卤代呫吨作为疫苗佐剂的制作方法

背景技术：

1、人免疫系统由两个组成部分即先天性和适应性免疫系统组成。先天性免疫系统编码在生物体的种系中，并构成哺乳动物的第一道防线，通过启动细胞内信号传导级联反应对病原体和异常细胞作出反应，其导致转录因子的活化，转录因子触发由多种细胞类型参与的细胞因子和趋化因子的产生，所述多种细胞类型包括树突细胞(dc)、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和自然杀伤细胞[beutler,mol.immunol.2004,40:845–859]。

2、随后的适应性免疫系统是获得性的，并涉及由免疫原呈递dc介导的抗原特异性t细胞和b细胞反应。适应性免疫系统通过t细胞受体和中和病原体和异常细胞的抗体的作用为宿主提供长期保护[beutler,mol.immunol.2004,40:845–859；和hoebe et al.,nat.immunol.2004,5:971–974]。

3、肿瘤学和病毒学是相切相关的领域，它们在哺乳动物、特别是人的先天性和适应性免疫系统中相交叉。尽管疾病的病因和表现通常是不同的，但这种交叉为将一个领域的发现应用于另一个领域提供了共同的基础。在这里，我们通过融合在每个领域独立做出的新发现，综合了适用于这两个领域的新方法，以提供用于疫苗的新佐剂。

4、现有疫苗的缺点

5、疫苗发现和制备方面的最新进展奇迹般地能够在创纪录的短时间内开发出来，以成功对抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)病毒及其引起的疾病，冠状病毒病2019(covid-19)疾病。最近分离出的sars-cov-2δ变体似乎毒性更强，但我们现有可用的疫苗通常仍然可以预防。

6、美国疾病控制和预防中心(cdc)morbidity and mortality weekly report(mmwr)/august 27,2021/70(34):1167–1169记载了在δ变体前329,865人日以上的2,875名完全接种疫苗的人中，经调整的疫苗有效性计算为91％，其中10人患有sars-cov-2感染。在δ变体占主导地位的时期，在119,218人日的2,352名完全接种疫苗的人中，经调整的疫苗有效性计算为66％，其中24人患有sars-cov-2感染。上述报告报告没有对疫苗来源进行隔离。

7、尽管在δ变体占主导地位之前，2,875名完全接种疫苗的人中只有10人感染了sars-cov-2，但如果整个美国(约3.3亿人)接种疫苗，疾病百分比(约0.3％)将转化为约99.9万例病例。使用上述文章中的δ变体后患病率的数字[(24/2352)x 333,000,000]，病例数约为340万。

8、对于针对乙型肝炎的疫苗接种，cdc估计超过90％的个体会产生抗体[cdc,viralhepatitis–hepatitis b faqs for the public–is the hepatitis b serieseffective？may 23,2016.]。cdc报告，针对季节性流感(甲型流感)的疫苗在2004-2005年至2019-2020年的季节中有效率为10％至60％[cdc seasonal flu vaccine effectivenessstudies；centers for disease control and prevention,national center forimmunization and respiratory diseases(ncird),last reviewed august 26,2021.]。

9、三方麻疹-腮腺炎-风疹(mmr)疫苗的结果相似。cdc报告，一剂mmr疫苗对麻疹的有效率为93％，对腮腺炎的有效率为78％，对风疹的有效率为97％。两剂mmr疫苗对麻疹有效率为97％，对腮腺炎的有效率为88％，两剂后没有报告风疹[measles,mumps,and rubella(mmr)vaccination:what everyone should know；national center for immunizationand respiratory diseases；last reviewed january 26,2021.]。

10、由此可见，尽管许多现代疫苗对大多数人群有效，但它们都错过了一些无效的接受者，即使是那些已经接种了针对特定疾病的疫苗。因此，需要对疫苗进行改进以拯救生命。

11、常用的乙型肝炎疫苗含有含铝佐剂。一种美国食品和药品监督管理局(fda)批准的乙型肝炎疫苗使用专有佐剂来提高其功效。该疫苗以商品名heplisav-出售，包括一种名为cpg 1018的佐剂。据说cpg 1018是一种22聚体硫代磷酸酯连接的寡核苷酸，其靶向tlr9并且据说会引起抗体浓度增加，刺激辅助(cd4+)和细胞毒性(cd8+)t细胞群，并产生稳健的t和b细胞记忆反应。

