使用选择性糖皮质激素受体调节剂刺激抗肿瘤反应的方法与流程

使用选择性糖皮质激素受体调节剂刺激抗肿瘤反应的方法


背景技术：

1.皮质醇是一种内源性糖皮质激素受体(gr)激动剂，对包括免疫系统在内的许多身体系统具有广泛影响。皮质醇过量与许多疾病有关，并导致许多疾病，包括库欣综合征、高血糖、高血压、激素紊乱、心理紊乱和其他疾病和紊乱。然而，即使在正常生理条件下，皮质醇活性也很明显。晨间血清皮质醇的正常范围为10-20μg/dl或276-552nm，超过其gr配体结合域的生化kd。高晨间皮质醇为身体从夜间到白天的过渡做好准备，提高清醒度，并确保对外来物质的免疫反应得到缓和。皮质醇的作用始于与gr的结合。gr与皮质醇的结合导致受体激动、胞质nfκb信号转导的反式抑制、核转运和广泛免疫抑制转录程序的反式激活。
2.糖皮质激素受体(gr)介导的信号转导通路具有涉及免疫系统不同组分的动态生物学效应，并且它们的体内效应是不可预测的。例如，据报道，糖皮质激素同时具有免疫抑制作用(例如抑制促炎细胞因子、促进抗炎细胞因子、抑制树突细胞、抑制自然杀伤细胞、促进t调节细胞和诱导t细胞凋亡)和免疫增强作用。参见hinrichs j.immunother.2005:28(6):517-524。gr介导的信号转导通路对癌细胞的影响同样难以捉摸。据信活化gr信号转导通路会在某些类型的癌细胞中诱导细胞凋亡，例如恶性淋巴癌。参见schlossmacher，j.endocrinol.211：17-25(2011)。然而，也报告了其他和相反的影响(例如见美国专利第9149485号)。
3.最近，针对免疫检查点信号转导通路的免疫治疗已被证明在治疗癌症方面有效。这些通路抑制免疫反应，且对于维持自身耐受，调节外周组织中的生理免疫反应的持续和幅度，以及使得旁系组织损伤减至最低至关重要。据认为，肿瘤细胞可活化免疫检查点信号转导通路，以降低针对肿瘤组织的免疫反应的效力。这些免疫检查点信号转导通路中的许多由存在于参与免疫反应的细胞(例如t细胞)表面上的检查点蛋白与其配体之间的相互作用引发，因此它们可以容易地被试剂阻断或由检查点蛋白或配体或受体的重组形式调节。阻断由检查点蛋白诱导的免疫抑制途径的药物通常被称为检查点抑制剂，一些已经商业化。细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla4，或ctla-4)抗体通过检查点蛋白ctla4阻断免疫抑制途径，是这类免疫疗法中第一个获得美国食品和药物监督局(fda)批准的。对额外免疫检查点蛋白(如程序性细胞死亡蛋白1(pd-1))的阻断剂的临床发现表明，增强抗肿瘤免疫的机会广泛多样，以及产生持久的临床反应的可能性。
4.gr在大多数人细胞中表达，在免疫细胞中尤其丰富。内源性皮质醇对免疫系统的影响和程度，以及它们对免疫反应(包括抗肿瘤免疫反应)的可能后果，目前还不完全清楚。因此，需要改进与皮质醇过量相关的疾病、皮质醇对免疫系统的影响以及增强免疫相关治疗的方法和疗法。


技术实现要素：

5.申请人在本文中公开了改善具有实体瘤的癌症患者的免疫功能的方法，包括给予所述癌症患者有效量的癌症治疗和有效量的非甾体糖皮质激素受体(gr)调节剂(grm)，优选选择性糖皮质激素受体调节剂(sgrm)，从而改善患者的免疫功能。在实施方式中，免疫功
能的改善有效地在具有实体瘤的所述患者中引发抗癌效果，从而减缓肿瘤生长、停止肿瘤生长、减少肿瘤负荷或其组合。在实施方式中，改善的免疫功能包括与给予所述非甾体sgrm之前的cd8+t细胞活化相比增加的cd8+t细胞活化；改善的免疫功能包括与给予所述非甾体sgrm之前的促炎性细胞因子分泌相比，促炎细胞因子分泌增加；改善的免疫功能包括与给予所述非甾体sgrm之前的瘤坏死因子α(tnfα)分泌相比，肿tnfα分泌增加；改善的免疫功能包括与给予所述非甾体sgrm之前的干扰素γ(ifnγ)分泌相比，ifnγ分泌增加；以及它们的组合。在实施方式中，在给予所述非甾体grm或sgrm几天(例如，给予1、2、3、4、5、6、7、10、14天或更多天)之后，免疫功能得到改善。
6.在一些情况下，grm(例如，sgrm)是包含稠合氮杂萘烷结构的非甾体化合物，其中稠合氮杂萘烷结构如美国专利7,928,237和美国专利8,461,172中所述和公开。在一些情况下，grm(例如sgrm)是包含杂芳基酮稠合氮杂萘烷结构的非甾体化合物，其中杂芳基酮稠合氮杂萘烷结构如美国专利8,859,774中所述和公开。在一些情况下，grm(例如sgrm)是包含八氢稠合氮杂萘烷结构的非甾体化合物，其中八氢稠合氮杂萘烷结构如美国专利10,047,082中所述和公开。
7.在一些情况下，经口给予grm(如sgrm，如非甾体sgrm)。
8.在实施方式中，grm与癌症治疗一起给予。在实施方式中，抗癌治疗包括癌症放疗、生长因子抑制剂的给予和抗血管生成因子的给予中的一种或多种。在实施方式中，癌症治疗包括给予化疗剂或抗体检查点抑制剂。在实施方式中，grm与至少一种化疗剂一起给予。在一些实施方式中，所述化学治疗剂选自紫杉烷、烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、内质网应激诱导剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂和它们的组合。例如，在实施方式中，化疗剂是紫杉烷，例如白蛋白结合-紫杉醇。在实施方式中，针对蛋白靶标的抗体检查点抑制剂选自pd-1、pd-l1、pd-l2、ctla-4、lag3、b7-h3、b7-h4、ox-40、cd137和tim3。
9.为了更好地理解内源性皮质醇在免疫抑制中的作用，我们将选择性gr拮抗剂瑞拉可兰应用于体外、体内和离体系统，以重现正常gc活性的生理效应。这些数据表明，拮抗gr将促进ici治疗的益处。本文讨论了其他改进和优点。附图简要说明
10.图1显示糖皮质激素受体(gr)表达水平(“gr h-评分”)与肿瘤和免疫浸润相关。黑色素瘤和tnbc肿瘤中cd3+t-细胞浸润与gr表达相关。
11.图2显示gr表达与pd-l1表达相关。
12.图3a显示gr表达与cd8+t-细胞以及调节性t细胞(treg)正相关。
13.图3b显示gr表达与th1 t细胞负相关，与th2 t细胞正相关。
14.图4显示了在存在生理水平皮质醇的情况下通过瑞拉可兰恢复t细胞活化。cd8+细胞上cd137(即41-bb)的表达被皮质醇降低，并被瑞拉可兰挽救。
15.图5显示，在植物血凝素(pha)刺激后，皮质醇抑制cd3+细胞表面受体，瑞拉可兰恢复cd3+细胞表面受体。
16.图6a显示，在植物血凝素(pha)刺激后，皮质醇抑制细胞因子和趋化因子，并通过瑞拉可兰恢复细胞因子/趋化因子水平。皮质醇的生理水平抑制了细胞因子和趋化因子，这种抑制被瑞拉可兰逆转。
17.图6b显示，在αcd3+il-12刺激后，皮质醇抑制细胞因子和趋化因子，并通过瑞拉可
兰恢复细胞因子/趋化因子水平。皮质醇的生理水平抑制了细胞因子和趋化因子，这种抑制被瑞拉可兰逆转。
18.图7显示在eg7小鼠模型中，瑞拉可兰促进对抗-pd1拮抗剂抗体(rpm1-14)的反应。在eg7肿瘤模型中评估rmp1-14和瑞拉可兰的组合。瑞拉可兰显著提高了该模型中抗-pd1抗体的效力。
19.图8提供了进一步的数据，证明了瑞拉可兰在eg7模型中增强抗-pd1抗体的作用。
20.图9显示了在eg7小鼠模型中，与对照组(组1)相比，单独使用瑞拉可兰(组3)对血清il-10的效果。
21.图10显示联合瑞拉可兰+白蛋白结合紫杉醇治疗抑制实体瘤患者的基因表达。抑制基因包括il8(cxcl8)、ido1和ep4(ptger4)(n＝46)。
22.图11显示了对瑞拉可兰+白蛋白结合-紫杉醇治疗完全反应(cr)的患者中选定生物标志物的效果总结。该患者表现出中性粒细胞与淋巴细胞比率(nlr)降低，cd4+细胞、cd8+细胞、cd3+t细胞、ptgs2和dusp1m表达变化以及其他变化。(c1d1表示治疗第1周期第1天；c1d15表示治疗第1周期第15天；c4d1表示治疗第4周期第1天，和eot表示治疗结束。)
23.图12提供了表格，总结了对联合瑞拉可兰+白蛋白结合-紫杉醇治疗反应良好的人类癌症患者的特征和先前治疗。(pr表示部分反应；cr表示完全反应；sd表示病情稳定(无肿瘤进展)。)
24.图13进一步说明了对联合瑞拉可兰+白蛋白结合紫杉醇治疗反应极好的人类癌症患者中对nlr、gr控制的基因转录、免疫调节细胞因子和免疫细胞的影响。
25.图14说明了短期瑞拉可兰治疗对t细胞功能的影响。短期药效学研究的结果(在对肿瘤体积产生任何观察者可观察的影响之前评估瑞拉可兰对t细胞功能的影响)表明，平均体重和肿瘤体积不受该时间段内评估的任何治疗的影响。
26.图15说明了eg7同基因模型中gr拮抗与αpd1联合的短期效应。在一项为期7天的药效学研究中，瑞拉可兰+αpd1增加了脾脏(左)和肿瘤(右)中的抗原特异性t细胞。
27.图16说明了在7天eg7研究后评估的瑞拉可兰和αpd1对脾细胞的影响。脾cd8+t细胞中的pd1表达(左上)和cd69表达(右上)显示为cd8+t细胞的百分比。cd3+cd8+t细胞显示为脾cd45.1+细胞的百分比(左下)。图中显示了未配对非参数t检验的p值。
28.图17说明了在7天eg7研究后评估的血清中的瑞拉可兰和αpd1、tnfα和il-6水平的影响。
具体实施方式
a.引言
29.在人类肿瘤和免疫细胞中观察到gr表达，其丰度与pdl1表达和th2和treg细胞的肿瘤浸润呈正相关，而与th1细胞浸润负相关。皮质醇抑制体外刺激的人pbmc中的t细胞活化和促炎细胞因子分泌，而瑞拉可兰使其恢复。在eg7小鼠模型中，瑞拉可兰显著提高了抗pd1抗体的效力。在晚期实体瘤患者的一期白蛋白结合-紫杉醇联合研究中，瑞拉可兰系统性抑制il-8、ep4和ido1的表达，并使中性粒细胞与淋巴细胞比率(nlr)正常化。在一组持续应答的患者中，瑞拉可兰增加了cd3+细胞和ifnγ，降低了treg和il-10，并抑制了已知gr-控制基因的转录。总之，这些数据表明皮质醇具有广泛的免疫抑制作用，可通过瑞拉可兰逆
转。
30.申请人在此公开了选择性糖皮质激素受体调节剂(sgrm)的作用。许多sgrm是gr拮抗剂。例如，瑞拉可兰是一种有效的选择性gr拮抗剂。在0.15nm处观察到半最大gr结合，而在超过1000nm的浓度下未观察到孕酮受体(pr)结合。在人刺激的pbmc中，tnf-α被gr激动剂抑制，瑞拉可兰恢复tnf-α的产生并且在9nm处观察到半最大效应。在皮质酮诱导的胰岛素抗性大鼠模型中，以达到与i期研究相似的全身暴露的剂量经口给予瑞拉可兰，使葡萄糖和胰岛素正常化。i期健康志愿者研究证明了耐受性和逆转单剂量强的松药效作用的能力。gr激动剂的药效学效应包括在全血中诱导fkbp5 mrna(一种典型的gr控制基因)和抑制全血中的嗜酸性粒细胞丰度，这两种效应均被瑞拉可兰逆转。与米非司酮(类固醇类似物和激素受体调节剂)不同，用瑞拉可兰未观察到gr反向激动。在库欣病患者的ii期研究中，瑞拉可兰证明了逆转过量皮质醇对高血压和胰岛素抗性的作用。
31.申请人在本文中公开了改善具有实体瘤的癌症患者的免疫功能的方法，包括给予所述癌症患者有效量的癌症治疗和有效量的非甾体选择性糖皮质激素受体(sgrm)，从而改善患者的免疫功能。这种改善的免疫功能可包括改善患者的免疫系统以引起抗癌效果。在实施方式中，免疫功能的改善有效地在具有实体瘤的所述患者中引发抗癌效果，从而减缓肿瘤生长、停止肿瘤生长、减少肿瘤负荷或其组合。在实施方式中，改善的免疫功能包括与给予所述非甾体sgrm之前的cd8+t细胞活化相比增加的cd8+t细胞活化；改善的免疫功能包括与给予所述非甾体sgrm之前的促炎性细胞因子分泌相比，促炎细胞因子分泌增加；改善的免疫功能包括与给予所述非甾体sgrm之前的tnfα分泌相比，tnfα分泌增加；改善的免疫功能包括与给予所述非甾体sgrm之前的ifnγ分泌相比，ifnγ分泌增加；以及它们的组合。在实施方式中，在给予所述非甾体grm或sgrm几天(例如，给予1、2、3、4、5、6、7、10、14天或更多天)之后，免疫功能得到改善。
32.在本文公开的方法的实施方式中，非甾体sgrm是包含杂芳基酮稠合氮杂萘烷结构的化合物，其具有下式：其中r1是具有5至6个环原子和1至4个独立地选自：n、o和s的杂原子的杂芳基环，任选地被1至4个各自独立地选自r
1a
的基团取代，各r
1a
独立地选自氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、cn、n-氧化物、c
3-8
环烷基、c
3-8
杂环烷基；环j选自下组：环烷基环、杂环烷基环、芳基环和杂芳基环，其中所述杂环烷基和杂芳基环具有5至6个环原子和1至4个独立地选自：n、o和s的杂原子；各r2独立地选自氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、c
1-6
烷基-c
1-6
烷氧基、cn、oh、nr
2ar2b
、c(o)r
2a
、c(o)or
2a
、c(o)nr
2ar2b
、sr
2a
、s(o)r
2a
、s(o)2r
2a
、c
3-8
环烷基和c
3-8
杂环烷基，其中，杂环烷基任选地被1至4个r
2c
基团取代；或者，与同一碳相连的两个r2基团组合形成氧代基团(＝o)；
或者，两个r2基团组合形成具有5至6个环原子和1至3个各自独立地选自：n、o和s的杂原子的杂环烷基环，所述杂环烷基环任选地被1至3个r
2d
基团取代；r
2a
和r
2b
各自独立地选自氢和c
1-6
烷基；各r
2c
独立地选自氢、卤素、羟基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、cn和nr
2ar2b
，各r
2d
独立地选自氢和c
1-6
烷基，或者与相同环原子相连的两个r
2d
基团组合形成(＝o)；r3选自下组：苯基和吡啶基，其各自任选地被1-4个r
3a
基团取代；各r
3a
独立地选自氢、卤素和c
1-6
卤代烷基；并且下标n是0至3的整数；或其盐及异构体。
33.在非甾体sgrm是杂芳基酮稠合氮杂萘烷的方法实施方式中，非甾体sgrm是(r)-(1-(4-氟苯基)-6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8-六氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲酮，即瑞拉可兰，其具有如下结构：
[0034]
在非甾体gra是杂芳基酮稠合的氮杂萘烷化合物的方法实施方式中，非甾体sgrm是(r)-(1-(4-氟苯基)-6-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8-六氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(噻唑-2-基)甲酮(称为“cort122928”)，其具有以下结构：
[0035]
在非甾体sgrm包含杂芳基酮稠合的氮杂萘烷化合物的方法实施方式中，非甾体sgrm是(r)-(1-(4-氟苯基)-6-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)4,4a-5,6,7,8-六氢-1h-吡唑并p,4-g]异喹啉-4a-基)(吡啶-2-基)甲酮(称为“cort113176”)，其具有以下结构：
[0036]
在本文公开的方法的实施方式中，非甾体sgrm包含八氢稠合氮杂萘烷结构的化合物，其具有下式：其中r1是具有5至6个环原子和1至4个独立地选自：n、o和s的杂原子的杂芳基环，任选地被1至4个各自独立地选自r
1a
的基团取代，各r
1a
独立地选自：氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、n-氧化物和c
3-8
环烷基；环j选自下组：芳基环和杂芳基环，其各自具有5至6个环原子和1至4个杂原子，所述杂原子各自独立地选自：n、o和s；各r2独立地选自：氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、c
1-6
烷基-c
1-6
烷氧基、-cn、-oh、-nr
2ar2b
、-c(o)r
2a
、-c(o)or
2a
、-c(o)nr
2ar2b
、-sr
2a
、-s(o)r
2a
、-s(o)2r
2a
、c
3-8
环烷基和具有1至3个杂原子的c
3-8
杂环烷基，所述杂原子各自独立地选自n、o和s；或者，相邻环原子上的两个r2基团组合形成具有5至6个环原子和1至3个杂原子的杂环烷基环，所述杂原子各自独立地选自：n、o和s，其中所述杂环烷基环任选地被1-3个r
2c
基团取代；r
2a
、r
2b
和r
2c
各自独立地选自：氢和c
1-6
烷基；各r
3a
独立地是卤素；且下标n是0至3的整数；或其盐及异构体。
[0037]
在本文公开的方法的实施方式中，非甾体sgrm包含八氢稠合氮杂萘烷结构的化合物，其具有下式：
其中r1选自吡啶和噻唑，其任选地被1-4个各自独立地选自r
1a
的基团取代，其中r
1a
独立选自氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、n-氧化物和c
3-8
环烷基；环j选自苯基、吡啶、吡唑和三唑；各r2独立地选自氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、-cn；r
3a
为f；下标n是0至3的整数。或其盐及异构体。
[0038]
在非甾体sgrm包含八氢稠合氮杂萘烷结构的实施方式中，非甾体sgrm是((4ar,8as)-1-(4-氟苯基)-6-((2-甲基-2h-1,2,3-三唑-4-基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8,8a,9-八氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲酮，称作艾昔可兰，其具有以下结构：在实施方式中，非甾体sgrm是八氢稠合氮杂萘烷化合物，其化学名称为((4ar,8as)-1-(4-氟苯基)-6-((2-异丙基-2h-1,2,3-三唑-4-基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8,8a,9-八氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(噻唑-2-基)甲酮，称作“cort125329”，具有式：
