确定细胞中基因编辑效率的方法与流程

确定细胞中基因编辑效率的方法
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背景技术：

5.2a肽可用于促进共表达多个基因。2a肽在该作用中特别有利，因为相对于其他多基因共表达策略，它们可以导致高水平的下游蛋白质表达。此外，2a肽的小尺寸是有益的，因为它导致对被共表达基因功能的干扰风险低。尽管存在与使用2a肽作为多个基因或同一基因的多个变体的共表达机制相关的益处，但常规的基于2a的策略的一个缺点是无法确认共表达的基因插入靶标细胞的基因组。当将不同的基因集插入细胞阵列时，这一点尤其明显。当将新基因插入细胞基因组以2a肽在翻译过程中被切割下来的方式完成，使得从插入基因表达的一些蛋白质不再与2a肽连接时，这个问题会更复杂。实际上，有可能并且在某些情况下，将共表达基因的插入设计为包括足以从翻译的目标蛋白质中去除所有2a片段的额外切割位点是有利的。这是一种理想的方法，尽管它对确认将共表达基因插入靶细胞的能力有影响，因为它允许插入的蛋白质是“天然的”并且不包括可能导致非内源性表位的2a片段。因此，需要找到有效且可靠的筛选方法来检测基因是否成功插入靶细胞的基因组中，其利用自剪切2a肽的存在，但不依赖于仍然连接至翻译的目标蛋白质上的2a肽或其片段。


技术实现要素：

6.本公开提供了确定受试者中过继细胞疗法的存在的方法，其包括：在来自已接受过继细胞疗法的受试者的样品中检测2a肽的表达水平，其中过继细胞疗法包括表达2a肽或其片段的细胞。
7.在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测与过继细胞疗法的存在相关。在某些实施方案中，2a肽或其片段的不存在与过继细胞疗法的无效率有关。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1天至30天之间。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1个月至12个月之间。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1年至5年之间。
8.此外，本公开提供了监测已经接受过继细胞疗法的受试者中过继细胞疗法的持久性的方法，包括：在来自受试者的第一时间点的样品中检测2a肽或其片段的表达水平；以及在来自受试者的第二时间点的样品中检测2a肽或其片段的表达水平；其中过继细胞疗法包括表达2a肽的细胞，并且其中在第二时间点的样品中2a肽或其片段的检出与过继细胞疗法的持久性相关。本公开还提供了监测已经接受过继细胞疗法的受试者中过继细胞疗法的持
久性的方法，包括：在来自受试者的第一时间点的样品中检测2a肽或其片段的表达水平；以及在来自受试者的第二时间点的样品中检测2a肽或其片段的表达水平；其中过继细胞疗法包括表达2a肽的细胞，并且其中在第二时间点的样品中2a肽或其片段的不存在与过继细胞疗法的无效率相关。在某些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第二过继细胞疗法。
9.本公开提供了在已接受过继细胞疗法的受试者中监测过继细胞疗法的增殖的方法，包括：在来自受试者的第一时间点的样品中检测表达2a肽或其片段的细胞的量；和在来自受试者的第二时间点的样品中检测表达2a肽或其片段的细胞的量；其中当相对于在第一时间点的样品中表达2a肽或其片段的细胞的量，在第二时间点的样品中表达2a肽或其片段的细胞的量增加时，发生过继细胞疗法的增殖。本公开还提供了在已接受过继细胞疗法的受试者中监测过继细胞疗法的增殖的方法，包括：在来自受试者的第一时间点的样品中检测表达2a肽或其片段的细胞的量；和在来自受试者的第二时间点的样品中检测表达2a肽或其片段的细胞的量；其中当相对于在第一时间点的样品中表达2a肽或其片段的细胞的量，在第二时间点的样品中表达2a肽或其片段的细胞的量减少或相同时，不发生过继细胞疗法的增殖。在某些实施方案中，第二时间点发生在第一时间点之后的1天至30天之间。在某些实施方案中，第二时间点发生在第一时间点之后的1个月至12个月之间。在某些实施方案中，第二时间点发生在第一时间点之后的1年至5年之间。
10.在某些实施方案中，细胞是细胞产品。在某些实施方案中，细胞是neotcr产品。在某些实施方案中，样品是血液样品。在某些实施方案中，样品是肿瘤样品。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，受试者患有癌症。
11.在某些实施方案中，通过流式细胞术检测2a肽或其片段。在某些实施方案中，通过免疫组织化学(ihc)检测2a肽或其片段。在某些实施方案中，ihc是chipcytometry。
12.本公开进一步提供了用于用过继细胞疗法治疗的受试者的预后的方法，包括：在来自受试者的样品中检测2a肽或其片段的表达水平，其中过继细胞疗法包括表达2a肽或其片段的细胞，并在来自受试者的样品中确定2a肽或其片段的表达水平，其中2a肽或其片段的检出与过继细胞治疗的功效相关。本公开还提供了用于用过继细胞疗法治疗的受试者的预后的方法，包括：在来自受试者的样品中检测2a肽或其片段的表达水平，其中过继细胞疗法包括表达2a肽或其片段的细胞，并在来自受试者的样品中确定2a肽或其片段的表达水平，其中2a肽或其片段的未检出与过继细胞疗法的降低的功效相关。在某些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用第二过继细胞疗法。
13.在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1天至30天之间。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1个月至12个月之间。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1年至5年之间。
14.在某些实施方案中，细胞是细胞产品。在某些实施方案中，细胞是neotcr产品。在某些实施方案中，样品是血液样品。在某些实施方案中，样品是肿瘤样品。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，受试者患有癌症。
15.在某些实施方案中，通过流式细胞术检测2a肽或其片段。在某些实施方案中，通过ihc检测2a肽或其片段。在某些实施方案中，ihc是chipcytometry。
16.本发明还提供了在已接受过继细胞疗法的受试者中治疗癌症的方法，其中过继细
胞疗法包括表达2a肽或其片段的细胞，该方法包括：在来自受试者的样品中检测2a肽或其片段的表达水平，其中2a肽或其片段的缺失或检出降低与过继细胞疗法的低效率相关；当2a肽的表达水平缺失或降低时，施用第二过继细胞疗法。
17.在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1天至30天之间。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1个月至12个月之间。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1年至5年之间。
18.在某些实施方案中，细胞是细胞产品。在某些实施方案中，细胞是neotcr产品。在某些实施方案中，样品是血液样品。在某些实施方案中，样品是肿瘤样品。在某些实施方案中，受试者是人。
19.在某些实施方案中，通过流式细胞术检测2a肽或其片段。在某些实施方案中，通过ihc检测2a肽或其片段。在某些实施方案中，ihc是chipcytometry。
20.在某些实施方案中，2a肽或其片段是剪切的2a肽。在某些实施方案中，2a肽选自包含p2a、t2a、e2a和f2a肽的组。在某些实施方案中，2a肽是p2a或t2a肽。在某些实施方案中，2a肽是p2a肽。
21.在某些实施方案中，使用抗2a抗体或其抗原结合部分检测2a肽或其片段。在某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分交叉竞争与2a肽的结合，其中参考抗体或抗体结合部分是3h4抗体。在某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分结合2a肽的相同表位，其中，参考抗体或其抗原结合部分，其中参考抗体或抗原结合部分是3h4抗体。在某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分交叉竞争与2a肽的结合，其中参考抗体或抗原结合部分是abs31抗体。在某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分结合2a肽的相同表位，其中，参考抗体或其抗原结合部分，其中参考抗体或抗原结合部分是abs31抗体。在某些实施方案中，抗2a抗体或其抗原结合部分是3h4抗体。在某些实施方案中，抗2a抗体或其抗原结合部分是abs31抗体。在某些实施方案中，抗2a抗体与具有seq id no:3中所述氨基酸序列的表位结合。
22.本公开提供了确定细胞是否已被编辑的方法，包括用编码抗原结合受体和2a肽的载体转导或转染细胞；检测细胞中2a肽或其片段的表达水平；其中2a肽或其片段的检出与基因编辑的效率相关。本公开还提供了确定细胞是否已被编辑的方法，包括用编码抗原结合受体和2a肽的载体转导或转染细胞；检测细胞中2a肽或其片段的表达水平；其中2a肽或其片段的不存在与基因编辑的无效率相关。本公开提供的抗原结合受体是t细胞受体(tcr)。
23.本公开提供了载体，其包括第一和第二同源臂，其与第一和第二靶核酸序列同源，并定向为促进同源重组；核苷酸序列，其编码位于第一和第二同源臂之间的tcr；以及第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码位于编码tcr多肽的核苷酸序列上游的2a核糖体跳跃元件，所述第二核苷酸序列编码位于编码tcr多肽的核酸序列下游的2a核糖体跳跃元件，其中，编码2a核糖体跳跃元件的第一和第二核苷酸序列具有相同的氨基酸序列，并且相对于彼此是密码子发散的。
24.本公开进一步提供了用于批量释放用于过继细胞疗法的细胞群的方法，包括：用包含抗原结合受体和2a肽的载体转导或转染细胞群；检测表达2a肽或其片段的细胞数量；
当表达2a肽的细胞数量超过阈值时，释放细胞群用于治疗用途。在某些实施方案中，抗原结合受体是t细胞受体(tcr)。在某些实施方案中，载体包括第一和第二同源臂，其与第一和第二靶核酸序列同源，并定向为促进同源重组；核苷酸序列，其编码位于第一和第二同源臂之间的tcr；以及第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码位于编码tcr多肽的核苷酸序列上游的2a核糖体跳跃元件，所述第二核苷酸序列编码位于编码tcr多肽的核酸序列下游的2a核糖体跳跃元件，其中，编码2a核糖体跳跃元件的第一和第二核苷酸序列具有相同的氨基酸序列，并且相对于彼此是密码子发散的。
25.在某些实施方案中，阈值通过以下公式计算：
[0026][0027]
在某些实施方案中，阈值等于或大于5％。在某些实施方案中，细胞群包括细胞产品。在某些实施方案中，细胞群包括neotcr产品。
[0028]
在某些实施方案中，通过流式细胞术检测2a肽或其片段。在某些实施方案中，通过ihc检测2a肽或其片段。在某些实施方案中，ihc是chipcytometry。
[0029]
在某些实施方案中，2a肽是剪切的2a肽。在某些实施方案中，2a肽选自包含p2a、t2a、e2a和f2a肽的组。在某些实施方案中，2a肽是p2a或t2a。在某些实施方案中，2a肽是p2a。
[0030]
在某些实施方案中，使用抗2a抗体或其抗原结合部分检测2a肽或其片段。在某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分交叉竞争与2a肽的结合，其中参考抗体或抗体结合部分是3h4抗体。在某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分结合2a肽的相同表位，其中，参考抗体或其抗原结合部分，其中参考抗体或抗原结合部分是3h4抗体。在某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分交叉竞争与2a肽的结合，其中参考抗体或抗原结合部分是abs31抗体。在某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分结合2a肽的相同表位，其中，参考抗体或其抗原结合部分，其中参考抗体或抗原结合部分是abs31抗体。在某些实施方案中，抗2a抗体或其抗原结合部分是3h4抗体。在某些实施方案中，抗2a抗体或其抗原结合部分是abs31抗体。在某些实施方案中，抗2a抗体与具有seq id no:3中所述氨基酸序列的表位结合。
[0031]
本公开提供了用细胞产品治疗患者的方法，该方法包括：向需要其的患者施用细胞产品，在未来的时间点从患者抽取血液或收集肿瘤样品，并使用facs或ihc分析分析血液或肿瘤样品，以使用抗2a抗体确定2a肽或其抗体结合片段是否存在，其中，如果检出2a肽或其抗体结合片段，则细胞产品存在并持续存在于患者中，如果未检出2a肽或其抗原结合片段，那么细胞产品不再存在于患者中，其中，如果细胞产品存在且持续存在，该产品在植入患者中是有效的，且不对患者施用额外的治疗，其中，如果不存在细胞产品，则该产品在植入患者中时不是有效的，并对患者施用新的疗法。在某些实施方案中，细胞产品是neotcr产品。在某些实施方案中，患者是癌症患者。在某些实施方案中，未来的时间点选自1-10天、11-30天、31-90天、91-180天和181-365天之间的时间点。在某些实施方案中，未来的时间点选自1-2年、2-5年、5-10年、10-20年和20-50年之间的时间点。
[0032]
