用于治疗大疱性表皮松解症的归巢肽引导的核心蛋白聚糖缀合物

1.本发明一般地涉及分子医学领域。更具体地，本发明涉及用于治疗大疱性表皮松解症的归巢肽引导的核心蛋白聚糖缀合物，以及相应的治疗方法。


背景技术：

2.作为人体最大的器官，皮肤对于有效的药物递送提出了独特的挑战。与局部即透皮药物递送相关的主要挑战是大分子向皮肤中的渗透差。通过细胞间脂质的扩散提供了经皮给药的选择，但其仅限于对亲脂性小分子的经皮给药。因此，全身施用的皮肤特异性的治疗剂将是对于皮肤病的治疗的重大进步，特别是对影响整个皮肤的那些疾病，例如大疱性表皮松解症，这是一组引起皮肤脆弱起泡的罕见遗传疾病。
3.隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)是由col7a 1基因中的编码vii型胶原蛋白(c7)的突变引起的。临床表现包括皮肤糜烂和水疱、割伤性瘢痕、假指触(pseudosyndactyly)和发展为侵袭性和快速转移的皮肤鳞状细胞癌(cscc)的高风险。尽管一些基于基因、细胞和蛋白质的疗法在将vii型胶原递送到皮肤方面已显示出有希望的结果，但是仍然存在挑战，并且仍然不能治愈rdeb。
4.转化生长因子β(tgfβ)信号传导已被证明在rdeb中纤维化的发展和向恶性肿瘤的进展中发挥重要作用。早期，已经证明tgfβ信号传导早在col7a1-/-小鼠中出生一周就被激活(liao et al，2018，stem cells 36：1839-1850)。因此，对tgfβ信号传导激活的早期干预可有益于降低rdeb中的疾病负担。tgfb信号传导还被认为是具有相同col7a 1突变的同卵双胞胎的表型调节剂(odorisio et al.，2014，hum mol genet 23：3907-3922)。此外，蛋白聚糖核心蛋白聚糖(dcn)，一种天然tgfβ抑制剂的表达水平在较少受影响的孪生子中显著升高。dcn是细胞外基质(ecm)的结构成分，dcn-/-小鼠表现出不规则的胶原纤维形成，并且皮肤的抗张强度显著降低(reed and iozzo，2002，glycoconj j 19：249-255)。此外，dcn通过调节多种生长因子的活性而具有抗纤维化和抗肿瘤功能，其中包括对tgfβ的抑制作用(and prince，2015，biomed res iht 2015：654765；and ruoslahti，2019，br j pharmacol 176：16-25)。最近，还证明在col7a1-/-小鼠中dcn表达的上调是脐带血衍生的非限制性体干细胞(ussc)的作用机制之一(liao et al.，2018，同上)。最近cianfarani等(2019，matrix biol 81：3-16)报道，在表达残余水平vii型胶原的c7-亚效等位基因(hypomorphic)rdeb小鼠模型(c7-亚效等位基因小鼠)中全身性给予慢病毒驱动人dcn表达可减弱tgfβ诱导的纤维化，支持dcn作为rdeb的潜在治疗性疾病修饰分子的作用。
5.此外，dcn结合并中和结缔组织生长因子(ctgf/ccn2)，其是tgfβ的纤维化信号传导的下游介体，并且已经被认为是预防瘢痕形成的治疗靶标(vial et al.2011，j biol chem 286：24242-24252；daniels et al.2003，am j pathol 163：2043-2052)。由于tgfβ和ctgf/ccn2的结合位点位于dcn的不同部分，因此dcn理论上可以同时阻断纤维化的两种介质。事实上，除了rdeb之外，dcn在抑制tgfβ驱动的瘢痕形成中的作用已经在许多疾病模型
(例如肾、肺和肝纤维变性以及皮肤伤口愈合)中得到了充分的证实(odorisio et al.，2014，同上；liao et al.，2018，同上；cianfarani et al.，2019，同上)。然而，尽管在临床前研究中有许多阳性抗癌和纤维化结果，dcn尚未作为全身疗法进入临床。迄今为止，唯一报道的dcn临床应用是在12名具有眼贯穿性损伤的患者中，单剂量的200或400μg人重组dcn玻璃体内注射似乎具有良好的耐受性，没有眼部不良事件发生(abdullatifet al.，2018，graefes arch clin exp ophthalmol 256：2473-2481)。
6.全身给药的普遍性限制是仅有小部分药物到达其所需位置，并且在其它器官中会遇到全身性的副作用。因此，现代药物开发的关键目标是制备靶向器官特异性的药物，而在身体的其它部分中具有最小的不利影响。这个目标可以通过开发识别在受影响器官中表达的特定表位的药物来实现。或者，可通过与亲和配体(如识别给定器官血管中的组织特异性或靶标特异性分子特征的血管归巢肽)缀合，将药物转化成靶向性的。
7.噬菌体肽文库的体内筛选已鉴定，血管中的这些组织或疾病特异性分子特征(血管邮政编码，vascular zip codes)可通过全身性施用的亲和配体(例如血管归巢肽)靶向。这些研究基本上确定了在不同组织的血管系统中存在器官或疾病特异性分子标记，使得邮政编码系统(血管邮政编码)能够靶向特异性递送全身施用的治疗剂(ruoslahti et al.，2010，j cell biol 188：759-768；ruoslahti，2017，adv drug deliv rev 110-111：3-12；ruoslahti，2004，biochem soc trans 32：397-402；pasqualini and ruoslahti，1996，nature 380(6572)：364-366)。用于肿瘤特异性归巢和细胞/组织穿透的最有效的血管归巢肽含有在c末端具有精氨酸(或少有的赖氨酸)残基的共有基序r/kxxr/k(seq id no：3)，因此称为c末端规则(cendr)序列(ruoslahti，2017，j clin invest 127：1622-1624；teesalu et al.，2009，proc natl acad sci u s a 106：16157-16162；sugahara et al.，2009，cancer cell 16：510-520；sugahara et al.，2010，science 328：1031-1035)。cendr序列结合神经纤毛蛋白-1(nrp-1)，激活外渗和组织渗透途径，将肽连同其有效载荷递送至肿瘤组织的实质中(ruoslahti，2017，adv drug deliv rev 110-111：3-12；ruoslahti，2017，j clin invest 127：1622-1624；teesalu et al.，2009，pnas 106(38)：16157-16162)。含有隐藏的cendr的多肽的靶标选择性在于结合具有肿瘤特异性表达模式的首要受体(primary receptor)，以及在肿瘤中的蛋白水解激活以暴露靶器官中的cendr序列。由于nrp-1在所有组织中由内皮细胞表达(ruoslahti，2017，adv drug deliv rev 110-111：3-12)，nrp-1的外渗和组织渗透不可能仅限于癌症组织，也会发生在其他患病或健康组织中。
8.体内噬菌体展示筛选还鉴定了一组肽，其归巢于皮肤伤口中生成血管的血管(and ruoslahti，2007，am j pathol 171：702-711)。最有希望的肽中的两种，称为car(carsknkdc；seq id no：5)和crk(crkdkc；seq id no：3)的循环肽，已经用于以靶向选择性方式递送不同的治疗分子(et al.，2017，acs biomaterials science&engineering 3：1273-1282)。有趣的是，尽管crk肽含有隐藏的的cendr序列rkdk(seq id no：1)，但其是血管归巢cendr肽中唯一不能穿透细胞和组织的多肽(and ruoslahti，2007，am j pathol 171：702-711；agemy et al.，2010，blood 116：2847-2856)。
9.wo 2008/136869公开了crk肽作为特异性的归巢元件用于将核心蛋白聚糖靶向递送至皮肤伤口。其所公开的crk-核心蛋白聚糖融合体不归巢于非创伤性皮肤。
10.因此，全身施用的但具有皮肤特异性的治疗剂对于皮肤病如大疱性表皮松解症的治疗将是重大进步。


技术实现要素：

11.本发明提供了用于治疗大疱性表皮松解症的归巢肽(homing peptide)引导的核心蛋白聚糖(decorin)缀合物。该缀合物包含核心蛋白聚糖片段和归巢肽，其中归巢肽的c末端由氨基酸序列rkdk(seq id no：1)或crkdk(seq id no：2)组成。
12.还提供了通过施用有效量的包含核心蛋白聚糖片段和归巢肽的归巢肽引导的核心蛋白聚糖缀合物在有需要的受试者中治疗大疱性表皮松解症的方法，其中所述归巢肽的c末端由氨基酸序列rkdk(seq id no：1)或crkdk(seq id no：2)组成。
