到的病毒蛋白的光密度评价。将未处理细胞取作100％。
[0271]
a：病毒部分(核蛋白)
[0272]
b：细胞部分(刺突蛋白s1)
[0273]
图3：用10μm pr-619、10μm氯喹或10μm羟基氯喹处理3d之后qrt-pcr分析的评价
[0274]
图4：pr-619处理后wst试验中的细胞存活率。将未处理细胞取作100％。使用十字孢碱(sts)作为阳性对照(分别地，n＝3)。
[0275]
a：pr-619
[0276]
b：氯喹
[0277]
c：羟基氯喹
[0278]
图5：pr-619对sars-cov-2plpro的作用的评价(分别地，n＝3)
[0279]
a：对sars-cov-2plpro的抑制作用。使用dmso作为对照。
[0280]
b：针对各浓度计算sars-cov-2plpro活性
[0281]
未处理
[0282]
1.25μm pr-619
[0283]
2.5μm pr-619
[0284]
5μm pr-619
[0285]
10μm pr-619
[0286]
dmso
[0287]
图6：不同浓度的p5091的作用的评价
[0288]
a：在用p5091处理3d之后的蛋白质印迹条带(总病毒蛋白)
[0289]
b：在用p5091处理3d之后在蛋白质印迹条带中检测到的病毒蛋白的光密度评价。将未处理细胞取作100％。
[0290]
图7：p5091处理后wst试验中的细胞存活率。将未处理细胞取作100％。使用十字孢碱(sts)作为阳性对照(n＝1)。
[0291]
图8：p5091对sars-cov-2plpro的作用的评价(分别地，n＝3)
[0292]
a：对sars-cov-2plpro的抑制作用
[0293]
b：针对各浓度计算的sars-cov-2plpro活性
[0294]
6μm p5091
[0295]
3μm p5091
[0296]
1.5μm p5019
[0297]
未处理