本公开提供了使用facs检测细胞产品的细胞中剪切的2a肽或其抗体结合片段的方法，包括以下方法之一：a)方法1，包括：用活/死标记染色细胞，用固定剂固定细胞，用目
标细胞表面标志物对细胞染色，用具有抗2a抗体的透化缓冲液对细胞染色，用固定剂固定细胞；b)方法2，包括：用活/死标记染色细胞，用目标细胞表面标志物对细胞染色，用固定剂固定细胞，用具有抗2a抗体的透化缓冲液染色细胞，用固定剂固定细胞；和c)方法3包括：用活/死标记染色细胞，用目标细胞表面标志物对细胞染色，用具有抗2a抗体的透化缓冲液对细胞染色，用固定剂固定细胞；其中，使用facs分析在流式细胞仪上分析的方法1、2或3中的染色细胞。在某些实施方案中，使用实施例2和/或3中描述的方法对细胞进行基因编辑。
[0033]
本公开提供了确定用细胞产品治疗的患者的预后的方法，该方法包括：向需要其的患者施用细胞产品，在未来的时间点从患者抽取血液或收集肿瘤样品，并使用facs或ihc分析分析血液或肿瘤样品，以使用抗2a抗体确定2a肽或其抗体结合片段是否存在，其中，如果检出2a肽或其抗体结合片段，则细胞产品存在并持续存在于患者中，如果未检出2a肽或其抗体结合片段，那么细胞产品不再存在于患者中，其中，如果细胞产品存在且持续存在，患者的预后是对细胞产品疗法反应良好，其中如果细胞产品不存在，则患者的预后是对细胞产品疗法反应不良。在某些实施方案中，细胞产品是neotcr产品。在某些实施方案中，患者是癌症患者。在某些实施方案中，积极预后是对细胞疗法的部分或完全反应。在某些实施方案中，消极预后是对细胞疗法和/或疾病进展没有反应。
[0034]
本公开提供了在输注细胞产品后在患者中确定细胞产品的持久性和/或存在性的方法，该方法包括：在施用细胞产品后的时间点从患者抽取血液或收集肿瘤样品，以及使用facs或ihc分析分析血液或肿瘤样品，以使用抗2a抗体确定是否存在2a肽或其抗体结合片段，其中如果使用抗2a抗体检出2a肽或者其抗体结合片段，则在患者中细胞产品存在并持续存在。本公开提供了在输注细胞产品后在患者中确定细胞产品的增殖的方法，该方法包括：在施用细胞产品后的两个或多个时间点从患者抽取血液或收集肿瘤样品，使用facs或ihc分析分析血液或肿瘤样品，以使用抗2a抗体确定2a肽或其抗体结合片段是否存在，并确定在两个或多个时间点用抗2a抗体染色的细胞数量之间的差异，其中，在第一时间点和第二时间点之间，用抗2a抗体染色的细胞数量增加是细胞增殖的证据，其中，在第一时间点和第二时间点之间用抗2a抗体染色的细胞数量减少或没有增加是细胞没有增殖的证据。
[0035]
本公开提供了检测基因编辑反应的基因编辑率的方法，该方法包括：用抗2a肽抗体对来自基因编辑反应的细胞进行透化和染色，使用facs或ihc对细胞进行分选，以确定未染色和染色的细胞数，并使用以下计算方法计算基因编辑率：(抗2a抗体染色阳性的细胞数)
÷
(细胞总数)。在某些实施方案中，透化和染色细胞选自由本文公开的方法1、方法2和方法3组成的组。
[0036]
本公开提供了确定合格用于释放用于治疗需要其的患者的细胞产品的方法，该方法包括：取细胞产品的样品，使用facs或ihc分析分析样品，以使用抗2a抗体确定2a肽或其抗体结合片段是否存在，并确定编辑的细胞的百分比，其中，如果编辑的细胞的百分比符合用于释放的产品标准，则释放细胞产品用于治疗患者。在某些实施方案中，编辑的细胞的百分比使用以下公式确定：(抗2a抗体染色阳性的细胞数)/(细胞总数)。在某些实施方案中，用于释放的产品标准是至少5％的基因编辑的细胞。
[0037]
在某些实施方案中，未来的时间点选自1-10天、11-30天、31-90天、91-180天和181-365天之间的时间点。在某些实施方案中，未来的时间点选自1-2年、2-5年、5-10年、10-20年和20-50年之间的时间点。在某些实施方案中，抗2a抗体结合表位dveenpg(seq in no:
3)。在某些实施方案中，抗2a抗体是3h4或abs31抗体。在某些实施方案中，抗2a抗体与3h4和/或abs31抗体竞争结合。在某些实施方案中，抗2a抗体与3h4和/或abs31抗体结合相同的表位。在某些实施方案中，ihc是chipcytometry。
附图说明
[0038]
图1.图1显示了2a肽的序列。对于每个肽，2a肽的保守c末端序列以粗体显示。t2a肽的单下划线序列代表据称由novus biologicals 3h4单克隆抗体识别的表位，该单克隆抗体被设计用于t2a的蛋白质印迹检测。p2a肽的双下划线序列代表用于通过facs检测并在本文公开的p2a表位。
[0039]
图2a和2b.图2a显示了质粒模板的示意图，其中目标基因的两侧为2a肽。如图所示，目标基因的两侧还有信号序列，以实现表达的目标基因的靶向和运输，任选的蛋白酶切割位点，其可用于从目标基因产物中去除非天然氨基酸，所述非天然氨基酸否则可以是由于来自2a肽的氨基酸仍然连接至目标基因，和2a肽。图2b显示了翻译序列(顶部)和翻译后加工(底部)。将目标基因整合到所需的基因座并翻译该基因。图2a和2b中所示的构建体还包括密码子优化的序列。包括密码子优化的序列，以恢复内源性目标基因的功能表达，同时在该基因的启动子/调控元件的天然控制下插入另外的基因。或者，尽管未示出，但为了使本文所述的2a诊断工作，不需要密码子优化的序列。例如，可以简单地破坏靶基因，并除去其表达，但仍然使用2a诊断来查看插入的目标基因的表达。
[0040]
图3a和3b.图3a和3b显示了用于将新抗原特异性tcr构建体(neotcr)整合到tcrα基因座的新抗原特异性tcr构建体设计。图3a显示了靶标tcrα基因座(内源性trac，上图)及其crispr cas9靶标位点(水平条带，箭头指示的切割位点)，以及具有编码neotcr的多核苷酸的环形质粒hr模板(下图)，其位于整合前的左右同源臂(分别为“lha”和“rha”)之间。图3b显示了tcrα基因座中的整合的新tcr(上图)、转录和剪接的neotcr mrna(中间图)以及表达的neotcr的翻译和加工(下图)。
[0041]
图4a和4b.图4a提供了图解在基因编辑的细胞中剪切2a肽的检测和染色的高级示意图。图4b提供了在t细胞中剪切的2a肽的检测和染色的高级图，这些t细胞经过基因编辑以表达neotcr。如图4a和图4b两者所示，将2a肽从目标基因上切下，以避免在目标基因上产生非内源性表位，否则可能导致患者中的免疫原性反应。显示剪切的2a肽位于内质网中，并在透化细胞后使用facs检测(如图右手侧的皂苷透化和抗体染色所示)。
[0042]
图5a和5b.图5a显示了在透化细胞中，使用与alexafluor 467缀合的抗2a抗体对活细胞进行门控的两个facs图。上图示出在neotcr-2转染的细胞中有抗2a抗体(即alexafluor 467)信号，但模拟品(mock)转染(对照)的细胞中没有。图5b显示了对淋巴细胞、单线态(singlets)、活细胞和cd8+阳性的细胞上进行门控的两个facs图。浅色图处于透化条件，深色图处于未透化条件。如左侧模拟品转染(对照细胞)facs图所示，当没有用2a肽编辑时，透化或未透化中没有可识别的2a肽信号。如右手侧facs图所示，使用2a肽编辑的细胞在细胞透化时显示可检出的抗2a肽信号，而在细胞未透化时则不显示。
[0043]
图6.图6显示了三列facs图：左列(对照；荧光减一对照(fmo))；中列(对照；同种型，用未与抗2a抗体缀合的apc染色的的细胞)；右列(用与alexafluor 467缀合的抗2a抗体染色的细胞)。所有实验均在透化的细胞中进行。如抗2a x neotcr-2和抗2a
×
neotcr-1绘
图的右上象限所示，在基因编辑的细胞中检出2a肽(在构建体中使用2a肽进行编辑)。对照和模拟品转染图显示无2a染色。这表明，用neotcr特异性dextramer证实了细胞表面neotcr的表达(即，2a肽或其剪切部分与neotcr特异性dextramer共同染色)。
[0044]
图7.图7显示了单线态(singlets)、活细胞和cd4+阳性淋巴细胞门控的cd4 t细胞上的dextramer(特定neotcr的染色)和2a肽染色。
[0045]
图8.图8显示了facs图，显示了在未经刺激的cd8+t细胞或用transact过夜刺激18小时的cd8+t细胞上的dextramer(neotcr)和2a肽染色。该实验的门控是对淋巴细胞、单线态(singlets)、活细胞和cd8+细胞呈阳性。
[0046]
图9.图9显示了facs图，显示了通过与用1000nm、100nm、10nm、1nm、0.1nm、0.01nm和0nm脉冲的细胞共培养刺激24小时的基因编辑的t细胞上的dextramer(neotcr)和2a肽染色。
[0047]
图10.图10显示了在进行正常染色程序之前，在特定条件下固定5分钟的细胞的数据。使用dextramer(neotcr)或2a肽染色评估编辑的细胞。条件为(按图中从左到右的顺序)：1)dextramer染色后细胞内(ic)固定缓冲液，2)表面蛋白染色后的细胞内(ic)固定缓冲液，3)dextramer染色后1.6％多聚甲醛(pfa)固定，4)表面蛋白染色后1.6％多聚甲醛(pfa)固定，5)无固定。
[0048]
图11.图11显示了不同固定方法后2a染色的分离指数。条件为(按图中从左到右的顺序)：1)4％多聚甲醛(pfa)固定，5分钟，2)4％多聚甲醛(pfa)固定，10分钟，3)细胞内(ic)固定缓冲液，5分钟，4)细胞内(ic)固定缓冲液，10分钟，5)固定和透化，6)1.6％多聚甲醛(pfa)固定，5分钟，7)1.6％多聚甲醛(pfa)固定，10分钟，8)无固定剂。
[0049]
图12a和12b.图12a显示了facs图，显示了在未经刺激的cd8+t细胞或用transact刺激一个两天的cd8+t细胞上的dextramer(neotcr)和tcrαβ染色。图12b显示了facs图，显示了在未经刺激的cd8+t细胞或用transact刺激一个两天的cd8+t细胞上的dextramer(neotcr)和2a肽染色。
[0050]
图13a和13b.图13a显示了在施用neotcr产品的患者血液样品中检出的2a+细胞频率。图13b显示了施用neotcr产品的患者血液样品中检出的2a+细胞数量。
[0051]
图14.图14显示了系列稀释测定，以确定用于chipcytometry分析中3h4抗2a抗体的正确稀释度。
[0052]
图15a和15b.图15a显示了使用3h4抗2a抗体的基因编辑的细胞的ihc染色。图15b是图15a中细胞的放大视图。
[0053]
图16.图16显示了使用ihc特别是chipcytometry的同一细胞的两个切片图像。如图所示，抗2a抗体可以检测细胞内2a肽(以及如本文所述的2a肽的剪切片段)。
[0054]
发明详述
[0055]
本公开部分基于令人惊讶的结果，即2a肽可以在遗传修饰的细胞(例如，靶向表达抗原的细胞的neotcr细胞)中检测到。因此，本公开提供了易于用过继细胞疗法治疗的患者疾病的诊断和预后，以及确定此类过继细胞疗法的效率，例如过继细胞疗法的存在、持久性和/或增殖的方法。此外，本公开提供了确定过继细胞疗法中所用细胞的基因编辑效率的方法。本公开还提供了用于基于确定细胞群中基因编辑的效率，用于过继细胞疗法的细胞群批量释放的方法。
[0056]
本公开的非限制性实施方案由本说明书和实施例描述。出于公开的清晰目的而非限制的目的，详细描述分为以下小节：
[0057]
1.定义；
[0058]
2.过继细胞疗法；
[0059]
3. 2a肽；
[0060]
4.使用方法；
[0061]
5.试剂盒；和
[0062]
6.示例性实施方案。
[0063]
1.定义
[0064]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有本领域技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了本公开主题中使用的许多术语的一般定义：singleton et al.,dictionary of microbiology and molecular biology(2nd ed.1994)；the cambridge dictionary of science and technology(walker ed.,1988)；the glossary of genetics,5th ed.,r.rieger et al.(eds.),springer verlag(1991)；和hale&marham,the harper collins dictionary of biology(1991)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有以下赋予它们的含义。
[0065]
应当理解，本文描述的本发明的方面和实施方案包括“包括”、“由
……
组成”和“基本上由
……
组成”方面和实施方案。术语“包括(comprises)”和“包含(comprising)”旨在具有美国专利法赋予它们的广泛含义，可以表示“包括(includes)”、“包含(including)”等。
[0066]
如本文所用，术语“约”或“大约”是指在由本领域技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在3个或超过3个标准差内。或者，“约”可表示给定值的最多20％，例如最多10％、最多5％或最多1％的范围。或者，特别是就生物系统或过程而言，该术语可表示值的一个数量级内，例如在5倍或2倍内。
[0067]
如本文所使用的，术语“抗体”以最广泛的含义使用并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原-结合活性。“其抗原结合部分”是指除完整抗体之外的分子，其包含完整抗体的一部分，与完整抗体结合的抗原结合。抗原结合部分的实例包括但不限于fv，fab，fab'，fab'-sh，f(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv和scfab)；单域抗体(dab)；由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0068]
