具有VGLL1特异性的T细胞受体和其用途

具有vgll1特异性的t细胞受体和其用途
1.优先权声明
2.本技术要求2020年5月21日提交的美国临时专利申请号63/028,262的权益，所述美国临时专利申请的全部内容以引用方式并入本文。
3.序列表的并入
4.包含在名为“utfcp1477wo_st25.txt”的文件(其为58.7kb(如microsoft windows中所测量)且创建于2021年5月14日)中的序列表以电子呈交方式一同提交并以引用方式并入本文。
技术领域
5.本发明大体上涉及免疫学和医学领域。更具体地，其涉及肿瘤抗原特异性t细胞受体和其用于治疗癌症的用途。


背景技术：

6.胰腺导管腺癌(pdac)是最具侵袭性的胰腺癌形式，因其差预后和高死亡率而众所周知，其8％的总体5年存活率是所有癌症类型中最低的。早期检测不常见，85％的患者呈现为局部晚期或转移性疾病。有效治疗的进展缓慢，且pdac相关死亡的发生率持续上升。尽管最近通过优化手术和化疗治疗方案的排序在存活方面实现了一些令人鼓舞的改善，但开发新的有效治疗选项仍然是晚期pdac患者的迫切需求(strobel等，2019)。
7.基于细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的免疫疗法已成功地在多种癌症类型中诱导客观临床反应。通过t淋巴细胞的非特异性活化起作用的检查点抑制剂(cpi)疗法已对患者的长期存活产生显著的积极影响。然而，cpi的益处主要限于高度突变的肿瘤类型，如黑色素瘤和肺腺癌，所述肿瘤可在表面hla分子的背景下表达大量的潜在新抗原肽(rizvi等，2015)。肿瘤浸润性淋巴细胞(til)疗法(其中对个体癌症患者重新输注从其自身肿瘤扩增的t细胞)也显示出诱导大体积肿瘤消退的巨大前景。til是多克隆的，且可识别患者特异性新抗原以及共有的肿瘤相关抗原(taa)，诸如黑素细胞分化抗原(mda)或癌-睾丸抗原(cta)。通过输注抗原特异性内源性t细胞(etc疗法)或遗传工程改造的tcr-t细胞来靶向单个经验证的hlai类限制性taa，也已被证明在诱导患有黑色素瘤和其他实体癌的患者的临床反应方面是成功的。
8.遗憾的是，基于cpi和ctl的免疫疗法在治疗pdac患者方面未显示出相同的有益影响(young等，2018)。这种成功的缺乏归因于pdac的高度免疫抑制性肿瘤微环境(tme)，以及导致新抗原靶标缺乏的相对较低的突变负担(yarchoan等，2017)。已在pdac中鉴别出许多潜在可靶向的hlai类限制性肽抗原，最显著的是来源于癌胚抗原相关细胞粘附分子(ceacam)、粘蛋白16(muc16)、间皮素(msln)和突变的kras等等的抗原。尽管有前景，但针对这些taa的疗法面临着固有的局限性，包括在非肿瘤组织中诱导毒性、靶抗原表达的低盛行率或不能打破通常阻碍高亲和力ctl生成的自身耐受机制。除了有限的例外，针对这些抗原的临床试验产生了令人失望的结果，强调需要鉴别在pdac患者中表现出更高盛行率的安全
的免疫原性靶标。因此，对于针对用于这些恶性肿瘤的额外靶抗原的新型的基于t细胞的疗法存在未满足的医疗需求。


技术实现要素：

9.在一些实施方案中，本公开提供vgll1 t细胞受体(tcr)和其使用方法，诸如在包括过继性t细胞疗法的疗法中。在一个实施方案中，提供工程改造的t细胞受体(tcr)，其中所述tcr特异性地结合vestigial样1(vgll1)并且包含：(a)α链cdr1(seq id no:10)、cdr2(seq id no:11)和cdr3(seq id no:12)以及β链cdr1(seq id no:21)、cdr2(seq id no:22)和cdr3(seq id no:23)；(b)α链cdr1(seq id no:33)、cdr2(seq id no:34)和cdr3(seq id no:35)以及β链cdr1(seq id no:44)、cdr2(seq id no:45)和cdr3(seq id no:46)；(c)α链cdr1(seq id no:56)、cdr2(seq id no:57)和cdr3(seq id no:58)以及β链cdr1(seq id no:67)、cdr2(seq id no:68)和cdr3(seq id no:69)；或(d)α链cdr1(seq id no:79)、cdr2(seq id no:80)和cdr3(seq id no:81)以及β链cdr1(seq id no:90)、cdr2(seq id no:91)和cdr3(seq id no:92)。