12、佐剂有助于在接种疫苗的人中产生更强的免疫反应。美国fda批准的几种佐剂含有铝盐，例如无定形羟基磷酸磷酸铝(aahs)，氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾(明矾)。以前作为as04出售但目前未在美国使用的单磷酸基脂质a(mpl)和另一种称为as01b的mpl是从细菌表面分离出来的。as01b还包括qs-21，这是一种从智利皂树(quillaja saponariamolina)中提取的天然化合物。目前美国fda最终批准的佐剂是一种由角鲨烯组成的水包油乳液，命名为mf59[adjuvants and vaccines,centers for disease control andprevention,national center for emerging and zoonotic infectious diseases(ncezid),division of healthcare quality promotion(dhqp)；last reviewed august14,2020.]。

13、对病毒感染的炎症反应。

14、嗜性宿主细胞的猖獗病毒感染能够引发严重的局部或全身炎症反应，因为受感染细胞释放炎症信号传导成分(例如，细胞因子、趋化因子和与先天性免疫反应有关的损伤相关分子模式[damp]；和t细胞和适应性免疫反应的其他功能成分)，导致感染的局部或全身症状。治疗此类疾病表现的方法，例如减少严重的肺炎症反应，可以能够提供重要的疾病控制，直到患者能够通过抗病毒药物疗法和/或适应性免疫反应产生适当的抗病毒反应。

15、尽管有若干药剂可能有助于控制病毒性疾病，通过预防嗜性细胞的病毒感染或病毒在受感染的嗜性细胞内的功能活性，或通过在病毒感染期间调节不受控制的炎症反应，显然需要对抗病毒药剂的新选择。

16、干扰素

17、干扰素(ifn)是一类信号传导蛋白(即细胞因子)，是细胞防御病毒、传染性微生物和肿瘤细胞的核心[andrea et al.,eur j paed neurol 6suppl a(6):a41–a46(2002).]。例如，病毒感染的宿主细胞会释放ifn，向附近的细胞发出信号以增强其抗病毒防御能力。干扰素因其通过保护细胞免受病毒感染而“干扰”病毒复制的能力而得名[parkin et al.,lancet 357(9270):1777–1789(2001).]。

18、除了直接的抗病毒作用外，ifn还可以活化免疫细胞(例如自然杀伤细胞和巨噬细胞)，并通过增加主要组织相容性复合物(mhc)抗原的表达来上调抗原呈递。ifn分类为以下三组：

19、·i型ifn，其由ifn-α、ifn-β、ifn-ε、ifn-κ和ifn-ω组成，是为响应病毒而产生的，并在与细胞受体结合后抑制病毒rna和dna的复制；i型ifn在应对癌症的免疫信号传导中具有类似的作用；

20、·ii型ifn(ifn-γ)由白细胞介素12(il-12)活化并由细胞毒性t细胞和辅助性t细胞释放；和

21、·iii型ifn与对一些类型的病毒和真菌感染的免疫反应有关。

22、sting活化和免疫活化

23、干扰素基因刺激物(sting)是一种驻留在内质网(er)中的跨膜蛋白，其为先天性免疫的重要调节因子并且由ishikawa et al.,nature 455(7213):674-678(2008)首次报告。这些作者发现sting诱导i型ifn反应并在表达后发挥有效的抗病毒状态，而sting的缺失能够使细胞极易受到病毒感染。

24、更具体地，sting通常通过与cgmp-amp(cgamp)等的环状二核苷酸结合而被活化，当cgamp合酶识别细胞溶质dna时，cgmp-amp作为细胞内第二信使产生。与cgamp结合会导致sting二聚化并从er易位到高尔基体。重新定位后，sting募集丝氨酸/苏氨酸激酶，即tank结合激酶1(tbk1)，导致干扰素调节因子3[irf3]的磷酸化以及i型ifn和ifn刺激基因(包括ifn-β和cxcl10)的上调[motani et al.,j biol chem 293(20):7717–7726(2018).]。