术语“2a诊断”是指在施用过继细胞疗法(例如细胞产品)的患者或过继细胞疗法本身中检测2a肽或其抗体结合片段、或抗体或其抗原结合部分的方法。在某些实施方案中，本文所述的检测2a肽或其片段的方法称为“2a诊断”。在某些实施方案中，可以使用2a诊断检测2a肽或其抗体结合片段、或抗体或其抗原结合部分。在某些实施方案中，2a诊断可使用抗2a肽抗体。在某些实施方案中，可以使用结合翻译的2a肽的任何抗体或其抗原结合部分。在某些实施方案中，抗2a抗体或其抗原结合部分缀合到检测部分。在某些实施方案中，检测部分是荧光团。
[0069]
在本文中，“2a”和“2a肽”可互换使用，是指一类长度为18-22个氨基酸的病毒自剪切肽，其在真核细胞翻译过程中能够介导肽的剪切。
[0070]
如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”可互换使用，是指所有肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌性细胞和组织。这些术语进一步用于指或描述通常以不受调节的细胞生长/增殖为特征的哺乳动物的生理状况。癌症的实例包括但不限于本文描述的那些。癌症可影响多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于选自由膀胱、骨骼、脑、乳腺、软骨、神经胶质、食道、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾、肝、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、尿道、子宫和阴道组成的组的器官，或其组织或细胞类型。癌症包括癌症，例如肉瘤、癌或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”和“增殖性病症”并不相互排斥。
[0071]
本文中使用的术语“细胞产品”是指一种基因编辑的细胞疗法，其中在基因编辑过程中使用一种或多种2a肽。在某些实施方案中，细胞产品通过插入dna而制备，其中目标基因插入两个2a序列之间(例如，见图2a)。在某些实施方案中，dna为线性或环形的(例如，质粒dna)。在某些实施方案中，细胞产品通过插入dna而制备，其中目标基因一侧的侧翼为2a肽。在某些实施方案中，当存在多于一个2a肽序列时，这些序列是相同的2a肽(例如，两个p2a序列、两个t2a序列、两个e2a序列或两个f2a序列)。在某些实施方案中，当存在多于一个2a肽序列时，这些序列是不同的2a肽(例如，但不限于一个t2a和一个p2a)。在某些实施方案中，使用病毒基因编辑方法制备细胞产品。在某些实施方案中，使用靶向或非靶向病毒方法制备细胞产品。在某些实施方案中，使用非病毒基因编辑方法(例如电穿孔)制备细胞产品。细胞产品包括但不限于t细胞、nk细胞、hsc、til和来源于hsc的细胞。在某些实施方案中，细胞产品还可以包括可以使用2a肽作为基因编辑过程的一部分进行编辑的任何其他天然细胞。例如，细胞产品可用于治疗自身免疫疾病、神经疾病和损伤(包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森病、脊髓和神经损伤和/或损坏)、癌症、传染病、关节疾病(包括但不仅限于重建关节受损的软骨)、改善免疫系统、心血管疾病和异常、衰老、免疫缺陷(包括但不限于多发性硬化和肌萎缩侧索硬化)、过敏和遗传病症。在某些实施方案中，细胞产品包括neotcr产品和neotcr病毒产品。
[0072]“neotcr”和“neotcr”在本文中可互换使用，是指通过基因编辑方法引入t细胞中的新表位特异性t细胞受体。
[0073]
如本文所使用的，术语“neotcr细胞”是指精确地改造成表达一个或多个neotcr的一个或多个细胞。在某些实施方案中，细胞是t细胞。在某些实施方案中，t细胞是cd8+和/或cd4+t细胞。在某些实施方案中，cd8+和/或cd4+t细胞是来自将为其施用neotcr产品的患者的自体细胞。
[0074]
如本文所用的，术语“neotcr产品”是指包含一个或多个neotcr细胞的药物制剂。neotcr产品包括自体精密基因组改造的cd8+和cd4+t细胞。使用靶向dna介导的非病毒精密基因组工程方法，内源性tcr的表达被破坏，并被患者特异性neotcr取代。在某些实施方案中，从靶向肿瘤独有的新表位的外周cd8+t细胞分离出neotcr。在某些实施方案中，所得改造的cd8+或cd4+t细胞在其天然序列表面、天然表达水平和天然tcr功能上表达neotcr。neotcr外部结合结构域和细胞质信号传递结构域的序列相对于从天然cd8+t细胞分离的tcr是未修饰的。neotcr基因表达的调控由位于基因组整合的neotcr基因盒上游的天然内源性tcr启动子驱动的。通过这种方法，在未刺激和抗原激活的t细胞状态中观察到neotcr
表达的天然水平。为每位患者生产的neotcr产品代表一定剂量的自体cd8+和/或cd4+t细胞，这些细胞进行精确基因组改造，以表达从新表位特异性cd8+t细胞克隆的单个新表位特异性tcr，所述新表位特异性cd8+ t细胞从相同患者的外周血中单独分离。neotcr产品是细胞产品的非限制性实例。
[0075]
本文中使用的“neotcr病毒产品”具有与neotcr产品相同的定义，除了基因组改造是使用病毒介导的方法进行的。neotcr病毒产品是细胞产品的非限制性实例。
[0076]
如本文所用，“tcr”指t细胞受体。
[0077]
本文中使用的术语“完全反应”是指响应于治疗，癌症的所有病征消失。本文中使用的术语“部分反应”是指响应于治疗，肿瘤大小或体内癌症程度的减小。
[0078]
如本文所使用的，术语“pe”是指r-藻红蛋白。
[0079]
本文中使用的术语“dextramer”是指特异性结合其同源neotcr的多聚化新表位hla复合物。
[0080]
如本文所使用的，术语“持久性”是指过继细胞疗法例如neotcr细胞中使用的细胞的质量，其在决定治疗结果中起作用。输注细胞的持久性差是成功的癌症过继细胞疗法的关键挑战，并且已证明与癌症患者的持久临床缓解呈负相关。事实上，较差的持久性阻碍了体内输注细胞的长期效应子功能，并潜在地阻碍过继细胞疗法的长期治疗影响。有几个因素会影响过继转移的t细胞的持久性。
[0081]
如本文所使用的，“内源性”指通常在细胞或组织中表达的核酸分子或多肽。
[0082]
如本文所使用的，“外源性”是指不内源性地存在于细胞中的核酸分子或多肽。因此，术语“外源的”将包括在细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽，例如外来的、异源的和过表达的核酸分子和多肽。“外源”核酸是指不存在于天然野生型细胞中的核酸；例如，外源核酸可以在序列、位置/定位或两者上与内源对应物不同。为清楚起见，相对于其天然内源对应物，外源核酸可具有相同或不同的序列；它可以通过基因工程引入细胞本身或其祖细胞中，并且可以任选地连接到备选的控制序列，例如非天然启动子或分泌序列。
[0083]
如本文所使用的，“载体”是指用于将异源dna导入细胞以进行表达或复制的离散元件。如本文所使用的，载体可被设计并用于体内或体外表达由插入到载体中的编码序列编码的多肽基因产物。在某些实施方案中，载体包含2a肽。
[0084]
本文使用的“facs”指荧光激活细胞分选术。“流式细胞术”和“facs”在本文中可互换使用。
[0085]“药物制剂”是指这样一种制剂，其形式允许包含在其中的活性成分的生物学活性是有效的，并且不包含对将要施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。为清楚起见，neotcr产品中使用的dmso的数量不被认为具有不可接受的毒性。
[0086]
如本文所使用的，术语“批量释放”是指允许通过审查和测试产品特征来监控产品质量的机制。批量释放是在产品上市或用作治疗剂之前，对产品(例如细胞产品)的每一个单独批次进行评估的过程。在某些实施方案中，本文公开的产品(例如，neotcr产品)的批量释放需要高于某个阈值的一定数量的基因编辑的细胞。
[0087]
用于治疗目的的“受试者”、“患者”或“个体”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养和农场动物以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
[0088]“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”可互换使用，并且如本文所用是指获得有益的或期望的结果，包括临床结果。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速度、改善或缓解疾病状态、缓解或改善预后。在某些实施方案中，本公开的neotcr产品用于延迟增殖性病症(例如，癌症)的发展或减缓此类疾病的进展。
[0089]
如本文所使用的，术语“治疗有效量”或“有效量”是指足以减少、抑制或消除癌症生长的过继细胞疗法的量。过继细胞疗法中治疗有效或有效的细胞数量可能因背景而异。有效量可以在一次或多次施用中施用。
[0090]
如本文所使用的，术语“ihc”或“免疫组织化学”是指细胞或组织的免疫染色。
[0091]
2.过继细胞疗法
[0092]
本公开提供了与使用细胞的转移的免疫疗法的开发和改进相关的方法，所述细胞被设计为靶向疾病和/或有害细胞。例如，但不限于，细胞可以表达外源性tcr或嵌合抗原受体(car)。在某些非限制性实施方案中，本公开提供了用于评估过继细胞疗法的方法。例如，但不限于，本文所公开的方法可以确定在受试者中过继细胞疗法的持久性。在某些实施方案中，本文所述的方法涉及使用细胞的转移的癌症免疫疗法的开发和改进，所述细胞被改造为与癌症反应并杀死癌症。
[0093]
如本文所使用的，“过继细胞疗法”是指将免疫细胞(例如t细胞)输注到受试者以帮助身体对抗疾病(例如癌症)的疗法。在某些实施方案中，过继细胞疗法包括取自受试者自身血液或肿瘤组织的t细胞，经体外扩增，然后输注到患者中以帮助免疫系统对抗癌症。在某些实施方案中，过继细胞疗法包括细胞，例如t细胞，其被改造以提高其靶向癌细胞的能力。在某些实施方案中，过继细胞疗法包括免疫系统的细胞或造血干细胞。例如，但限于，过继细胞疗法可以包括cd8+细胞、cd4+细胞、nk细胞、δ-γ-t细胞、调节性t细胞或肿瘤浸润淋巴细胞。在某些实施方案中，过继细胞疗法包括t细胞。在某些实施方案中，过继细胞疗法包括nk细胞。在某些实施方案中，过继细胞疗法包括下文所述的细胞产品。在某些实施方案中，过继细胞疗法包括章节2.2中描述的neotcr产品。在某些实施方案中，过继细胞疗法包括如下所述的neotcr病毒产品。
[0094]
2.1.细胞产品
[0095]
在某些非限制性实施方案中，本公开提供了用于评估细胞产品的方法。细胞产品包括使用含有一个或多个2a肽的构建体进行基因编辑的细胞。在某些实施方案中，可以使用非病毒方法制备细胞产品。在某些实施方案中，可以使用病毒方法制备细胞产品。在某些实施方案中，细胞产品包括具有目标基因的构建体，所述目标基因例如外源型tcr，其插入到构建体的基因组中，所述构建体进一步包含一个或多个2a肽编码序列。在某些实施方案中，2a肽编码序列的使用使得能够通过共翻译切割事件在单个开放阅读框内表达多个蛋白质。这种方法可以克服基因编辑中的主要障碍，即不同蛋白质表达不均的问题。
[0096]
如本文所述，细胞产品可以包括在翻译产物中保留2a肽或其片段的基因编辑的细胞。在某些实施方案中，插入细胞产品的基因组的目标基因在目标基因表达的蛋白质的侧翼端保留2a肽或其片段。在某些实施方案中，插入细胞产品的基因组的目标基因在目标基因表达的蛋白质的两侧翼端保留2a肽或其片段。
[0097]
如本文所述，细胞产品还可以包括基因编辑的细胞，在翻译期间其将2a肽从目标
基因完全切割下来，使得插入基因组中的一个或多个目标基因所表达的蛋白质在该基因所表达蛋白质的任何侧翼端不具有全部或部分2a肽。在这种情况下，由插入的目标基因表达的蛋白质不包含任何非天然表位，所述非天然表位由在基因表达的蛋白质的任一侧翼端包括2a肽的一个或多个氨基酸引起。
[0098]
在某些实施方案中，如本文所述的细胞产品包括使用病毒方法编辑的基因编辑的细胞。在某些实施方案中，如本文所述的细胞产品包括使用非病毒方法编辑的基因编辑的细胞。
[0099]
2.2.neotcr产品和neotcr病毒产品
[0100]
越来越多的证据表明，对检查点抑制剂有反应的实体瘤更可能具有更高的体细胞突变负荷(导致肿瘤独有的新抗原的表达)，并且肿瘤表现出更高的cd8 t细胞浸润和/或表现出预先存在的高pd-l1肿瘤表达(schumacher and schreiber,science 348.6230(2015):69-74)。这些特征中的每一个都代表了这些肿瘤内源性免疫原性的更高潜力，即那些患者的免疫系统可能在开始检查点抑制剂治疗之前已经启动了显著的t细胞免疫应答(lawrence,et al.,nature 499.7457(2013):214-218.；tumeh,et al.,nature 515.7528(2014):568-571；wargo,et al.,current opinion in immunology 41(2016):23-31)。下一代肿瘤深度测序的应用和内源性肿瘤靶向t细胞应答的免疫分析为癌症免疫治疗益处、肿瘤突变负荷和预先存在的新抗原特异性t细胞群之间的联系提供了强有力的证据。新抗原特异性t细胞群特异性识别和杀死具有这些肿瘤独有突变(新抗原)的肿瘤细胞，被认为是有效癌症免疫疗法的主要介质，以触发临床益处(tran et al.,nature immunology 18.3(2017):255-262；schumacher and schreiber,science 348.6230(2015):69-74)。靶向新表位的过继性tcr-t细胞疗法具有克服上述限制的潜力。