10.在一些方面，tcr包含α链cdr1(seq id no:10)、cdr2(seq id no:11)和cdr3(seq id no:12)以及β链cdr1(seq id no:21)、cdr2(seq id no:22)和cdr3(seq id no:23)。在某些方面，tcr包含与seq id no:15的氨基酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除所述cdr之外的α链可变区和与seq id no:20的氨基酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除cdr之外的β链可变区。例如，可变区包含cdr，并且序列的其余部分具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97、98％或99％)序列同一性。在具体方面，tcr包含seq id no:15的α链可变区和seq id no:20的氨基酸序列的β链可变区。在某些方面，tcr包含与seq id no:3的核苷酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除cdr之外的α链可变区和与seq id no:9的核苷酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除cdr之外的β链可变区。在特定方面，tcr包括包含seq id no:3的核苷酸序列的α链可变区和包含seq id no:9的核苷酸序列的β链。在一些方面，除cdr之外的tcr与seq id no:13具有至少90％同一性。在具体方面，tcr包含seq id no:13。
11.在某些方面，tcr包含α链cdr1(seq id no:33)、cdr2(seq id no:34)和cdr3(seq id no:35)以及β链cdr1(seq id no:44)、cdr2(seq id no:45)和cdr3(seq id no:46)。在某些方面，tcr包含与seq id no:38的氨基酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除cdr之外的α链可变区和与seq id no:43的氨基酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除cdr之外的β链可变区。在某些方面，tcr包含seq id no:38的α链可变区和seq id no:43的氨基酸序列的β链可变区。在一些方面，tcr包含与seq id no:26的核苷酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除cdr之外的α链可变区和与seq id no:32的核苷酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除cdr之外的β链可变区。在一些方面，tcr包括包含seq id no:26的核苷酸序列的α链可变区和包含seq id no:32的核苷酸序列的β链可变区。
在一些方面，除cdr之外的tcr与seq id no:36具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性。在某些方面，tcr包含seq id no:36。
12.在某些方面，tcr包含α链cdr1(seq id no:56)、cdr2(seq id no:57)和cdr3(seq id no:58)以及β链cdr1(seq id no:67)、cdr2(seq id no:68)和cdr3(seq id no:69)。在一些方面，tcr包含与seq id no:61的氨基酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除cdr之外的α链可变区和与seq id no:66的氨基酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除cdr之外的β链可变区。在一些方面，tcr包含seq id no:61的α链可变区和seq id no:66的氨基酸序列的β链可变区。在某些方面，tcr包含与seq id no:49的核苷酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除cdr之外的α链可变区和与seq id no:55的核苷酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除cdr之外的β链可变区。在一些方面，tcr包括包含seq id no:49的核苷酸序列的α链可变区和包含seq id no:55的核苷酸序列的β链。在具体方面，除cdr之外的tcr与seq id no:59具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性。在特定方面，tcr包含seq id no:59。