[0039]
在一些情况下，grm(例如sgrm，例如非甾体sgrm)的有效量为日剂量1至100mg/kg/天，或在约1-20mg/kg/天之间。在一些实施方式中，grm的日剂量为1、2、4、6、8、10、12、14、
16、18、20、30、40、50 60、70、80、90或100mg/kg/天。在一些情形中，grm至少给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80周。在实施方式中，grm是sgrm。在优选实施方式中，grm是gr拮抗剂(gra)，并且可以是选择性gra。
[0040]
在实施方式中，grm与癌症治疗一起给予。在本文公开的方法的实施方式中，癌症治疗包括给予化疗剂。在实施方式中，所述化疗剂选自紫杉烷、烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、内质网应激诱导剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂和它们的组合。在实施方式中，化疗剂是紫杉烷，并且可以是例如白蛋白结合紫杉醇。
[0041]
在本文公开的方法的实施方式中，癌症治疗包括给予免疫治疗剂。例如，在本文公开的方法的实施方式中，癌症治疗包括给予抗体检查点抑制剂。因此，在实施方式中，本文公开的方法包括给予针对选自pd-1、pd-l1、pd-l2、ctla-4、lag3、b7-h3、b7-h4、ox-40、cd137和tim3的靶标的抗体检查点抑制剂(针对蛋白质靶标的抗体)。在实施方式中，抗癌治疗包括一种或多种癌症放疗、生长因子抑制剂的给予和抗血管生成因子的给予。
[0042]
在本文公开方法的实施方式中，癌症治疗包括治疗患有实体瘤的对象的方法，包括鉴定患有实体瘤并具有过量皮质醇的患者；给予组合治疗，包括给予1)选择性糖皮质激素受体调节剂(sgrm)和2)癌症化疗剂；从而恢复cd8+t细胞活化、恢复促炎细胞因子分泌或两者。在实施方式中，方法包括增加t细胞数量、增加血浆干扰素γ(ifnγ)、减少treg细胞、减少白细胞介素-10(il-10)及其组合中的一种或多种。定义
[0043]
如本文所使用的，基因cxcl8、ido1和ptger4以及其他是指：
[0044]
如本文所用，术语“肿瘤”和术语“癌症”能互换使用，其均指由过度细胞分裂所导致的组织异常生长。侵入周围组织和/或可以转移的肿瘤被称为“恶性”。不转移的肿瘤被称为“良性”。
[0045]
如本文所用，术语“患者”是指正在或将要接受或已经接受疾病或病症医疗护理的人。
[0046]
如本文所用，术语“给予”、“给药”、“给予的”或“被给予”指向对象或患者提供化合物或组合物(例如，本文所述那些)。例如，化合物或组合物可以经口给予患者。
[0047]
如本文所用，术语“有效量”或“治疗量”指药剂有效治疗、消除或减缓被治疗疾病
的至少一种症状的量。一些情形中，“治疗有效量”或“有效量”可指能够显示可检测的治疗或抑制作用的功能性物质或药物组合物的量。所述效果可通过本领域已知的任何试验方法检测。有效量可以是有效引起抗肿瘤反应的量。出于本公开目的，有效量的sgrm或有效量的化学治疗剂是分别与化学治疗剂或sgrm组合时将减少肿瘤负荷或产生与癌症改善相关的其他所需有益临床结果的量。
[0048]
如本文所用，术语“给予”、“给药”、“给予的”或“被给予”指向对象或患者提供化合物或组合物(例如，本文所述那些)。给予可以口服给予(即对象口服接受化合物或组合物，其作为丸剂、胶囊、液体或适合口服给予其他形式。口服给予可以是含服的(其中化合物或组合物保持在口中，如在舌下，并且在那里被吸收)。可以通过注射给予，即通过针头、微针、压力注射器或其他刺穿皮肤或使化合物或组合物强行穿过对象皮肤的方式递送化合物或组合物。注射可以是静脉内(即进入静脉)；动脉内(即进入动脉)；腹膜内(即进入腹膜)；肌肉内(即进入肌肉)；或通过其他注射途径。给药途径还可以包括直肠、阴道、经皮、经肺(如通过吸入)、皮下(如通过从含有该化合物或组合物的植入物吸收到皮肤中)，或通过其他途径。
[0049]
如本文所用，术语“组合治疗”指给予对象至少两种药剂以治疗疾病。这两种药剂可同时给予，或可在整个或部分疗程中以任何顺序依序给予。所述至少两种药剂可按相同或不同给药方案给予。在一些情形中，一种药剂按预定方案给予，而另一种药剂间歇给予。在一些情形中，两种药剂均间歇给予。在一些实施方式中，一种药剂(例如，sgrm)每天给予，而另一种药剂，例如，化疗剂，每两、三或四天给予。
[0050]
如本文所用，术语“化合物”用于指具有独特、可鉴定的化学结构的分子部分。分子部分(“化合物”)可以游离物质形式存在，其中它不与其它分子相关联。化合物也可作为较大聚集体的部分存在，其中它与一个或多个其它分子相关联，但仍保留其化学特点。其中具有确定化学结构的分子部分(“化合物”)与溶剂的分子相关联的溶剂合物是此类相关形式的示例。水合物是其中相关联的溶剂为水的溶剂合物。述及“化合物”，指(所述及结构的)分子部分本身，不论其是以游离形式还是缔合形式存在。
[0051]
如本文所用，术语“药学上可接受的运载体”旨在包括与药物给予相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学活性物质的这类介质和试剂的用法是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂都与活性化合物不相容，否则应考虑在组合物中使用这些介质或试剂。补充性活性化合物也可掺入所述组合物。
[0052]
如本文所用，术语"促肾上腺皮质激素"(acth)是指由垂体前叶腺产生和分泌的肽类激素，它刺激肾上腺皮质分泌糖皮质激素，帮助细胞合成葡萄糖、分解蛋白质、调动游离脂肪酸和抑制过敏反应中的炎症。一种这样的糖皮质激素是皮质醇，它调节碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢。在健康哺乳动物中，acth分泌受到严格调节。acth分泌受下丘脑释放的促肾上腺皮质素释放激素(crh)的正向调节。acth分泌受皮质醇和其他糖皮质激素的负调节。
[0053]
术语“肾上腺激素”、“肾上腺前激素”和“肾上腺激素或肾上腺前激素”，指的是肾上腺产生的激素或其前体的类固醇分子。如本文所使用的，但不限于，“肾上腺激素或肾上腺前激素”可以是17α-羟基孕烯醇酮、17α-羟孕酮、11-脱氧皮质醇、孕烯醇酮、孕激素、11-去氧皮质醇酮、皮质酮、18-羟基皮质酮、醛固酮、脱氢表雄酮(雄甾醇酮、dhea)、硫酸脱氢表
雄酮(dhea-s)和雄烯二酮中的一种或多种。如本文所用，术语“肾上腺激素”、“肾上腺前激素”和“肾上腺激素或肾上腺前激素”，指的是皮质醇以外的激素和前激素，除非明确说明皮质醇也包括在内。
[0054]
术语“测量水平”，在acth、皮质醇、肾上腺激素、肾上腺前激素或其他激素或类固醇情况下，是指测定、检测或定量从对象获得的样品中皮质醇、acth或其他类固醇的量、水平或浓度。样本可以是例如血液样本、唾液样本、尿液样本或从患者获得的其他样本。可以从样品的部分测量水平。例如，水平(例如acth或皮质醇)可以在血液样品的血浆部分中测量；可以在血液样品的血清部分中测量；或者在实施方式中，可以在全血中测量。
[0055]
术语“免疫反应”是指由上述细胞或肝脏产生的淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用导致对入侵病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或在自身免疫或病理性炎症的情况下正常人细胞或组织的人体的选择性损害、破坏或消除。
[0056]
免疫系统的细胞在本文中根据本领域中常用和公认的术语进行鉴定。例如，“treg”和“t
reg”在本文中互换使用，以指调节性t细胞。“ifn”指干扰素，因此例如，ifnγ指干扰素γ。“il”指白细胞介素，因此例如，il-10指白细胞介素10。“tnf”指肿瘤坏死因子，因此例如，tnfα指肿瘤坏死因子α。本领域普通技术人员已知并使用其他术语和首字母缩略词。
[0057]
如本文所用，术语“检查点抑制剂敏感型癌”指对检查点抑制剂有反应的癌症。向具有这种肿瘤的患者给予一种或多种检查点抑制剂将导致与肿瘤负荷的减少，或与癌症改善相关的其他期望的有益临床结果。
[0058]
如本文所用，术语“增强的有效量“是指有效增强另一种治疗剂治疗、消除或转移被治疗疾病的至少一种症状的药理学试剂量。用于增强另一种药剂活性的药剂在治疗、消除或减轻疾病本身症状方面可能有效或无效。在一些情况下，增强剂没有效，与单独使用治疗剂的治疗相比，增强剂的效果可以通过两种药物组合治疗引起的症状缓解程度的增加来显示。在一些情况下，增强剂本身在治疗症状方面是有效的，并且增强效果可以通过增强剂和治疗剂之间的协同作用来显示。例如，sgrm可起到增强剂作用，以增强检查点抑制剂在治疗癌症中的活性，而不论sgrm如果单独给予是否会有效治疗癌症。在一些实施方式中，可以实现10％至1000％的增强效果。在一些实施方式中，给予sgrm的量是使得肿瘤对检查点抑制剂敏感的量，即显示肿瘤负荷的减少，或其他相关临床益处，这些在不存在sgrm时用检查点抑制剂治疗肿瘤不会出现。
[0059]
如本文所用，术语“检查点蛋白质”是指存在于某些类型细胞(如t细胞和某些肿瘤细胞)表面上的蛋白质，其可以诱导检查点信号通路并导致免疫反应的抑制。常见的检查点蛋白质包括ctla4、pd-1、pd-l1、pd-l2、lag3、b7-h3、b7-h4、tim3、cd160、cd244、vista、tigit和btla。(pardoll,2012,nature reviews cancer 12:252-264；baksh,2015,semin oncol.2015年六月；42(3):363-77)。例如，ctla4、pd-1和pd-l1的研究最为充分，针对这些蛋白质的疗法是临床上广泛使用的疗法。
[0060]
在一些情况下，检查点抑制剂是抑制至少一种检查点蛋白的小分子非蛋白化合物。在一个实施方式中，检查点抑制剂是小分子非蛋白化合物，其抑制选自ctla-4、pd-1、pd-l1、pd-l2、lag3、b7-h3、b7-h4、tim3、cd160、cd244、vista、tigit和btla的检查点蛋白。
[0061]
在一些情况下，检查点抑制剂是针对至少一种检查点蛋白的抗体，例如pd-1、ctla-4、pd-l1、pd-l2、ctla-4、lag3、b7-h3、b7-h4、tim3、cd160、cd244、vista、tigit和btla。在一些情况下，检查点抑制剂是对两种或多种检查点蛋白有效的抗体，所述检查点蛋白选自pd-1、ctla-4、pd-l1、pd-l2、ag3、b7-h3、b6-h4、tim3、cd160、cd244、vista、tigit和btla。
[0062]
在一些情况下，检查点抑制剂是针对检查点蛋白或针对超过一种检查点蛋白的抗体。这种抗体检查点抑制剂可被称为“α”，并通过在靶蛋白名称前加希腊字母“α”进行识别。因此，针对pd1的抗体检查点抑制剂可以被称为“αpd1”，针对cd3的抗体检查点抑制剂可以被称作“αcd3”，等等。涉及给予此类抗体检查点抑制剂的治疗也可以相同的方式进行识别，因此使用抗pd1抗体的治疗可以被称为“αpd1”或“αpd1治疗”，使用抗cd3抗体的治疗可被称为”αcd3”或“αcd3治疗”，等等。
[0063]
如本文所用，术语“pd-1”是指程序性细胞死亡蛋白1(也称为cd279)，其为免疫球蛋白超家族的细胞表面膜蛋白。pd-1由b细胞、t细胞和nk细胞表达。pd1的主要作用是在反应感染的炎症期间限制外周组织中t细胞的活性，以及限制自身免疫性。pd1表达在活化的t细胞中被诱导，pd1与其内源性配体之一的结合通过抑制刺激性激酶来抑制t细胞活化。pd-1还起到抑制tcr“终止信号”的作用。pd1在treg细胞(调节性t细胞)上高度表达，并可在配体存在下增加其增殖(pardoll,2012,nature reviews cancer 12:252-264)。
[0064]
如本文所用，术语“pd-l1”是指程序性细胞死亡配体1(也称为cd274和b7-h1)，其为pd-1的配体。pd-l1存在于活化的t细胞、b细胞、骨髓细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞上。虽然pd-1有两种内源性配体，即pd-l1和pd-l2，但是抗肿瘤治疗主要集中于抗pd-l1。pd1和pd-l1的复合物抑制cd8+t细胞的增殖并降低免疫反应(topalian等,2012,n engl j.med 366:2443-54；brahmer等,2012,nengl j.med 366:2455-65)。
[0065]
如本文所用，术语“pd-l2”是指程序性细胞死亡配体2。pd-l2与pd-l1竞争结合pd-1。
[0066]
如本文所用，术语“ctla4”和“ctla-4”是指细胞毒性t淋巴细胞抗原4(也称为cd152)，其为仅在t细胞上表达的免疫球蛋白超家族的成员。ctla4能抑制t细胞活化，据报道其能抑制辅助t细胞活性并增强调节性t细胞免疫抑制活性。尽管ctl4-a的确切作用机制仍在研究中，但是有人提出它通过与cd28竞争在抗原呈递细胞上与cd80和cd86的结合来抑制t细胞活化，并主动向t细胞传递抑制剂信号(pardoll,2012,nature reviews cancer 12:252-264)。
[0067]
如本文所用，术语“lag3”指淋巴细胞活化基因-3(也称为cd223)。
[0068]
如本文所用，术语“b7-h3”指免疫检查点蛋白，也称为cd276；b7-h3通常在癌细胞(例如一些实体瘤)上过表达。
[0069]
如本文所用，术语“b7-h4”是指免疫检查点蛋白，也称为含v-组结构域的t细胞活化抑制剂1，其可存在于抗原呈递细胞的表面上。
[0070]
如本文所用，术语“tim3”是指也被称为t细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域的蛋白质3的蛋白质。
[0071]
如本文所用，术语“cd160”指的是人类中由cd160基因编码的27kd糖蛋白。cd160的表达与外周血nk细胞和具有细胞裂解效应活性的cd8 t淋巴细胞密切相关。
[0072]
如本文所用，术语“cd244”是指也被称为“分化簇244”的蛋白质。它是免疫调节受体信号转导淋巴细胞活化分子(slam)家族的成员。
[0073]
如本文所用，术语“vista”指免疫检查点蛋白，也称为t细胞活化的v-结构域ig抑制剂。它由c10orf54基因编码。
[0074]
如本文所用，术语“tigit”(具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体)指免疫受体蛋白，也称为wucam和vstm3。
[0075]
如本文所用，术语“btla”(b淋巴细胞和t淋巴细胞衰减剂)是指由btla基因在人类中编码的检查点蛋白。它也被称为cd272(分化簇272)。
[0076]
如本文所用，术语“检查点抑制剂”是指封闭由一种或多种检查点蛋白质诱导的免疫抑制通路的任何分子，其包括抗体和小分子。
[0077]
如本文所用，本文所用的术语“抗体”还包括全长抗体以及抗体的“抗原结合部分”。如本文所用，术语“抗原结合部分”是指保留特异性结合至抗原(如pd-1)的能力的一个或多个抗体片段。术语抗体的“抗原结合部分”所包含的结合片段的实例包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，二价片段，包括在铰链区通过二硫桥联接的两个fab片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段，(v)dab片段(ward等，(1989)nature 341：544-546)，其由vh结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(cdr)。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh分别由不同基因编码，但是可通过重组方法利用合成接头使其连接成为一条蛋白链，其中vl和vh区配对形成单价分子，称为单链fv(scfv)。参见如bird等人，(1988)science 242：423-426；huston等人，(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883；osbourn等人，1998,nature biotechnology 16：778。这种单链抗体也意为包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。可以将特定scfv的任何vh和vl序列连接到人免疫球蛋白恒定区cdna或基因组序列，以产生编码完整igg分子或其他同种型的表达载体。vh和vi也可以用于产生fab、fv或其他免疫球蛋白片段，其使用蛋白质化学或重组dna技术。还包括其他形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中vh和vl结构域表达于单个多肽链上，但是使用的接头太短而不能将两个结构域配对在同一条链上，从而迫使结构域与其他链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点(如参见holliger,p.等人，(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-6448；poljak,r.j.等人，(1994)structure 2:1121-1123)。
[0078]