[0101]
在某些非限制性实施方案中，本公开提供了用于评估neotcr产品的方法。neotcr产品是一种新型的过继性tcr-t细胞疗法，其用天然序列的自体neotcr改造，从患者的个人内在t细胞癌免疫应答中识别和分离。最初代表每个患者的创始(主干)突变的肿瘤特异性基因组改变，包括癌症病理学的“驱动”突变，随着时间的推移，数量会增加，并多样化，成为晚期恶性肿瘤的“分支”或“乘客”突变。这些累积的肿瘤特异性突变谱代表了每个癌症患者免疫识别靶标的独特私有特征(私有新抗原)。靶向这些私有和肿瘤独有新抗原(新表位或neoe特异性t细胞)的t细胞具有专门靶向和杀死肿瘤细胞的潜力，而忽略不表达这些肿瘤特异性突变的健康细胞。通过这种方式，每位患者的免疫系统都会参与到肿瘤中，并且在适当杠杆作用时，适当放大内在免疫应答，已被证明可以根除肿瘤。
[0102]
由于所有癌症都是由潜在的创始或主干突变驱动的，因此本文公开的neotcr产品靶向主干新表位并具有治疗任何癌症患者的潜力。neotcr产品是一种过继性个性化细胞疗法。在某些实施方案中，neotcr产品涉及改造个体自身的cd8和cd4 t细胞以表达已经识别肿瘤专有新抗原的天然存在的neotcr。因此，这些neotcr具有天然序列，并且来源于预先存在的突变靶向的cd8 t细胞。通过专有的分离技术从外周血中获取neotcr，该技术可鉴定每个患者的肿瘤独有新表位靶点。
[0103]
在某些非限制性实施方案中，neotcr产品的制造方法包括对来自同一患者的白细胞单采术(leukopak)的新鲜衍生的cd4和/或cd8 t细胞的基因组改造。在某些实施方案中，neotcr产品被精确基因组改造，以重构“天然”自体t细胞功能并且已经验证其在整个选择
过程中与自体患者预测的抗原相互作用的方式表达一种neotcr。因此，对癌症参与者的临床益处源于递送单剂量的体外改造的、靶向肿瘤突变的自体neotcr细胞，从而提供了在患者中引发快速和持久反应的潜力，其中一些患者没有治愈性治疗选择。
[0104]
对neotcr产品和neotcr病毒产品的药理学评估表明，采用体外制造方法生产的neotcr细胞在与表达同源新抗原的肿瘤细胞接触时具有强大的抗原特异性杀伤性、效应细胞因子分泌和增殖活性。此外，如大量t细胞和单细胞分泌组分析所证明的，neotcr产品和neotcr病毒产品已被证明响应于靶标肿瘤细胞，具有强烈的多功能效应蛋白分泌反应。预计观察到的多功能t细胞效应表型有助于在将neotcr产品和neotcr病毒产品输注到癌症患者体内时产生临床益处的潜力，其方式类似于将多功能car-t细胞输注到恶性血液病患者中所观察到的方式。
[0105]
在某些实施方案中，本文所述的neotcr产品包含记忆干细胞(t
msc
)和中枢记忆(t
cm
)t细胞表型，这是本文所述的离体制造方法的结果。这些“更年轻”或分化程度较低的t细胞表型被描述为在小鼠模型中和恶性血液病患者中改造的car-t细胞的临床试验中赋予提高的植入物潜力和延长的输注后持久性。因此，包含“年轻”t细胞表型的neotcr产品的施用通过提高的植入物潜力、延长的输注后持久性以及快速分化为效应t细胞以根除全身肿瘤细胞，具有使癌症患者受益的潜力。
[0106]
还用本文所述的neotcr产品进行了离体(ex vivo)作用机制研究，所述neotcr产品是从癌症患者的t细胞开始制造的。如通过t细胞杀伤活性、增殖和细胞因子产生的抗原特异性测量的，观察到相当的基因编辑效率和功能活性，证明本文所述的制造方法用来自癌症患者的t细胞作为起始材料成功产生了产品。
[0107]
在某些实施方案中，在实施例1和2中，本文公开的neotcr产品的制造方法涉及结合到向导rna序列的crispr-cas9核酸酶的双核糖核蛋白种类的电穿孔，每个种类都靶向基因组tcrα和基因组tcrβ基因座。cas9核酸酶靶向每个基因组基因座的特异性先前已在文献中描述为高度特异的。分别使用cosmid和guide-seq在体外和计算机分析中对neotcr产品进行了全面测试，以调查可能的脱靶基因组切割位点。通过深度测序评估了来自健康供体的多个neotcr产品或相当的细胞产品的候选脱靶位点的切割，支持已发表的证据，即所选核酸酶是高度特异的。本文实施例1和2中描述的neotcr产品的精密基因组改造方法的其他方面已进行安全性评估。在通过靶向基因座扩增(tla)或标准fish细胞遗传学评估多个neotcr产品时，没有发现精确基因组改造后基因组不稳定性的证据。没有检测到neotcr序列基因组中任何地方的脱靶整合。在细胞产品中没有发现残留cas9的证据。
[0108]
因此，neotcr产品和neotcr非病毒产品为需要其的患者的癌症治疗提供了新的发展。neotcr产品的其他信息可在国际专利公开号wo2019089610中找到，其内容通过引用并入本文。
[0109]
3.2a自剪切肽
[0110]
在某些非限制性实施方案中，本公开提供了用于通过确定2a肽或其片段的表达，评估过继细胞疗法(例如，neotcr产品)的方法。“2a肽”是一类18-22个氨基酸长的病毒的和自剪切的肽。在真核细胞翻译过程中，2a肽能够介导肽的切割。2a肽类的四个著名成员是t2a、p2a、e2a和f2a。t2a肽首先在明脉扁刺蛾病毒(theresa asigna)病毒2a中被鉴定。p2a肽首先在猪捷申病毒-1(porcine teschovirus-1)2a中被鉴定。e2a肽首先在马鼻炎a病毒
中被鉴定。f2a肽首先在手足口病病毒中被鉴定。2a肽的自剪切机制是核糖体跳过在2a的c端形成甘氨酰-脯氨酰肽键的结果。具体而言，2a肽具有c端保守序列，这是产生空间位阻和核糖体跳跃所必需的。在某些实施方案中，c端保守序列是gdvexnpgp(seq id no:1)。在某些实施方案中，c端保守序列是gdvesnpg(seq id no:2)。核糖体跳跃可能导致以下三种选择之一：1)成功跳跃和翻译重新开始，导致两个剪切的蛋白质(除了c端脯氨酸，连接到完整的2a肽的2a蛋白的上游，连接到n-末端的一个脯氨酸的2a蛋白的下游；2)成功跳跃但核糖体脱落导致翻译中断，只有2a上游的蛋白质；或3)不成功的跳跃和继续翻译(即融合蛋白)。术语“2a”是指病毒基因组的特定区域。2a肽类的成员以最初描述它们的病毒命名。
[0111]
如本文所使用的，术语“2a”和“2a肽”可互换使用，指一类18-22个氨基酸长、病毒性、自剪切肽，在真核细胞翻译过程中其能够介导肽的剪切。
[0112]
4.使用方法
[0113]
尽管过继细胞疗法(例如neotcr产品)已显示出临床成功，但在提高成功率方面仍存在一些挑战。例如，在用过继细胞疗法治疗的患者中观察到临床无反应性或复发。为了应对这些挑战并改进癌症患者的治疗方法，需要准确和可重复地检测有效的过继细胞疗法。
[0114]
在过继细胞疗法的制备过程中，用表达可以整合到基因组中的抗原结合受体(例如外源性tcr)的载体转导或转染t细胞。整合的抗原结合受体的检测可能需要基因组或转录组分析，例如定量pcr或数字pcr。然而，这些方法在过继细胞疗法中无法使用或无效率下，所述过继细胞疗法被改造以表达外源性t细胞受体(tcr)例如neotcr产品的天然序列。
[0115]
本公开提供了检测过继细胞疗法的动力学、持久性、生物分布和效应子功能的方法。在某些实施方案中，过继细胞疗法包括细胞产品。在某些实施方案中，过继细胞疗法包括neotcr产品。在某些实施方案中，过继细胞疗法包括neotcr病毒产品。在某些实施方案中，本文所公开的方法可用于诊断用途。在某些实施方案中，本文所公开的方法可用于预测用途。在某些实施方案中，本文所公开的方法可用于改进制备工艺。在某些实施方案中，本文所公开的方法可用于临床试验实验室操作。在某些实施方案中，本文所公开的方法降低了假阴性发生率。在某些实施方案中，本文所公开的方法降低了假阳性发生率。在某些实施方案中，本文所公开的方法增加了制备过程的可复制性。
[0116]
4.1诊断和预后方法
[0117]
本公开的实施方案涉及用于在接受过继细胞疗法的受试者中诊断是否存在过继细胞疗法的方法。在某些实施方案中，所述方法包括在来自受试者的样品中检测2a肽或其片段的表达水平。在某些实施方案中，过继细胞疗法包括本文公开的表达2a肽或其片段的细胞。在某些实施方案中，根据检出的2a蛋白的时间和/或量，2a肽或其片段的检出与过继细胞疗法的存在、持久性和/或增殖相关。在某些实施方案中，2a肽或其片段的不存在与过继细胞疗法的无效率有关。
[0118]
在某些非限制性实施方案中，本公开提供了用于对用过继细胞疗法治疗的受试者进行预后的方法。在某些实施方案中，所述方法包括在来自受试者的样品中检测2a肽或其片段的表达水平。在某些实施方案中，过继细胞疗法包括本文公开的表达2a肽或其片段的细胞。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检出与过继细胞疗法的功效相关。在某些实施方案中，2a肽或其片段的不存在与过继细胞疗法的功效降低有关。
[0119]
在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测可以发生在受试者接受过继细胞疗法之
后的任何时间。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、21天、28天、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、12个月、15-24个月之间、和每年一次。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生大约在第一周每天，随后每周一次，直到输注后的第一个月结束，然后每月检测2a肽或者其片段，直至输注后第六个月结束。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在之后大约1天、大约2天、大约3天、大约4天、大约5天、大约6天、大约7天、大约14天、大约21天、大约28天、大约2个月、大约3个月、大约4个月、大约5个月、大约6个月、大约9个月、大约12个月、大约15-24个月，和大约每年一次。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在以下一个或多个时间点：之后大约1天、大约2天、大约3天、大约4天、大约5天、大约6天、大约7天、大约14天、大约21天、大约28天、大约2个月、大约3个月、大约4个月、大概5个月、大约6个月、大约9个月、大约12个月、大约15-24个月，和大约每年一次。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后10天、20天、30天、45天以及其间的任何时间。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后10天、20天、30天、45天以及其间的任何时间。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1天、10天、20天、30天、45天以及其间的任何时间。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月以及其间的任何时间。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1年、2年、3年、5年、10年、15年、20年以及其间的任何时间。
[0120]
在某些实施方案中，2a诊断可用于确定细胞的病毒转导或非病毒转染以制备细胞产品的效率。
[0121]
在某些实施方案中，2a诊断可用于确定输注后患者中细胞产品的存在和/或持久性。在输注后确定患者中细胞产品的存在和/或持久性对于确定细胞产品的功效至关重要，因为如果细胞产品不存在并且在患者体内不持久，它就不能治疗靶标疾病。
[0122]
在某些实施方案中，2a诊断可用于基于输注后患者中细胞产品的存在和/或持久性的检测来确定输注细胞产品后患者的预后。在某些实施方案中，输注后患者中细胞产品的存在和/或持久性表明积极预后。在某些实施方案中，积极预后表示疾病状态降低。在某些实施方案中，积极预后表示疾病状态稳定。在某些实施方案中，积极预后表示疾病状态的消融或实质性降低。在某些实施方案中，疾病状态为癌症。在癌症中，积极预后是疾病稳定、肿瘤负担减轻(部分反应)或对细胞产品的完全反应。在某些实施方案中，输注后未在患者中检测到细胞产品是消极预后。在某些实施方案中，消极预后表示疾病的传播或表示疾病治疗的不存在。在某些实施方案中，疾病是癌症，且消极预后是额外的肿瘤负担。在某些实施方案中，试剂盒2a诊断使用与实施例4-7中公开的方法相同或基本相似的方法。在某些实施方案中，2a诊断需要在用抗2a肽抗体染色之前或同时在没有任何固定剂的情况下使细胞透化。在某些实施方案中，2a诊断不需要在用抗2a肽抗体染色之前固定细胞。在某些实施方案中，抗2a抗体是实施例4所述的3h4抗体(novus biological，货号nbp2-59627af594和nbp2-59627af647)。在某些实施方案中，抗2a抗体与实施例4中所述的3h4抗体结合相同的表位。在某些实施方案中，抗2a抗体与实施例4中所述的3h4抗体竞争结合。在某些实施方案中，抗2a抗体是abs31(sigma-aldrich，货号abs31)。在某些实施方案中，抗2a抗体与abs31结合相同的表位。在某些实施方案中，抗2a抗体与abs31抗体竞争结合。
[0123]
在某些实施方案中，2a诊断作为试剂盒提供和销售。在某些实施方案中，试剂盒包含使用2a诊断的说明。在某些实施方案中，试剂盒包含与实施例4-7中公开的方法相同或基本相似的使用2a诊断的说明。在某些实施方案中，试剂盒包含使用2a诊断的说明，其指导用户在用抗2a肽抗体染色之前或同时使目标细胞透化，但不固定目标细胞。在某些实施方案中，试剂盒包含使用2a诊断的说明，其指导用户在用抗2a肽抗体染色之前不固定目标细胞。在某些实施方案中，抗2a抗体是实施例4中描述的3h4抗体。在某些实施方案中，抗2a抗体与实施例4中所述的3h4抗体结合相同的表位。在某些实施方案中，抗2a抗体与实施例4中所述的3h4抗体竞争结合。