13.由于归巢肽，该缀合物在体内选择性地归巢至并穿透皮肤和皮肤伤口。
14.在以下附图、具体实施方式、实施例和从属权利要求中阐述了以上方面的实施方式和细节。
附图说明
15.附图示出了本发明所公开的主题的若干实施方式，并且与描述一起用于解释本发明所公开的组合物和方法的原理。
16.图1a至1c说明了示例性的重组dcn-tcrk蛋白的结构及其与神经纤毛蛋白-1的结合。图1a是dcn-tcrk的结构示意图。天然dcn的信号肽和前肽被用于纯化的6
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his标记(i)取代。his-标签之后是成熟dcn蛋白聚糖的氨基末端(ii)、核心蛋白(iii)和羧基末端(iv)。将tcrk肽(v)克隆到蛋白质的羧基端。图1b示出了dcn-tcrk与神经纤毛蛋白-1(nrp-1)的体外结合。dcn-tcrk(左图)和肽对照(右图，阳性肽：rparpar(seq id no：25)和阴性肽：rparpara(seq id no：26))在elisa板中固定。包括牛血清白蛋白(bsa)作为dcn-tcrk和肽的非特异性蛋白对照。wt和突变体nrp1用fam标记并加入到固定板中。基于荧光强度测量nrp1的结合。误差棒代表sem。实验以一式三份的样本重复进行，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001，student
′
s不成对t-检验。图1c示出了dcn-tcrk在nrp-1阳性细胞中的内化。将fam标记的dcn-tcrk分别与nrp-1表达阳性和阴性的pc3和m21细胞一起孵育。通过抗fam免疫染色检测dcn-tcrk。细胞核用dapi复染。来自三个独立研究的实验的代表性图像。比例尺20微米。
17.图2a至2d说明了重组蛋白的产生和示例性的dcn-tcrk的表征。图2a显示了在start的histrap hp柱步骤之后具有一个大峰的纯化色谱图的实例，其所有峰值馏分(peak fraction)都用于进一步处理。在图2b中，纯化的dcn-tcrk的考马斯染色的还原sds-page凝胶(上图)和western印迹(下图)与现有技术的dcn一起示出。在sds凝胶上加载2μg和1μg蛋白质；对于western印迹分析，应用1和0.5μg蛋白质。蛋白质的单体形式以及包括gag侧链的形式是可见的。图2c示出了dcn-tcrk的流体动力学直径的动态光散射(dls)测量(n＝3)。图2d示出了dcn-tcrk的熔融温度的差示扫描量热法(dsc)曲线。
18.图3说明了dcn-tcrk与dcn相比的药代动力学。将5mg/kg dcn-tcrk或dcn静脉注射到健康的balb/c小鼠中。从八个时间点收集血样，并用标准elisa分析人dcn。n＝4/组。
19.图4a至4d说明了dcn-tcrk改善col7a1-/-小鼠的存活并归巢至皮肤。图4a示出了
接受dcn-tcrk(寿命中值：11天；n＝21)、dcn(寿命中值：7天；n＝17)和pbs(寿命中值：2天；n＝24)给药的col7a1-/-小鼠的kaplan-meier存活分析。图4b显示了在肝内给药后一周、两周和三周(每个时间点n＝3)在受体col7a1-/-小鼠的皮肤中使用人核心蛋白聚糖elisa试剂盒测定的dcn和dcn-tcrk水平的定量结果。在三周时间点dcn水平没有定量，因为没有小鼠存活到dcn施用后的该时间点。*p＜0.05，**p＜0.01图4c示出了使用抗组氨酸抗体(抗his)在col7a1-/-小鼠的爪子和背部皮肤上的免疫组织化学染色结果。细胞核用dapi复染。比例尺：20μm。图4d示出了抗组氨酸标签和抗nrp-1的代表性双染色结果，并且呈现了dcn-tcrk、dcn和未处理的rdeb皮肤的合并图像(用dapi复染)。比例尺：25μm
20.图5示出了col7a1-/-小鼠的kaplan-meier存活分析，比较了葡聚糖/人血清白蛋白(d/hsa；中值寿命：3天；n＝29；历史数据liao et al.2018，stem cell transl med，7：530-542)给药后的历史存活情况与dcn-tcrk(中值寿命：11天；n＝21)和dcn(中值寿命：7天；n＝17)和pbs(中值寿命：2天；n＝24)给药后的存活情况。
21.图6说明了dcn-tcrk使rdeb中的纤维化基因标记正常化。图6a示出了与wt相比，在未处理的rdeb皮肤中表达量增加＞1.5倍的基因的聚类图谱中的相对基因表达。图6b示出了载体、dcn和dcn-tcrk处理的col7a1-/-小鼠皮肤相对于wt的基因表达的log2倍数变化和-log10 p值的火山图。
22.图7说明了给药dcn-tcrk抑制col7a1-/-小鼠中纤维化的发展。图7a示出了在有和没有dcn-tcrk处理的一周和两周龄的wt和col7aa1-/-小鼠中ctgf/ccn2的代表性免疫组织化学染色结果。比例尺上图50μm，下图25μm。图7b示出了在有和没有dcn-tcrk处理的情况下，来自一周和两周龄的wt和col7a1-/-小鼠的爪皮肤的天狼猩红染色结果。使用偏振光获得天狼猩红图像。比例尺25μm。图7c示出了用20
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物镜获得的每个视野的天狼猩红平均强度的定量结果。每个切片获得八个或更多个视野，并且每个活组织检查分析至少4个切片。比例尺25μm。*p＜0.05，**p＜0.01。图7d示出了在有和没有dcn-tcrk处理的情况下，在两周龄的rdeb和wt皮肤中胶原i型(col1第一栏)表达和在两周龄的wt和col7a1-/-小鼠中α-平滑肌肌动蛋白(αsma第二栏)和血管(cd31第三栏)的双重免疫荧光染色的代表性图片。细胞核用dapi复染。在第四列中示出了合并图像。比例尺25μm。图7e示出了皮肤切片上coli和αsma表达的平均免疫染色强度的定量结果(在每个处理组中n＝3)。在此，*、**和***分别代表p≤0.05、0.01和0.001。
23.图8示出了体外胶原蛋白网格收缩测定的结果。上图为接种于胶原凝胶48小时后，加入或不加入终浓度为75nm的dcn和dcn-tcrk的人正常成纤维细胞和rdeb患者来源的成纤维细胞的代表性图像。下图为以与初始面积相比收缩的百分比计算的胶原凝胶的收缩结果。数据(n＝3)以平均值
±
sem表示。*p＜0.05，**p＜0.001。
具体实施方式
24.应当理解，本发明不限于所述的任何特定方法、方式、试剂和制剂，因为它们可以变化。还应理解，本发明所用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不是要限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限定。
25.如本发明所用，单数表达“一”、“一个”和“该”是指一个或多个。因此，除非另有说明，单数名词也带有相应复数名词的含义。
26.本发明涉及归巢肽引导的核心蛋白聚糖缀合物的治疗用途。更具体地，本发明提供了用于治疗大疱性表皮松解症的归巢肽引导的核心蛋白聚糖缀合物，以及通过向有需要的受试者施用有效量的归巢肽引导的核心蛋白聚糖缀合物来治疗所述受试者的大疱性表皮松解症的方法。
27.大疱性表皮松解症是一组罕见的疾病，其引起皮肤脆弱、起疱。这些水泡可能由于轻微的损伤而出现，甚至是由于受热、摩擦、刮擦或胶带而出现。在严重的情况下，水疱可能发生在体内，例如口或胃的内壁。大疱性表皮松解症以多种形式存在，包括获得性和先天性形式，其中后者可以是隐性或显性的。大疱性表皮松解症的非限制性实例包括获得性大疱性表皮松解症、交界性大疱性表皮松解症、单纯性大疱性表皮松解症、kindler综合征和营养不良性大疱性表皮松解症，包括显性营养不良性大疱性表皮松解症和隐性营养不良性大疱性表皮松解症，例如逆向性隐性营养不良性大疱性表皮松解症(recessive dystrophic epidermolysis bullosa inversa)。还包括所述实例的任意亚型。
28.如本发明所用，术语“受试者”是指动物受试者，优选哺乳动物受试者，更优选人类受试者。在本发明中，术语“患者”是指人类受试者。
29.如本发明所用，术语“治疗”是指将缀合物或包含缀合物的药物组合物给药予受试者，其目的可以包括改善、减轻、抑制或治愈大疱性表皮松解症。
30.如本发明所用，术语“有效量”是指使大疱性表皮松解症的有害作用至少得到改善的量。
31.如本发明所用，术语“核心蛋白聚糖”(dcn)是指富含亮氨酸的小分子硫酸软骨素蛋白聚糖的任意同源异构体(isoform)。它是一种多功能蛋白聚糖，例如，调节胶原纤维形成，防止组织纤维化，促进组织再生，并作为tgf-β的拮抗剂。在一些实施方式中，核心蛋白聚糖是包含核心蛋白聚糖同源异构体a、b、c、d或e的氨基酸序列或由其组成的人核心蛋白聚糖，其具有或不具有n-末端信号序列和/或前肽。在一些实施方式中，核心蛋白聚糖包含seq id nos：6-20中任意一种或由其组成。还包括所述核心蛋白聚糖种类的保守序列变体和肽模拟物。如本发明所用，术语“核心蛋白聚糖片段”是指本发明缀合物的一部分，其包含核心蛋白聚糖或由核心蛋白聚糖组成。