抗体可以是多克隆或单克隆的；异种、同种异体或同源的；或其修饰形式，如人源化、嵌合等。本发明抗体特异性地或基本上特异性地与一种或多种检查点蛋白质结合。术语“单克隆抗体”是指仅含有一种抗原结合位点的抗体分子群，该抗原结合位点能够与抗原的特定表位发生免疫反应，而术语“多克隆抗体”和“多克隆抗体组合物”是指含有多种抗原结合位点的抗体分子群，这些抗原结合位点能够与特定抗原相互作用。单克隆抗体组合物通常对与其发生免疫反应的特定抗原表现出单一的结合亲和力。
[0079]
如本文所用，术语“对检查点蛋白质有效的抗体”是指可以与检查点蛋白质结合并拮抗检查点蛋白质在抑制免疫反应中的功能的抗体。例如，针对pd-1的抗体是指能够与pd-1结合并通过如阻断pd-1与pd-l1之间的相互作用来阻断pd-1对免疫反应的抑制功能的抗体。在某些情形中，抗体可以针对两种检查点蛋白质，即具有结合两种检查点蛋白质并抑制其功能的能力。
[0080]
术语“皮质醇”是指由肾上腺束状带产生的天然存在的糖皮质激素(也称为氢化可的松)。皮质醇具有以下结构：术语“总皮质醇”是指与皮质醇结合球蛋白(cbg或转铁蛋白)结合的皮质醇和游离皮质醇(不与cbg结合的皮质醇)。术语“游离皮质醇”指的是不与皮质醇结合球蛋白(cbg或转铁蛋白)结合的皮质醇。如本文所用，术语“皮质醇”是指总皮质醇、游离皮质醇和/或与cbg结合的皮质醇。
[0081]
术语“糖皮质类固醇”(“gc”)或“糖皮质激素”是指与糖皮质激素受体结合的类固醇激素。糖皮质类固醇的通常特征在于其具有21个碳原子、在环a中的α,β-不饱和酮、连接至环d的α-酮醇基团。它们在c-11、c-17和c-19的氧化程度和羟基化程度上存在差异(rawn,“膜脂质的生物合成和运输，胆固醇衍生物的形成(biosynthesis and transport of membrane lipids and formation of cholesterol derivatives),”biochemistry,daisy等人(编),1989,第567页)。
[0082]
如本文所用，短语“未另外表明用糖皮质激素受体调节剂治疗”是指未患有医学界公认的可以用糖皮质激素受体拮抗剂有效治疗的任何病症的患者，肝脂肪变性除外。本领域已知并被医学界接受的可以用糖皮质激素受体拮抗剂有效治疗的病症包括：与干扰素-α治疗相关的精神病、精神病性重度抑郁症、痴呆、应激障碍、自身免疫性疾病、神经损伤和库欣综合征。
[0083]
盐皮质激素受体(mr)，也称为i型糖皮质激素受体(gr i)，被人体内的醛固酮激活。
[0084]
如本文所用的术语“糖皮质激素受体”(gr)指ii型gr，是一种特异性结合皮质醇和/或皮质醇类似物例如地塞米松的胞内受体(参见例如，turner和muller,j.mol.endocrinol.2005 35(2):283-292)。所述糖皮质激素受体也称为皮质醇受体。该术语包括gr的异构体、重组gr和突变gr。
[0085]
术语“糖皮质激素受体调节剂”(grm)指调节与gr的gc结合或调节和gr与激动剂的结合相关的任何生物应答的任何化合物。例如，作为激动剂的grm，例如地塞米松，能够增加hepg2细胞(人肝肝细胞癌细胞系；ecacc，英国)中酪氨酸氨基转移酶(tat)的活性。作为拮抗剂的grm，例如米非司酮，能够降低hepg2细胞中酪氨酸氨基转移酶(tat)的活性。可如文献中所述检测tat活性：a.ali等,j.med.chem.,2004,47,2441-2452。
[0086]
如本文所用，术语“选择性糖皮质激素受体调节剂”(sgrm)指调节与gr的gc结合，或调节gr和激动剂结合相关联的任何生物反应的任何组合物或化合物。通过“选择性”，药物优先结合至gr而非其它核受体，例如黄体酮受体(pr)、盐皮质激素受体(mr)或雄激素受体(ar)。优选选择性糖皮质激素受体调节剂与gr结合的亲和性是其与所述mr、ar或pr，mr和pr两者，mr和ar两者，ar和pr两者，或者mr、ar和pr的结合的亲和性的10倍(kd值的1/10)。在
一个更优选的实施方式中，选择性糖皮质激素受体拮抗剂与gr结合的亲和性是其与mr、ar或pr，mr和pr，mr和ar，ar和pr，或mr、ar和pr的结合的亲和性的100倍(kd值的1/100)。在另一实施方式中，选择性糖皮质激素受体调节剂与gr结合的亲和性是其与mr、ar或pr，mr和pr，mr和ar，ar和pr，或mr、ar和pr的结合的亲和性的1000倍(kd值的1/1000)。瑞拉可兰是sgrm。
[0087]“糖皮质激素受体拮抗剂”(gra)是指抑制gc与gr结合，或抑制gr与激动剂结合相关的任何生物反应的任何化合物。因此，可以通过测量化合物抑制地塞米松作用的能力来鉴定gr拮抗剂。可如文献中所述检测tat活性：a.ali等,j.med.chem.,2004,47,2441-2452。gra是ic
50
(半最大抑制浓度)少于10微摩尔的化合物。参见美国专利8,859,774的实施例1，其全部内容通过引用并入本文。
[0088]
如本文所用，术语“选择性糖皮质激素受体拮抗剂”(sgra)是指抑制gc与gr结合，或抑制和gr与激动剂结合相关的任何生物学反应的任何组合物或化合物(其中抑制是相对于在化合物不存在的情况下的反应确定的)。通过“选择性”，药物优先结合至gr而非其它核受体，例如黄体酮受体(pr)、盐皮质激素受体(mr)或雄激素受体(ar)。优选选择性糖皮质激素受体调节剂与gr结合的亲和性是其与所述mr、ar或pr，mr和pr两者，mr和ar两者，ar和pr两者，或者mr、ar和pr的结合的亲和性的10倍(kd值的1/10)以上。在一个更优选的实施方式中，选择性糖皮质激素受体拮抗剂与gr结合的亲和性是其与mr、ar或pr，mr和pr，mr和ar，ar和pr，或mr、ar和pr的结合的亲和性的100倍(kd值的1/100)以上。在另一实施方式中，选择性糖皮质激素受体拮抗剂与gr结合的亲和性是其与mr、ar或pr，mr和pr，mr和ar，ar和pr，或mr、ar和pr的结合的亲和性的1000倍(kd值的1/1000)。瑞拉可兰是sgra。
[0089]
非甾体gra、sgra、grm和sgrm化合物包括包含稠合氮杂萘烷结构(也可称为稠合氮杂萘烷骨架)的化合物，包含杂芳基-酮稠合氮杂萘烷结构(也可称为杂芳基-酮稠合氮杂萘烷骨架)的化合物，以及包含八氢稠合氮杂萘烷结构(也可称为八氢稠合氮杂萘烷骨架)的化合物。
[0090]
包含稠合氮杂萘烷结构的多种示范性非甾体gra、sgra、grm和sgrm化合物包括美国专利号7,928,237和8,461,172所示的那些。包含杂芳基酮稠合氮杂萘烷结构的示范性非甾体gra、sgra、grm和sgrm化合物包括美国专利号8,859,774中所述的那些。包含八氢稠合氮杂萘烷结构的示范性非甾体gra、sgra、grm和sgrm化合物包括美国专利号10,047,082中所述的那些。本文中提及的所有专利、专利出版物和专利申请均以参考的方式用全文纳入本文。
[0091]
示例性的包含稠合氮杂萘烷骨架的糖皮质激素受体拮抗剂包括在美国专利第7,928,237和8,461,172号中所描述的那些。在实施方式中，稠合氮杂萘烷gra是化合物(r)-4a-乙氧基甲基-1-(4-氟苯基)-6-(4-三氟甲基-苯磺酰基)-4,4a,5,6,7,8-六氢-1h,1,2,6-三氮杂-环戊二烯并[b]萘(“cort108297”)，具有以下结构：
[0092]
美国专利8,859,774；美国专利9,273,047；美国专利9,707,223；以及美国专利9,956,216中描述了示例性杂芳基酮稠合氮杂萘烷化合物，所有这些专利在此通过引用全文并入。在实施方式中，杂芳基-酮稠合氮杂萘烷gra为化合物(r)-(1-(4-氟苯基)-6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8-六氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲酮(美国专利8,859,774的实施例18，也称为“瑞拉可兰”和“cort125134”，其具有下列结构：
[0093]
在实施方式中，杂芳基-酮稠合氮杂萘烷gra是化合物(r)-(1-(4-氟苯基)-6-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8-六氢-1-h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(噻唑-2-基)甲酮，(称为“cort122928”)，其具有以下结构：
[0094]
在实施方式中，杂芳基-酮稠合氮杂萘烷gra是化合物(r)-(1-(4-氟苯基)-6-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8-六氢-1-h-吡唑并p,4-g]异喹啉-4a-基)(吡啶-2-基)甲酮，(称为“ort113176”)，其具有以下结构：
[0095]
包括八氢(octohydro)稠合氮杂萘烷结构的示例性的糖皮质激素受体拮抗剂包括在美国专利第10,047,082号中所描述的那些。在实施方式中，所述八氢稠合氮杂萘烷化合物是化合物((4ar,8as)-1-(4-氟苯基)-6-((2-甲基-2h-1,2,3-三唑-4-基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8,8a,9-八氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲酮(称作艾昔可兰或“cort125281”)，其具有以下结构：
[0096]
在一些情形中，非甾体sgrm是cort125329，即，((4ar,8as)-1-(4-氟苯基)-6-((2-异丙基-2h-1,2,3-三唑-4-基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8,8a,9-八氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(噻唑-2-基)甲酮，其具有如下结构：
[0097]
本文中所用术语“组合物”旨在涵盖包含特定成分的产品，例如所述化合物，其互变异构形式，其衍生物，其类似物，其立体异构体，其多晶型物，其氘化种类，其药学上可接受的盐，酯，醚，代谢物，异构体混合物，其药学上可接受的溶剂合物和特定量的药学上可接受的组合物，以及由特定量的特定成分的组合直接或间接产生的任何产品。对于药物组合物而言，该术语目的是涵盖包括活性成分和构成运载体的惰性成分的产品，以及任何直接或间接从任意两个或更多个成分组合、复合或聚集，或一个或更多成分的分解，或一个或更
多成分的其他类型的反应或相互作用形成的任意产品。因此，本发明的药物组合物意在涵盖通过将本发明化合物与其药学上可接受的运载体混合而制得的任何组合物。
[0098]
在一些实施方式中，术语“基本由
……
组成”指制剂中唯一活性成分是所示活性成分的组合物，但也可包括其他化合物，这些其它化合物用于稳定、保存制剂等，但不直接涉及所示活性成分的治疗作用。在一些实施方式中，术语“基本由
……
组成”可指包含活性成分和促进活性成分释放的组分的组合物。例如，该组合物可包含使活性成分随时间推移缓释至对象的一种或多种组分。在一些实施方式中，术语“由
……
组成”指包含活性成分和药学上可接受的运载体或赋形剂的组合物。
[0099]
关于grm和sgrm的内容中，本文所用的短语“非甾体”和短语“非甾体骨架”指不与皮质醇(其甾体类骨架包含17个碳原子，以4个稠合环形式相连)共有结构同源性或非其修饰形式的grm和sgrm。这些化合物包括蛋白质的合成模拟物和类似物，包括部分肽、伪肽和非肽分子实体。
[0100]
非甾体gra、sgra、grm和sgrm化合物包括包含稠合氮杂萘烷结构(也可称为稠合氮杂萘烷骨架)的化合物，包含杂芳基-酮稠合氮杂萘烷结构(也可称为杂芳基-酮稠合氮杂萘烷骨架)的化合物，包含八氢稠合氮杂萘烷结构(也可称为八氢稠合氮杂萘烷骨架)的化合物。包含稠合氮杂萘烷结构的多种示范性非甾体gra、sgra、grm和sgrm化合物包括美国专利号7,928,237和8,461,172所示的那些。包含杂芳基酮稠合氮杂萘烷结构的示范性非甾体gra、sgra、grm和sgrm化合物包括美国专利号8,859,774中所述的那些。包含八氢稠合氮杂萘烷结构的示范性非甾体gra、sgra、grm和sgrm化合物包括美国专利号10,047,082中所述的那些。本文中提及的所有专利、专利出版物和专利申请均以参考的方式用全文纳入本文。
[0101]
当取代基基团由其常规化学式从左至右定义时，它们同样包括了从右至左定义该结构所得的化学上相同的取代基，例如-ch2o-与-och
2-等同。
[0102]“烷基”是指具有指定数量碳原子的直链或支链饱和脂族基团。烷基可包括任何数目的碳，例如c
1-2
、c
1-3
、c
1-4
、c
1-5
、c
1-6
、c
1-7
、c
1-8
、c
1-9
、c
1-10
、c
2-3
、c
2-4
、c
2-5
、c
2-6
、c
3-4
、c
3-5
、c
3-6
、c
4-5
、c
4-6
和c
5-6
。例如，c
1-6
烷基包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基。
[0103]“烷氧基”指具有氧原子的烷基基团，所述氧原子将烷基连接至连接点：烷基-o-。就烷基而言，烷氧基可具有任何适当数目的碳原子，如c
1-6
。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。
[0104]“卤素”指氟、氯、溴和碘。
[0105]“卤代烷基”是指其中一些或全部氢原子被卤素原子替代的如上文所定义的烷基。就烷基而言，卤代烷基可具有任何合适数量的碳原子，如c
1-6
，并且包括三氟甲基、氟甲基等。
[0106]
术语“全氟”可用于表示全部氢被氟替代的化合物或基团。例如，全氟甲烷包括1,1,1-三氟甲基。
[0107]“卤代烷氧基”指一些或全部氢原子被卤素原子取代的烷氧基。就烷基而言，卤代烷氧基可具有任何适当数目的碳原子，如c
1-6
。所述烷氧基可被1、2、3或更多个卤素取代。当所有氢都被一种卤素取代、例如被氟取代时，该化合物是全取代的，例如全氟化。卤代烷氧
基包括但不限于：三氟甲氧基、2,2,2,-三氟乙氧基和全氟乙氧基。
[0108]“环烷基”指饱和的或部分不饱和的、单环的、稠合二环或桥接的多环组合件，其包含从3至12个环原子或指定数量的原子。环烷基可包括任意数量的碳，如c
3-6
、c
4-6
、c
5-6
、c
3-8
、c
4-8
、c
5-8
、c
6-8
、c
3-9
、c
3-10
、c
3-11
和c
3-12
。饱和的单环环烷基环包括例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。饱和的二环和多环环烷基环包括：例如，降冰片烷、[2.2.2]二环辛烷、十氢化萘和金刚烷。环烷基还可以是部分不饱和的，在其环中具有一个或多个双键或三键。代表性的部分不饱和的环烷基包括但不限于：环丁烯、环戊烯、环己烯、环己二烯(1,3-和1,4-异构体)、环庚烯、环庚二烯、环辛烯、环辛二烯(1,3-、1,4-和1,5-异构体)、降冰片烯和降冰片二烯。当环烷基是饱和的单环c
3-8
环烷基时，示例性的基团包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。当环烷基是饱和单环c
3-6
环烷基时，示例性的基团包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
[0109]“杂环烷基”是指具有3至12个环原子和1至4个的n、o和s杂原子的饱和环系统。也可以使用其它的杂原子，包括但不限于b、al，si和p。所述杂原子还可被氧化，例如但不限于-s(o)-和-s(o)
2-。杂环烷基可以包括任何数目的环原子，如3至6、4至6、5至6、3至8、4至8、5至8、6至8、3至9、3至10、3至11或3至12个环原子。任何适当数量的杂原子都可包括在杂环烷基中，如1、2、3或4，或者1至2、1至3、1至4、2至3、2至4或3至4。所述杂环烷基可包括：如氮杂环丙烷、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷、氮杂环辛烷(azocane)、奎宁环、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪(1,2-，1,3-和1,4-异构体)、环氧乙烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、噁烷(四氢吡喃)、氧杂环庚烷、硫杂丙环、硫杂环丁烷、四氢硫杂茂(thiolane)(四氢噻吩)、硫杂环己烷(thiane)(四氢噻喃)、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、二氧戊环、二硫戊环、吗啉、硫代吗啉、二噁烷或二噻烷。所述杂环烷基还可与芳族或非芳族环系统稠合以形成包括但不限于二氢吲哚的基团。
[0110]
当杂环烷基包括3-8个环原子和1-3个杂原子时，代表性的成员包括但不限于：吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、噁烷、四氢噻吩、硫杂环己烷、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、吗啉、硫代吗啉、二噁烷和二噻烷。杂环烷基也可形成具有5-6个环原子和1-2个杂原子的环，代表性的成员包括但不限于：吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、四氢噻吩、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷和吗啉。