25、ishikawa et al.,nature 461(8):788-793(2009)表明，由于缺乏成功的i型ifn反应，小鼠的sting缺陷会产生对1型单纯疱疹病毒(hsv-1)感染的致命易感性。

26、当细胞被细胞内病原体感染时，sting会诱导i型ifn的产生，它通过与分泌它的同一细胞(即自分泌信号传导)和附近的细胞(即旁分泌信号传导)结合来保护受感染的细胞和附近的细胞免受局部感染。i型干扰素(ifn-i)反应可能对于提供针对病毒感染的有效保护至关重要。

27、宿主传感器识别病原体相关分子模式(pamp)，例如病毒核酸，会迅速触发ifn-i的产生。ifn-i诱导的信号传导集中至转录因子上，转录因子会迅速诱导数百个称为干扰素刺激基因(isg)的基因表达[综述于schoggins,annu rev virol.6(1):567–584(2019)]。这种抗病毒信号传导级联反应几乎发生在所有暴露于ifn-i的细胞类型中。

28、isg与其他受ifn-i控制的下游分子(包括促炎细胞因子)一起，具有多种功能，从直接抑制病毒复制到募集和活化各种免疫细胞。因此，通常需要稳健的、适时的和局部的ifn-i反应作为抵御病毒感染的第一道防线，因为它促进病毒清除、诱导组织修复并触发针对病毒的长期适应性免疫反应。sa ribero et al.,plos pathog 16(7):e1008737(july29,2020)。

29、sun et al.,proc natl acad sci,usa,105(21):8653-8658(2009)表明，sting的二聚化对这种先天性免疫系统信号传导至关重要。abe et al.,mol cell 50:5-15(2013)表明，保护功能需要急性sting活化(通过二聚化)，而慢性活化可导致反作用的炎症反应和自身免疫性疾病。

30、在一些情况下，sting充当(例如从宿主细胞核和传染性病原体泄漏的)外源和内源dna的细胞内传感器。这种内源dna可能导致自身炎症性疾病，如系统性红斑狼疮(sle)或aicardi-goutières综合征(ags)[barber,nat rev immunol 15(12):760-770(december2015).]。有趣的是，正如上文的abe et al.所述，关于抗病毒活性，似乎保护功能需要急性sting活化(通过二聚化)，而慢性活化则可能导致免疫下调。

31、上文的barber指出针对逆转录病毒和rna病毒的复制具有相似的活性。因此，sting的表达和二聚化在对抗所有主要病毒类别的感染方面发挥着关键的细胞防御作用。

32、上文的barber还描述了除了其抗病毒作用外的一种类似的抗细菌感染功能。在该综述中，barber指出，他们的研究强调了适当的免疫反应和炎症之间的微妙平衡，这种平衡可能会被微生物利用。barber进一步指出，这些发现可能对sting靶向佐剂的开发和旨在诱导稳健、持久的适应性免疫反应的疫苗设计产生重要影响。

33、这些观察结果表明，sting的急性活化对抗微生物活性(即抗病毒、抗细菌、抗真菌或抗寄生虫)至关重要。

34、最近的研究表明，sting同二聚体与细胞质多核苷酸、特别是与病毒相关的单链和双链dna(ssdna和dsdna)分子复合。除了i型ifn之外，发现这种含有二聚化sting的复合物对于hsv-1介导的各种各样的先天性免疫和促炎基因的转录活化是必不可少的[abe etal.,mol cell 50:5-15(2013).]。

35、某些细胞类型中的sting活化会触发细胞死亡，包括细胞凋亡和坏死。这种作用对于预防不必要或过度的炎症事件和维持宿主免疫稳态至关重要。除了以i型ifn和肿瘤坏死因子(tnf)的产生为代表的典型免疫反应外，sting信号传导还能够在各种细胞类型中诱导细胞死亡事件。

36、目前，已经开发出几种sting激动剂来治疗难治性恶性肿瘤。参见例如，ramanjuluet al.,nature 564:439-443(december 20/272018)中使用基于连接的氨基苯并咪唑(abzi)的化合物。