32.在一些实施方式中，所述核心蛋白聚糖片段包含与seq id nos：6-20的氨基酸序列具有至少约99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％或60％或其间的任何百分比序列同一性的氨基酸序列或由其组成，只要该核心蛋白聚糖的生物学性质没有显著改变。这样的核心蛋白聚糖变体可以由一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代产生。用于确定核心蛋白聚糖是否保持其生物学特性的手段和方法在本领域中是容易获得的。
33.如本发明所用，两个序列之间的序列同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性％＝相同位点的数目/位点的总数
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100)，考虑到空位的数目和每个空位的长度，这需要引入两个序列的最佳排列。序列的比较和两个序列之间同一性百分比的测定可以使用本领域可用的数学算法来完成。
34.如本发明所用，术语“归巢肽”广义上指优先于其它细胞或组织选择性地归巢于，即靶向体内特定细胞或组织的任何肽。因此，归巢肽可用作靶向递送载体。
35.用于本发明的归巢肽引导的核心蛋白聚糖缀合物与wo 2008/136869中公开的已知核心蛋白聚糖融合蛋白至少在所用归巢肽方面不同。现有技术核心蛋白聚糖融合蛋白包
含已知的crk肽(crkdkc；seq id no：3)，而本发明中使用的新的归巢肽的c末端由氨基酸序列rkdk(seq id no：1)组成。在一些实施方式中，本发明中使用的新归巢的c末端由crkdk(seq id no：2)组成。
36.现在已经令人惊奇地发现，已知crk肽(crkdkc；seq id no：3)的c-末端半胱氨酸的截断改变了该肽的归巢特异性。当crk肽选择性地归巢至皮肤创伤时，下文表示为tcrk(rkdk，seq id no：1；或crkdk，seq id no：2)的截短的ckr赋予该肽归巢至和穿透非创伤性皮肤的能力，同时保持其归巢至皮肤创伤的能力。换句话说，crk肽仅选择性地归巢于皮肤创伤，而tcrk肽选择性地归巢并渗透至皮肤创伤和非创伤性皮肤。
37.crk肽的c-末端半胱氨酸的截断暴露了隐藏的cendr(c-末端规则)序列r/kxxr/k(seq id no：4)，即本发明tcrk肽中的rkdk(seq id no：1)。不受任何理论的限制，tcrk肽可通过在其细胞表面表达nrp-1的真皮微血管内皮细胞的内化作用穿透皮肤组织。有趣的是，含有隐藏的cendr基序的crk肽不能够穿透细胞和组织(and ruoslahti，2007，am j pathol 171：702-711；agemy et al.，2010，blood 116：2847-2856)。
38.因此，本发明缀合物中所用的归巢肽在归巢肽的c末端包含tcrk元件。
39.如本发明所用，术语“c末端”(也称为羧基端、羧基末端、c端或cooh末端)是指由游离羧基(-cooh)封端的氨基酸链的末端。在此，术语“c末端”和“c端”是可互换的。
40.如本发明所用，术语“n末端”(也称为氨基末端、胺末端、n端或nh2末端)是指氨基酸链的起始。氨基酸链的第一个氨基酸含有游离胺基(-nh2)。在此，术语“n-末端”和“n端”是可互换的。肽序列从n端到c端书写。
41.如本发明所用，术语“tcrk元件”是指具有氨基酸序列rkdk(seq id no：1)或crkdk(seq id no：2)的肽，其在体内选择性地归巢至皮肤和皮肤伤口，并且可以穿透皮肤组织。术语“tcrk元件”和“tcrk肽”可互换。
42.根据本发明，tcrk元件位于本发明所用的归巢肽的c末端。更具体地，tcrk元件位于归巢肽的c末端，并包含末端羧基。换言之，归巢肽的c末端由氨基酸序列rkdk(seq id no：1)或crkdk(seq id no：2)组成。因此，包含tcrk元件的归巢肽以氨基酸序列rkdk(seq id no：1)或crkdk(seq id no：2)结束。
43.在一些实施方式中，本发明所用的归巢肽由seq id no：1或seq id no：2组成。在一些其他实施方式中，归巢肽包含seq id no：1或seq id no：2。在后一种情况下，归巢肽包含连接至tcrk元件n末端的额外氨基酸。然而，这种较长的归巢肽的c末端仍由tcrk元件组成。在一些实施方式中，归巢肽可包含至多100个氨基酸。在一些实施方式中，归巢肽可包含至多50个氨基酸。在一些实施方式中，归巢肽可包含至多20个氨基酸。在一些实施方式中，肽归巢可包含至多10个氨基酸。
44.在一些实施方式中，归巢肽可以是环状结构的一部分，并且它可以被环化，例如通过二硫键环化，然后被蛋白酶切割以在归巢肽的c末端暴露tcrk序列作为cendr肽。
45.如本发明所用，表达“tcrk引导的核心蛋白聚糖”是指任意核心蛋白聚糖缀合物，其靶向递送或归巢是通过根据本发明公开的实施方式中的任一个的tcrk归巢肽完成的。这种缀合物的非限制性实例包括其中核心蛋白聚糖片段包含seq id no：6-20中任一项所示的氨基酸序列或由其组成，并且从其c-末端连接到seq id no：1或2的tcrk元件的n-末端，具有或不具有中间连接序列(linker)，例如seq id no：23或24所示的序列的那些缀合物。
进一步的实例包括包含seq id no：21或22的氨基酸序列或由其组成的缀合物。更进一步的实例包括与所述序列具有至少约99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％或60％序列同一性的序列变体以及它们的保守序列变体和肽模拟物，只要tcrk元件的靶向特异性和穿透能力，以及核心蛋白聚糖的生物活性基本上保持不变。
46.在一些实施方式中，可以以融合蛋白的形式提供使用tcrk引导的核心蛋白聚糖缀合物，但不限于此。因此，在一些实施方式中，缀合物是“融合蛋白”，其包含与本发明公开的归巢肽的n-末端融合或连接的核心蛋白聚糖片段，优选从核心蛋白聚糖片段的c末端融合或连接，其具有或不具有一个或多个额外的氨基片段，例如肽、寡肽、多肽或蛋白质片段，其可由天然或非天然氨基酸或肽模拟物组成，或包含天然或非天然氨基酸或肽模拟物。这样的一个或多个额外的氨基酸片段可融合或连接于核心蛋白聚糖片段的n末端和/或融合或连接在核心蛋白聚糖片段的c末端和归巢肽的n末端之间。所述额外的氨基酸片段可具有治疗活性，或其可用于例如诊断、成像或可视化的目的。
47.如本发明所用，术语“肽”是指通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽(酰胺)键彼此连接以形成氨基酸序列的一系列氨基酸残基。通常，肽被定义为由2至100个氨基酸组成的分子，例如2至50个氨基酸。然而，肽可以细分为具有少量氨基酸(例如2至20个)的寡肽和具有许多氨基酸(例如20至100个或20至50个)的多肽。蛋白质基本上是通常由超过50个或超过100个氨基酸组成的大肽。因此，为了表达简单起见，本发明所用的术语“肽”包括任何肽键连接的天然(l-)和/或非天然(d-)氨基酸残基系列，并且可与“寡肽”、“多肽”、“蛋白质”及其片段互换，除非另有明确说明。也包括肽的肽模拟物(peptidomimetic)形式。
48.用于本发明的融合蛋白可以具有任何合适的长度，例如，至多300、350、400、500、1000或2000个残基，或者它可以具有包括所述整数或在所述整数之间的任何数目的残基。如本发明所用，术语“残基”是指氨基酸或氨基酸类似物。
49.在一些实施方式中，用于本发明的融合蛋白可包含促进例如纯化、分离和/或检测的小肽标签。用于纯化目的合适亲和标签的非限制性实例包括聚组氨酸标签(his标签)、血凝素标签(ha标签)、谷胱甘肽s-转移酶标签(gst标签)、生物素标签、抗生物素蛋白标签和链霉亲和素蛋白标签。合适的检测标签包括但不限于荧光蛋白，例如gfp。
50.根据其长度，用于本发明的融合蛋白可通过本领域可用的任何合适的手段、方法或技术制备，例如通过自动肽合成仪，或通过基因工程技术制备。例如，可通过基因工程制备包含编码核心蛋白聚糖和tcrk归巢肽的多核苷酸的表达载体，然后将其转染到宿主细胞中以表达融合蛋白。合适的宿主细胞的非限制性实例包括原核宿主，例如细菌(例如大肠杆菌、杆菌)、酵母(例如毕赤酵母、酿酒酵母)和真菌(例如丝状真菌)，以及真核宿主，例如昆虫细胞(例如sf9)和哺乳动物细胞(例如cho细胞、hek细胞)。表达载体可以通过多种通常用于将外源dna导入原核或真核宿主细胞的技术转染到宿主细胞中，所述技术包括但不限于电穿孔、核转染、声孔效应、磁转染、热激、磷酸钙沉淀、deae-葡聚糖转染等。本领域可容易地获得多种表达载体，本领域技术人员可根据不同的变量，例如所用的宿主细胞，容易地选择合适的表达载体。用于本发明的融合蛋白还可以通过体外蛋白表达(也称为体外翻译、无细胞蛋白表达、无细胞翻译或无细胞蛋白合成)制备。本领域有几种基于例如细菌、兔网织红细胞、cho或人裂解物的无细胞表达系统可商购获得。体外蛋白质表达可以分批反应或透析模式进行。