[0111]“芳基”指具有任意合适数量的环原子和任意合适数量的环的芳族环系统。芳基可包括任何合适数目的环原子，如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个环原子，以及6至10、6至12或6至14个环原子。芳基可以是单环，稠合以形成二环或三环基团，或由键连接以形成联芳基。代表性的芳基基团包括苯基、萘基和联苯基。其它芳基基团包括具有亚甲基连接基团的苄基。一些芳基具有6-12个环原子，如苯基、萘基或联苯基。其它芳基具有6-10个环原子，如苯基或萘基。一些其它芳基具有6个环原子，如苯基。芳基可以是取代的或未取代的。
[0112]“杂芳基”指具有5个环原子到16个环原子单环、稠合二环或多环组合件，其中1到5个环原子是例如n，o或s的杂原子。其他的杂原子也可以是有用的，包括但不限于b，al，si和p。所述杂原子也可被氧化，例如但不限于n-氧化物，-s(o)-和-s(o)
2-。杂芳基可以包括任何数目的环原子，如3至6、4至6、5至6、3至8、4至8、5至8、6至8、3至9、3至10、3至11或3至12个环原子。杂芳基基团中可包含任何合适数目的(如1、2、3、4或5个，或1至2、1至3、1至4、1至5、2至3、2至4、2至5、3至4或3至5个)杂原子。杂芳基基团可具有5至8个环原子和1至4个杂原
子、或5至8个环原子和1至3个杂原子、或5至6个环原子和1至4个杂原子、或5至6个环原子和1至3个杂原子。杂芳基可包括如下基团：例如，吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、四唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑、和异噁唑。所述杂芳基也可稠合至芳族环系统(如苯环)以形成包括但不限于：苯并吡咯(如吲哚和异吲哚)、苯并吡啶(如喹啉和异喹啉)、苯并吡嗪(喹喔啉)、苯并嘧啶(喹唑啉)、苯并哒嗪(如酞嗪和噌啉)、苯并噻吩和苯并呋喃。其它杂芳基包括由化学键连接的杂芳基环(如联吡啶)。杂芳基可以是取代的或未取代的。
[0113]
杂芳基可通过环上的任何位置连接。例如，吡咯包括1-,2-和3-吡咯，吡啶包括2-,3-和4-吡啶，咪唑包括1-,2-,4-和5-咪唑、吡唑包括1-,3-,4-和5-吡唑，三唑包括1-,4-和5-三唑，四唑包括1-和5-四唑，嘧啶包括2-,4-,5-和6-嘧啶，哒嗪包括3-和4-哒嗪，1,2,3-三嗪包括4-和5-三嗪，1,2,4-三嗪包括3-,5-和6-三嗪，1,3,5-三嗪包括2-三嗪，噻吩包括2-和3-噻吩，呋喃包括2-和3-呋喃，噻唑包括2-,4-和5-噻唑，异噻唑包括3-,4-和5-异噻唑，噁唑包括2-,4-和5-噁唑，异噁唑包括3-,4-和5-异噁唑，吲哚包括1-,2-和3-吲哚，异吲哚包括1-和2-异吲哚，喹啉包括2-,3-和4-喹啉，异喹啉包括1-,3-和4-异喹啉，喹唑啉包括2-和4-喹唑啉，噌啉包括3-和4-噌啉，苯并噻吩包括2-和3-苯并噻吩，并且苯并呋喃包括2-和3-苯并呋喃。
[0114]
一些杂芳基基团包括具有5至10个环原子和1至3个包括n、o或s的环原子的基团，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑、异噁唑、吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪、噌啉、苯并噻吩和苯并呋喃。其它一些杂芳基基团包括具有5至8个环原子和1至3个杂原子的基团，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑和异噁唑。其它一些杂芳基基团包括具有9至12个环原子和1至3个杂原子的那些基团，例如吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪、噌啉、苯并噻吩、苯并呋喃和联吡啶。此外，其它杂芳基包括具有5至6个环原子和包括n、o或s的1至2个环杂原子的那些基团，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑和异噁唑。
[0115]
一些杂芳基基团包含5至10个环原子和仅氮杂原子，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪和噌啉。其它一些杂芳基包含5-10个环原子和仅氧杂原子，例如呋喃和苯并呋喃。其它一些杂芳基包含5-10个环原子和仅硫杂原子，例如噻吩和苯并噻吩。其它一些杂芳基基团包含5-10个环原子和至少2个杂原子，例如咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻唑、异噻唑、噁唑、异噁唑、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪和噌啉。
[0116]“杂原子”指o、s或n。
[0117]“盐”指本发明方法中使用的化合物的酸或碱盐。药学上可接受的盐的说明性示例有：无机酸(盐酸、氢溴酸、磷酸等)盐，有机酸(乙酸、丙酸、谷氨酸、柠檬酸等)盐，和季铵(甲基碘、乙基碘等)盐。应理解，药学上可接受的盐是无毒的。合适的药学上可接受的盐的其他信息可在remington's pharmaceutical sciences(《雷明顿药物科学》)，第17版，马克出版公司(mack publishing company)，宾西马尼亚州伊斯顿，1985中找到，其通过引用纳入本
文。
[0118]“异构体”指具有相同化学式但在结构上有区别的化合物。
[0119]“互变异构体”指两种或更多种结构异构体之一，它们以平衡态共存且易于从一种形式转换成另一种形式。
[0120]
本发明的化合物的描述遵循本领域技术人员已知的化学成键原理。因此，当某一基团可被一种或多种取代基取代时，这类取代基的选择应符合化学成键原理并生成非内在不稳定和/或本领域普通技术人员已知其在环境条件(如水性、中性或生理条件)下可能是不稳定的化合物。
[0121]“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的运载体”指有助于活性剂给予于对象和被对象吸收的物质，且可被包括在本发明的组合物中而不会对患者造成明显的不良毒理作用。本文所用的这些术语旨在包括与药物给予相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的赋形剂的非限制性示例包括水、nacl、生理盐水、乳酸林格溶液、普通蔗糖、普通葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、包封剂、增塑剂、润滑剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和着色剂等。本领域普通技术人员应理解，其它药用赋形剂可用于本发明中。药学活性物质的这类介质和试剂的用法是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂都与活性化合物不相容，否则应考虑在组合物中使用这些介质或试剂。补充性活性化合物也可掺入所述组合物。本领域普通技术人员应理解，其它药用赋形剂可用于本发明中。
[0122]
在一些实施方式中，本文公开的方法包括联合治疗，其包括给予包含稠合氮杂萘烷结构的grm；包含杂芳基酮稠合氮杂萘烷结构的grm；或包含八氢稠合氮杂萘烷结构的grm。
[0123]
包含稠合氮杂萘烷结构的示例性grm包括美国专利号7,928,237和8,461,172中所述的grm，并且可以如其中公开的那样制备。这些专利整体引入本文。这种示例性grm可以是sgrm。在一些情形中，包括稠合氮杂萘烷结构的grm具有如下结构：其中l1和l2独立地选自键和未取代的亚烷基；r1选自：未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的杂环烷基、-or
1a
、nr
1cr1d
、-c(o)nr
1cr1d
和-c(o)or
1a
，其中r
1a
选自：氢、未取代的烷基和未取代的杂烷基，r
1c
和r
1d
各自选自：未取代的烷基和未取代的杂烷基，其中r
1c
和r
1d
任选地与它们所连接的氮连接形成未取代的环，所述环任选地含有另外的环氮；r2具有如下通式：
其中r
2g
选自：氢、卤素、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烃基、未取代的杂环烷基、-cn和-cf3；j是苯基；t是从0到5的整数；x是-s(o2)-；且r5是苯基，其任选地被1至5个r
5a
基团取代，其中r
5a
选自：氢、卤素、-or
5a1
、s(o2)nr
5a2r5a3
、-cn和未被取代的烷基，其中r
5a1
选自：氢和未取代的烷基，并且r
5a2
和r
5a3
各自选自：氢和未取代的烷基，或其盐及异构体。
[0124]
在一些情形中，所述稠合氮杂萘烷化合物是
[0125]
包括杂芳基酮稠合氮杂萘烷结构的示例性的grm包括u.s.8,859,774中描述的那些，其可以如其中公开的那样制备，并且整体引入本文。这种示例性grm可以是sgrm。某些情形中，包括杂芳基酮稠合氮杂萘烷结构的grm具有如下结构：其中r1是具有5至6个环原子和1至4个独立地选自：n、o和s的杂原子的杂芳基环，任选地被1至4个各自独立地选自r
1a
的基团取代；各r
1a
独立地选自：氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、-cn、n-氧化物、c
3-8
环烷基和c
3-8
杂环烷基；环j选自下组：环烷基环、杂环烷基环、芳基环和杂芳基环，其中所述杂环烷基和杂芳基环具有5至6个环原子和1至4个独立地选自：n、o和s的杂原子；各r2独立地选自：氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、c
1-6
烷基-c
1-6
烷氧基、-cn、-oh、-nr
2ar2b
、-c(o)r
2a
、-c(o)or
2a
、-c(o)nr
2ar2b
、-sr
2a
、-s(o)r2a
、-s(o)2r
2a
、c
3-8
环烷基和c
3-8
杂环烷基，其中所述杂环烷基任选地被1至4个r
2c
基团取代；或者，与同一碳相连的两个r2基团组合形成氧代基团(＝o)；或者，两个r2基团组合形成具有5至6个环原子和1至3个各自独立地选自：n、o和s的杂原子的杂环烷基环，所述杂环烷基环任选地被1至3个r
2d
基团取代；r
2a
和r
2b
各自独立地选自：氢和c
1-6
烷基；各r
2c
独立地选自：氢、卤素、羟基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、-cn和-nr
2ar2b
，各r
2d
独立地选自：氢和c
1-6
烷基，或者与相同环原子相连的两个r
2d
基团组合形成(＝o)；r3选自下组：苯基和吡啶基，其各自任选地被1-4个r
3a
基团取代；各r
3a
独立地选自：氢、卤素和c
1-6
卤代烷基；并且下标n是0至3的整数；或其盐及异构体。
[0126]
在一些情形中，非甾体sgrm是cort 125134，即，(r)-(1-(4-氟苯基)-6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8-六氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲酮，其具有如下结构：
[0127]
包括八氢稠合氮杂萘烷结构的示例性grm包括u.s.10,047,082中描述的那些，可以按照其中的描述进行制备，该美国专利的公开内容全部纳入本文。这种示例性grm可以是sgrm。某些情形中，包括八氢稠合氮杂萘烷结构的grm具有如下结构：其中r1是具有5至6个环原子和1至4个独立地选自：n、o和s的杂原子的杂芳基环，任选地被1至4个各自独立地选自r
1a
的基团取代，各r
1a
独立地选自：氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、n-氧化物和c
3-8
环烷基；环j选自下组：芳基环和杂芳基环，其各自具有5至6个环原子和1至4个杂原子，所述杂原子各自独立地选自：n、o和s；
各r2独立地选自：氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、c
1-6
烷基-c
1-6
烷氧基、-cn、-oh、-nr
2ar2b
、-c(o)r
2a
、-c(o)or
2a
、-c(o)nr
2ar2b
、-sr
2a
、-s(o)r
2a
、-s(o)2r
2a
、c
3-8
环烷基和具有1至3个杂原子的c
3-8
杂环烷基，所述杂原子各自独立地选自n、o和s；或者，相邻环原子上的两个r2基团组合形成具有5至6个环原子和1至3个杂原子的杂环烷基环，所述杂原子各自独立地选自：n、o和s，其中所述杂环烷基环任选地被1-3个r
2c
基团取代；r
2a
、r
2b
和r
2c
各自独立地选自：氢和c
1-6
烷基；各r
3a
独立地是卤素；且下标n是0至3的整数；或其盐及异构体。
[0128]
在实施方式中，所述八氢稠合氮杂萘烷化合物具有如下通式：其中r1选自吡啶和噻唑，任选地被1-4个各自独立地选自r
1a
的基团取代；r
1a
各自独立地选自氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、n-氧化物和c
3-8
环烷基；环j选自苯基、吡啶、吡唑和三唑；r2各自独立地选自氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基和-cn；r
3a
为f；下标n是从0到3的整数；或其盐及异构体。
[0129]
在一些情形中，非甾体sgrm是艾昔可兰(也称作cort125281)，即，((4ar,8as)-1-(4-氟苯基)-6-((2-甲基-2h-1,2,3-三唑-4-基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8,8a,9-八氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲酮，其具有如下结构：
[0130]
在一些情形中，非甾体sgrm是cort125329，即，((4ar,8as)-1-(4-氟苯基)-6-((2-异丙基-2h-1,2,3-三唑-4-基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8,8a,9-八氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(噻唑-2-基)甲酮，其具有如下结构：
鉴定选择性糖皮质激素受体调节剂(sgrm)
[0131]
为了确定测试化合物是否为sgrm，首先对该化合物进行测定以检测其结合至gr并抑制gr-介导的活性的能力，这确定该化合物是否为糖皮质激素受体调节剂。若该化合物被确认为糖皮质激素受体调节剂，随后对其进行特异性测试，以确定该化合物能否选择性地结合至gr，相较于非gr蛋白，例如雌激素受体、黄体酮受体、雄激素受体或盐皮质激素受体。在一个实施方式中，sgrm以本质上较高的亲和性(例如相比非gr蛋白质至少10倍更高亲和性)结合至gr。相对于与非gr蛋白质的结合，对于与gr的结合，sgrm可显示100倍、1000倍或更大选择性。结合：
[0132]
测试化合物结合至糖皮质激素受体的能力可采用多种试验检测，例如，通过筛选该测试化合物和糖皮质激素受体配体(例如地塞米松)与糖皮质激素受体竞争性结合的能力。本领域技术人员应知晓，有许多方法来进行这样的竞争性结合试验。在一些实施方式中，糖皮质激素受体与带标记的糖皮质激素受体配体预孵育，随后与测试化合物接触。这种类型的竞争性结合试验在本文中也可被称作结合置换试验(binding displacement assay)。与糖皮质激素受体结合的带标记的配体的减少指示该测试化合物结合至糖皮质激素受体。在一些情形中，带标记的配体是荧光标记的化合物(例如，荧光标记的类固醇或类固醇类似物)。或者，可使用带标记的测试化合物直接检测测试化合物与糖皮质激素受体的结合。后一类型的试验被称为直接结合试验。
[0133]
可采用多种不同的形式的直接结合试验和竞争性结合试验。这些形式可与免疫测定和受体结合试验中使用的那些类似。对于结合试验(包括竞争性结合试验和直接结合试验)的不同形式的描述，参见《基础和临床免疫学》(basic and clinical immunology)第7版(d.stites和a.terr编)1991；《酶免疫试验》(enzyme immunoassay)，e.t.maggio编，crc出版社，佛罗里达州博卡拉顿(1980)；以及“酶促免疫实验的实践和理论(practice and theory of enzyme immunoassays)”，p.tijssen，laboratory《生物化学与分子生物学实验室技术》(techniques in biochemistry and molecular biology)，埃尔斯威尔科学出版社(elsevier science publishers b.v.)，阿姆斯特丹(1985)，其各自通过引用方式纳入本文。
[0134]
在固相竞争性结合试验中，例如，样品化合物可与带标记的分析物竞争结合于固体表面的结合剂上的特异性结合位点。在此类形式中，带标记的分析物可以是糖皮质激素受体配体，而结合剂可以是与固相结合的糖皮质激素受体。或者，带标记的分析物可以是带
标记的糖皮质激素受体，而结合剂可以是固相糖皮质激素受体配体。与捕获剂结合的带标记的分析物的浓度与结合试验中测试化合物的竞争能力呈反比。
[0135]
或者，可在液相中进行竞争性结合试验，且可用各种本领域已知技术将结合的带标记蛋白质与未结合的带标记蛋白质分离。例如，已经开发了用于区分结合配体和过量结合配体或区分结合测试化合物和过量未结合测试化合物的数种操作。这些包括通过如下方式鉴定结合的复合物：蔗糖梯度沉降、凝胶电泳或凝胶等电聚焦，受体-配体复合物的硫酸鱼精蛋白沉淀或羟基磷灰石吸附，以及用葡聚糖包被的活性炭(dcc)吸附或通过固定化抗体结合除去未结合的化合物或配体。分离后，测定结合的配体或测试化合物的量。
[0136]