[0124]
本文所述的2a诊断可以制造为用于检测细胞产品的方法的试剂盒或其他商业产品。
[0125]
4.2.治疗方法
[0126]
本公开提供了用于治疗已接受本文公开的过继细胞疗法例如细胞产品的受试者的方法，包括执行本文公开的诊断或预后方法之一并在过继细胞无效率时施用第二过继细胞疗法。
[0127]
在某些实施方案中，第二过继细胞疗法是细胞产品。在某些实施方案中，第二过继细胞疗法是neotcr产品。在某些实施方案中，第二过继细胞疗法是neotcr病毒产品。在某些实施方案中，本文公开的过继细胞疗法可用于治疗疾病。在某些实施方案中，第二过继细胞疗法可用于治疗人类疾病。例如，但不限于，人类疾病可以是自身免疫性疾病、神经疾病和/或损伤(包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森病、脊髓和神经损伤和/或损害)、癌症、传染病、关节疾病(包括但不限于重建关节中受损的软骨)、免疫系统疾病、心血管疾病和/或异常、衰老、免疫缺陷(包括但不限于，多发性硬化症和肌萎缩侧索硬化)、过敏反应或遗传疾病。
[0128]
在某些实施方案中，本文公开的第二过继细胞疗法可用于治疗增殖性疾病，例如癌症。癌症的非限制性实例包括血癌(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、胶质母细胞瘤、喉癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、腺癌、神经胶质瘤、软组织肉瘤和各种癌症(包括前列腺癌和小细胞肺癌)。合适的癌进一步包括肿瘤学领域中已知的任何癌，包括但不限于星形细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、原发性神经外胚层肿瘤(pnet)、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、胰腺导管腺癌、小细胞和大细胞肺腺癌、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、上皮腺癌及其肝转移瘤、淋巴管肉瘤、肝癌、淋巴管内皮肉瘤、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、基底细胞癌、汗腺癌、乳头状癌、皮脂腺癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、wilms’瘤、睾丸肿瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链疾病、乳腺肿瘤、如导管和小叶腺癌、子宫颈鳞状癌和腺癌、子宫和卵巢上皮癌、前列腺腺癌、膀胱移行性鳞状细胞癌、b和t细胞淋巴瘤(结节性和弥漫性)浆细胞瘤、急性和慢性白血病、恶性黑色素瘤、软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。在某些实施方案中，癌症选自由血癌(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、
皮肤癌、胃癌、胶质母细胞瘤和喉癌组成的组。在某些实施方案中，当前公开的年轻t细胞和包含其的组合物可用于治疗和/或预防不愿接受常规治疗干预的血癌(例如，白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)或卵巢癌。
[0129]
在一些实施方案中，受试者可能患有晚期形式的疾病，在这种情况下，治疗目标可以包括缓解或逆转疾病进展，和/或改善副作用。受试者可能有病史，他们已经接受过治疗，在这种情况下，治疗目标通常包括降低或延迟复发风险。
[0130]
在某些实施方案中，本文公开的第二过继细胞疗法可用于治疗自身免疫疾病或神经疾病和损伤。在某些实施方案中，本文公开的第二过继细胞疗法可用于治疗传染病、关节疾病和损伤，或免疫疾病和缺陷。在某些实施方案中，第二过继细胞疗法可用于治疗心血管疾病和异常、衰老、免疫缺陷。在某些实施方案中，第二过继细胞疗法可用于治疗过敏反应或遗传疾病。
[0131]
4.3.另外的方法
[0132]
本公开的实施方案涉及用于确定细胞是否已被编辑的方法。在某些实施方案中，所述方法包括用编码抗原结合受体和2a肽或其片段的载体转导或转染细胞，并检测细胞中2a肽或其片段的表达水平。在某些实施方案中，2a肽或其片段的检出与基因编辑的效率相关。在某些实施方案中，2a肽或其片段的不存在与基因编辑的无效率有关。
[0133]
在某些实施方案中，抗原结合受体是t细胞受体(tcr)。在某些实施方案中，载体包括第一和第二同源臂，其与第一和第二靶核酸序列同源并且定向以促进同源重组。在某些实施方案中，载体包括编码位于第一和第二同源臂之间的tcr的核苷酸序列。在某些实施方案中，载体包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码位于编码tcr多肽的核苷酸序列上游的2a核糖体跳跃元件，所述第二核苷酸序列编码位于编码tcr多肽的核苷酸序列下游的2a核糖体跳跃元件。在某些实施方案中，编码2a核糖体跳跃元件的第一和第二核苷酸序列具有相同的氨基酸序列并且相对于彼此是密码子发散的。
[0134]
在某些非限制性实施方案中，本公开提供了用于批量释放用于过继细胞疗法的细胞群的方法。在某些实施方案中，所述方法包括用包含抗原结合受体和2a肽或其片段的载体转导或转染细胞群，检测表达2a肽或其片段的细胞的量，和当表达2a肽或其片段的细胞的量高于阈值时，释放细胞群用于治疗用途。
[0135]
在某些实施方案中，抗原结合受体是t细胞受体(tcr)。在某些实施方案中，载体包括第一和第二同源臂，其与第一和第二靶核酸序列同源并且定向以促进同源重组。在某些实施方案中，载体包括编码位于第一和第二同源臂之间的tcr的核苷酸序列。在某些实施方案中，载体包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码位于编码tcr多肽的核苷酸序列上游的2a核糖体跳跃元件，所述第二核苷酸序列编码位于编码tcr多肽的核苷酸序列下游的2a核糖体跳跃元件。在某些实施方案中，编码2a核糖体跳跃元件的第一和第二核苷酸序列具有相同的氨基酸序列并且相对于彼此是密码子发散的。在某些实施方案中，阈值通过以下公式计算：
[0136][0137]
在某些实施方案中，阈值是至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至
少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％。
[0138]
6.示例性实施方案
[0139]
在某些实施方案中，本公开涉及确定受试者中过继细胞疗法的存在的方法，包括：在来自已接受过继细胞疗法的受试者的样品中检测2a肽的表达水平，其中过继细胞疗法包括表达2a肽或其片段的细胞。
[0140]
在本文所公开的方法的某些实施方案中，2a肽或其片段的检出与过继细胞疗法的存在相关。在本文所公开的方法的某些实施方案中，2a肽或其片段的不存在与过继细胞疗法的无效率有关。在本文所公开的方法的某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1天至30天之间。在本文所公开的方法的某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1个月至12个月之间。在本文所公开的方法的某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1年至5年之间。
[0141]
在某些实施方案中，本公开涉及在已经接受过继细胞疗法的受试者中监测过继细胞疗法的持久性的方法，包括：在来自受试者的第一时间点的样品中检测2a肽或其片段的表达水平；以及在来自受试者的第二时间点的样品中检测2a肽或其片段的表达水平；其中过继细胞疗法包括表达2a肽的细胞，并且其中在第二时间点的样品中2a肽或其片段的检出与过继细胞疗法的持久性相关。
[0142]
在某些实施方案中，本公开涉及在已经接受过继细胞疗法的受试者中监测过继细胞疗法的持久性的方法，包括：在来自受试者的第一时间点的样品中检测2a肽或其片段的表达水平；以及在来自受试者的第二时间点的样品中检测2a肽或其片段的表达水平；其中过继细胞疗法包括表达2a肽的细胞，并且其中在第二时间点的样品中2a肽或其片段的不存在与过继细胞疗法的无效率相关。在本文公开的方法某些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用第二过继细胞疗法。
[0143]
在一些实施方案中，本公开涉及在已接受过继细胞疗法的受试者中监测过继细胞疗法的增殖的方法，包括：在来自受试者的第一时间点的样品中检测表达2a肽或其片段的细胞的量；和在来自受试者的第二时间点的样品中检测表达2a肽或其片段的细胞的量；其中当相对于在第一时间点的样品中表达2a肽或其片段的细胞的量，在第二时间点的样品中表达2a肽或其片段的细胞的量增加时，发生过继细胞疗法的增殖。
[0144]
在一些实施方案中，本公开涉及在已接受过继细胞疗法的受试者中监测过继细胞疗法的增殖的方法，包括：在来自受试者的第一时间点的样品中检测表达2a肽或其片段的细胞的量；和在来自受试者的第二时间点的样品中检测表达2a肽或其片段的细胞的量；其中当相对于在第一时间点的样品中表达2a肽或其片段的细胞的量，在第二时间点的样品中表达2a肽或其片段的细胞的量减少或相同时，不发生过继细胞疗法的增殖。
[0145]
在本文公开的方法的某些实施方案中，第二时间点发生在第一时间点之后的1天至30天之间。在本文公开的方法的某些实施方案中，第二时间点发生在第一时间点之后的1个月至12个月之间。在本文公开的方法的某些实施方案中，第二时间点发生在第一时间点之后的1年至5年之间。
[0146]
在本文公开的方法的某些实施方案中，细胞是细胞产品。在本文公开的方法的某些实施方案中，细胞是neotcr产品。在本文公开的方法的某些实施方案中，样品是血液样
品。在本文公开的方法的某些实施方案中，样品是肿瘤样品。在本文公开的方法的某些实施方案中，受试者是人。在本文公开的方法的某些实施方案中，受试者患有癌症。在本文公开的方法的某些实施方案中，通过流式细胞术检测2a肽或其片段。在本文公开的方法的某些实施方案中，通过免疫组织化学(ihc)检测2a肽或其片段。在本文公开的方法的某些实施方案中，ihc是chipcytometry。
[0147]
在某些实施方案中，本公开涉及用过继细胞疗法治疗的受试者的预后的方法，包括：在来自受试者的样品中检测2a肽或其片段的表达水平，其中过继细胞疗法包括表达2a肽或其片段的细胞，并在来自受试者的样品中确定2a肽或其片段的表达水平，其中2a肽或其片段的检出与过继细胞疗法的功效相关。在某些实施方案中，本公开涉及用过继细胞疗法治疗的受试者的预后的方法，包括：在来自受试者的样品中检测2a肽或其片段的表达水平，其中过继细胞疗法包括表达2a肽或其片段的细胞，并在来自受试者的样品中确定2a肽或其片段的表达水平，其中2a肽或其片段的未检出与过继细胞疗法的降低的功效相关。
[0148]
在本文公开的方法的某些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用第二过继细胞疗法。在本文所公开的方法的某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1天至30天之间。在本文所公开的方法的某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1个月至12个月之间。在本文所公开的方法的某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1年至5年之间。
[0149]
在本文公开的方法的某些实施方案中，细胞是细胞产品。在本文公开的方法的某些实施方案中，细胞是neotcr产品。在本文公开的方法的某些实施方案中，样品是血液样品。在本文公开的方法的某些实施方案中，样品是肿瘤样品。在本文公开的方法的某些实施方案中，受试者是人。在本文公开的方法的某些实施方案中，受试者患有癌症。在本文公开的方法的某些实施方案中，通过流式细胞术检测2a肽或其片段。在本文公开的方法的某些实施方案中，通过ihc检测2a肽或其片段。在本文公开的方法的某些实施方案中，ihc是chipcytometry。
[0150]
在某些实施方案中，本公开涉及在已接受过继细胞疗法的受试者中治疗癌症的方法，其中过继细胞疗法包括表达2a肽或其片段的细胞，该方法包括：在来自受试者的样品中检测2a肽或其片段的表达水平，其中2a肽或其片段的不存在或检出减少与过继细胞疗法的无效率相关；当2a肽的表达水平缺失或降低时，施用第二过继细胞疗法。
[0151]
在本文所公开的方法的某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1天至30天之间。在本文所公开的方法的某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1个月至12个月之间。在本文所公开的方法的某些实施方案中，2a肽或其片段的检测发生在受试者接受过继细胞疗法后1年至5年之间。
[0152]
在本文公开的方法的某些实施方案中，细胞是细胞产品。在本文公开的方法的某些实施方案中，细胞是neotcr产品。在本文公开的方法的某些实施方案中，样品是血液样品。在本文公开的方法的某些实施方案中，样品是肿瘤样品。在本文公开的方法的某些实施方案中，受试者是人。在本文公开的方法的某些实施方案中，通过流式细胞术检测2a肽或其片段。在本文公开的方法的某些实施方案中，通过ihc检测2a肽或其片段。在本文公开的方法的某些实施方案中，ihc是chipcytometry。