51.用于本发明的融合蛋白的融合亲本(fusion partners)可以直接彼此连接或通过连接序列彼此连接。连接序列可以是肽连接序列或非肽连接序列。如果连接序列是肽连接序列，则它可以由一个或多个氨基酸组成。肽连接序列的非限制性实例包含seq id no：23或24中所示的氨基酸序列或由其组成。
52.此外，归巢肽可以通过如spytag/spycatcher的系统与本发明缀合物或组合物中包含的核心蛋白聚糖或任何其他治疗性蛋白质偶联。
53.根据上文，在一些实施方式中，用于本发明的融合蛋白可以使用编码融合蛋白的核酸分子来产生。这些核酸分子不仅可以用于重组生产它们编码的融合蛋白，而且可以通过本领域可用的手段和方法用于基因治疗。
54.本发明还设想了包含融合蛋白的天然(l-)和/或非天然(d-)氨基酸和/或肽模拟物的保守序列变体用于治疗大疱性表皮松解症。
55.如本发明所用，术语“保守序列变体”是指氨基酸序列修饰，其不显著改变相关的蛋白质或肽的生物学特性。保守序列变体包括由一个或多个本领域中熟知的相似的氨基酸(例如，相似大小的氨基酸或具有相似电荷特性的氨基酸)取代产生的变体。
56.如本发明所用，术语“肽模拟物”指设计成模拟给定蛋白质或肽而不改变其活性如归巢特异性的肽样分子。肽模拟物的非限制性实例包括化学修饰的肽、d-肽肽模拟物、包含非天然存在的氨基酸的肽样分子、类肽和β-肽。该术语还包括类似肽但不通过天然肽键连接的分子。用于生产肽模拟物的手段和方法在本领域中是容易获得的。
57.用于治疗大疱性表皮松解症的tcrk引导的核心蛋白聚糖缀合物可以根据需要进一步包含一个或多个共价(直接或间接通过连接序列)或非共价连接的额外的部分，只要所述缀合物的治疗活性得以保留。
58.在一些实施方式中，额外的部分可以具有其自身的治疗活性，例如抗炎活性、抗血管生成活性、再生活性、促血管生成活性、细胞毒性活性、促凋亡活性、抗微生物活性(例如抗细菌活性、抗病毒活性、抗真菌活性或抗原生动物活性)、抗纤维化活性、抗皱活性、止痒活性、抗或促递质(例如组胺)活性或细胞因子活性，或者它可以是细胞因子抑制剂(例如拮抗剂、可溶性受体、细胞因子结合分子或阻断其它细胞因子的细胞因子)，以提及治疗部分的潜在生物活性或治疗效果的一些非限制性实例。
59.因此，在一些实施方式中，额外的部分可以是小分子，例如选自抗组胺药、抗生素、类维生素a、过氧化苯甲酰、鬼臼毒素、细胞毒性药物和免疫调节剂例如皮质类固醇衍生物、钙调磷酸酶抑制剂和咪喹莫特。此外，额外的部分可以是蛋白质部分，例如抗纤维化tgf-β3，任意再生或抗炎生长因子或细胞因子，例如白介素-10(il-10)，任意血管生成生长因子，例如血管内皮生长因子(vegf)，任意抗凋亡蛋白质，例如bit1，任意炎症抑制酶，例如cd73，或任意胶原，例如vii型胶原。
60.在一些实施方式中，可以使用额外的部分来促进tcrk-引导的核心蛋白聚糖缀合物的检测。因此，缀合物可以包含可检测试剂。如本发明所用，术语“可检测试剂”是指可直接或间接检测的任何分子，优选通过非侵入性和/或体内可视化技术检测。适用于本发明所公开的缀合物的可检测试剂的非限制性实例包括光学剂，例如包括多种有机和/或无机小分子和多种荧光蛋白及其衍生物的荧光剂，磷光剂，发光剂，例如化学发光剂，和显色剂；放射性标记物，例如放射γ射线、正电子、β或α粒子或x射线的放射性核素；非放射性同位素，
例如镉(gd)；离子和非离子造影剂，例如碘基造影剂；电磁剂，例如磁性、铁磁性、顺磁性和/或超顺磁性试剂；上转换纳米颗粒(ucnp)、共振颗粒、量子点和金颗粒。其它本领域可获得的合适的可检测试剂。本领域技术人员可以根据缀合物中使用的可检测试剂的类型和种类容易地选择合适的成像技术。这些技术包括但不限于放射技术、同位素技术，例如正电子发射断层摄影、超声成像和磁共振成像(mri)。
61.可检测试剂可以直接连接到核心蛋白聚糖缀合物，例如通过共价键连接，或间接连接到核心蛋白聚糖缀合物，例如通过结合剂、连接序列或螯合剂，如二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、4，7，10-四氮杂环十二烷-n-，n
′
，n
″
，n
″′‑
四乙酸(dota)和/或金属硫蛋白连接。用于将可检测试剂缀合或以其他方式缔合至肽或蛋白质缀合物的技术是本领域众所周知的。例如，包含可检测蛋白，如荧光蛋白(例如gfp)的缀合物可以通过重组技术作为融合蛋白产生。
62.本发明所公开的归巢肽引导的核心蛋白聚糖缀合物，更具体为tcrk引导的核心蛋白聚糖缀合物，在自然界中不存在。
63.在一些实施方式中，用于治疗大疱性表皮松解症的tcrk引导的核心蛋白聚糖缀合物以药物组合物形式提供，所述药物组合物包含所述缀合物和药学上或生理学上可接受的载体以使得能够体内给药。
64.如本发明所用，术语“药物组合物”广义上指一种或多种活性成分和生理学上合适的组分例如载体、佐剂和/或赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物向受试者或生物体的施用。如本发明所用，术语“活性成分”广义上指负责生物学效果的物质，包括但不限于抗炎效果、抗血管生成效果、再生效果、促血管生成效果、细胞毒性效果、促凋亡效果、抗微生物效果(例如抗细菌效果、抗病毒效果、抗真菌效果或抗原生生物效果)、抗纤维化效果、止痒效果、抗递质效果、促递质效果(例如组胺)、细胞因子诱导的效果或细胞因子抑制。如本发明所公开的，术语“活性成分”具体指tcrk引导的核心蛋白聚糖，尽管该组合物和/或缀合物可能含有如前所述的进一步的活性试剂。
65.药物组合物可以根据需要，使用本领域容易获得的手段和方法，例如通过常规的混合、溶解、制粒、包糖衣、磨细、乳化、包封、包埋、冻干或类似的方法配制为例如半固体或固体制剂、溶液、分散体或悬浮液。
66.如本发明所用，术语“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”可互换使用，指适于给予受试者或生物体而没有过度的不良副作用如毒性、显著的刺激和/或过敏反应的物质。换句话说，效益/风险比必须是合理的。
67.如本发明所用，术语“药学上可接受的载体”是指与活性成分组合以促进给药并且对于接受者是生理学上可接受的载体物质或稀释剂。药学上可接受的载体在本领域中是容易获得的，并且取决于预期的施用途径，可以选自但不限于经皮载体、经粘膜载体、肠内载体、肠胃外载体和用于延长释放制剂的载体的组中。所选的载体不应消除活性成分的生物活性和性质，但应使其任何降解最小化，以及使接受者的不良副作用最小化。
68.如本发明所用，术语“赋形剂”是指加入到药物组合物中以进一步促进活性成分给药的优选惰性物质。不同类型赋形剂的典型实例包括但不限于稳定剂、防腐剂、ph调节剂、填充剂、增稠剂、粘度调节剂、润滑剂、增溶剂、表面活性剂、甜味剂、掩味剂等。
69.有用的稳定赋形剂包括但不限于表面活性剂，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80
和泊洛沙姆407；聚合物，例如聚乙二醇类(polyethylene glycols)和聚乙烯吡咯烷酮(povidones)；碳水化合物，例如蔗糖、甘露醇、葡萄糖和乳糖；糖醇，例如山梨糖醇、甘油、丙二醇和乙二醇；蛋白质如白蛋白；氨基酸，例如甘氨酸和谷氨酸；脂肪酸，例如乙醇胺；抗氧化剂，例如抗坏血酸；螯合剂，例如edta盐；和金属离子如ca、ni、mg和mn。有用的防腐剂包括但不限于苯甲醇、氯丁醇、苯扎氯铵和可能的对羟基苯甲酸酯类。有用的缓冲赋形剂包括但不限于磷酸钠和磷酸钾、柠檬酸盐、醋酸盐和碳酸盐或甘氨酸缓冲液，这取决于目标ph范围。氯化钠作为张力调节剂的用途也是有用的。其它赋形剂材料的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇类。如本领域技术人员容易理解的，给定的赋形剂可以提供一种以上的功能。
70.药物组合物可以以多种方式给药，这取决于是需要局部治疗还是全身治疗，以及取决于待治疗的部位。给药方式可以是例如肠胃外、肠内或局部。
71.如果使用组合物，则组合物的肠胃外给药通常通过注射例如静脉内、腹膜内、皮下或肌内注射来施用。用于肠胃外给药的制剂通常是无菌的水性或非水性溶液、悬浮液或乳液，但是该制剂也可以以浓缩形式或以粉末形式提供，以便根据需要重构。缓释或持续释放制剂也在考虑中。配制用于肠胃外给药的制剂的手段和方法在本领域是容易获得的，并且本领域技术人员可以根据所需的制剂的具体情况容易地选择合适的生理学上合适的载体、佐剂和/或赋形剂。