或者，可进行均质结合试验，其中不需要分离步骤。例如，通过糖皮质激素受体与其配体或测试化合物的结合来改变糖皮质激素受体上的标记物。带标记的糖皮质激素受体中的这一改变导致由该标记物发射的信号的减少或增加，从而使得结合试验结束时，对标记物的度量允许对结合状态下的糖皮质激素受体进行检测或定量。可使用多种标记物。组分可用数种方法中的任一种来标记。有用的放射性标记物包括引入3h、
125
i、
35
s、
14
c或
32
p的那些。有用的非放射性标记物包括引入荧光团，化学发光剂，磷光剂，电化学发光剂等的那些。荧光剂在用于检测蛋白质结构偏移的分析技术(如荧光各向异性和/或荧光极化)中特别有用。标记物的选择取决于所需灵敏度、与化合物偶联的容易程度、稳定性要求和可用的仪器。对于可以使用的各种标记或信号产生系统的综述，参见美国专利号4,391,904，其通过引用全文纳入本文以用于全部目的。标记物可以按照本领域已知方法与试验所需组分直接或间接偶联。某些情形中，在对gr具有已知亲和性的荧光标记的配体(例如类固醇或类固醇类似物)的存在下，使测试化合物与gr接触，并通过检测带标记配体的荧光极化来估计结合与游离的带标记配体的量。活性：1)hepg2酪氨酸氨基转移酶(tat)试验
[0137]
测试显示对于gr的所需结合亲和性的化合物在抑制gr介导的活性方面的活性。通常对该化合物进行酪氨酸氨基转移酶测定(tat试验)，其评估测试化合物抑制地塞米松诱导酪氨酸氨基转移酶活性的能力。参见实施例1。适用于本文公开方法的gr调节剂具有少于10微摩尔的ic
50
(半最大抑制浓度)。也可以使用其他试验，包括但不限于以下描述的试验，以确认化合物的gr调节活性。2)基于细胞的试验
[0138]
涉及全细胞或含糖皮质激素受体的细胞组分的基于细胞的试验也可用于检测测试化合物的结合或对于糖皮质激素受体活性的调节。可用于本发明方法的示例性细胞类型包括，例如，任何哺乳动物细胞，包括白细胞，例如嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞，例如t细胞和b细胞、白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、肿瘤细胞(包括小鼠乳腺肿瘤病毒细胞)、内皮细胞、成纤维细胞、心肌细胞，肌肉细胞，乳腺肿瘤细胞，卵巢癌，宫颈癌，胶质母细胞瘤，肝细胞，肾细胞和神经元细胞，以及真菌细胞，包括酵母。细胞可以是原代细胞或肿瘤细胞或其它类型的永生细胞系。当然，糖皮质激素受体可在不表达糖皮质激素受体的内源性形式的细胞中表达。
[0139]
在一些情况下，糖皮质受体的片段以及蛋白质融合体可用于筛选。当需要与糖皮质激素受体配体竞争结合的分子时，所用的gr片段是能够与配体(如地塞米松)结合的片
段。或者，gr的任何片段都可用作靶标以鉴定与糖皮质激素受体相结合的分子。糖皮质激素受体片段可包括糖皮质激素受体的任何片段，例如从其至少20、30、40、50个氨基酸到最多达与其全部仅相差一个氨基酸的蛋白质的片段。
[0140]
在一些实施方式中，通过糖皮质激素受体活化触发的信号转导的减少可用于鉴定糖皮质激素受体调节剂。糖皮质激素受体的信号转导活性可用许多方式确定。例如，可监测下游分子事件来确定信号转导活性。下游事件包括作为糖皮质激素受体的刺激的结果而出现的活动或表现。对于未经改变的细胞中的转录活化和拮抗的功能评价中有用的示例性下游事件包括，多种糖皮质激素反应元件(gre)-依赖性基因(pepck、酪氨酸氨基转移酶、芳香酶)的上调。此外，可以使用对于gr活化易感型的特定类型的细胞，如成骨细胞中骨钙素的表达(其由糖皮质激素下调)；显示糖皮质激素介导的pepck和葡萄糖-6-磷酸(g-6-pase)上调的原代肝细胞。已显示，使用熟知的gre调节的序列(例如，在报告基因构建体的上游转染的小鼠乳房肿瘤病毒启动子(mmtv))的经转染细胞系中的gre介导的基因表达。有用的报告基因构建体的示例包括萤光素酶(luc)，碱性磷酸酶(alp)和氯霉素乙酰转移酶(cat)。转录抑制的功能评价可以在细胞系(例如单核细胞或人皮肤成纤维细胞)中进行。有用的功能试验包括测量转染的细胞系中由nfkb或ap-1转录因子调控的基因表达；il-1β刺激的il-6表达；胶原酶、环加氧酶-2和多种趋化因子(mcp-1、rantes)的下调；或lps刺激的细胞因子释放(例如tnfα)的那些试验。
[0141]
经全细胞试验测试的化合物还在细胞毒性试验中进行测试。细胞毒性试验用于确定感知效应在何种程度上缘于非糖皮质激素受体结合细胞效应。在示例性的实施方式中，细胞毒性试验包括使组成性活性细胞与测试化合物接触。任何细胞活力降低都指示细胞毒性作用。3)其它试验
[0142]
对于可用于鉴定用于本发明方法的组合物的许多试验的进一步说明性示例是基于体内糖皮质激素活性的试验。例如，可采用评估推定gr调节剂抑制被糖皮质激素刺激的细胞中dna中3h-胸苷摄取能力的试验。或者，推定gr调节剂可与3h-地塞米松竞争与肝细胞瘤组织培养物gr结合(参见例如，choi等，steroids 57:313-318,1992)。作为另一示例，可利用推定gr调节剂阻遏3h-地塞米松-gr复合物的核结合的能力(alexandrova等，j.steroid biochem.mol.biol.41:723-725,1992)。为了进一步鉴定推定gr调节剂，还可使用能够通过受体结合性动力学来区分糖皮质激素激动剂和调节剂的动力学试验(描述于jones，biochem j.204:721-729，1982)。
[0143]
在另一说明性示例中，daune，molec.pharm.13:948-955，1977；和美国专利第4,386,085号中描述的试验可用于鉴定抗糖皮质激素活性。简言之，切除肾上腺的大鼠的胸腺细胞在包含地塞米松和不同浓度的测试化合物(推定gr调节剂)的营养培养基中孵育。将3h-尿苷添加至细胞培养基，其经进一步孵育，随后检测放射性标记物掺入多核苷酸的程度。糖皮质激素激动剂使掺入的3h-尿苷的量减小。因此，gr调节剂将对抗该作用。选择性
[0144]
然后，使如上选择的gr调节剂经历选择性试验，以确定它们是否是sgrm。通常，选择性试验包括在体外测试与糖皮质激素受体结合的化合物与非糖皮质激素受体蛋白质的结合程度。选择性试验可在体外或基于细胞的系统中进行，如上文所述。可测试针对任何合
适的非糖皮质激素受体蛋白的结合，包括抗体、受体、酶等。在示例性的实施方式中，非糖皮质激素受体结合蛋白是细胞表面受体或核受体。在另一个示例性的实施方式中，非糖皮质激素受体蛋白是类固醇受体，如雌激素受体、孕酮受体、雄激素受体或盐皮质激素受体。
[0145]
相对于mr，针对gr的拮抗剂的选择性可采用本领域技术人员已知的多种试验来测量。例如，可通过检测拮抗剂与gr(相较于mr)相结合的能力来鉴定具体拮抗剂(参见例如，美国专利第5,606,021号；第5,696,127号；第5,215,916号；第5,071,773号)。所述分析可采用直接结合试验或通过评估在已知配体存在下与纯化的gr或mr的竞争性结合来进行。在一个示例性试验中，采用以高水平稳定表达糖皮质激素受体或盐皮质激素受体的细胞(参见例如，美国专利第5,606,021号)作为纯化受体的来源。然后直接检测配体对于受体的亲和性。然后选择相对于mr显示对于gr至少10倍、100倍更高亲和性，通常1000倍的那些gr调节剂用于本发明方法。
[0146]
选择性试验还可包括测试抑制gr-介导的活性而非mr-介导的活性的能力。鉴定此类gr特异性调节剂的一种方法是采用转染试验评估拮抗剂防止报告构建体活化的能力(参见例如，bocquel等，j.steroid biochem molec.biol.45:205-215,1993；美国专利第5,606,021号、第5,929,058号)。在一个示例性的转染试验中，将编码受体的表达质粒和包含与受体特异性调节元件相连的报告基因的报告质粒共同转染进入合适的受体阴性宿主细胞。然后，转染的宿主细胞在存在或不存在激素(例如皮质醇或其类似物)的情况下培养，所述激素能够活化报告质粒的激素反应性启动子/增强子元件。随后，监测经转染和培养的宿主细胞的报告基因序列产物的诱导(即，存在)。最后，通过测定在存在或不存在拮抗剂的情况下的报告基因的活性，来监测激素受体蛋白(由表达质粒上的受体dna序列编码，并在经转染和培养的宿主细胞中产生)的表达和/或类固醇结合能力。可与gr和mr受体的已知拮抗剂相比来确定化合物的拮抗剂活性(参见例如，美国专利第5,696,127号)。然后，以相对于参比拮抗剂化合物，对于各化合物所观察到的最大反应百分比的方式，来报告功效。然后，选择相对于mr、pr或ar，针对gr显示至少100倍，通常1000倍或更高的活性的gr调节剂，用于本文公开的方法。诊断癌症
[0147]
癌症的特征是异常细胞的不受控制的生长和/或扩散。通常会进行活组织检查，并在显微镜下检查活组织检查中的细胞或组织，以确认可疑情况。在某些情形中，需要对细胞的蛋白质、dna和rna进行额外的测试以验证诊断。鉴定检查点抑制剂敏感型癌症
[0148]
在本发明的一些实施方式中，方法用于治疗具有至少一种检查点抑制剂敏感型癌症的患者。检查点抑制剂敏感型癌症是响应检查点抑制剂的癌症，例如给予一种或多种检查点抑制剂能减少肿瘤负荷，或实现与癌症改善相关的有益或期望的临床结果。例如，给予检查点抑制剂可导致以下一种或多种：减少癌细胞的量；减小肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减缓和/或停止)癌细胞浸润到周围器官；抑制(即在一定程度上减慢和/或停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与该病症相关的一种或多种症状；缩小肿瘤的大小；减少由疾病引起的症状；提高疾病患者的生活质量；减少治疗该疾病所需的其他药物的剂量；延缓疾病进展；和/或延长患者的生存期。。
[0149]
检查点抑制剂敏感型肿瘤通常具有高表达的配体，例如pd-l1或b7，其分别与检查
点蛋白pd-1或ctla-4结合。这些相互作用抑制了针对肿瘤细胞的免疫反应。据信，如本文所公开给予grm或sgrm可在对检查点抑制剂相对不敏感的肿瘤中诱导检查点抑制剂敏感性，或可增强肿瘤中的检查点抑制剂敏感性。检查点抑制剂敏感型肿瘤和可诱导成为检查点抑制剂敏感型的肿瘤的非限制性例子包括：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、胶质瘤、肾癌、胃癌(stomach cancer)、食管癌、口腔鳞状细胞癌、头颈癌、黑素瘤、肉瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、神经内分泌肿瘤、膀胱癌、胃癌(gastric cancer)、前列腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌和间皮瘤。iii.鉴定gr表达
[0150]
在一些实施方式中，检查点抑制剂敏感型癌症也是gr
+
癌症。癌细胞中的gr表达可通过使用一种或多种常规生化分析来检测。在一些实施方式中，通过使用诸如微阵列和rt-pcr的方法检测gr转录物表达来确定gr表达。在其他实施方式中，gr表达是通过使用诸如蛋白质印迹分析和免疫组织化学染色的方法检测蛋白质表达来确定的。在其他实施方式中，使用这些方法的组合来确定gr表达。
[0151]
在优选实施方式中，进行免疫组织化学染色，并使用h评分法来定量癌组织上gr的表达。在一个示例性测定中，福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织切片被脱蜡，并用抗原回收溶液处理，以使糖皮质激素受体易于接近抗gr抗体。然后将抗gr抗体与组织切片一起孵育，并且通过添加识别抗gr抗体的马过氧化物酶(hrp)偶联的二抗来检测与组织切片上的gr结合的抗体。二抗偶联物上的hrp催化比色反应，并在接触适当底物时，在存在gr的位置产生染色。在一种方法中，gr染色的强度水平由0表示阴性染色，1+表示弱染色，2+表示中等染色，3+表示强染色。见www.ihcworld.com/ihc_scoring.htm。每个强度级别的gr
+
细胞百分数乘以强度级别，所有强度级别的结果相加，产生0
–
300之间的h评分。在一个实施方式中，具有等于或高于预定阈值的h评分的癌症类型被认为是gr
+
癌症。在优选实施方式中，阈值为150。在另一个实施方式中，gr
+
癌症是具有至少10％的肿瘤细胞以任何强度显示gr染色的癌症。使用h评分150的阈值，许多癌症类型为gr
+
。参见下表1。如临床试验的公开结果所示，这些癌症类型中的大多数也是检查点抑制剂敏感型癌症。见网址“clinicaltrials.gov”。检查点抑制剂
[0152]
本文公开的方法使用至少一种sgrm与至少一种检查点抑制剂组合来治疗癌症。在一些实施方式中，检查点抑制剂是针对至少一种检查点蛋白的抗体(“cia”)。在一些实施方式中，检查点抑制剂是小分子非蛋白化合物(“cic”)，其阻断由一种或多种检查点蛋白诱导的免疫抑制通路。i检查点抑制剂抗体(“cia”)
[0153]
在一个实施方式中，用于治疗癌症的方法包括与检查点抑制剂抗体组合给予sgrm。这种抗体可以阻断检查点蛋白质的免疫抑制活性。许多此类抗体已被证明能有效治疗癌症，如针对pd-1、ctla4和pd-l1的抗体。
[0154]
抗pd-1抗体已用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌、结直肠癌、头颈癌、三阴性乳腺癌、白血病、淋巴瘤和肾细胞癌。示例性抗pd-1抗体包括兰博利珠单抗(mk-3475,merck)，尼莫单抗(bms-936558,bristol-myers squibb)，amp-224(merck)，和匹利珠单抗(ct-011,curetech ltd.)。
[0155]
抗pd-l1抗体已用于治疗非小细胞肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌和血液系统恶性肿瘤。示例性的抗pd-l1抗体包括mdx-1105(medarex)，medi4736(medimmune)，mpdl3280a(genentech)和bms-935559(bristol-myers squibb)。
[0156]
抗ctla4抗体已用于治疗黑色素瘤、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌的临床试验。抗ctl4a的显著特征是抗肿瘤作用的动力学，其生理反应所需的初始治疗后的滞后期最长达6个月。在一些情况中，肿瘤尺寸实际上在治疗起始后、观察到减少之前，会增加(pardoll，2012，nature reviews cancer 12:252-264)。示例性的抗-ctla4 cia包括伊匹单抗(bristol-myers squibb)和特姆单抗(pfizer)。
[0157]
针对其他检查点蛋白(如lag3、b7-h3、b7-h4和tim3)的cia也可与本文公开的sgrm组合用于治疗癌症。
[0158]
本公开中使用的cia可以是不同cia的组合，特别是若目标检查点蛋白质(如pd-1和ctla4)通过不同的信号通路抑制免疫反应。因此，针对任一检查点蛋白质的cia组合或针对两种检查点蛋白质的单个cia可以提供增强的免疫反应。生成cia
[0159]
可以使用本领域熟知的方法开发cia。例如，参见kohler和milstein，nature 256：495(1975)，以及coligan等人编，current protocols in immunology，第1卷，第2.5.1-2.6.7页(john wiley&sons 1991)。单克隆抗体可以通过以下方法获得：给小鼠注射包含抗原的组合物(如检查点蛋白质或其表位)，去脾获得b-淋巴细胞，将b-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生抗原抗体的阳性克隆，培养产生抗体的克隆抗原，并从杂交瘤培养物中分离抗体。
[0160]
可以通过各种成熟的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化产生的单克隆抗体。这种分离技术包括使用蛋白-a sepharose的亲和层析、尺寸排阻层析和离子交换层析。例如，参见coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。另见baines等人，“免疫球蛋白g(igg)的纯化”，methods in molecular biology，第10卷，第79-104页(the humana press,inc.1992)。在最初产生针对检查点蛋白质的抗体后，可以对抗体进行测序，随后通过重组技术进行制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技术人员熟知的。例如，参见leung等人，hybridoma 13:469(1994)；us20140099254a1。
[0161]
可以使用转基因小鼠生产人类抗体，这些转基因小鼠经过基因工程改造，可以使用检查点蛋白质产生特异性人类抗体，以应对抗原性挑战。参见green等人，nature genet，7:13(1994)、lonberg等人，nature 368:856(1994)。针对检查点蛋白质的人抗体也可以通过遗传或染色体转染方法、噬菌体展示技术或通过体外活化的b细胞构建。参见例如mccafferty等人，1990，nature 348：552-553；美国专利第5,567,610和5,229,275号。修饰cia
[0162]
cia也可以通过引入相对于现有cia的保守性修饰来产生。例如，修饰的cia可以包含重链和轻链可变区、和/或与上面产生的抗体的对应物同源的fc区。可用于本文公开的方法的修饰的cia必须保留能够阻断检查点信号通路的所需功能特性。
[0163]
cia也可以通过改变蛋白质修饰位点来产生。例如，可以改变抗体的糖基化位点以
产生缺乏糖基化的抗体，如此修饰的cia通常具有增加的抗体对抗原的亲和力。抗体也可以通过在一个或多个peg基团与抗体连接的条件下与聚乙二醇(peg)反应来进行聚乙二醇化。聚乙二醇化可以增加抗体的生物半衰期。具有此类修饰的抗体也可与本文公开的选择性gr调节剂组合使用，只要其保留阻断检查点通路的所需功能特性即可。ii.小分子、非蛋白质检查点抑制剂化合物(“cic”)