13.在一些方面，tcr包含α链cdr1(seq id no:79)、cdr2(seq id no:80)和cdr3(seq id no:81)以及β链cdr1(seq id no:90)、cdr2(seq id no:91)和cdr3(seq id no:92)。在某些方面，tcr包含与seq id no:84的氨基酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除cdr之外的α链可变区和与seq id no:89的氨基酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除cdr之外的β链可变区。在一些方面，tcr包含seq id no:84的α链可变区和seq id no:89的氨基酸序列的β链可变区。在某些方面，tcr包含与seq id no:72的核苷酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除cdr之外的α链可变区和与seq id no:78的核苷酸序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的除cdr之外的β链可变区。在一些方面，tcr包括包含seq id no:72的核苷酸序列的α链可变区和包含seq id no:78的核苷酸序列的β链。在具体方面，除cdr之外的tcr与seq id no:82具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性。在特定方面，tcr包含seq id no:82。
14.在一些方面，工程改造的tcr结合hla-a*0101。在某些方面，tcr被进一步定义为可溶性tcr，其中可溶性tcr不包含跨膜结构域。在另外的方面，tcr进一步包含可检测的标记物。在一些方面，tcr与治疗剂(诸如免疫毒素或化学治疗剂)共价结合。
15.又一实施方案提供多价tcr复合物，其包含本实施方案或其方面的多个tcr(例如，工程改造的t细胞受体(tcr)，其中所述tcr特异性地结合vestigial样1(vgll1)并且包含：(a)α链cdr1(seq id no:10)、cdr2(seq id no:11)和cdr3(seq id no:12)以及β链cdr1(seq id no:21)、cdr2(seq id no:22)和cdr3(seq id no:23)；(b)α链cdr1(seq id no:33)、cdr2(seq id no:34)和cdr3(seq id no:35)以及β链cdr1(seq id no:44)、cdr2(seq id no:45)和cdr3(seq id no:46)；(c)α链cdr1(seq id no:56)、cdr2(seq id no:57)和cdr3(seq id no:58)以及β链cdr1(seq id no:67)、cdr2(seq id no:68)和cdr3(seq id no:69)；或(d)α链cdr1(seq id no:79)、cdr2(seq id no:80)和cdr3(seq id no:81)以及β
链cdr1(seq id no:90)、cdr2(seq id no:91)和cdr3(seq id no:92))。在一些方面，多价tcr包含2、3、4或更多个彼此缔合的tcr。在某些方面，多价tcr存在于脂质双层中、脂质体中或附着到纳米粒子。在一些方面，tcr经由接头分子彼此缔合。
16.另一实施方案提供编码本实施方案或其方面的tcr(例如，工程改造的t细胞受体(tcr)，其中所述tcr特异性地结合vestigial样1(vgll1)并且包含：(a)α链cdr1(seq id no:10)、cdr2(seq id no:11)和cdr3(seq id no:12)以及β链cdr1(seq id no:21)、cdr2(seq id no:22)和cdr3(seq id no:23)；(b)α链cdr1(seq id no:33)、cdr2(seq id no:34)和cdr3(seq id no:35)以及β链cdr1(seq id no:44)、cdr2(seq id no:45)和cdr3(seq id no:46)；(c)α链cdr1(seq id no:56)、cdr2(seq id no:57)和cdr3(seq id no:58)以及β链cdr1(seq id no:67)、cdr2(seq id no:68)和cdr3(seq id no:69)；或(d)α链cdr1(seq id no:79)、cdr2(seq id no:80)和cdr3(seq id no:81)以及β链cdr1(seq id no:90)、cdr2(seq id no:91)和cdr3(seq id no:92))的多肽。又一实施方案提供编码多肽的多核苷酸，所述多肽编码本实施方案或其方面的tcr。