37、sali et al.,(plos pathog,pages 1-30,december 8,2015)报道了一种能够通过转录因子ifn调节因子3(irf3)活化i型ifn反应的小分子sting激动剂的鉴定。该小分子也称为g10(其结构式示于下文中)，在人成纤维细胞中触发了irf3/ifn相关的转录。

38、

39、对该分子的细胞反应的进一步研究揭示了多个irf3依赖性抗病毒效应基因以及i型和iii型ifn亚型的表达。这导致建立了这样的细胞状态，其阻止了包括基孔肯亚病毒、委内瑞拉马脑炎病毒和辛德毕斯病毒在内的新的ssrna甲病毒种类的复制。这些作者报道说，g10分子不直接与sting结合，而是作为人sting依赖性表型的间接活化剂。

40、guo et al.,[antimicrob agents chemother 59(2):1273–1281(2015)]报道了合成的小分子5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(dmxaa)(其结构示于下文中)可激活sting依赖性信号传导通路，在小鼠巨噬细胞中诱导i型ifn为主的细胞因子反应，从而通过减少细胞质病毒核衣壳的量而有效抑制培养的小鼠肝细胞中和在小鼠的肝脏中的hbv复制。dmxaa之前已被确定为鼠sting的激动剂。人sting未能与dmxaa结合或响应于dmxaa而发出信号[conlon et al.,j immunol190:5216–5225(2013).]。sting在这个级联反应中的直接作用似乎是对作为先天性和适应性免疫系统之间的中介的dc的作用。

41、

42、sting已被认为是tbk1/irf3和nf-κb通路以及随后的ifn和tnf产生的免疫反应活化剂。sting被认为通过诱导促炎细胞因子在宿主防御、自身免疫性疾病和肿瘤免疫中发挥关键作用。还研究了靶向sting途径在癌症免疫疗法中的应用[liu et al.,mediatinflamm(2018)article id 1202797,(4pages).]。

43、zhu et al.,mol cancer 18:152(2019)综述了癌症治疗之后sting的活性。他们报道了许多研究表明，sting活化和i型ifn产生的刺激对于抗癌免疫反应至关重要。

44、zhu et al.记载了新出现的证据表明，sting还以i型ifn非依赖性的方式调节抗癌免疫力。例如，sting已被证明可以诱导细胞死亡并促进癌细胞抗原的释放。此外，sting活化已被证明可以增强癌症抗原呈递，有助于t细胞的致敏和活化，促进t细胞的运输和浸润到肿瘤中，并促进t细胞对癌细胞的识别和杀灭。

45、这些作者还报道了许多研究还表明，i型ifn有助于体内和体外肿瘤的控制。这些研究表明，i型ifn在抗肿瘤反应中起着核心作用。然而，最近的研究表明，i型ifn也可能损害抗癌免疫力，甚至导致意外的癌症治疗失败。例如，ifn-β已被证明可以诱导肿瘤细胞中程序性细胞死亡配体1(pd-l1)和程序性细胞死亡配体2(pd-l2)的产生，这可能有助于癌细胞的免疫逃逸。

46、barber[nat rev immunol 15(12):760-770(december 2015)]综述了sting依赖性先天性免疫信号传导在病毒学中的作用，这在很大程度上与病毒学相似。sting活化导致i型ifn的活化，这对适应性免疫系统具有启动作用(通过dc交叉呈递肿瘤抗原来活化肿瘤抗原特异性t细胞)。在小鼠中消除sting会消除t细胞对黑色素瘤的反应以及免疫检查点抑制剂的活性，并且barber指出，正如在病毒学中所观察到的，慢性sting活化可能在促进肿瘤发生中发挥作用。

47、barber最后指出以下结论：“越来越明显的是，sting在促进抗肿瘤免疫反应方面发挥着关键作用。此外，刺激肿瘤微环境中的sting活性可能构成一种新的帮助治疗恶性疾病的免疫治疗策略”[barber,nat rev immunol 15(12):768(2015)]。