[0164]
在另一个实施方式中，用于治疗癌症的方法，例如检查点抑制剂敏感型癌症，使用与cic组合的sgrm。cic是一种小分子非蛋白质化合物，可拮抗检查点蛋白质的免疫抑制功能。许多cic是本领域已知的，例如pct公开号wo2015034820、wo20130144704和wo2011082400中公开的cic。
[0165]
cic也可以使用本领域已知并公开于例如欧洲专利申请ep2360254中的组合库方法中的众多方法中的任一种来鉴定。组合文库包括：生物库(biological libraries)；空间可寻址平行固相或溶液相库(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries)；需要反卷积的合成库方法(synthetic library methods requiring deconvolution)；“一珠一化合物”库法(the'one-bead one-compound'library method)和使用亲和层析选择的合成库方法(synthetic library methods using affinity chromatography selection)。生物库方法仅限于肽库，而其他四种方法适用于肽、非肽寡聚体或化合物的小分子库(lam,k.s.(1997)anticancer drug des.12:145)。iii.评估候选检查点抑制剂的功能特性
[0166]
许多公知的测定法可用于评估候选物(即，通过用包含检查点蛋白、检查点蛋白表位或来自组合文库的测试化合物的抗原免疫动物而产生的抗体)是否为检查点抑制剂，如上文所公开的。非限制性示例分析包括结合分析——如酶联免疫吸附分析(elisa)、放射免疫分析(ria)——荧光活化细胞分选(facs)分析、基于细胞的分析和体内分析。结合试验
[0167]
在一个实施方式中，试验是直接结合试验。检查点蛋白可以与放射性同位素或酶标记物偶联，使得可以通过检测复合物中标记的检查点蛋白来确定检查点蛋白和候选物的结合。例如，可以直接或间接地用
125
i、
35
s、
14
c或3h标记检查点蛋白，并通过直接计数放射性发射或闪烁计数检测放射性同位素。可以例如通过测量直接结合来确定候选物结合其同源检查点蛋白的能力。或者，检查点蛋白分子可以用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶进行酶标记，并且通过将合适的底物转化为产物来确定候选物与目标检查点蛋白的结合。
[0168]
酶联免疫吸附试验(elisa)通常用于评估cia候选物与其目标检查点蛋白的结合特异性。在典型的试验中，通过在37℃下用5μg/ml检查点蛋白涂覆过夜来用检查点蛋白包被微量滴定板。将包含候选cia的血清样品在pbs、5％血清、0.5％吐温-20中稀释，并在室温下在孔中孵育1小时，然后在相同稀释物中加入抗-人igg fc和igg f(ab’)-辣根过氧化物酶。在室温下1小时后，通过添加abts底物(sigma，st.louis mo.)评估酶活性，并在415-490nm下30分钟后读取。
[0169]
候选物的结合动力学(例如，结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定来评估，例如通过biacore分析(biacoreab，uppsala，瑞典)。在一个示例性试验中，使用biacore提供的标准胺偶联化学和试剂盒，通过伯胺将纯化的重组人检查点蛋白共价连接到cm5芯
片(羧甲基葡聚糖涂覆的芯片)。通过在浓度为267nm、流速为50μl/分钟的hbs ep缓冲液(由biacore ab提供)中流动候选物来测量结合。跟踪检查点蛋白-候选物结合动力学3分钟，跟踪解离动力学7分钟。使用bia评估软件(biacore ab)将缔合和解离曲线拟合到1:1langmuir结合模型。为了最小化结合常数估计中亲和力的影响，仅使用对应于缔合和解离阶段的初始数据段进行拟合。可以测量相互作用的kd、k
on
和k
off
值。优选的检查点抑制剂可以以1
×
10-7
或更低的kd与其目标检查点蛋白结合。
[0170]
对于通过与配体结合来阻断免疫反应的检查点蛋白，可以使用附加的结合试验来测试候选物阻断配体与检查点蛋白结合的能力。在一个示例性试验中，流式细胞术用于测试配体(例如pd-l1)与转染的cho细胞上表达的检查点蛋白(例如，pd-1)结合的阻断。将各种浓度的候选物添加到表达检查点蛋白的细胞悬液中，并在4℃下孵育30分钟。洗去未结合的抑制剂，将fitc标记的配体蛋白加入试管中，并在4℃下孵育30分钟。使用facscan流式细胞仪(becton dickinson，加利福尼亚州圣何塞)进行facs分析。细胞染色的平均荧光强度(mfi)指示与检查点蛋白结合的配体的量。添加了候选物的样品中降低的mfi表明候选物在阻断配体与目标检查点蛋白的结合方面是有效的。
[0171]
均相时间分辨荧光(htrf)结合试验，如pct出版物wo2015034820中所述，也可用于测定候选物阻断检查点蛋白-配体相互作用的能力。在一个实施方式中，如通过pd-1/pd-l1均相时间分辨荧光(htrf)结合试验所测量的，该方法中使用的cic可以10pm或更小，例如从0.01到10pm，优选1pm或更低，例如0.01到1pm的ic
50
值抑制pd-1/pd-l1相互作用。基于细胞的试验
[0172]
在另一个实施方式中，评估候选物是否是检查点抑制剂的试验是基于细胞的试验。混合淋巴细胞反应(mlr)测定，如美国专利8,008,449号所述，常规用于测量t细胞增殖、il-2和/或ifn-γ的产生。在一个示例性试验中，使用人cd4
+
t细胞富集柱(r&dsystems)从pbmc纯化人t细胞。将候选物以不同浓度添加到多个t细胞培养物中。将细胞在37℃下培养5天，从每个培养物中提取100μl培养基用于细胞因子测定。使用opteia elisa试剂盒(bd biosciences)测量ifn-γ和其他细胞因子的水平。用3h-胸苷标记细胞，再培养18小时，并分析细胞增殖。结果表明，与对照相比，含有候选物的培养物显示出增加的t细胞增殖、增加的il-2和/或ifn-γ的产生，表明候选物在阻断检查点蛋白对t细胞免疫反应的抑制方面是有效的。体内试验
[0173]
在另一个实施方式中，用于评估候选物是否是检查点抑制剂的试验是体内试验。在一个示例性试验中，将6-8周龄的雌性aj小鼠(harlan laboratories)按体重随机分为6组。第0天，将溶解在200μl dmem培养基中的2x10
6 sa1/n纤维肉瘤细胞植入小鼠右侧皮下。用pbs载剂或候选物以预定剂量治疗小鼠。在第1天、第4天、第8天和第11天，通过腹腔注射约200μl含有候选物或载剂的pbs对动物给药。每周监测小鼠两次肿瘤生长，持续约6周。使用电子卡尺对肿瘤进行三维测量(高度
×
宽度
×
长度)，并计算肿瘤体积。当肿瘤达到肿瘤终点(1500mm3)或小鼠体重减轻超过15％时，对小鼠实施安乐死。结果表明，与对照组相比，候选物治疗组的肿瘤生长较慢，或达到肿瘤终点体积(1500mm3)的平均时间较长，表明候选物具有抑制肿瘤生长的活性。组合疗法
[0174]
本文公开的方法涉及向患有肿瘤负荷，在一些情况下是由于存在检查点抑制剂敏感型癌症的对象给予sgrm和检查点抑制剂两者的联合治疗。在一些实施方式中，本文公开的方法涉及向患有传统上不被认为是检查点抑制剂敏感型癌症的肿瘤类型，但其可被诱导对grm或sgrm给予的检查点抑制剂变敏感的肿瘤负荷的对象给予sgrm和检查点抑制剂两者的联合治疗。在一些实施方式中，联合治疗涉及在整个或部分疗程中以任何顺序依序给予检查点抑制剂和sgrm。
[0175]
在一些情况下，sgrm和检查点抑制剂按照相同或不同的给药方案给药。例如，grm或sgrm可单独给予一天、或两天、或三天、或一周或其他导入期，然后检查点抑制剂可在此类初始grm或sgrm导入期之后给予。在一些情况下，sgrm按照预定方案给药，而检查点抑制剂间歇给药。在一些情况下，检查点抑制剂按照预定方案给药，而sgrm间歇给药。在一些情况下，sgrm和检查点抑制剂均间歇给药。在一些实施方式中，每天给予sgrm，且每周、每两周、每三周一次、每四周一次或以其他间隔给予检查点抑制剂。在一些实施方式中，sgrm在一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天或其他天数的导入期内每天给予，而检查点抑制剂(例如检查点抑制剂)每周、每两周、每三周一次、每四周一次或以其他间隔给予。在检查点抑制剂间歇给药期间，grm或sgrm的给药可以每天或其他定期基础上继续。
[0176]
在一些情况下，sgrm和检查点抑制剂在从约一天到约一周、从约两周到约四周、从约一个月到约两个月、从约二个月到大约四个月、约四个月到六个月、大约六个月到八个月、到约八个月到一年、从约1年到约2年的时间段内，或约2年至约4年或更长的时间段内连续依次或同时给予每月一次或两次，每月三次，每隔一周，每周一次，每周两次，每周三次，每周四次，每周五次，每周六次，每隔一天，每天，每天两次，每天三次或更频繁。
[0177]
在一些实施方式中，联合治疗包括共同给予sgrm和检查点抑制剂。在一些实施方式中，检查点抑制剂和sgrm的联合给药涉及同时或近似同时(例如，在彼此相隔约1、5、10、15、20或30分钟内)给予两种药剂。持续时间
[0178]
用sgrm和检查点抑制剂治疗以减少肿瘤负荷的持续时间可根据对象的病情严重程度和对象对联合治疗的反应而变化。在一些实施方式中，sgrm和/或检查点抑制剂的给药时程可以是约1周至104周(2年)，更典型为约6周至80周，最典型为约9周至60周。给药的合适时程还包括5-9周、5-16周、9-16周、16-24周、16-32周、24-32周、24-48周、32-48周、32-52周、48-52周、48-64周、52-64周、52-72周、64-72周、64-80周、72-80周、72-88周、80-88周、80-96周、88-96周、和96-104周。给药的合适时程还包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、25、30、32、35、40、45、48、50、52、55、60、64、65、68、70、72、75、80、85、88、90、95、96、100、和104周。通常，应继续给予sgrm和/或检查点抑制剂，直到观察到期望的临床显著减少或改善。根据本发明的sgrm和检查点抑制剂的治疗可以持续长达两年或甚至更长。在一些实施方式中，sgrm给药的持续时间与检查点抑制剂的持续时间相同。在一些实施方式中，sgrm给药的持续时间比检查点抑制剂的持续时间短或长。
[0179]
在一些实施方式中，sgrm或检查点抑制剂给药不是持续的，可以中止一个或多个时程，然后恢复给药一个或多个时程。其中给药中止的合适时程包括5-9周、5-16周、9-16周、16-24周、16-32周、24-32周、24-48周、32-48周、32-52周、48-52周、48-64周、52-64周、52-72周、64-72周、64-80周、72-80周、72-88周、80-88周、80-96周、88-96周、和96-100周。其
中给药中止的合适时程还包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、25、30、32、35、40、45、48、50、52、55、60、64、65、68、70、72、75、80、85、88、90、95、96、和100周。评估减少肿瘤负荷中的改善
[0180]
本文公开的联合治疗可减少肿瘤负荷。用于测量这些响应的方法是癌症治疗领域技术人员所熟知的，例如，描述于实体肿瘤响应评价标准(“recist”)指南，可获自http://ctep.cancer.gov/protocoldevelopment/docs/recist_guideline.pdf。
[0181]
在一个方式中，肿瘤负荷通过检测肿瘤特异性遗传标志物的表达来测量。这种方法特别适用于转移性肿瘤或不易测量的肿瘤，例如骨髓癌。肿瘤特异性遗传标志物是癌细胞特有的或相较于非癌细胞在癌细胞中丰度高得多的蛋白质或其它分子。例如，见wo2006/104474。肿瘤特异性遗传标志物的非限制性实例包括肝癌的甲胎蛋白(afp)、多发性骨髓瘤的β-2-微球蛋白(b2m)；绒毛膜癌和生殖细胞肿瘤的β-人绒毛膜促性腺激素(β-hcg)；胰腺癌、胆囊癌、胆管癌和胃癌的ca19-9；卵巢癌的ca-125和he4；结直肠癌的癌胚抗原(cea)；神经内分泌肿瘤的嗜铬粒蛋白a(cga)；膀胱癌的纤维蛋白/纤维蛋白原；前列腺癌的前列腺特异性抗原(psa)；甲状腺癌的甲状腺球蛋白。见http://www.cancer.gov/about-cancer/diagnosis-staging/diagnosis/tumor-markers-fact-sheet。
[0182]
测量肿瘤特异性遗传标志物的表达水平的方法是为人熟知的。在一些实施方式中，从血液样品或肿瘤组织中分离遗传标志物的mrna，并进行实时逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)以定量遗传标志物表达。在一些实施方式中，进行western印迹或免疫组化分析来评价肿瘤特异性遗传标志物的蛋白质表达。通常检测随本发明组合治疗的时间推移采样的多个样品中的肿瘤特异性遗传标志物的水平，而水平的下降与肿瘤负荷的减小相关联。
[0183]
在另一方式中，由本文公开的联合治疗所致的肿瘤负荷的减小由肿瘤尺寸的减小或身体中癌量的减少显示。对于肿瘤尺寸的测量通常由基于成像的技术实现。例如，计算机断层(ct)扫描可以通过识别现有病灶的生长或新病灶或肿瘤转移的发展，提供关于肿瘤缩小或生长以及疾病进展的准确和可靠的解剖学信息。
[0184]
在又一方法中，肿瘤负荷的减小可通过功能和代谢成像技术来评估。这些技术可以通过观察灌注、氧合和代谢的变化来提供对治疗响应的早期评估。例如，
18
f-fdg pet利用带放射性标记的葡萄糖类似物分子来评估组织代谢。肿瘤通常具有升高的葡萄糖摄取，对应于肿瘤组织代谢减少的值的变化表明肿瘤负荷减少。类似成像技术公开于kang等，korean j.radiol.(2012)13(4)371-390。
[0185]
接受本文公开的联合治疗的患者可显示不同程度的肿瘤负荷减小。在一些情况中，患者可显示完全反应(cr)，也称作“无疾病迹象(ned)”。cr表示通过测试、体检和扫描指示，所有可检测的肿瘤均已消失。在一些情况中，接受本文公开的组合治疗的患者可能经历部分反应(pr)，其大致对应于至少50％的总肿瘤体积减少，但仍存在一些残留疾病的迹象。在一些情形中，深度部分反应中的残留疾病可能实际上是死亡的肿瘤或疤痕，从而被分类为具有pr的少数患者可能实际上具有cr。同样地，在治疗过程中显示缩小的许多患者在持续治疗后显示进一步缩小，并且可达到cr。在一些情况中，接受组合治疗的患者可能经历较小反应(mr)，这大致意味着小量的缩小，也即，多于25％但少于50％的总肿瘤体积(那将达到pr)。在一些情况中，接受组合治疗的患者可能显示病情稳定(sd)，这意味着肿瘤大致保持相同尺寸，但可包括小量生长(通常少于20或25％)或小量缩小(少于pr的任何情况，除非
打破较小反应。若如此，则sd定义为一般低于25％)。
[0186]
由联合治疗所致的所需益处或所需临床结果还可包括，例如，癌细胞向外周器官的浸润减少(即，减缓至一定程度和/或终止)；肿瘤转移的抑制(即，减缓至一定程度和/或终止)；响应率(rr)的增加；响应持续时间的增加；与癌症相关联的一种或多种症状减轻至一定程度；治疗疾病所需的其它药物剂量的减少；疾病进展的延迟；和/或患者存活的延长；和/或生活质量的提高。用于评价这些作用的方法是为人熟知的和/或公开于，例如，http://cancerguide.org/endpoints.html和recist指南，同上。药物组合物和给药
[0187]
grm和sgrm(如本文所用，grm和sgrm包括非甾体类grm和非甾体类sgrm)，可以以各种口服、胃肠外和局部剂型制备并给药。口服制剂包括适于患者摄取的片剂、丸剂、粉末剂、糖衣丸、胶囊、液体、锭剂、凝胶剂、糖浆、浆料、混悬剂等。grm和sgrm也可通过注射给予，即静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内给予。同样，grm和sgrm可通过吸入(例如鼻内吸入)的方式给予。此外，grm和sgrm可以透皮给药。因此，本发明还提供包含药学上可接受的运载体或赋形剂和grm或sgrm的药物组合物。
[0188]
对于从grm和sgrm制备药物组合物而言，药学上可接受的运载体可以是固体或液体。固体形式制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂。固体运载体可以是一种或多种物质，其也可起到稀释剂、调味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料的作用。关于制剂和给药技术的细节在科学和专利文献中有广泛地描述，参见例如最新版本的《雷明顿药物科学》(remington's pharmaceutical sciences)，宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司(mack publishing co)(“雷明顿”)。
[0189]
在粉末剂中，运载体是细碎的固体，其与细碎的活性组分grm或sgrm混合。在片剂中，活性组分与具有所需粘合性质的运载体以合适比例混合并压制为所需的形状和大小。
[0190]
所述粉末和片剂优选地包含5％或10％至70％的活性化合物。合适的运载体为碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄耆胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可油等。术语“制剂”旨在包括活性化合物伴有作为运载体的包封材料的制剂，所述运载体提供胶囊，其中，伴有或不伴有其它运载体的活性组分被载体包围，由此与其相联。类似地，包括扁囊剂和锭剂。片剂、粉末剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可用作适合于口服给药的固体剂型。