17.在再一实施方案中，提供编码本实施方案或其方面的tcr的表达载体(例如，工程改造的t细胞受体(tcr)，其中所述tcr特异性地结合vestigial样1(vgll1)并且包含：(a)α链cdr1(seq id no:10)、cdr2(seq id no:11)和cdr3(seq id no:12)以及β链cdr1(seq id no:21)、cdr2(seq id no:22)和cdr3(seq id no:23)；(b)α链cdr1(seq id no:33)、cdr2(seq id no:34)和cdr3(seq id no:35)以及β链cdr1(seq id no:44)、cdr2(seq id no:45)和cdr3(seq id no:46)；(c)α链cdr1(seq id no:56)、cdr2(seq id no:57)和cdr3(seq id no:58)以及β链cdr1(seq id no:67)、cdr2(seq id no:68)和cdr3(seq id no:69)；或(d)α链cdr1(seq id no:79)、cdr2(seq id no:80)和cdr3(seq id no:81)以及β链cdr1(seq id no:90)、cdr2(seq id no:91)和cdr3(seq id no:92))。在一些方面，编码tcr的序列在启动子的控制之下。在某些方面，表达载体是病毒载体。在一些方面，病毒载体是逆转录病毒载体。在另外的方面，载体进一步编码接头结构域。例如，接头结构域位于α链和β链之间。
18.又一实施方案提供经工程改造以表达本实施方案或其方面的tcr的宿主细胞(例如，工程改造的t细胞受体(tcr)，其中所述tcr特异性地结合vestigial样1(vgll1)并且包含：(a)α链cdr1(seq id no:10)、cdr2(seq id no:11)和cdr3(seq id no:12)以及β链cdr1(seq id no:21)、cdr2(seq id no:22)和cdr3(seq id no:23)；(b)α链cdr1(seq id no:33)、cdr2(seq id no:34)和cdr3(seq id no:35)以及β链cdr1(seq id no:44)、cdr2(seq id no:45)和cdr3(seq id no:46)；(c)α链cdr1(seq id no:56)、cdr2(seq id no:57)和cdr3(seq id no:58)以及β链cdr1(seq id no:67)、cdr2(seq id no:68)和cdr3(seq id no:69)；或(d)α链cdr1(seq id no:79)、cdr2(seq id no:80)和cdr3(seq id no:81)以及β链cdr1(seq id no:90)、cdr2(seq id no:91)和cdr3(seq id no:92))。在一些方面，细胞是t细胞、nk细胞、不变nk细胞、nkt细胞、间充质干细胞(msc)或诱导性多能干(ips)细胞。在某些方面，宿主细胞是免疫细胞。在具体方面，从脐带中分离宿主细胞。在一些方面，t细胞是cd8
+ t细胞、cd4+t细胞或γδt细胞。在具体方面，t细胞是调节性t细胞(treg)。在一些方面，细胞是自体的。在某些方面，细胞是同种异体的。
19.另一实施方案提供用于工程改造本实施方案或其方面的宿主细胞的方法，其包括
使所述免疫细胞与本实施方案或其方面的tcr或本实施方案或其方面中任一个的表达载体接触，所述tcr为，例如，工程改造的t细胞受体(tcr)，其中所述tcr特异性地结合vestigial样1(vgll1)并且包含：(a)α链cdr1(seq id no:10)、cdr2(seq id no:11)和cdr3(seq id no:12)以及β链cdr1(seq id no:21)、cdr2(seq id no:22)和cdr3(seq id no:23)；(b)α链cdr1(seq id no:33)、cdr2(seq id no:34)和cdr3(seq id no:35)以及β链cdr1(seq id no:44)、cdr2(seq id no:45)和cdr3(seq id no:46)；(c)α链cdr1(seq id no:56)、cdr2(seq id no:57)和cdr3(seq id no:58)以及β链cdr1(seq id no:67)、cdr2(seq id no:68)和cdr3(seq id no:69)；或(d)α链cdr1(seq id no:79)、cdr2(seq id no:80)和cdr3(seq id no:81)以及β链cdr1(seq id no:90)、cdr2(seq id no:91)和cdr3(seq id no:92))。在一些方面，免疫细胞是t细胞或外周血淋巴细胞。在某些方面，接触被进一步定义为转染或转导。在一些方面，转染包括将编码本实施方案或其方面的tcr的rna电穿孔到免疫细胞中。在一些方面，所述方法进一步包括在转导免疫细胞之前从根据权利要求41所述的表达载体生成病毒上清液。在一些方面，免疫细胞是受刺激的淋巴细胞，诸如人淋巴细胞。在具体方面，刺激包括使免疫细胞与okt3和/或il-2接触，或在okt3和/或il-2中孵育免疫细胞。在另外的方面，所述方法进一步包括分选免疫细胞以分离tcr工程改造的t细胞。在一些方面，所述方法进一步包括通过连续稀释进行t细胞克隆。在特定方面，所述方法进一步包括通过快速扩增方案扩增t细胞克隆。