72.用于肠胃外和其它药物制剂的水性载体的非限制性实例包括无菌水、水-醇溶液、盐水和生理ph的缓冲溶液。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖溶液、葡萄糖加氯化钠溶液、含有乳糖的林格氏溶液或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖溶液的载体等等。
73.用于肠胃外和其它药物制剂的非水性载体的非限制性实例包括溶剂如丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、鱼油和可注射的有机酯如油酸乙酯。
74.如果肠胃外制剂以浓缩溶液或分散体或以粉末形式提供，则上述水性或非水性载体可用于重构。用于重新配制的溶液可以与浓缩物或粉末在同一包装中提供。如果采用冻干法制备粉末，使用冷冻保护剂可能是有益的，所述冷冻保护剂包括但不限于聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、葡聚糖)、糖(例如蔗糖、葡萄糖、乳糖)、氨基酸(例如甘氨酸、精氨酸、谷氨酸)和白蛋白。
75.如果使用组合物，可以应用组合物的肠内给药，例如，通过口服给药或经由经皮内镜胃造口术(peg)给药。用于口服给药的组合物包括但不限于粉末、颗粒、胶囊、小袋、片剂和水性或非水性溶液和悬浮液。配制用于肠内给药的制剂的手段和方法在本领域是容易获得的，并且本领域技术人员可以根据所需的制剂的具体情况容易地选择合适的生理学上合适的载体、佐剂和/或赋形剂。
76.如果使用，组合物的局部给药可以例如通过经皮给药、经粘膜给药、表皮给药、鼻内给药、直肠给药、阴道给药和通过吸入剂给器来给药。取决于施用途径，用于局部施用的制剂可以包括软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、粉末和缓释或持续释放制剂或固体。配制用于局部给药的制剂的手段和方法在本领域是容易获得的，并且本领域技术人员可以根据所需的制剂的具体情况容易地选择合适的生理学上合适的载体、佐剂和/或赋形剂。
77.一些组合物可以以药学上可接受的酸或碱加成盐的形式给药，所述盐通过与无机酸和有机酸反应形成，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，所述有机酸例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸，或通过与无机碱和有机碱反应形成，所述无机碱例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾，所述有机碱例如单-、二-、三烷基和芳基胺和取代的乙醇胺。
78.本发明公开的缀合物或药物组合物的给药量和方式可以由治疗皮肤疾病和病症，尤其是大疱性表皮松解症的临床领域的普通技术人员容易地确定。通常，剂量将根据考虑因素而变化，例如：待治疗的受试者的年龄、性别和一般健康状况；如果有的话，并行治疗的种类；治疗频率和所需效果的性质；所述大疱性表皮松解症的严重性和类型；以及由个人医生调整的其它变量。在一次或多次应用中可以给予所需剂量以获得所需结果。例如，药物组合物可以以单一日剂量给药，或者总日剂量可以以例如每日两次、三次或四次的分剂量给药。药物组合物可以例如以单位剂型或以延长释放制剂提供。
79.实验部分
80.材料和方法
81.克隆核心蛋白聚糖融合蛋白
82.将不含天然信号和前肽序列的人核心蛋白聚糖(dcn)cdna(krusius and ruoslahti，1986，pnas 83：7683-787)克隆至哺乳动物表达载体pefires-p(hobbs et al.，1998，biochem biophys res commun 252：368-372)中。将tcrk创伤归巢肽cdna克隆至侧翼为终止密码子的核心蛋白聚糖的c末端。将6
×
his标签克隆至核心蛋白聚糖之前的n末端。通过使用pipe方法(klock and lesley，2009，methods mol biol 498：91-103)装配构建体。按照生产商的说明(c2987h；new england biolabs ipswich，ma)，采用neb 5-α感受态大肠杆菌(高效)细胞进行转化。使用来自qiagen(hilden，germany)的试剂盒进行质粒纯化(mini-prep)、pcr纯化和琼脂糖凝胶纯化。dcn天然形成二聚体(scott et al.，2004，pnas 101：15633-15638)。单体6
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his标签-dcn-tcrk融合蛋白的蛋白序列为：g h h h h h h d e a s g i g p e v p d d r d f e p s l g p v c p f r c q c h l r v v q c s d l g l d k v p k d l p p d t t l l d l q n n k i t ei k d g d f k n l k n l h a l i l v n n k i s k v s p g a f t p l v k l e r l y l s k n q l k e l p e k met p k t l q e l r a h e n e i t k v r k v t f n g l n q met i v i e l g t n p l k s s g i e n g a f q g met k k l s y i r i a d t n i t s i p q g l p p s l t e l h l d g n k i s r v d a a s l k g l n n l a k l g l s f n s i s a v d n g s la n t p h l r e l h l d n n k l t r v p g g l a e h k y i q v v y l h n n n i s v v g s s d f c p p g h n t k k a s y s g v s l f s n p v q y w e i q p s t f r c v y v r s a i q l g n y k g s e f c r k d k终止(seq id no：21)。
83.图1a示出了用于实验部分的dcn-tcrk融合蛋白的示意图。如详细描述中清楚地阐明的，图1a的dcn-tcrk融合蛋白是适用于本发明的tcrk引导的核心蛋白聚糖缀合物的非限制性实例。
84.重组蛋白制备
85.pefires-p表达载体中的构建体通过脂质体转染法(fugene 6，promega，madison，wi)转染到hek293f细胞中。在由dmem hi-葡萄糖(4.5g/l)+2mm l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、
100iu/ml青霉素(全部来自sigma aldrich，st.louis，mo)和10％fbs(gibco，grand island，ny)组成的培养基中，在5-160μg/ml嘌呤霉素(hyclone，thermo fisher scientific)存在下选择阳性克隆。将建立的细胞系维持在含有10μg/ml嘌呤霉素的培养物中。
86.然后将经验证的细胞重悬于补充有2mm l-丙氨酰-l-谷氨酰胺(sigma)的无血清opticho培养基(gibco)中，并在5％co2气氛中于37℃下在安装于旋转振荡器上的方形玻璃瓶中培养。在细胞达到1-2
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106个细胞/ml的密度后，将它们在33℃下进一步培养4天，用于重组蛋白表达和分泌到培养基中。在start色谱系统(ge healthcare，munich，germany)上通过两步histrap纯化方案从培养基中纯化蛋白质
87.重组蛋白纯化
88.将细胞培养上清液过滤并通过0.45μm过滤装置(corning#430514，corning，ny)在冰上脱气。6
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his标记的蛋白质通过ni-nta-imac经由两步纯化方案纯化，首先使用histrap excel柱，然后使用histrap hp柱，在start色谱系统(ge healthcare，munich，germany)上，根据制造商的说明在4℃冷箱中进行。缓冲液由his缓冲液试剂盒(ge healthcare/vwr(11-0034-00)制备，所有缓冲液都过滤并脱气。
89.将histrap excel柱洗脱物在含有0.5m nacl的20mm磷酸钠缓冲液(ph 7.4)中稀释至最终咪唑浓度为30mm，然后在histrap hp柱上进一步纯化，用35mm咪唑洗涤，梯度洗脱至300mm咪唑(图2a包括这种纯化色谱图的一个实例)。在sds nupage 4-12％梯度凝胶(life technologies/thermo fisher scientific，waltham，ma)上分析峰值馏分，并通过pageblue蛋白质染色溶液(thermo fisher scientific，waltham，ma)观察。