[0191]
合适的固体赋形剂是碳水化合物或蛋白质填料，包括但不限于：糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或脱水山梨糖醇；来自玉米、小麦、稻、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；树胶，包括阿拉伯胶和黄蓍胶；以及蛋白质，例如明胶和胶原。必要时，可添加崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸，或其盐，例如海藻酸钠。
[0192]
糖衣剂芯体具有合适的包衣剂，如浓缩糖溶液，其中还可包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。片剂或糖衣剂包衣中可加有染料或颜料，用于产品标示或表征活性化合物的量(即剂量)。本发明的药物制剂还可采用如下形式口服：例如明胶制成的推入式(push-fit)胶囊，以及明胶和包衣剂(如甘油或山梨糖醇)制成的密封软胶囊。推入式胶囊可含有与填充剂或粘合剂(如乳糖或淀粉)、润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂混合的gr调节
剂。软胶囊中，所述gr调节剂化合物可溶解或悬浮于合适的液体中，例如含有或不含稳定剂的脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。
[0193]
液体形式制剂包括溶液、悬浮液和乳液，例如水或水/丙二醇溶液。对于胃肠外注射，可将液体制剂在水性聚乙二醇溶液中配制成溶液。
[0194]
适于口服使用的水溶液可通过将活性组分溶解于水中并如需要添加合适的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂来制备。适用于口服使用的水性悬浮液可通过将细碎活性组分分散在含有粘性物质的水中来制备，所述粘性物质例如，天然或合成的树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂，例如天然磷脂(例如卵磷脂)、环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如，十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadecaethylene oxycetanol))、环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇所成偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)。所述水性悬浮液还可含有一种或多种防腐剂(如对羟基苯甲酸乙酯或者对羟基苯甲酸正丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂(如蔗糖、阿斯巴甜或糖精)。制剂可经渗透压调节。
[0195]
还包括用于临用前转变为口服液体形式制剂的固体形式制剂。这种液体形式包括溶液、悬浮液和乳液。除活性组分外，制剂还可包含着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人工和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
[0196]
可通过将sgrm悬浮在植物油(如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(如液体石蜡)或其混合物中来配制油性悬浮剂。所述油性混悬剂可含有增稠剂，如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂以提供适口的口服制剂，例如甘油、山梨醇或蔗糖。可通过加入抗氧化剂如抗坏血酸保存这些制剂。作为可注射油性载体的例子，参见minto,j.pharmacol.exp.ther.281:93-102,1997。本发明的药物制剂也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是如上所述的植物油或矿物油或者它们的混合物。合适的乳化剂包括：天然树胶，例如阿拉伯树胶和黄蓍胶，天然磷脂，例如大豆卵磷脂，脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨醇单油酸酯，以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。乳剂还可包含甜味剂和调味剂，如糖浆剂和酏剂的情形。这类制剂还可含有缓和剂(demulcent)、防腐剂或着色剂。
[0197]
grm和sgrm可以通过局部途径透皮递送，配制成涂抹棒、溶液剂、混悬剂、乳剂、凝胶剂、乳膏剂、软膏剂、糊剂、胶冻剂、涂布剂、粉末剂和气雾剂。
[0198]
grm和sgrm还可以微球的形式递送，用于在体内缓释。例如，微球可以通过皮内注射含有药物的微球进行给药，其在皮下缓慢释放(参见rao,j.biomater.sci.polym.ed.7:623-645,(1995)；作为可生物降解和可注射的凝胶制剂(参见例如gao,pharm.res.12:857-863,(1995))；或者作为用于口服给药的微球(例如参见eyles,j.pharm.pharmacol.49:669-674,(1997))。透皮和皮内途径均提供几周或几个月的稳定持续递送。
[0199]
本发明的药物制剂可以盐形式提供并能用许多酸，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸，琥珀酸等形成。盐倾向于更易溶于相应游离碱形式的水性或其它质子溶剂中。在其他情况下，所述制剂可以是在ph4.5到5.5范围内的1mm-50mm组氨酸，0.1％-2％蔗糖，2％-7％甘露醇中的冻干粉末，在使用前与缓冲液结合。
[0200]
在另一个实施方式中，本发明的制剂可通过使用与细胞膜融合或内吞的脂质体递
送，即通过使用连接至脂质体(或直接连接至寡核苷酸)的配体，其结合细胞的表面膜蛋白受体导致胞吞作用。通过使用脂质体，尤其是在脂质体表面携带有对靶细胞特异性的配体，或者否则优先定向到特定器官的情况下，可以在体内将gr调节剂的递送集中到靶细胞中。(参见例如，al-muhammed,j.microencapsul.13:293-306,1996；chonn,curr.opin.biotechnol.6:698-708,1995；ostro,am.j.hosp.pharm.46:1576-1587,1989)。
[0201]
所述药物制剂优选是单位剂型形式。以这种形式将所述制剂细分成含有适量活性组分grm或sgrm的单位剂量。所述单位剂型可以是套装制剂，套装包含分散的定量制剂，如小瓶或安瓿瓶中的分装好的片剂、胶囊剂和粉末剂。另外，所述单位剂型本身可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭，或是适量的这些剂型的套装形式。
[0202]
单位剂量制剂中的活性组分的量可不同，或在如下范围内调节：0.1mg-10000mg，更典型地，1.0mg-6000mg，最典型地，50mg-500mg。根据具体应用和活性组分的功效，合适的剂量还包括约1mg、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、或2000mg。必要时，所述组合物还可包含其它相容的治疗剂。
[0203]
所述药物制剂优选是单位剂型形式。以这种形式将所述制剂细分成含有适量本发明的化合物和组合物的单位剂量。所述单位剂型可以是套装制剂，套装包含分散的定量制剂，如小瓶或安瓿瓶中的分装好的片剂、胶囊剂和粉末剂。另外，所述单位剂型本身可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭，或是适量的这些剂型的套装形式。
[0204]
grm可经口给予。例如，grm可以作为如本文所述的丸剂、胶囊剂或液体制剂给予。或者，可以通过胃肠外给药提供grm。例如，grm可以静脉内给予(如通过注射或输注)。本文描述的化合物及其药物组合物或其制剂的其他给予方法在本文中进行了描述。
[0205]
在一些实施方式中，grm以一剂给药。在其他实施方式中，grm以多于一剂给予，如2剂、3剂、4剂、5剂、6剂、7剂或更多剂。在某些情况下，剂量是等量的。在其他情况下，剂量是不等量的。剂量可以在给药期间增加或逐渐减少。该量将根据例如grm特性和患者特征而变化。
[0206]
任何合适的grm剂量可以用于本文公开的方法中。给予的grm的剂量可以是至少约300毫克(mg)/天，或约600mg/天，如约600mg/天、约700mg/天、约800mg/天、约900mg/天、约1000mg/天、约1100mg/天、约1200mg/天或更多。例如，在gra是米非司酮的情况下，grm剂量可以是例如300mg/天、600mg/天、900mg/天或1200mg/天的米非司酮。在实施方式中，经口给予grm.在一些实施方式中，grm以至少一剂给药。换而言之，grm可以每天1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多剂给药。在实施方式中，grm以每天1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多剂口服给药。
[0207]
可以在例如2-48小时期间以一剂或多剂向患者给药至少一剂grm。在一些实施方式中，grm以一剂给药。在其他实施方式中，grm以多于一剂给药，如2剂、3剂、4剂、5剂或更多剂，在2-48小时期间，如2小时期间、3小时期间、4小时期间、5小时期间、6小时期间，7小时期间、8小时期间、9小时期间、10小时期间、11小时期间、12小时期间、14小时期间、16小时期间、18小时期间、20小时期间，22小时期间、24小时期间、26小时期间、28小时期间、30小时期间、32小时期间、34小时期间、36小时期间、38小时期间、40小时期间、42小时期间、44小时期间、46小时期间或48小时期间。在一些实施方式中，grm在2-48小时、2-36小时、2-24小时、2-12小时、2-8小时、8-12小时、8-24小时、8-36小时、8-48小时、9-36小时、9-24小时、9-20小
时、9-12小时、12-48小时、12-36小时、12-24小时、18-48小时、18-36小时、18-24小时、24-36小时、24-48小时、36-48小时或42-48小时给予。
[0208]
可根据患者所需并耐受的剂量和频率进行单次或多次制剂给药。所述制剂应提供足量的活性剂以有效治疗疾病状态。因此，在一个实施方式中，用于口服给予grm的药物制剂的日剂量是每天每千克体重约0.01mg至约150mg之间。在一些实施方式中，日剂量为约1.0-100mg/kg/天、5-50mg/kg/天、10-30mg/kg/天和10-20mg/kg/天。可以使用更低的剂量，特别是当药物给予与口服给药相比在解剖学上隐蔽的部位，如脑脊髓液(csf)空腔，进入血液，进入体腔或器官内腔。明显较高的剂量可用于局部给药。用于制备可胃肠外给予的制剂的实际方法对本领域技术人员是已知的或显而易见的，并在出版物中有更详细的描述，如雷明顿，同上。还参见nieman，“受体介导的抗类固醇作用(receptor mediated antisteroid action)”agarwal等编，de gruyter，纽约(1987)。
[0209]
用grm或sgrm治疗的持续时间可根据对象疾病严重程度和对象对grm或sgrm的反应而变化。在一些实施方式中，grm和sgrm的给药时程可以是约1周至104周(2年)，更典型为约6周至80周，最典型为约9周至60周。给药的合适时程还包括5-9周、5-16周、9-16周、16-24周、16-32周、24-32周、24-48周、32-48周、32-52周、48-52周、48-64周、52-64周、52-72周、64-72周、64-80周、72-80周、72-88周、80-88周、80-96周、88-96周、和96-104周。给药的合适时程还包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、25、30、32、35、40、45、48、50、52、55、60、64、65、68、70、72、75、80、85、88、90、95、96、100、和104周。通常grm或sgrm的给药应当持续直到观察到临床上显著的减少或改善。根据本发明使用grm或sgrm治疗可以持续两年之久或更长。
[0210]
在一些实施方式中，grm或sgrm给药不是持续的，可以中止一个或多个时程，然后恢复给药一个或多个时程。其中给药中止的合适时程包括5-9周、5-16周、9-16周、16-24周、16-32周、24-32周、24-48周、32-48周、32-52周、48-52周、48-64周、52-64周、52-72周、64-72周、64-80周、72-80周、72-88周、80-88周、80-96周、88-96周、和96-100周。其中给药中止的合适时程还包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、25、30、32、35、40、45、48、50、52、55、60、64、65、68、70、72、75、80、85、88、90、95、96、和100周。
[0211]
所述剂量方案还考虑了本领域众所周知的药代动力学参数，即吸收率，生物利用度，代谢，清除率等(参见，例如，hidalgo-aragones(1996)j.steroid biochem.mol.biol.58:611-617；groning(1996)pharmazie 51:337-341；fotherby(1996)contraception 54:59-69；johnson(1995)j.pharm.sci.84:1144-1146；rohatagi(1995)pharmazie 50:610-613；brophy(1983)eur.j.clin.pharmacol.24:103-108；最新的雷明顿，同上)。现有技术允许临床医生确定每个患者，gr调节剂和治疗的疾病或病症的剂量方案。
[0212]
sgrm可与已知的可用于调节糖皮质激素受体的其它活性剂结合使用，或与单独可能无效但可有助于活性剂功效的辅助剂结合使用。
[0213]
在一些实施方式中，共同给药包括在一种活性剂grm或sgrm的0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20或24小时内给予第二活性剂。共同给药包括同时、大约同时(例如在彼此的约1、5、10、15、20或30分钟内)或以任意顺序依次给予两种活性剂。在一些实施方式中，共同给药可通过共同配制完成，即制备包含两种活性剂的单一药物组合物。在其它实施方式中，所述活
性剂可分开配制。在另一个实施方式中，所述活性剂和/或辅助剂可彼此连接或偶联。
[0214]
在可接受的运载体中制备含有本发明的gr调节剂的药物组合物后，可将其放置于合适的容器中，并贴上用于治疗所示病症的标签。对于grm或sgrm的给药，这种标签应包括，例如，给药的量、频率和方法的相关说明。
[0215]
本发明所述的药物组合物可以盐形式提供，并能用许多酸，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等形成。盐倾向于更易溶于相应游离碱形式的水性或其它质子溶剂中。在其它情况下，所述制剂可以是在ph4.5到5.5范围内的1mm-50mm组氨酸，0.1％-2％蔗糖，2％-7％甘露醇中的冻干粉末，其在使用前与缓冲液合并。
[0216]
在另一个实施方式中，本发明所述的组合物可用于胃肠外给药，如静脉内(iv)给药或给予体腔或器官腔中。用于给药的制剂通常将包含溶解在药学上可接受的运载体中的本发明所述的组合物的溶液。可用的可接受的运载体和溶剂包括水和林格氏溶液(等渗氯化钠)。此外，通常采用无菌非挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此，可采用各种低刺激非挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，注射剂的制备中也同样可使用脂肪酸如油酸。这些溶液是无菌的并且通常不含不需要的物质。这些制剂可以通过常规公知的灭菌技术灭菌。制剂可含有模拟生理条件如ph调节剂和缓冲剂，毒性调节剂所需的药学上可接受的辅助物质，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中本发明组合物的浓度可在较大范围内调整，主要根据所选定的给药模式和患者的需要，基于流体体积、粘度、体重等来选择。对于静脉注射给药，制剂可以是无菌可注射制剂，如无菌可注射水性或油脂性悬浮液。可利用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂，按照已知方法配制混悬液。无菌可注射制剂也可以是无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂如1,3-丁二醇的溶液配制的无菌可注射溶液或悬浮液。联合治疗
[0217]
可采用grm或sgrm与化疗剂、检查点抑制剂或其他治疗(例如癌症治疗)的各种组合，或此类药物和化合物的组合来治疗患者。对于“组合疗法”或“组合使用”，并不意味着必须同时给予治疗剂和/或配制用于一起递送，尽管这些递送方法在本文所述的范围内。所述grm或sgrm和化疗剂或其它药物可以按照相同或不同的剂量方案给药。在一些实施方式中，可在整个或部分疗程中以任何顺序依序给予所述grm或sgrm和化疗剂和其它药物。在一些实施方式中，grm或sgrm和化疗剂或其它药物同时或大约同时给药(例如，在彼此的约1、5、10、15、20或30分钟内)。组合疗法的非限制性示例如下，以grm或sgrm和化疗剂的给药为例，grm或sgrm为“a”，化疗剂或其它药物，作为治疗方案一部分，为"b"：