[0153]
在本文公开的方法的某些实施方案中，2a肽或其片段是剪切的2a肽。在本文公开
的方法的某些实施方案中，2a肽选自包含p2a、t2a、e2a和f2a肽的组。在本文公开的方法的某些实施方案中，2a肽是p2a或t2a肽。在本文公开的方法的某些实施方案中，2a肽是p2a肽。
[0154]
在本文公开的方法的某些实施方案中，使用抗2a抗体或其抗原结合部分检测2a肽或其片段。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分交叉竞争与2a肽的结合，其中参考抗体或抗原结合部分是3h4抗体。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分与2a肽的相同表位结合，其中，参考抗体或其抗原结合部分，其中参考抗体或抗原结合部分是3h4抗体。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分交叉竞争与2a肽的结合，其中参考抗体或抗原结合部分是abs31抗体。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分与2a肽的相同表位结合，其中，参考抗体或其抗原结合部分，其中参考抗体或抗原结合部分是abs31抗体。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体或其抗原结合部分是3h4抗体。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体或其抗原结合部分是abs31抗体。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体与具有seq id no:3中所述氨基酸序列的表位结合。
[0155]
在某些实施方案中，本公开涉及确定细胞是否已被编辑的方法，包括用编码抗原结合受体和2a肽的载体转导或转染细胞；检测细胞中2a肽或其片段的表达水平；其中2a肽或其片段的检出与基因编辑的效率相关。在某些实施方案中，本公开涉及确定细胞是否已被编辑的方法，包括用编码抗原结合受体和2a肽的载体转导或转染细胞；检测细胞中2a肽或其片段的表达水平；其中2a肽或其片段的缺失与基因编辑的无效率相关。
[0156]
在本文公开的方法的某些实施方案中，抗原结合受体是t细胞受体(tcr)。在本文公开的方法的某些实施方案中，载体包括第一和第二同源臂，其与第一和第二靶核酸序列同源，并定向为促进同源重组；核苷酸序列，其编码位于第一和第二同源臂之间的tcr；以及第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码位于编码tcr多肽的核苷酸序列上游的2a核糖体跳跃元件，所述第二核苷酸序列编码位于编码tcr多肽的核酸序列下游的2a核糖体跳跃元件，其中，编码2a核糖体跳跃元件的第一和第二核苷酸序列具有相同的氨基酸序列，并且相对于彼此是密码子发散的。
[0157]
在某些实施方案中，本公开涉及批量释放用于过继细胞疗法的细胞群的方法，包括：用包含抗原结合受体和2a肽的载体转导或转染细胞群；检测表达2a肽或其片段的细胞数量；当表达2a肽的细胞数量超过阈值时，释放细胞群用于治疗用途。
[0158]
在本文公开的方法的某些实施方案中，抗原结合受体是t细胞受体(tcr)。在本文公开的方法的某些实施方案中，载体包括第一和第二同源臂，其与第一和第二靶核酸序列同源，并定向为促进同源重组；核苷酸序列，其编码位于第一和第二同源臂之间的tcr；以及第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码位于编码tcr多肽的核苷酸序列上游的2a核糖体跳跃元件，所述第二核苷酸序列编码位于编码tcr多肽的核酸序列下游的2a核糖体跳跃元件，其中，编码2a核糖体跳跃元件的第一和第二核苷酸序列具有相同的氨基酸序列，并且相对于彼此是密码子发散的。在本文公开的方法的某些实施方案中，阈值通过以下公式计算：
[0159]
[0160]
在本文公开的方法的某些实施方案中，阈值等于或大于5％。在本文公开的方法的某些实施方案中，细胞群包括细胞产品。在本文公开的方法的某些实施方案中，细胞群包括neotcr产品。在本文公开的方法的某些实施方案中，通过流式细胞术检测2a肽或其片段。在本文公开的方法的某些实施方案中，通过ihc检测2a肽或其片段。在本文公开的方法的某些实施方案中，ihc是chipcytometry。
[0161]
在本文公开的方法的某些实施方案中，2a肽是剪切的2a肽。在本文公开的方法的某些实施方案中，2a肽选自包含p2a、t2a、e2a和f2a肽的组。在本文公开的方法的某些实施方案中，2a肽是p2a或t2a。在本文公开的方法的某些实施方案中，2a肽是p2a。
[0162]
在本文公开的方法的某些实施方案中，使用抗2a抗体或其抗原结合部分检测2a肽或其片段。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分交叉竞争与2a肽的结合，其中参考抗体或抗原结合部分是3h4抗体。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分与2a肽的相同表位结合，其中，参考抗体或其抗原结合部分，其中参考抗体或抗原结合部分是3h4抗体。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分交叉竞争与2a肽的结合，其中参考抗体或抗原结合部分是abs31抗体。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体与参考抗体或其抗原结合部分与2a肽的相同表位结合，其中，参考抗体或其抗原结合部分,其中参考抗体或抗原结合部分是abs31抗体。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体或其抗原结合部分是3h4抗体。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体或其抗原结合部分是abs31抗体。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体与具有seq id no:3中所述氨基酸序列的表位结合。
[0163]
在某些实施方案中，本公开涉及用细胞产品治疗患者的方法，该方法包括：向需要其的患者施用细胞产品，在未来的时间点从患者抽取血液或收集肿瘤样品，并使用facs或ihc分析分析血液或肿瘤样品，以使用抗2a抗体确定2a肽或其抗体结合片段是否存在，其中，如果检出2a肽或其抗体结合片段，则细胞产品存在并持久存在于患者中，如果未检出2a肽或其抗体结合片段，那么细胞产品不再在患者中检出，其中，如果细胞产品存在且持久存在，该产品在植入患者时有效，且不对患者施用额外的治疗，其中，如果不存在细胞产品，则该产品在植入到患者时不是有效的，并对患者施用新的疗法。
[0164]
在本文公开的方法的某些实施方案中，细胞产品是neotcr产品。在本文公开的方法的某些实施方案中，患者是癌症患者。在本文公开的方法的某些实施方案中，未来的时间点选自1-10天、11-30天、31-90天、91-180天和181-365天之间的时间点。在本文公开的方法的某些实施方案中，未来的时间点选自1-2年、2-5年、5-10年、10-20年和20-50年之间的时间点。
[0165]
在某些实施方案中，本公开涉及使用facs检测细胞产品的细胞中剪切的2a肽或其抗体结合片段的方法，包括以下方法之一：a)方法1，包括：用活/死标记染色细胞，用固定剂固定细胞，用目标细胞表面标志物对细胞染色，用具有抗2a抗体的透化缓冲液对细胞染色，用固定剂固定细胞；b)方法2，包括：用活/死标记染色细胞，用目标细胞表面标志物对细胞染色，用固定剂固定细胞，用具有抗2a抗体的透化缓冲液染色细胞，用固定剂固定细胞；和c)方法3包括：用活/死标记染色细胞，用目标细胞表面标志物对细胞染色，用具有抗2a抗体的透化缓冲液对细胞染色，用固定剂固定细胞；其中，使用facs分析在流式细胞仪上分析方
法1、2或3中的染色的细胞。在本文公开的方法的某些实施方案中，使用实施例2和/或3中描述的方法对细胞进行基因编辑。
[0166]
在某些实施方案中，本公开涉及确定用细胞产品治疗的患者的预后的方法，该方法包括：向需要其的患者施用细胞产品，在未来的时间点从患者抽取血液或收集肿瘤样品，并使用facs或ihc分析分析血液或肿瘤样品，以使用抗2a抗体确定2a肽或其抗体结合片段是否存在，其中，如果检出2a肽或其抗体结合片段，则细胞产品存在并持久存在于患者中，如果未检出2a肽或其抗原结合片段，那么细胞产品不再存在于患者中，其中，如果细胞产品存在且持久存在，患者的预后是对细胞产品疗法反应良好，其中如果细胞产品不存在，则患者的预后是对细胞产品疗法反应不良。
[0167]
在本文公开的方法的某些实施方案中，细胞产品是neotcr产品。在本文公开的方法的某些实施方案中，患者是癌症患者。在本文公开的方法的某些实施方案中，良好预后是对细胞疗法的部分或完全反应。在本文公开的方法的某些实施方案中，不良预后是对细胞疗法和/或疾病进展没有反应。
[0168]
在某些实施方案中，本公开涉及在输注细胞产品后在患者中确定细胞产品的持久性和/或存在性的方法，该方法包括：在施用细胞产品后的时间点从患者抽取血液或收集肿瘤样品，以及使用facs或ihc分析分析血液或肿瘤样品，以使用抗2a抗体确定是否存在2a肽或其抗体结合片段，其中如果使用抗2a抗体检出2a肽或者其抗体结合片段，则在患者中细胞产品存在并持久存在。
[0169]
在某些实施方案中，本公开涉及在输注细胞产品后在患者中确定细胞产品的增殖的方法，该方法包括：在施用细胞产品后的两个或多个时间点从患者抽取血液或收集肿瘤样品，使用facs或ihc分析分析血液或肿瘤样品，以使用抗2a抗体确定2a肽或其抗体结合片段是否存在，并确定在两个或多个时间点用抗2a抗体染色的细胞数量之间的差异，其中，在第一时间点和第二时间点之间，用抗2a抗体染色的细胞数量增加是细胞增殖的证据，其中，在第一时间点和第二时间点之间用抗-2a抗体染色的细胞数量减少或没有增加是细胞没有增殖的证据。
[0170]
在某些实施方案中，本公开涉及检测基因编辑反应的基因编辑率的方法，该方法包括：用抗2a肽抗体对来自基因编辑反应产生的细胞进行透化和染色，使用facs或ihc对细胞进行分类，以确定未染色和染色的细胞数，并使用以下计算方法计算基因编辑率：(抗2a抗体染色阳性的细胞数)/(细胞总数)。在本文公开的方法的某些实施方案中，透化和染色细胞选自由本文公开的方法1、方法2和方法3组成的组。
[0171]
在某些实施方案中，本公开涉及定性细胞产品合格用于释放，用于治疗需要其的患者的方法，该方法包括：提取细胞产品的样品，使用facs或ihc分析分析样品，以使用抗2a抗体确定2a肽或其抗体结合片段是否存在，并确定编辑的细胞的百分比，其中，如果编辑的细胞的百分比符合用于释放的产品标准，则释放细胞产品用于治疗患者。
[0172]
在本文公开的方法的某些实施方案中，编辑的细胞的百分比使用以下公式确定：(抗2a抗体染色阳性的细胞数)/(细胞总数)。在本文公开的方法的某些实施方案中，用于释放的产品标准是至少5％的基因编辑的细胞。在本文公开的方法的某些实施方案中，未来的时间点选自1-10天、11-30天、31-90天、91-180天和181-365天之间的时间点。在本文公开的方法的某些实施方案中，未来的时间点选自1-2年、2-5年、5-10年、10-20年和20-50年之间
的时间点。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体结合表位dveenpg(seq in no:3)。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体是3h4或abs31抗体。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体与3h4和/或abs31抗体竞争结合。在本文公开的方法的某些实施方案中，抗2a抗体与3h4和/或abs31抗体结合相同的表位。在本文公开的方法的某些实施方案中，ihc是chipcytometry。
实施例
[0173]
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上面提供的大体描述，可以实施各种其他实施方案。
[0174]
实施例1将基因插入内源基因座
[0175]
将含有目标基因的构建体插入内源基因座。这是通过使用同源修复模板来完成的，该模板包含侧翼为左右hr臂的目标基因的编码序列。除了hr臂之外，目标基因还夹在2a肽、2a肽上游的蛋白酶切割位点(以从上游翻译的目标基因中去除2a肽)，和信号序列之间(图2a)。一旦整合到基因组中，目标基因就被转录为单信使rna。在该目的基因信使rna的翻译过程中，侧翼区域通过自剪切2a肽与目的基因断开连接，蛋白酶切割位点被切割以去除翻译的目的基因上游的2a肽(图2b)。除了2a肽和蛋白酶切割位点之外，还在每个2a肽之前插入了甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸(gsg)接头，以进一步增强表达盒中目的基因与其他元件的分离。
[0176]
已确定p2a肽用于细胞产品时优于其他2a肽，因为它具有高效的剪切能力。因此，使用两(2)个p2a肽和密码子分散来表达目标基因，而不从p2a肽的目标基因任一端的剩余氨基酸中引入任何外源表位(通过使用蛋白酶切割位点)并且p2a肽被特别选择作为选择的2a肽与密码子分散相结合，以避免具有会导致基因组不稳定和缺失的串联重复(密码子分散元件)。没有外源表位的基因编辑的细胞(即目标基因两侧没有侧翼p2a肽氨基酸)的益处是1)免疫原性降低，2)输注含有基因编辑的细胞的细胞产品的患者对所述基因编辑的细胞具有免疫反应的可能性较小，以及3)增加neotcr在基因编辑的细胞中正常发挥作用的机会，因为没有n或c末端融合。