90.合并选择的峰值馏分，用50kda mwco float-a-lyzers(fisher scientific/spectrum labs)对冷tbs缓冲液(ph 7.6)透析，然后经10kda mwco vivaspin 6管(ge healthcare)浓缩。将样品过滤灭菌(ultrafree-mc gv离心过滤器0.22μm，millipore，burlington，ma)，并通过分光光度计(thermo fisher scientific，waltham，ma)在a280nm测量蛋白质浓度。所有步骤在4℃或冰上进行。在-80℃下快速冷冻等分试样之前，加入无菌tween-20至终浓度为0.05％以防止聚集。
91.重组蛋白通过sds page和western印迹法验证。使用biorad
′
s湿罐mini-protean trans-blot细胞系统(根据生产商的说明书)。根据制造商的方案，用抗人核心蛋白聚糖的鼠源一抗(mab143，r&d systems，minneapolis，mn)探测pvdf膜。使用来自cell signaling technology的次级辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体。通过imagequant las 4000mini(ge healthcare)捕获化学发光印迹图像。
92.生物物理蛋白质分析
93.流体动力学直径通过动态光散射(dls)使用zetasizer nano zs仪器(malvern instruments ltd，worchestershire，uk)测量。dcn-tcrk蛋白样品在tbs缓冲液中1∶5稀释。在25℃下进行三次10
×
10测定，使用zetasizer软件v7.11(malvern instruments ltd)通过蛋白质分析模型(非负最小二乘分析，随后是l-cuve)和体积尺寸分布分析数据。
94.dcn-tcrk的解折叠温度使用vp-毛细管dsc(差示扫描量热法)仪器(ge healthcare，microcal inc./malvern instruments ltd.)在tbs缓冲液(50mm tris-cl，150mm nacl，ph 7.5)中测定，蛋白质浓度为0.2mg/ml。所有溶液都脱气。以2℃/分钟的扫描
速率将样品从20℃加热至130℃。反馈模式被设置为“低”，过滤周期为5秒。解链温度tm(转变中点)通过非2-状态拟合模型使用origin 7.0 dsc软件套件(microcal inc.)计算。
95.使用eksigent 425 nanolc与sciex高速tripletof
tm 5600+质谱仪偶联，从单体凝胶带鉴定表达的重组dcn-tcrk蛋白。在分离凝胶带和考马斯染色后，然后使去除蛋白质进行如在et.al.，2018中详细描述的还原(tcep，25mm)、烷基化(碘乙酰胺，0.5m)和胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化后，将肽稀释至14μl样品缓冲液(2％乙腈，0.1％甲酸)中，并将1μl样品注入三重tof质谱仪。
96.体外结合分析
97.使用elisa分析来分析dcn-tcrk和肽与nrp-1的体外结合。96孔，黑色fluotrac
tm 600高结合板(greiner bio-one，kremsm
ü
nster，austria)用100μl/孔100μg/ml dcn-tcrk的pbs溶液在4℃包被过夜。分别平行包被10μg/孔的rparpar(seq id no：25)和rpaprara(seq id no：26)肽作为阳性和阴性对照。bsa用作固定化对照。用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤平板3次，并在37℃下用300μl封闭溶液(1
×
pbs，1％bsa，0.1％tween-20)封闭1小时。his-标记的神经纤毛蛋白-1 b1b2结构域(nrp-1wt)和三突变体ns346a-e348a-t349a神经纤毛蛋白-1 b1b2结构域(nrp-1突变体)在sanford burnham prebys医学发现研究所(la jolla，ca)的蛋白质生产和分析设施处按先前所述进行表达和纯化(teesalu et al.，2009，pnas 106：16157-16162)。重组蛋白nrp1 wt、nrp1突变体和dcn-tcrk采用fam(5-(和-6)-羧基荧光素，#90024，biontium inc，ca，usa)标记，方法是将胺反应性fam染料(稀释于dmso中，终浓度0.2％)和蛋白质1∶10比例混合。将混合反应物在室温、黑暗中孵育2小时，然后用pbs超滤/透析，以从蛋白质中分离游离染料。将100μl fam标记的nrp1 wt或nrp1突变体蛋白的封闭溶液加入到每个孔中(20μg/孔)，在室温下孵育4-6小时或在4℃下孵育过夜，并用封闭溶液洗涤3次。在每个孔中加入100μl pbs后，立即用荧光读数器(flex state ii，molecular devices；峰激发＝485nm，峰发射＝530nm，截止＝515)以顶部读取模式读板。
98.为了fam-dcn-tcrk与nrp-1阳性前列腺癌-3(pc-3)细胞(由位于sanford-burnham-prebys medical discovery institute，la jolla，ca的ruoslahti实验室赠送)和阴性黑素瘤(m21)细胞(由位于加利福尼亚州圣地亚哥大学david cheresh实验室赠送)在体外结合，首先在生长培养基中培养细胞，所述生长培养基由10％胎牛血清(fbs)在dmem高糖培养基中，补充青霉素和链霉素(gibco)组成。为了实验，吸出培养基，用温培养基洗涤细胞两次，并将新鲜培养基与10μg fam标记的dcn-tcrk重组蛋白一起加入。根据制造商的方案，使用lightning-link荧光素试剂盒(expedon ltd，uk)，通过将dcn-tcrk重组蛋白直接偶联到荧光素上来进行标记。细胞在37℃孵育一小时；吸出培养基，洗涤细胞并用-20℃甲醇固定。用pbs洗涤细胞，并在室温下封闭(pbs，1％bsa，1％fbs，1％山羊血清，0.05％tween-20)30分钟，随后在室温下用初级抗fitc(invitrogen，ca，usa.catalog#a-889)封闭一小时。洗涤细胞，并将二抗alexa fluor 488山羊抗兔igg(invitrogen，usa)在室温下在黑暗中施用一小时。细胞核用dapi染色。盖玻片用fluorosmount-g(electron microscopy sciences，pa，usa)固定在载玻片上，使用共焦显微镜(olympus fv1200mpe，tokyo，japan)成像，并使用fv10-asw4.2指示器分析。
99.小鼠和研究批准
100.balb/cjrj小鼠(janvier labs，le-genest-saint-isles，france)用于药代动力
学研究。小鼠用标准实验室颗粒喂养，并随意饮水。所有使用balb/cjrj小鼠的动物实验都是按照芬兰国家动物伦理委员会批准的方案(esavi/6422/04.10.07/2017)进行的。
101.隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)的动物模型，即col7a1-/-rdeb小鼠，用于研究dcn-tcrk的皮肤归巢和治疗功能。col7a1-/-rdeb小鼠通过繁殖具有通过聚合酶链反应(pcr)确定的基因型的c57bl6/j col7a1+/-小鼠获得的。c57bl6/j col7a1+/-小鼠，由thomas jefferson大学的dr jouni uitto提供，其通过读码框外缺失靶向去除col7a1基因而开发。所有使用col7a1-/-rdeb的动物研究使用由纽约医学院动物管理和使用委员会(iacuc)批准的方案进行。
102.重组蛋白的药代动力学
103.重组蛋白dcn-tcrk或dcn在含有0.05％tween-20的tris缓冲盐水(tbs)中稀释。用8周龄balb/c雄性小鼠研究dcn-tcrk和dcn的药代动力学。在异氟烷麻醉下，将5mg/kg的dcn-tcrk或dcn注射到尾静脉中。在注射后15分钟、30分钟、60分钟、2小时、4小时和16小时收集来自不同尾静脉的血液样品。在注射后8小时或24小时，在美托咪定-氯胺酮麻醉下处死小鼠，并从锁骨下静脉收集血液样品。将样品与1m乙二胺四乙酸(edta)混合，在室温下2000g离心10分钟，储存血浆用于分析。根据制造商提供的说明书，用human decorin duoset elisa试剂盒(#dy143，r&d systems)测定血浆样品中人源核心蛋白聚糖的浓度。在每个培养板中使用来自未注射小鼠的静脉血样品以确保一抗的特异性。