48、正如simon et al.,proc r soc b 282:20143085(2015)所述，免疫功能在儿童早期迅速增加，并在整个成年期一直到高龄开始均保持一致。这些作者指出，随着人衰老，免疫系统会经历强烈的重塑和衰退。这种免疫衰老使老年人患急性病毒和细菌感染的风险更高。

49、虽然似乎很少有关于sting表达和活化随年龄变化的直接数据，但是很可能其与高龄开始(即60岁或以上)的先天性免疫总体下降的模式吻合，特别是考虑到sting在介导先天性抗病毒免疫中的核心作用。这些作者指出，随着年龄的增长(即工业化国家开始的中位年龄约为70岁)，癌症发病率平行增加，这也可能归因于sting表达和活化随着年龄的增长而下降。

50、此外，对急性sting活化的有效结果和慢性sting活化在传染病和肿瘤学中的反作用结果的一致观察表明，急性sting活化在治疗传染病和肿瘤学适应证中的核心作用。

51、本发明示例了抗微生物和抗癌活性之间的联系，作为一种用于改善基于疫苗的微生物感染和癌症生长的治疗的新佐剂，其使用卤代呫吨如玫瑰红作为疫苗的佐剂添加剂的选择。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明考虑了卤代呫吨(hx)化合物作为用于施用于哺乳动物例如人的疫苗中的免疫原的佐剂的医药用途。考虑的卤代呫吨(hx)化合物可以以其自身使用，也可以作为其药学上可接受的盐、其氮原子未被取代、被一个或两个相同或不同的c1-c4烷基取代或所述烷基与酰胺氮原子一起形成5-或6-元环的酰胺、c1-c4烷基酯、或其芳族衍生物(酰胺或酯)使用。芳族衍生物是由具有包含0、1或2个独立为氮、氧或硫的杂环原子的5-或6-元芳环或5,6-或6,6-稠合芳环系统的醇或单取代胺形成的酯或酰胺。玫瑰红是优选的hx化合物，并且其二钠盐玫瑰红二钠是最优选的hx化合物。

2、本发明的一个实施方案考虑了一种疫苗组合物，其含有溶解或分散在药学上可接受的稀释剂如水或0.9％盐水中以疫苗有效量存在的免疫原，以及佐剂有效量的如上文所述的卤代呫吨。例如，卤代呫吨化合物(hx)的佐剂有效量是小于用于杀死癌细胞的细胞毒性量的量，但足以引起sting二聚化的量。

3、另一考虑的实施方案是一种容纳浓缩疫苗前组合物的容器(vessel或container)，例如小瓶或瓶子或其他合适的工具，所述浓缩疫苗前组合物含有免疫原和上文所述的hx化合物。预先确定两种成分的量以分别提供疫苗有效量的免疫原和佐剂有效量的hx化合物，从而在制备疫苗时提供溶解或分散在预定量的药学上可接受的稀释剂的疫苗。

4、哺乳动物hx化合物佐剂化疫苗组合物和相应的浓缩疫苗前组合物还可含有一种或多种赋形剂。示例性赋形剂包括缓冲盐、向组合物提供所需渗透压(osmolarity或osmolality)的渗透剂，以及一种或多种附加佐剂。示例性优选的附加佐剂包括一种或多种常用的含铝疫苗佐剂，以及一种或多种所谓的“检查点抑制剂”，其通常是单克隆抗体，有助于刺激t细胞如cd4和cd8 t细胞的产生。此类赋形剂，如疫苗相关药学中的习惯，可以基于疫苗组合物的重量以哺乳动物hx化合物佐剂化疫苗组合物的约0.001％至10重量％的量、优选0.1-10重量％存在。下文将更详细地讨论赋形剂。

5、本发明的又一实施方案是一种改良的疫苗组合物，其含有溶解或分散在药学上可接受的稀释剂中的疫苗有效量的预定的免疫原，其中改良包括也与免疫原一起溶解或分散在药学上可接受的稀释剂中的佐剂有效量的如上所述的卤代呫吨(hx)化合物。

6、冠词“a”和“an”在本文中用于指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。

7、本文引用的每篇专利、专利申请和文章均通过引用并入本文。