[0177]
实施例2使用2a肽在tcrα基因座中整合neotcr来制备neotcr产品。
[0178]
如pct/us/2018/058230中所述，neotcr被整合到t细胞的tcrα基因座中。具体而言，使用了同源修复模板，该模板包含侧翼为左和右hr臂的neotcr编码序列。此外，内源性tcrβ基因座被破坏，导致仅由neotcr构建体编码的tcr序列的表达。大体策略使用环状hr模板以及线性模板进行应用。
[0179]
新抗原特异性tcr构建体设计在图3a和3b中示出。靶标tcrα基因座(cα)与质粒hr模板一起示出，并示出了所得编辑的序列和下游mrna/蛋白质产物。示出了靶标tcrα基因座(内源性trac)及其crispr cas9靶标位点(水平条带，由箭头指示剪切位点)(图3a)。示出了位于左右同源臂之间(分别为“lha”和“rha”)的具有编码neotcr的多核苷酸的环状质粒hr模板。示出了通过密码子优化的hr模板引入的trac区域(垂直条纹)。tcrβ恒定结构域源自trbc2，其表明在功能上与trbc1等同。neotcr盒中的其他元件包括：2a＝p2a核糖体跳跃元件；f＝2a上游的弗林蛋白酶切割位点，其从上游tcrβ蛋白中去除2a标签；hgh＝人生长激素信号序列。neotcr表达基因盒的hr模板包括两个侧翼同源臂，用于直接插入crispr cas9核
酸酶rnp与tcrα向导rna靶向的tcrα基因座中。这些同源臂(lha和rha)位于neotcr表达基因盒的neoe特异性tcr序列的侧翼。虽然本实施例中使用的蛋白酶切割位点是弗林蛋白酶切割位点，但可以使用本领域技术人员已知的任何合适的蛋白酶切割位点。类似地，虽然hgh是为该实施例选择的信号序列，但可以基于所需的运输选择和使用本领域技术人员已知的任何信号序列。
[0180]
一旦整合到基因组中(图3b)，neotcr表达基因盒就从内源性tcrα启动子转录为单个信使rna，其仍包括来自该个体t细胞的内源性tcrα多肽的一部分(图3b)。在此单个neotcr信使rna的核糖体多肽翻译过程中，neotcr序列通过p2a肽处的自剪切与内源性、crispr破坏的tcrα多肽分开(图3b)。编码的neotcrα和neotcrβ多肽也通过内源性细胞人弗林蛋白酶和neotcr表达基因盒中包含的第二自剪切p2a序列基序的切割而彼此分开(图5b)。neotcrα和neotcrβ多肽分别被信号前导序列(源自人生长激素，hgh)靶向内质网，用于多聚体组装并将neotcr蛋白复合体运输到t细胞表面。包含弗林蛋白酶切割位点有助于从上游tcrβ链中去除2a序列，以减少对tcrβ功能的潜在干扰。在每个2a(未示出)之前包含gly-ser-gly接头进一步增强了三种多肽的分离。
[0181]
此外，三个重复的蛋白质序列在hr模板内是密码子分散的以促进基因组稳定性。tcr基因盒内的两个p2a相对于彼此以及两个hgh信号序列相对于彼此是密码子分散的，以促进引入的neotcr盒序列在离体工程化t细胞基因组内的稳定性。相似地，重新引入的trac外显子1(垂直条纹)的5'末端通过去除两个直接重复的间插序列，降低了整个盒随时间丢失的可能性。
[0182]
实施例3使用2a肽在基因座中整合目标基因来制备细胞产品。
[0183]
如上文实施例2中所述，2a肽可用在线性或环形构建体中，位于目标基因(在实施例2中为tcrα)两端的侧翼，并通过非病毒方法(在实施例2中为crispr/cas9)将目标基因插入细胞基因组，以便翻译和表达成活性蛋白。
[0184]
类似地，可以使用2a肽和非病毒方法，使用本领域已知的任何合适的核酸酶，将目标基因插入基因组。例如，这些核酸酶包括但不限于锌指核酸酶(zfn)、归巢内切核酸酶、talen、crispr/cas(cas而非cas9)。
[0185]
其中2a肽可用于基因编辑的非核酸酶、非病毒方法的实例包括但不限于通过转座进行基因添加，包括但不局限于tc1/mariner、pif/harbinger、hat、增变基因(mutator)、merlin、transib、p,piggybac和cacta。重组包括cre、flp、phic31。此外，可以使用任何同源定向修复编辑，包括先导编辑(prime editing)。
[0186]
此外，在适当的情况下，基因编辑和基因整合的病毒方法可以与插入基因组的目标基因侧翼的2a肽一起使用。病毒方法的非限制性实例包括靶向整合(包括但不限于aav)和随机整合(包括但不限于慢病毒方法)。
[0187]
使用上述或本领域技术人员已知的任何基因编辑方法，可以设计适当的构建体以包括侧翼为2a肽的目标基因。其他功能元件，包括但不限于信号序列、酶和蛋白酶切割位点，也可以包括在用于基因编辑的构建体中(包括目标基因的转录、剪接、翻译和加工)。
[0188]
或者，使用上述或本领域技术人员已知的任何基因编辑方法，可以设计适当的构建体以包括一个或多个目标基因，构建体中包括一个或多个2a肽以分隔基因。2a肽的这种使用可用于例如病毒或非病毒基因编辑方法。此类病毒方法的实例包括但不限于本文所述
的靶向和非靶向方法。其他功能元件，包括但不限于信号序列、酶和蛋白酶切割位点，也可以包括在用于基因编辑的构建体中(包括目标基因的转录、剪接、翻译和加工)。
[0189]
构建体可以是线性的或环形的(例如，质粒)和双链或单链的。图2a中提供了旨在将目标基因插入细胞基因组中的质粒构建体的实例。如图2a所示，目标基因侧翼为2a肽序列，并包括任选的信号序列和蛋白酶切割位点。图2b示出了一旦整合到基因组中，目标基因的翻译和加工。
[0190]
这种在目标基因的侧翼末端包括2a肽的方法可用于制备细胞产品，所述细胞产品具有插入细胞基因组的任何目标基因。
[0191]
实施例4通过细胞内流式细胞术的p2a肽染色作为基因编辑效率的直接评估。
[0192]
如图2a、2b、3a和3b所示，可以将目标基因改造到特定细胞基因组中的特定基因座，例如原代细胞(例如t细胞或nk细胞)，而没有在转基因上产生源于在改造步骤中使用的2a肽的侧翼端的非內源性表位(即，没有产生与递送的基因的非天然融合)。因此，最终翻译的产品是目标基因，没有任何侧翼末端。这对于体内使用和用于患者施用的细胞疗法是最佳选择，因为没有产生非天然融合，其导致细胞产品对产品不良反应的机会降低(包括但不限于抗药物抗体反应的机会降低)和/或具有neotcr的细胞产品，所述具有neotcr的细胞产品由于n和c末端融合而具有修饰的功能；但是，如果没有标签，它对以下有效和准确测试以下提出了挑战：1)确认细胞表达目标基因，2)确认一旦施用，细胞能够在患者中持久存在并分裂。当目标基因是天然蛋白(即患者天然产生的蛋白质)时，此问题被进一步放大。这是因为对目标基因翻译的蛋白质的检测与天然发生的基因相似、基本相似和/或相同。因此，为了基于翻译的蛋白质检测患者或细胞池中基因编辑的细胞，有必要检测基因编辑的细胞的非天然成分，而不是目标基因本身的翻译的蛋白质。
[0193]
通过信使rna和pcr检测基因编辑的细胞，尤其是用天然序列编辑的细胞的能力是困难、昂贵且耗时的，并且需要不是对每个诊所/医院都可得到的设备。在时间对患者的益处至关重要的临床环境中，需要一种基于蛋白质的检测阳性基因编辑的细胞的方法。本文描述了这种技术，并解决了细胞疗法世界中这种未满足的需求。
[0194]
基于这种未满足的需求，开发了一种测定方法来检测剪切的2a肽，所述2a肽仍保留细胞内，而目标基因被翻译并运输到其所需的位置。对于tcr，目标基因的所需位置是细胞膜。
[0195]
预期这种细胞内检测剪切的2a肽不会成功。具体而言，2a肽是小肽(见图1)，从目标蛋白质剪切后，它们成为原始肽的片段。这种小肽和蛋白质片段(即上游部分tra)预计会在细胞内快速循环和降解，并且使用抗体可以在细胞内部分检出剪切的肽是出乎意料的(见图4)。还出乎意料和发现的是，如图4所示的带有2a肽的截短的neotcr保留在内质网中，并且细胞内存在最小的2a肽。
[0196]
2a肽染色可在细胞透化时容易地检出。在使用实施例2中描述的2a肽非病毒基因编辑方法将neotcr整合到tcrα基因座后，对产生的基因编辑的neotcr细胞中2a肽的抗2a肽抗体检测进行测试(图5a)。使用与2a肽的dveenpg(seq id no:3)表位结合的抗2a抗体。该表位是通过分析t2a、p2a、e2a和f2a序列的序列重叠来确定的(见图1中的粗体序列)。基于p2a剪切，确定需要找到与p2a肽的agdveenpg(seq id no:4)序列结合的抗p2a抗体(见图1，p2a肽的双下划线序列)。如图1所示，t2a肽的单下划线序列代表根据制造商，为t2a肽的蛋
白质印迹检测而设计的novus biologicals 3h4单克隆抗体(“3h4抗体”)识别的表位。鉴于3h4抗体能够结合t2a和p2a，确定用抗2a抗体检测的关键表位为dveenpg(seq id no:3)。本文呈现的实验表明，3h4抗体与p2a肽结合(图5a和5b)。
[0197]
本实验使用标记有alexa fluor 647的3h4抗体。确定有必要使用facs对2a肽特异性染色的细胞进行透化(图5b)。任何具有正确吸收/发射光谱的荧光团均可用于facs分析。这表明剪切的2a肽是细胞内的，尽管剪切的2a肽在细胞溶质中快速更新和降解，但可能用与2a肽结合的抗体检测剪切的2a肽是出乎意料的。具体而言，示出与2a肽的dveenpg(seq id no:3)序列结合的抗体能够检测细胞的细胞内空间中的剪切的2a肽。总之，剪切的2a肽在细胞表面上无法检测到，如需要使细胞透化以实现特异性染色所证明。
[0198]
图5b所示的facs分析的门控设置在淋巴细胞、活的单细胞和cd8+上。如图所示，未透化的细胞中未出现3h4抗体染色，细胞透化时出现染色。
[0199]
图5a所示的facs分析是在透化的活细胞上进行门控的。如图所示，模拟品转染的细胞(即未经基因编辑的细胞)不表达任何2a肽，也没有任何3h4抗体染色。相比之下，用1、3或5微升3h4抗体染色的基因编辑的细胞(neotcr-2细胞)均示出在透化的细胞中检出细胞内2a。
[0200]
对透化细胞进行了额外的facs实验，以确认2a染色对基因编辑的细胞是特异性的。这是通过双重染色完成的：1)用3h4(alexa fluor647/apc)对2a肽进行染色，2)结合pe标记的dextramer(图6)。dextramer是一种检测使用本文所述基因编辑方法引入细胞的neotcr的标签。3h4抗体检测在如本文所述的基因编辑的neotcr构建体翻译期间剪切的2a肽。如fmo和同种型(apc)列所示，鉴于fmo和同种型列不包括暴露于3h4抗体，期望没有2a肽背景信号。“模拟品”行是第二对照。这一行是未经基因编辑的细胞。正如预期的那样，没有dextramer信号和2a肽信号。与模拟品行相反，基因编辑的第1行和第2行是由facs分选的细胞，这些细胞已使用本文所述的方法进行基因编辑以表达neotcr(包括使用2a肽)。如基因编辑的第1行(neotcr-2)和第2行(neotcr-1)所示，右上象限(q2)显示对dextramer(即neotcr信号)和2a肽(即成功基因编辑的证据)均呈阳性的大量细胞。这一发现是出乎意料的。具体地，出乎意料的是，1)鉴于剪切的2a肽的大小和快速循环/细胞加工，可能使用facs检测剪切的2a肽；2)由于科学文献排除了抗体的此类用途，更重要的是推荐了非facs检测方法，如其中使用细胞池的全细胞裂解物(与facs的单细胞检测相反)的蛋白质印迹，facs是一种用单克隆抗体检测剪切的2a肽的可行方法。即使3h4抗体制造商提供的文献也没有将facs列为2a肽检测的可行选项。尤其是2a肽，这也是出乎意料的，因为与蛋白质印迹抗体相比，流式抗体必须是高度特异的(其中基于大小可以忽略噪声)。2a肽序列的大小和序列非常有限，从中可以获得不同的抗体(没有很多表位/选项)。因此，预计产生的少数克隆不适合流式细胞术，而且发现3h4有效的事实是令人惊讶和预料不到的。
[0201]
表1实施例中使用的基因编辑的细胞
[0202][0203][0204]
检测剪切的2a肽对生产neotcr产品至关重要的两个关键原因是：1)某些neotcr不是dextramer的强结合物，2)dextramer必须对每个neotcr是特异的，这对于个性化药物来说既昂贵又复杂。实际上neotcr不是dextramer的强结合物，而可能是cd4 t细胞群的副产物，这些细胞群是使用本文描述的方法或方法的修改进行基因编辑的。具体而言，虽然推测天然发生的mhc-i tcr需要同时存在的cd8辅助受体帮助来稳定肽mhc结合，但高亲和力tcr驱动cd8独立的靶结合和t细胞激活。cd4 t细胞在使用高亲和力neotcr进行改造时，因此能够识别肽-mhc-i靶标并触发效应t细胞功能。然而，较低亲和力的tcr依赖于cd8辅助受体来触发t细胞激活。因此，在facs分析中，低亲和力tcr可能无法有效结合dextramer，以确定细胞是否被基因编辑。
[0205]
因此，具有检测基因编辑的能力而不必依赖于通过dextramer结合检测neotcr的插入，为以前未解决的问题提供了解决方案。设计实验以确认在没有用dextramer检测neotcr的情况下，使用facs和cd4 t细胞中的抗2a肽抗体检出剪切的2a肽(图7)。
[0206]
图7显示了来自neotcr-3、neotcr-4、neotcr-5和neotcr-6的基因编辑的cd4 t细胞(淋巴细胞、单线态、活细胞和cd4+细胞上的facs门控)(见表1)。对于neotcr-3，用dextramer检测neotcr，通过3h4抗2a肽抗体检测剪切的2a肽(右上象限(q2))。这表明neotcr是一种高亲和力的neotcr，其能够以cd8独立方式结合dextramer。与neotcr-3不同，neotcr4-6显示出很少的dextramer结合(左上象限(q1)和右上象限(q2))。尽管有最低限度的dextramer染色，但neotcr 4-6示出剪切的2a肽(右下象限(q3))的实质性检测。因此，使用facs在受益于cd8辅助受体的低亲和力neotcr中，使用抗2a肽抗体检测剪切的2a肽，确认了基因编辑。此外，2a肽染色与dextramer染色独立，不使用dextramer染色的cd4 t细胞容易与使用dextramer染色的cd8 t细胞以相似水平染色。