104.在col7a1-/-小鼠中dcn-tcrk和dcn的施用
105.怀孕的col7a1
+
/-小鼠被单独圈养并且在分娩前每天监测。由于新生小鼠中的静脉内注射具有技术难度并且经常产生不一致的结果，发明人选择在出生24小时内将首次剂量的dcn-tcrk和dcn(5μg在15μl pbs中，相当于～5mg/kg)注射入col7a1-/-小鼠的肝脏，因为肝脏是胎儿和新生小鼠中造血的主要位点并且已经显示人细胞在肝内注射后快速进入循环(liao et al.，2015，stem cells 33：1807-1817；liao et al.，2018，steml cells transl med 7：530-542)。该第一剂量之后，每隔一天重复腹膜内施用蛋白质，直到小鼠达到14日龄(最大7剂)，当小鼠长到一周龄时，剂量增加到10μg。每天监测小鼠。对所有实验col7a1-/-小鼠在样品收集时均进行基因分型。
106.col7a1-/-小鼠中的组织学和免疫组织化学染色和hdcn定量
107.从选择的小鼠切下背部皮肤和爪(前爪和后爪)，包埋在tissue-tec oct化合物(sakura finetek，torrance，ca)中并储存在-80℃冰箱。每个样品切割6μm系列切片。在纽约医学院的核心组织学实验室进行天狼猩红染色和ctgf(#ab6992，abcam，cambridge，uk)免疫组织化学染色。为了对his标签进行免疫化学染色，将切片固定在4％多聚甲醛中，并用含0.1％triton(sigma，st louis，mo)的m.o.m.封闭剂(vector laboratories，burlingame，ca)(对于小鼠中产生的抗体)(vector laboratories，burlingame，ca)或10％马血清(gibco，grand island，ny)封闭。然后将载玻片与各自的一抗一起孵育，所述一抗包括抗col1a(#r1038，acris，rockville，md)、抗αsma(#14968，cell signaling technology，danvers，ma)、抗6x-his标签(#r930-25，thermofisher scientific，carlsbad，ca)和抗nrp-1(#af566-sp,r&d systems，minneapolis，mn)的抗体，随后是相应的alexa fluor 488二抗(invitrogen，carlsbad，ca)。然后将载玻片固定在含有dapi(vector laboratories，burlingame，ca)的vectashield固定培养基中。在每组实验中，使用nikon 90i eclipse显
微镜(nikon instrument inc.，ny)在不同组之间使用相同的设置获得图像。按照用户的指导，使用nis-element ar软件测量每个视野的免疫染色强度。rgb图像用于定量天狼猩红染色，并且通过选择图像内的参考点来定义阈值。
108.根据制造商的推荐，使用human decorin duoset elisa试剂盒(#dy143.r&d systems.minneapolis.mn)验证dcn-tcrk和dcn在col7a1-/-小鼠中归巢至皮肤。将组织活检样品在液氮中速冻，用预冷的研杵研磨，用裂解缓冲液(在pbs中含1％tween 20，蛋白酶抑制剂混合物，dnase和rnase)匀浆。在4℃下以12,000g离心10分钟后，收集上清液，并用biorad dc蛋白测定法(biorad.hercule.ca)定量总蛋白浓度。在用于测定之前，将来自给药和未给药dcn-tcrk或dcn的col7a1-/-小鼠的血清在样品稀释剂中1∶20稀释。
109.rt2谱pcr创伤愈合途径分析
110.使用rt2谱pcr阵列(rt
2 profiler pcr array)(qiagen.hilden.germany)研究了小鼠伤口愈合途径中涉及的基因的表达。rt2谱阵列含有在96孔板中的用于84个创伤愈合基因和5个管家基因与基因组dna、逆转录和pcr阳性对照的引物。在第7天从注射wt、rdeb和dcn或dcn-tcrk的col7a1-/-小鼠(每组3只小鼠)的整个前爪分离总rna，用nanodrop 200c(thermoscientific.waltham.ma)测定rna的质量和浓度。用基因组dna消除混合物(qiagen)处理rna。使用rt
2 first strand试剂盒(qiagen)将每个样品的500ng总rna用于逆转录。将cdna合成反应物与2
×
rt
2 sybr green master mix合并，并将25μl该混合物分配到96孔板的每个孔中。q-pcr在quantstudio5 real-time pcr仪(applied biosystems.foster city.ca)上进行。将ct值输出到excel文件中。在geneglobe数据分析中心(https://www.qiagen.com/us/geneglobe)使用pcr阵列数据分析模板分析得到原始数据。使用δδc
t
方法计算基因表达。使用1.5的倍数变化基因表达阈值和0.05的p值阈值来分析wt幼鼠和未处理/处理的幼鼠之间的数据。
111.胶原蛋白网格(collagen lattice)收缩测定
112.如前所述，在补充10％fbs的dmem中培养人正常成纤维细胞和rdeb患者来源的成纤维细胞(liao et al.，2018，stem cells 36：1839-1850)。通过将细胞悬浮液与中和的i型大鼠尾部胶原(advance biomatrix，carlsbad，ca)混合来制备胶原网格。胶原的终浓度为2.4mg/ml，细胞密度为2.1
×
105细胞/ml。将500μl细胞/胶原悬浮液分配到24孔板的单个孔中，并使其在室温下固化30分钟。胶原聚合后，在各孔中加入0.5ml补充了5％fbs的dmem，并将培养板在37℃，5％co2条件下培养。孵育12小时后，通过细移液管尖从各孔轻轻释放凝胶，分别以75μm的终浓度加入dcn或dcn-crk(n＝3/条件)。分别在12小时(初始面积)和48小时(收缩面积)获取图像，并使用image j定量凝胶的面积。
113.统计数据
114.应用kaplan-meier分析来确定中值寿命，并且使用对数排序(mantel-cox)测试来比较不同实验组(graphpad prism 6)之间的存活情况。使用student
′
s未配对t检验来研究dcn-tcrk与nrp-1的结合情况。p值低于0.05被认为是显着的。
115.结果
116.多功能重组dcn-tcrk融合蛋白的产生
117.本发明人通过将tcrk肽置于dcn的c末端而设计出dcn-tcrk融合蛋白(图1a)。dcn-tcrk和天然dcn都在哺乳动物细胞中表达，并用色谱法纯化(图2a)。两种重组蛋白均迁移为
约55kda的尖锐条带，sds凝胶电泳中条带上方有一涂片，通过western印迹分析检测为dcn(图2b)。尖锐条带对应于核心蛋白，并且涂片是由附着于dcn核心的糖胺聚糖硫酸酯链(主要是软骨素)的异质性引起的。质谱验证了dcn和c末端tcrk序列的同一性(表1)。流体动力学尺寸表明dcn-tcrk以同质且非聚集的大分子存在，其直径与所报道的dcn二聚体一致(scott et al.，2003，j biol chem 278：18353)(图2c)。差示扫描量热法产生了具有49℃的熔融温度(tm)的尖峰，表明tcrk-dcn在生理条件下将保持稳定的三级结构(图2d)。
118.表1.质谱分析人dcn的序列和c末端的tcrk序列。下划线字母表示被发现对人dcn特异的肽，斜体字母表示对包含进一步以粗体表示的tcrk序列(crkdk/rkdk)的c末端特异的氨基酸。
[0119][0120][0121]
dcn-tcrk在体外与nrp-1相互作用
[0122]
发明人接下来研究了与dcn融合的tcrk肽是否保留其与nrp-1相互作用的能力。dcn-tcrk被固定在elisa板上，并测试其与野生型(wt)或突变体nrp-1的结合，其中cendr结合口袋被三重突变所失活。(teesalu et al.，2009，pnas 106：16157-16162)。dcn-tcrk与对照牛血清蛋白相比，在显著更高的水平上有效地与wt nrp-1结合(p＜0.01)，而与突变体nrp-1没有明显的结合。此外，用合成rparpar(seq id no：25)肽，原型cendr肽，和rparpara(seq id no：26)，具有c-末端加帽cendr序列且不能与nrp-1相互作用的对照肽的平行研究，被用于证明该结合依赖于cendr序列(图1b)。发明人进一步确定了dcn-tcrk是否结合表达nrp-1的细胞，即人pc3前列腺癌细胞。分析中还包括不表达nrp-1的m21黑素瘤细胞。dcn-tcrk的内化仅在nrp-1阳性pc3细胞中观察到，但在nrp-1阴性m21细胞中未观察到，这支持了nrp-1依赖性细胞结合和穿透特性(图1c)。