[0218]
a/b/ab/a/bb/b/aa/a/ba/b/bb/a/aa/b/b/b b/a/b/b
[0219]
b/b/b/a
ꢀꢀꢀꢀꢀ
b/b/a/b a/a/b/b
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a/b/a/b
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a/b/b/a
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b/b/a/a
[0220]
b/a/b/a
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b/a/a/b a/a/a/b
ꢀꢀꢀꢀꢀ
b/a/a/a
ꢀꢀꢀꢀ
a/b/a/aa/a/b/a
[0221]
aaa(b/a aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa)n(其中“n”表示括号中的循环可由医师自行决定重复)。
[0222]
将该实施方式的治疗化合物或药剂给予患者需要遵循给予该化合物的一般方案，(必要时)考虑疗法的毒性。外科干预也可以与所述疗法组合应用。
[0223]
本方法可以与其他治疗方式相结合，例如手术、放疗、靶向治疗、免疫治疗、使用生长因子抑制剂或抗血管生成因子。
[0224]
本说明书引用的所有专利、专利发表物、发表物和专利申请通过引用全部纳入本文，就好像各发表物或专利申请特定和单独地通过引用纳入本文那样。
[0225]
虽然出于阐明目的已经通过说明和举例的方式详细描述了本发明，但本领域普通技术人员根据本发明的教导不难了解，可以在不背离所附权利要求书的构思或范围的情况下作出某些改变和修改。实施例
[0226]
以下提供的实施例仅是用于说明，而非限制。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改各种非关键参数以产生基本相似的结果。实施例1.hepg2酪氨酸氨基转移酶(tat)试验
[0227]
以下实验方案描述了用于测量hepg2细胞(一种人肝细胞癌细胞系；ecacc，英国)中地塞米松对tat诱导的试验。在37℃、5％/95％(v/v)co2/空气下使用补充了10％(v/v)胎牛血清、2mm l-谷氨酰胺和1％(v/v)neaa的meme培养基培养hepg2细胞。然后对hepg2细胞进行计数并调整，使其在不含酚红的rpmi 1640、10％(v/v)活性炭剥离的fbs、2mm l-谷氨酰胺中产生0.125x 106个细胞/ml的密度，并以200μl中25,000个细胞/孔接种在96孔无菌组织培养微量滴定板中，并在37℃、5％co2下孵育24小时。
[0228]
然后，除去生长培养基并使用测试培养基{rpmi 1640，无酚红、2mm l-谷氨酰胺+10μm毛喉素}代替。然后，针对100nm地塞米松攻击对测试化合物进行筛选。随后，将化合物从10mm储液中连续半对数稀释至100％(v/v)二甲亚砜中。然后，生成8-点半对数稀释曲线，随后在试验培养基中1:100稀释以产生10
×
最终化合物试验浓度，这导致最终化合物试验浓度范围为0.1％(v/v)二甲亚砜中的10-0.003μm。
[0229]
在37℃、5/95(v/v)co2/空气下在微量滴定板中将测试化合物与细胞预孵育30分钟，之后加入100nm地塞米松并随后再孵育20小时以使得tat诱导最优化。
[0230]
然后，hepg2细胞采用包含蛋白酶抑制剂混合物的30μl的细胞裂解缓冲液在4℃裂解15分钟。然后，可添加155μl的底物混合物，其包含0.1m磷酸钾缓冲液(ph 7.4)中的5.4mm酪氨酸钠盐、10.8mmα酮戊二酸和0.06mm吡哆醛5’磷酸。37℃孵育2小时之后，可通过添加15μl的10m氢氧化钾水溶液终止该反应，然后使板在37℃另孵育30分钟。tat活性产物可通过λ340nm处的吸光度测量。
[0231]
可通过使用抑制百分比(针对100nm地塞米松tat刺激进行标准化)对比化合物浓度作图并将数据拟合至4参数逻辑方程来计算ic
50
值。可使用cheng和prusoff方程将ic
50
值转化为ki(平衡解离常数)，前提是拮抗剂是竞争性抑制剂(相对于地塞米松)。实施例2.瑞拉可兰刺激抗肿瘤免疫反应
[0232]
对免疫检查点抑制剂(ici)的反应与肿瘤免疫浸润和pd-l1表达相关，因此我们首先评估在可能对ici反应的相同类型肿瘤中是否观察到gr表达。在黑色素瘤和tnbc肿瘤中，cd3+t细胞浸润与gr表达相关(图1)。gr表达也与foxp3+细胞相关，foxp3+细胞是抑制细胞毒性t细胞功能的treg的标志物。国家癌症研究所癌症基因组图谱(tcga；可访问国家癌症研究院“cancer.gov”网站，“about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga”页面)的转录物数据分析表明，gr表达与免疫抑制细胞的标志物相关。观察到gr和pdl1的整体相关性(p《2x10-16
)，在肾上腺癌、膀胱癌和胰腺癌中相关性特别高。图2显示gr表达与pd-l1表达相关。使用xcell(aran，genome biology 2017)估计单个肿瘤内不
同免疫细胞类型的丰度，观察到gr和cd8+t细胞、treg和th2细胞之间的正相关。图3a显示gr表达与cd8+t细胞和调节性t细胞(treg)正相关。图3b显示gr表达与th1 t细胞负相关，与th2 t细胞正相关。认为treg限制了cd8+t细胞活化和消除肿瘤的能力。这些数据表明，t细胞浸润抑制的肿瘤中gr升高，这类肿瘤通常被认为是ici治疗的良好候选。皮质醇抑制人pbmc活化，并通过瑞拉可兰恢复活化
[0233]
为了了解gc活性对t细胞活化的分子后果，评估了皮质醇和瑞拉可兰对刺激的人pbmc的影响。400nm皮质醇是通常存在于人血清中的浓度，可有效抑制植物血凝素(pha)或αcd3+il-12刺激的几乎所有表型效应。皮质醇降低cd8+细胞上cd137(即41-bb)的表达，而瑞拉可兰挽救它。图4显示了在存在生理水平的皮质醇的情况下，通过瑞拉可兰恢复t细胞活化。cd8+细胞内cd137(即41-bb)的表达被皮质醇降低，而被瑞拉可兰挽救。在pha或αcd3+il-12刺激的其他t细胞亚群中观察到类似的趋势(图5和图6)，包括表达lag3和ctla4的cd8+和cd4+。图5显示，在植物血凝素(pha)刺激后，皮质醇抑制cd3+细胞表面受体，瑞拉可兰恢复cd3+细胞表面受体。因此，如图4所示，炎性细胞因子如tnf-α通过刺激诱导，由皮质醇抑制，并通过瑞拉可兰拯救。在刺激诱导的细胞因子和趋化因子中观察到类似的模式(图6a和图6b),包括ifnγ、il-1β、il-1α和il-6。图6a和图6b显示，在植物血凝素(pha)(图6a)或αcd3(图6b)刺激后，皮质醇抑制细胞因子和趋化因子水平，而瑞拉可兰恢复细胞因子/趋化因子水平。(由于刺激包括重组il-12，因此上清液il-12测量结果被排除在图6b所示的分析之外。)皮质醇的生理水平抑制了细胞因子和趋化因子，这种抑制被瑞拉可兰逆转。这些结果表明，在正常生理浓度下，皮质醇介导的t细胞活化具有广泛的免疫抑制作用，这些作用被瑞拉可兰逆转。瑞拉可兰在同基因小鼠模型中促进t细胞功能和αpd1反应
[0234]
在eg7同基因小鼠模型中评估了皮质醇对cd8+细胞毒性t细胞的抑制作用以及瑞拉可兰促进t细胞活化的能力。eg7肿瘤细胞表达卵清蛋白，并在wt或ot-1/rag-/-小鼠中研究了该模型。ot-1/rag-/-小鼠仅具有表达转基因卵清蛋白特异性tcr的t细胞。在ot-1/rag-/-背景中，未治疗的小鼠能够控制肿瘤生长17-20天(图7)。在eg7肿瘤模型中评估pd1拮抗剂抗体(rmp1-14)和瑞拉可兰的组合。瑞拉可兰显著提高了该模型中抗-pd1抗体的效力。由于小鼠合成的皮质醇水平与人类不相当，因此在饮用水中以100mg/l给予皮质醇，导致平均血清皮质醇浓度为447nm(数据未显示)。皮质醇给予导致肿瘤快速生长(图7)。在用皮质醇处理的小鼠中五只中有两只过早死亡，对照小鼠中五只中有0只过早死亡。所有用皮质醇治疗的小鼠在第10天都有可测量的肿瘤，而5只对照小鼠中的2只在10-20天没有可检测的肿瘤。当给ot-1/rag-/-小鼠注射皮质醇+/-瑞拉可兰时，皮质醇+瑞拉可兰治疗组中观察到7只中有2只组织学证实完全缓解，而单用皮质醇组没有一只缓解。相反，在野生型(wt)小鼠的饮用水中给予皮质醇对肿瘤控制或生长没有影响(数据未显示)。总之，这些数据表明皮质醇通过细胞毒性cd8+t细胞抑制肿瘤消除，而瑞拉可兰恢复细胞毒性cd8+t细胞功能。
[0235]
在eg7肿瘤模型中评估pd1拮抗剂抗体(rmp1-14)和瑞拉可兰的组合。大多数报告评估了未添加皮质醇的wt小鼠中αpd1对eg7细胞的影响，因此使用了该更为成熟的模型。在该模型中，瑞拉可兰或αpd1单独使用没有显著影响。瑞拉可兰和αpd1的组合抑制了肿瘤生长(图8)。到第14天，与αpd1+瑞拉可兰组10只中的2只相比，αpd1单独组中10只有8只小鼠肿瘤大于1800mm3。与单独的αpd1组相比，瑞拉可兰+αpd1组到达伦理牺牲或1800mm3的时间也
明显更好(图8)。对单个小鼠肿瘤体积轨迹的评估显示，在该侵袭性模型的第10-20天之间有显著的控制。过量的皮质醇给药逆转了瑞拉可兰的作用，并恢复了肿瘤生长，这表明瑞拉可兰作用对于皮质醇活性拮抗性是特异的。研究第11天至第21天收集的终末血清显示，tnfα水平通过添加瑞拉可兰增加，但通过添加皮质醇而受到抑制。与在分离的人外周血单核细胞(pbmc)中观察到的效果一致，在该模型中重现了瑞拉可兰促进t细胞功能和促炎细胞因子分泌的能力。在实体瘤患者的i期研究中，瑞拉可兰的全身效应表明内源性gr活性的拮抗性
[0236]
gr是免疫抑制转录程序的广泛调节因子，因此我们首先评估了强的松和/或瑞拉可兰在全血中的转录效应。在一项健康志愿者i期研究中，25毫克剂量的强的松在给药后4小时产生强转录效应。这确定了全血中强的松诱导基因的基因组。在实体瘤患者中瑞拉可兰+白蛋白结合-紫杉醇的i期研究中，强的松诱导基因大部分受到抑制。仅在受益于治疗(由sd或更好的recist最佳总体反应定义)的患者中观察到两个基因组的显著重叠。在具有疾病进展的患者中，强的松诱导的基因与瑞拉可兰+白蛋白结合紫杉醇给药后抑制的基因之间没有显著重叠。图10显示联合瑞拉可兰+白蛋白结合紫杉醇治疗抑制实体瘤患者的基因表达。抑制基因包括表达il8(cxcl8)、ido1和ep4(ptger4)(n＝46)的基因。这些患者的中性粒细胞与淋巴细胞比率(nlr)也正常化(p＝0.01)。典型gr调节基因dusp1和ptgs2(cox2)在给予瑞拉可兰+白蛋白结合紫杉醇的患者中被抑制。在用瑞拉可兰和白蛋白结合紫杉醇治疗后最受抑制的基因是cxcl8(il-8)、ido1和ptger4(ep4)。cxcl8转录物的减少导致治疗后读数低于定量极限。已知这三种基因在抑制细胞毒性t细胞反应中起作用。全血中瑞拉可兰的总体转录效应与强的松效应相反(reciprocal)，并具有预期促进产生细胞毒性t细胞反应的特征性过程。
[0237]
gr活性已被证明会改变血液的细胞组成，因此我们评估了瑞拉可兰对中性粒细胞和淋巴细胞丰度的影响。基线中性粒细胞与淋巴细胞比率预测对检查点抑制剂的反应，nlr的降低也与改善的结果相关(lalani等人，journal for immunotherapy of cancer(2018)6:5)。首先，我们确定在皮质醇水平正常的健康志愿者中，瑞拉可兰不影响nlr。在健康志愿者中，强的松导致nlr快速急剧增加。当瑞拉可兰与强的松联合给药时，这种效应被逆转。这些数据表明，在健康个体中(在压力或疾病状态预计不会升高皮质醇水平的情况下)，瑞拉可兰不会影响nlr，且其可逆转糖皮质激素对nlr的激动。在晚期实体瘤患者中，我们观察到基线nlr高于健康对象。所有患者在前8天或15天的nlr总体下降。在基线nlr升高(nlr》3)的患者中，这种降低是显著的，但在正常nlr处于基线水平(nlr≤3)的患者中没有观察到nlr的显著变化。在治疗的前15天，nlr的降低与瑞拉可兰的c
最大
相关，但与紫杉醇无关，表明其作用主要由gr拮抗作用驱动。在nlr降低的患者中，有一种更明显的临床获益趋势。这些数据表明，gr激动剂增加nlr，而gr拮抗剂降低nlr。
[0238]
在小型i期实体瘤研究中，一名患者在使用瑞拉可兰+白蛋白结合紫杉醇治疗后，根据recist 1.1实现完全反应。鉴于患者的病史和既往治疗路线，这一观察结果出乎意料。图11显示了对瑞拉可兰+白蛋白结合-紫杉醇治疗完全反应(cr)的患者中选定生物标志物的效果总结。该患者表现出中性粒细胞与淋巴细胞比率(nlr)降低，cd4+细胞、cd8+细胞、cd3+t细胞、ptgs2和dusp1表达变化以及其他变化。(c1d1表示治疗第1周期第1天；c1d15表示治疗第1周期第15天；c4d1表示治疗第4周期第1天，和eot表示治疗结束。)在该患者中，治
疗8天后，nlr从5.5(升高)降至2.5(正常)(图11左上)。这种nlr改善伴随着gr控制转录物ptgs2和dusp1的减少(图11左下)。随着疾病进展，这些转录物的丰度反弹至基线以上，停止使用瑞拉可兰治疗，最终给予地塞米松。观察到treg的减少(作为cd4+t细胞％)和cd3+(作为单核cd45+％)、cd4+(作为cd3+％)以及cd8+(作为cd3+％)的百分比)的增加(图11右上)。在该患者中，血浆ifn-γ略微升高，而il-10降低(图11右下)。这些观察结果与皮质醇活性的免疫活化和拮抗作用一致。
[0239]
基于这一观察，评估了对瑞拉可兰+白蛋白结合紫杉醇反应持续时间较长的其他患者的免疫反应。正如ici试验中常见的那样，一小组(57名可评估患者中的10名)具有持续的益处(图12)。考虑到他们的疾病状态以及在某些情况下对白蛋白结合紫杉醇治疗先前反应持续时间，这尤其令人惊讶(图12)。这些患者的循环cd3+细胞和血浆ifnγ水平升高。这伴随着循环treg、血浆il-10水平和全血中gr控制基因转录的降低(图13)。
[0240]
如图13所示，有证据表明对瑞拉可兰+白蛋白结合紫杉醇具有异常持久反应的患者具有免疫活性。这些患者在血浆/全血中表现出以下趋势：nlr降低(d(天数)8p＝0.006；d15 p＝0.02)；t
reg
数量减少(p＝0.06)；cd3+细胞数量增加(p＝0.06)；早期全血中gr控制基因表达(ptgs2)降低(p＝0.008)，在eot时反弹；ifnγ增加(p＝0.03(排除高异常值))；il-10降低(p＝0.03)。在更广泛的试验人群中没有观察到这些趋势。此外，这些显著反应者的nlr从基线下降到c1d8和c1d15(图13)。综上所述，这些观察结果表明，长期受益与对瑞拉可兰+白蛋白结合紫杉醇的免疫反应有关。结论
[0241]
瑞拉可兰是一种强大的选择性gr拮抗剂，在健康志愿者和晚期实体瘤患者中显示出系统性gr拮抗作用。gr在人类肿瘤和免疫细胞中表达丰富，高肿瘤gr水平与高免疫浸润和pdl1表达相关。生理浓度的皮质醇在体外广泛抑制人pbmc的活化，而瑞拉可兰拯救了这种抑制。在同基因小鼠模型eg7中证明了瑞拉可兰与αpd1的组合。在实体瘤患者和健康志愿者的i期研究中，瑞拉可兰的全身效应与gr激动剂效应的相反(reciprocal)一致。
[0242]
已在临床上确定了免疫检查点抑制剂(ici)反应的关键相关性。肿瘤中的免疫浸润(通常称为“热”肿瘤)和pdl1表达倾向于预测对检查点抑制剂的更好反应，gr丰度与这两者相关。这表明存在高gr、免疫浸润和pdl1表达的重叠肿瘤子集。gr拮抗作用可能重新活化这些浸润的、被抑制的免疫细胞。促炎信号如tnf-α和ifn-γ的诱导，以及免疫抑制信号如il-8、ep4和ido1的抑制，与ici反应相关。内源性皮质醇在预期降低ici反应的方向上调节这些通路，而瑞拉可兰则具有相反作用。低nlr预测对检查点抑制剂的反应，而瑞拉可兰降低基线nlr升高的癌症患者的nlr。因此，瑞拉可兰的作用可能抑制病理性内源性皮质醇活性并促进ici反应。
[0243]
据报道，癌症患者内源性皮质醇活性升高，瑞拉可兰数据证实内源性皮质醇活性可被拮抗。gr拮抗剂使nlr正常化表明，癌症患者中的nlr升高可能部分由皮质醇活性升高驱动。nlr升高不是由于给予合成gr激动剂引起的，因为该研究中禁止此类治疗。类似地，在证明使用瑞拉可兰+白蛋白结合紫杉醇有益的患者中，瑞拉可兰对gr控制基因的拮抗作用表明，治疗前存在一些内源性gr激动剂活性。由于基线合成类固醇使用与ici的不良结果相关，基线皮质醇活性升高可能是限制某些患者ici反应的原因。实施例3.实体瘤中皮质醇效应的瑞拉可兰逆转
6。rmp1-14/cort125134(10/30mg/kg)的联合治疗导致与载剂对照和rmp1-14和cort125134单药治疗相比，肿瘤中ova四聚体+作为cd8+细胞％显著增加(p≤0.05)，且与载剂对照相比，cd8+ova四聚体+作为cd3+细胞％的水平显著更高(p≤0.05)。rmp1-14和cort125134单药治疗和rmp1-14/cort12534联合治疗与载剂对照相比，脾脏中pd-1+作为cd8+细胞％显著增加(p≤0.05)。联合治疗也导致与载剂对照和rmp1-14单药治疗相比，脾脏中cd3+cd8+水平作为cd45.1+细胞％水平显著更高(p≤0.05)。这些效应，包括t细胞活化和tnfα分泌，与在分离的人pbmc中观察到的体外效应一致。
[0250]
本说明书引用的所有专利、专利发表物、发表物和专利申请通过引用全部纳入本文，就好像各发表物或专利申请特定和单独地通过引用纳入本文那样。此外，虽然出于阐明目的已经通过说明和举例的方式详细描述了本发明，但本领域普通技术人员根据本发明的教导不难了解，可以在不背离所附权利要求书的构思或范围的情况下作出某些改变和修改。