[0207]
检测剪切的2a肽很重要的另一个关键原因是，在t细胞刺激期间，tcr可以下调，而neotcr编辑的细胞无法通过dextramer结合来鉴别。使用抗2a肽抗体检测基因编辑发生的能力也在未刺激的cd8 t细胞和刺激的cd8t细胞中进行了测试(图8)。用transact刺激受刺激的cd8 t细胞18小时。图8所示的facs分析门控为淋巴细胞、单线态、活细胞和cd8+细胞，
并在基因编辑的细胞neotcr-4、neotcr-5和neotcr 6上进行。这表明neotcr在刺激后被内化(右上象限(q2)染色丢失)，因此显示出最小的dextramer染色。尽管如此，抗2a抗体仍然能够检测到细胞内剪切的2a肽，证明抗2a肽抗体可以使用facs检测剪切的2a肽作为检测基因编辑细胞的一种度量。虽然transact用于图8所示的实验，但也可以使用本领域技术人员已知的其他激活机制，包括但不限于用cd3和cd28或同源compact分子刺激。
[0208]
还证实，基因编辑的t细胞的不同刺激水平(使用neotcr的同源肽)不会影响使用抗2a肽抗体通过facs检测剪切的2a肽的能力(图9)。如图所示，无论用于刺激基因编辑的t细胞的同源肽的数量如何，根据刺激可以检测到剪切的2a肽并保持不变。具体而言，表明刺激似乎会降低使用抗2a肽抗体检出的剪切的2a肽的强度，但在类似(尽管略低)百分比的细胞上仍然可以检测到剪切的2a肽，甚至在由于内化作用，基本上无法检测到dextramer染色时。
[0209]
总之，通过与内质网中2a表位标记的截短的neotcrα链可变区多肽结合，用抗2a肽抗体进行2a肽染色直接测量细胞中的基因编辑。抗体接近其表位需要细胞的透化。这种染色是特异性的，因为这种染色在模拟品转染的细胞中未观察到，在cd4和cd8 t细胞结合dextramer的细胞的基因编辑的细胞群中，仅在dextramer阳性细胞上观察到。该技术可有效地对cd4 t细胞进行染色，以评估其中dextramer不与cd4 t细胞结合的neotcr的基因编辑情况。对最近刺激的细胞进行染色也很有效，这些细胞已经将其neotcr内化到使用dextramer不染色的程度。在后一种情况下，值得注意的是2a+细胞的百分比略有降低，染色的平均荧光强度也有所降低。总的来说，这些实验表明，抗2a抗体可以直接使用facs容易地评估基因编辑的t细胞。
[0210]
实施例5使用抗2a抗体检测基因编辑率(即基因编辑的细胞的百分比或基因编辑的细胞的比例)的方法。
[0211]
不仅需要检测细胞是否已成功进行基因编辑，还需要能够检测基因编辑率。这是使用实施例4中描述的方法完成的。具体而言，对经过实施例1-3中公开的基因编辑过程的一批细胞进行facs分析，用抗2a肽抗体染色，并使用facs计算基因编辑的细胞的百分比，使得用抗2a肽抗体染色的细胞被确定为进行了基因编辑，未用抗2a肽抗体染色的细胞被确定为未进行编辑。这允许确定基因编辑方法的效率，并使用以下计算方法确定成功的基因编辑的百分比：(抗2a抗体染色阳性的细胞数)
÷
(细胞总数)。
[0212]
此外，还可以使用上述公式计算基因编辑率，除了2a染色(使用抗2a肽抗体)，还包括neotcr染色(使用dextramer)。在这些实验中，neotcr染色不包括在基因编辑率的计算中。
[0213]
基因编辑率的确定用于优化基因编辑方法，包括但不限于优化电穿孔方法。
[0214]
实施例6在体外和体内鉴别和追踪未经neotcr染色的编辑细胞的方法。
[0215]
经过基因编辑的细胞治疗产品的药物开发的一个关键步骤是追踪基因编辑的细胞在培养(体外)和输注到患者中(体内)后的存在和持久性。
[0216]
为了在体外追踪基因编辑的细胞的存在和持久性，一旦使用一个或多个2a肽(如实施例1-3中的实例所述)对细胞进行基因编辑并放入培养物中，在不同时间点采集培养细胞的样品，以使用facs确定基因编辑细胞是否在增殖、存活、和/或死亡，以检测如实施例5所述的剪切的2a肽的存在。基于收集的时间点，调整培养条件，以促进增殖和存活。
[0217]
为了在体内追踪基因编辑方法中包含一个或多个2a肽的基因编辑细胞的存在和持久性，可以从先前输注了包含基因编辑细胞的药物产品的患者提取血液样品，并在输注后的不同时间点如实施例5所述的使用facs检测剪切的2a肽，来检测基因编辑的细胞的存在和持久性。
[0218]
在具体实施例中，使用实施例1-3中描述的方法编辑细胞，然后制备成药物产品(细胞产品)，用于治疗需要其的患者的癌症。输注后，需要追踪编辑的细胞，以确定它们在患者中植入并持续存在，或者它们是否会死亡并被清除。这一点至关重要，因为需要知道编辑的细胞是否能够持续存在，并通过减少患者的肿瘤负荷、消除患者的肿瘤负荷或预防患者肿瘤负荷的持续扩大(即稳定疾病)来继续治疗患者。通过对输注基因编辑的细胞后从患者抽血中获得的抗2a肽染色的t细胞进行facs分选，确定存在并检测到基因编辑的细胞。
[0219]
实施例7用抗2a肽抗体和dextramer染色基因编辑的细胞的方法
[0220]
确定了固定、透化和染色的顺序影响基于抗2a肽抗体和dextramer染色的基因编辑的细胞的分析质量。为了优化染色和检测dextramer阳性和抗2a肽阳性细胞的能力，探索了多种染色方法。表2提供了各种染色方法的三个实例。除了表2中所示的实例外，还测试了染色方法的不同迭代和变型。此外，进行了实验，表明2a肽染色需要细胞透化。此外，为了正确检测neotcr的细胞表面表达，有必要在透化之前进行dextramer染色。
[0221]
表2三种示例性染色方法
[0222][0223]
如表2所示，三种示例性染色条件的不同顺序。每种方法的第一步包括20分钟活/死染色，其包括用活/死活性染料染色细胞，然后洗涤以去除多余的染料。在方法1和方法2中，中间固定的顺序不同：方法1在dextramer染色和另外的细胞表面标志物染色之间提供固定步骤，而方法2在另外的细胞表面标志物染色之后提供固定步骤。方法1和方法2与方法3的关键区别在于方法3中没有中间过程固定步骤。换句话说，方法1和2在2a肽染色之前提供了固定步骤，而方法3在2a肽染色之前没有固定步骤。这些实验的结果如图10所示。如图所示，本实验使用了两种不同的固定方法：1)ic固定缓冲液(“ic固定”)和2)1.6％多聚甲醛(“pfa”)。ic固定被设计为流式细胞术中使用的细胞内固定缓冲液，特别是用于细胞内染色程序中的固定，由ph 7.3的磷酸盐缓冲液中的多聚甲醛组成(thermofisher货号fb001)。如
图10所示，所有条件都导致能检测剪切的2a肽(抗2a肽抗体)和neotcr(dextramer)。
[0224]
然而，2a肽检测和neotcr检测之间的分离指数表明，与没有上述中间过程固定步骤的方法相比，在用抗2a抗体的2a肽染色之前使用固定显著降低了分离指数(图11)。使用facs的dextramer(tcr)检测和2a肽检测(抗2a肽抗体)之间的分离指数降低是2a肽染色和检测较差的结果。这可能是因为固定作用修饰了2a肽表位。尽管如此，剪切的2a肽仍然可以检测到，并且仍然可以执行实施例3中所述的实验，其中问题是使用facs没有检测到dextramer(tcr)信号的细胞是否实际上是基因编辑的，但neotcr是低亲和力结合剂，或者细胞是否没有进行基因编辑。
[0225]
还证实，当去除中间过程固定步骤时，其他表面抗体(如tcr)的检测可能会受到影响，并且似乎会失去dextramer结合。因此，有必要根据需要回答的问题，包括或排除中间过程固定步骤。对于需要表面标志物的高质量染色的实验，可以选择并使用中间过程固定步骤。事实上，这些实验已经进行并得到证实。对于需要最高质量2a肽检测的实验(例如，如果问题是如实施例5和6中所讨论的那样编辑的细胞的百分比是多少)，可以选择和使用没有中间过程固定步骤的方法。事实上，这些实验已经进行并得到证实。在稍低的高检测质量但对2a肽和neotcr均进行了充分检测的实验中(例如，定性实验)，可以使用具有中间过程固定步骤的方法，也可以使用不具有中间过程固定步骤的方法。事实上，这些实验已经进行并得到证实。根据使用多种条件进行的实验，确定当目标是1)确定细胞是否使用2a检测进行编辑，2)定性确认细胞上存在neotcr支持使用dextramer的基因编辑检测(2a检测)，以及任选的3)，当进行另外的功能分析以确认基因编辑到细胞中的neotcr活性时，确定使用表2的方法3中描述的方法进行facs测定是优选使用的方法。
[0226]
用于执行单独分析的最后一种方法：第一次facs分析用于剪切的2a肽检测，第二次facs分析用于neotcr。在这种情况下，细胞被分割为两个单独的分析。这提供了获得剪切的2a肽和neotcr的高质量定量数据的能力。
[0227]
实施例8：体内和体外检测和追踪细胞产品的方法
[0228]
实施例5-7中描述的任何方法均可用于任何细胞产品。虽然neotcr产品用于示例性目的，但体内和体外检测和追踪基因编辑的细胞的方法、实施例5-7中描述的体内和体外方法可用于任何细胞产品。
[0229]
此外，使用实施例5-7中描述的方法检测患者中细胞产品的存在和持久性，以确定细胞产品的细胞是否作为持久性细胞保留在患者中。如图12a和12b所示，在输注neotcr产品后的第1-2天，使用dextramer染色和2a肽染色，在从施用neotcr产品的患者的血液样品中检测到neotcr+t细胞。这通过检测neotcr本身和通过2a肽证实了患者在输注后2天内neotcr产品持续存在，所述2a肽证实了neotcr不是内源性tcr，而是基因编辑的产品。
[0230]
此外，使用实施例5-7中描述的方法计算输注后患者中细胞产品的药代动力学(pk)谱。具体而言，从输注neotcr产品的患者中确定neotcr产品的pk谱(包括但不限于半衰期、cmax、体积分布、tmax、cmin、浓度、消除半衰期，消除速率常数、清除率和曲线下面积)。
[0231]
此外，实施例5-7中描述的方法可用于检测患者中细胞产品的扩增以确定细胞产品的细胞是否在患者体内分裂和扩增。
[0232]
此外，实施例5-7中描述的方法已用于检测细胞产品在体外培养条件下的扩增，以确定细胞产品的细胞是否在体外分裂和扩增。
[0233]
如图13a和13b所示(来自同一患者的数据)，本文所述的2a诊断使用流式细胞术检测输注后人类患者血液中的基因编辑的细胞。具体而言，使用本文所述的流式细胞术方法，使用检测seq id no：1序列的抗体进行基因编辑的细胞的检测。图13a显示了在对一名使用neotcr产品治疗和施用的患者进行的实验中，追踪和检测2a阳性t细胞(cd4+、cd8+和cd5+)的频率35天。图13b显示了在向患者施用neotcr产品后35天内，每微升血液中2a阳性t细胞(cd4+、cd8+和cd5+)的数量。
[0234]
除了基于流式细胞术的检测，还使用ihc对组织进行2a诊断。对于ihc 2a诊断实验，使用了以下方法：1)制备细胞沉淀(20m或30m细胞/小瓶)，由基因编辑(2a阳性)和未经基因编辑的cd4和cd8 t细胞组成，如表3所示；2)将沉淀在冷冻保存培养基制剂(cryostor cs10：plasma-lyte a+2％人血清白蛋白(w/v)的1:1(v/v)混合物)中冷冻保存；3)将细胞沉淀解冻并置于离心管中并旋转以去除多余的液体；4)将细胞等分试样，用pbs洗涤，并在4℃下重悬于10％nbf(中性缓冲福尔马林)中过夜；5)将细胞用pbs洗涤并沉淀；6)将150μl预热的histogel(或替代的标准组织学试剂)(65℃)加入细胞沉淀中并立即涡旋以分散细胞；7)向管中加入70％etoh；8)将细胞包埋在石蜡中；9)将包埋细胞的ffpe块以5μm厚度切片到ffpe盖玻片上；10)使用citrisolv溶液然后使用递减的浓缩乙醇系列，对盖玻片上的切片进行脱蜡和再水化；11)然后切片在具有微碱性ph值的tris-based缓冲液(来自ventana的cc1溶液)中进行抗原修复，然后在tintoretriever压力锅中在95℃下进行热诱导表位修复(hier)；和12)然后将盖玻片加载到zellsafe芯片上，随后染色以进行chipcytometry分析。
[0235]
表3 ihc细胞沉淀组成
[0236] 总2a％％cd4％cd8cd4+2a+cd8+2a+neo12 tcr5820784362tcr 15725735160tcr 25919796060tcr 35723745160
[0237]
如图14所示，以连续稀释度测试3h4抗2a抗体(fitc缀合的)以找到最佳染色比例。已确定对于3h4 fitc缀合的抗体，1:150稀释度是最佳的，但所有其他稀释度(优选1:200-1:100)也适用于某些2a诊断。使用1:150稀释度，在由来自患者样品的表达对照neo12 tcr和tcr 1、tcr 2和tcr 3的细胞制成的载玻片上进行cipcytometry。图15a和15b中显示了ffpe细胞沉淀切片中的2a染色的代表性图像(图15b显示了图15a中细胞的放大图像)。这些图像显示2a诊断通过ihc分析成功检出基因编辑的细胞(使用抗2a抗体)。此外，图16提供了同一细胞的两个不同图像(底行显示细胞的横截面视图)，显示成功检测到细胞内2a肽(具体而言，2a肽的剪切片段)。
[0238]
前述的书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。本发明的范围不受所保藏的构建体的限制，因为所保藏的实施方案旨在作为本发明某些方面的单一说明，并且任何功能等同的构建体都在本发明的范围内。本文的材料的保藏并不构成承认本文包含的书面描述不足以实施本发明的任何方面，包括其最佳模式，也不应解释为将权利要求的范围限制为它所代表的具体说明。实际上，除了在本文示出和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说从前面的描述中将变得显而易见并且落入所附权利要求的范围内。