[0123]
dcn-tcrk和dcn在体内表现出相似的药代动力学
[0124]
为了确定tcrk肽的加入是否对dcn的循环半衰期有任何影响，dcn-tcrk和dcn被平行静脉内注射到健康的balb/c小鼠中，并通过elisa定量在给药24小时内的不同时间点dcn-tcrk和dcn在外周血中的量。dcn-tcrk在血液中的半衰期是30分钟，与dcn没有显着差异(图3)。药代动力学研究表明，用小血管归巢肽修饰dcn不影响dcn的药物动力学。
[0125]
给药dcn-tcrk改善col7a1-/-小鼠的存活
[0126]
在rdeb动物模型col7a1-/-小鼠中评价dcn和dcn-tcrk的治疗功能和皮肤归巢特性。这些小鼠通过培育杂合同窝出生仔畜产生，并且col7a1-/-小鼠可以在出生时基于皮肤中出血性起泡的表现来鉴定。将新生col7a1-/-小鼠随机分开以接受肝内dcn、dcn-tcrk或pbs(阴性对照)给药。在第一次给药后每隔一天对每组中存活的小鼠进行重复的腹膜内给药，直至第14天。这里，col7a1-/-小鼠的寿命中值在pbs注射后为2天，并且在给药dcn后显著延长至7天(p＜0.0001)(图4a)。然而，给药dcn后col7a1-/-小鼠的存活与葡聚糖/人血清白蛋白(d/hsa)的历史施用相比没有统计学显著性，所述葡聚糖/人血清白蛋白用作给药干细胞的媒介物并且可能通过调节液体平衡偶尔增加一些受体col7a1-/-小鼠的存活(图5)。此外，dcn注射并未延长受体的存活超过两周龄。重要的是，dcn-tcrk处理后小鼠的寿命中值进一步延长到11天，这明显优于pbs(p＜0.0001)或历史d/hsa给药后(p＜0.001)的寿命(图4a和5)。另外，85％dcn-tcrk处理的小鼠达到7天存活，这些小鼠中20％存活超过三周龄，随后处死用于皮肤分析。
[0127]
dcn-tcrk归巢于col7a1-/-小鼠的皮肤
[0128]
利用elisa测定在一周、两周和三周(n＝所有时间点3个)定量受体rdeb小鼠皮肤中的人dcn和dcn-tcrk(图4b)。在一周的时间点dcn-tcrk和dcn处理的皮肤之间没有统计学显著性差异。然而，在两周的时间点dcn-tcrk的水平显着高于dcn(3.6倍，p＜0.05)(图4b)。此外，由于最后一次腹膜内给药dcn-tcrk是在第14天进行的，因此在三周皮肤中dcn-tcrk的鉴定(19.47
±
12.80pg/ml)高度暗示其在体内至少7天的稳定性。
[0129]
还进行了基于组氨酸标签表达的免疫组织化学染色，以分析dcn-tcrk或dcn在rdeb皮肤中的解剖学分布。在一周、两周和三周在rdeb小鼠的爪和背部皮肤的真皮中检测到dcn-tcrk(图4c)。此外，受体rdeb小鼠的胃肠(gi)道染色没有显示与抗his抗体的反应性(数据未显示)，提示dcn-tcrk的皮肤特异性靶向。相反，尽管elisa证明皮肤裂解物中存在dcn，但dcn处理的rdeb皮肤上的抗his免疫染色(由一周时间点表示)似乎仅为非特异性的(弥散性的)(图4c)。dcn-tcrk的归巢由nrp-1依赖性细胞和组织穿透提供，抗his和-nrp-1双染色证明来自dcn-tcrk的信号在rdeb皮肤中对nrp-1呈阳性的细胞内或与之紧密接近(图4d)，这进一步支持发明人的非限制性假说。
[0130]
dcn-tcrk疗法抑制rdeb小鼠中的纤维化反应
[0131]
发明人最近的研究已经证明早在出生后一周就在爪的交叉指型折叠中开始的col7a1-/-小鼠中tgfβ信号传导的显著提高。因此，在本研究中，选择该时间点的皮肤活检样品，用于比较wt和载体(d/hsa)、dcn或dcn-tcrk处理的rdeb皮肤之间的84个对伤口愈合反应和纤维化形成至关重要的基因的表达(每组n＝3)(表2)。如图6a中的聚类图所证明的，相对于wt，超过一半的基因显示在注射载体的rdeb皮肤中表达增加＞1.5倍。基因表达的相对倍数变化(log2)和p值(-log10)也以火山图呈现，并且在每个图中显著(p＜0.05)异常调节的基因以白色标记(图6b)。在载体rdeb皮肤中显着上调的基因涉及tgfβ信号传导(即
tgfb1、tgfb3、ctgf)、wnt信号传导(ctnnb1)、mapk1/mapk3信号传导(mapk3)和表皮生长因子受体信号传导(egfr)、ecm重塑(ctsg，plaur)、细胞粘附(itgb3，itgb5)和炎症(il4、cxcl3、tnfα)。与经dcn处理的rdeb小鼠皮肤中的重量相比，在载体rdeb皮肤中没有显着下调的基因，总体基因表达谱与载体rdeb皮肤中的相似(图6b)。即使tgfb1的表达不再显著异常，但是在dcn处理的rdeb皮肤中tgfbr3和ctgf的表达仍然显著上调。一些基因，如il4、cxcl3、tnfα在dcn处理的rdeb皮肤中比在载体对照中更显著上调(图6b和表2)。
[0132]
重要的是，dcn-tcrk处理的rdeb皮肤的表达谱与载体和dcn处理的rdeb皮肤的表达谱明显不同，且与wt皮肤的表达谱相似(图6a)。尽管它显示某些基因表达的个体差异，但当与wt相比时，在dcn-tcrk处理的rdeb皮肤中，阵列中没有基因是显著失调的(图6和表2)。
[0133]
表2.载体、dcn和dcn-tcrk处理的col7a-/-皮肤中基因表达相对于wt和p值的变化倍数。n/a表示平均阈值循环未被确定或大于所定义的截止点。与wt相比显著上调的基因用粗体表示，仅在dcn处理的col7a-/-皮肤中显著上调的基因用下划线表示。
[0134]
[0135][0136]
在注射载体的rdeb皮肤中观察到ctgf/ccn2的强表达，并且在用dcn-tcrk治疗后表达水平显著降低(图7a)，这支持了tgfβ1介导的纤维化在未治疗的rdeb皮肤中的发展和通过dcn-tcrk治疗对其的抑制。此外，如通过天狼猩红染色所证明的，注射载体的rdeb皮肤中的总胶原沉积随时间增加，但在dcn-tcrk处理的小鼠皮肤中显著降低(图7b和7c)。免疫染色表明在两周时间点，载体处理的皮肤中i型胶原(col1)的表达显著增加，而dcn-tcrk处理的皮肤中的表达减弱(图7d和7e)。用肌成纤维细胞，即α-平滑肌肌动蛋白的免疫染色获得了类似的结果(asma，图7d ja 7e)。此外，wt中的大多数αsma+细胞以及dcn-tcrk处理的rdeb皮肤与血管共定位(cd31染色)，这表明它们作为血管平滑肌细胞和周细胞的本体，而载体处理的rdeb皮肤中的αsma+细胞在血管外，即，指示其为肌成纤维细胞(图7d)。
[0137]
为了直接证明dcn-tcrk的抗纤维化功能，使用正常和rdeb衍生的成纤维细胞比较了dcn和dcn-tcrk体外抑制胶原凝胶收缩的能力。在dcn对胶原蛋白收缩没有显著影响的低浓度(75μm)下，dcn-tcrk在正常(p＜0.05)和rdeb衍生(p＜0.01)成纤维细胞中都能抑制胶原蛋白凝胶收缩(图8)。
[0138]
讨论
[0139]
本发明证明，伤口归巢肽中cendr序列的c末端暴露提供了该肽在正常和受伤皮肤
中的新的组织穿透功能。tcrk肽与dcn的缀合促进治疗性融合蛋白的皮肤选择性靶向，所述治疗性融合蛋白在rdeb的鼠模型中发挥抗纤维化作用并改善存活情况。
[0140]
实验证明，dcn-tcrk重组蛋白的全身性给药在改善col7a1-/-小鼠的存活情况方面比未修饰的dcn更有效。确切的分子机制是未知的，但是在不受任何理论限制的情况下，假设多种不同的机制可以有助于改善存活。dcn是抗炎和纤维变性的分子。与发明人之前对tgfβ信号传导早在出生后一周就激活的发现一致，在未治疗的rdeb小鼠皮肤中，在一周的时间点上调了一半以上与纤维化形成相关的基因的表达。不受任何理论的限制，通过给药dcn-tcrk改善rdeb小鼠的存活情况可能与治疗性蛋白质的抗纤维化和抗炎作用有关。
[0141]
不仅在dcn-tcrk(而不是dcn)处理的rdeb皮肤中使直接参与tgfβ信号传导的基因正常化，而且通过给药dcn-tcrk也使与其它信号传导途径相关的基因如β-联蛋白和egfr正常化。wnt/β-连环蛋白和egfr信号转导都已被证实通过它们独立的促纤维化机制或通过与tgfβ信号转导的交叉作用有助于多种纤维化疾病中的纤维发生。例如，egfr的激活是tgfb和ccn2介导的成纤维细胞增殖和肌成纤维细胞转分化的促纤维化功能所需的。dcn可以结合和下调egfr和hgf受体met(以抑制β-联蛋白的表达)。在给药dcn-tcrk后，这些基因在col7a1-/-小鼠皮肤中的正常化表达提示dcn-tcrk在rdeb中的多种治疗性功能。相反，dcn处理的rdeb皮肤中促炎基因的上调可能表明施用天然dcn不能维持的治疗效果。
[0142]
总之，本发明证明隐藏的cendr序列的暴露在创伤靶向肽中提供了新的特征，以归巢至除了创伤皮肤之外的正常皮肤，并且还提供真皮组织渗透。还证明了该肽(tcrk)可在全身性皮肤疾病，尤其是大疱性表皮松解症的治疗中用作递送核心蛋白聚糖和其它治疗分子的载体。