20.另一实施方案提供治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的本实施方案或其方面的tcr工程改造细胞。在一些方面，受试者被鉴别为具有hla-a*0101等位基因。在某些方面，tcr工程改造细胞是t细胞或外周血淋巴细胞。在具体方面，t细胞是cd8
+ t细胞、cd4
+
t细胞或treg。在一些方面，癌症是胰腺癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫癌或宫颈癌。在某些方面，受试者是人。在一些方面，tcr工程改造细胞是自体的。在某些方面，tcr工程改造细胞是同种异体的。在另外的方面，所述方法进一步包括在施用vgll1特异性t细胞之前对受试者进行淋巴耗竭(lymphodepletion)。例如，淋巴耗竭包括施用环磷酰胺和/或氟达拉滨(fludarabine)。在另外的方面，所述方法进一步包括施用第二抗癌疗法。在一些方面，所述疗法是化学疗法、免疫疗法、手术、放射疗法或生物疗法。在某些方面，tcr工程改造细胞和/或至少第二治疗剂经静脉内、腹膜内、气管内、瘤内、肌内、内窥镜、病变内、经皮、皮下、局部或通过直接注射或灌注来施用。在一些方面，确定受试者具有过表达vgll1的癌细胞。
21.根据下文详细描述将明了本发明的其他目标、特征和优点。然而，应当理解，尽管具体实施方式和具体实施例显示了本发明的优选实施方案，但其仅以举例方式给出，因为本领域技术人员根据此详细描述将明了属于本发明精神和范围内的各种变化和修改。
附图说明
22.附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步证实本发明的某些方面。可通过与本文所呈现的具体实施方案的详细说明组合参考这些附图中的一个或多个来更好地理解本发明。
23.图1a-图1c：免疫肽组分析揭示由两个pdac患者来源的类器官系表达的vgll1衍生肽。(图1a)从来源于35名m.d.anderson pdac患者的39个肿瘤样本中鉴别pdac肿瘤特异性
的hla i类结合肽的实验策略。(图1b)从洗脱的pdac相关肽中鉴别潜在可靶向taa的生物信息学筛选策略。针对与42个gtex portal正常组织中的转录本表达相比的pdac肿瘤rnaseq表达评估了肽编码基因。将除睾丸之外的正常组织分为4类(非必需组织、警示组织、风险组织和危险组织)，这反映了从针对不同组织的脱靶(off-tumor)杀灭活性预期的潜在毒性。使用四个对应的逐渐增加严格性的表达阈值(30、10、3和1tpm，由左侧虚线表示)连续过滤所有肽编码基因，以消除在ctl疗法(右虚线)的背景下最有可能诱发自身免疫毒性的候选taa。描绘了从pdac患者mp015和mp081的肿瘤类器官细胞系中分离的高置信度肽的筛选，显示很少的洗脱肽符合这些严格的标准。(图1c)从两种不同的pdac类器官细胞系mp015和mp081中分离的hla-a*0101限制性vgll1衍生肽的质谱(上2个图)。与合成的经同位素标记的vgll1肽lseletpgky(seq id no:93)(含有13c/15n标记的赖氨酸残基)共洗脱且与其ms片段化谱匹配的患者来源的肽，其中标记的y
+
碎片离子系列证实8个原子质量单位的预期位移(下图)。
24.图2：vgll1在多种肿瘤类型中过表达。如通过rnaseq分析确定的正常组织(左，gtex portal数据库)和人癌症(右，tcga数据库)中的vgll1转录本表达。每个点代表一个正常供体或患者肿瘤样本。颜色对应于图1中定义的4个正常组织类别：绿色，非必需组织(脂肪、子宫颈、ebv、输卵管、肌肉、卵巢、转化的成纤维细胞、子宫、皮肤、睾丸、阴道、前列腺、乳房、唾液腺)；黄色，警示组织(肾上腺、神经、脾、甲状腺、全血、胰腺、垂体、膀胱)；橙色，风险组织(结肠、食管、肝脏、小肠、胃、肾、肺)；红色，危险组织(动脉、脑、心脏)。虽然》95％的正常gtex警示、风险和危险组织样品低于每百万3个转录本(tpm，虚线)，但大量tcga癌症患者表现出高于该阈值的vgll1转录本表达(方框)。
25.图3：vgll1与差的胰腺患者存活相关。上图：显示通过肿瘤vgll1转录本表达分层的tcga pdac患者总体存活(os)的卡普兰-迈耶(kaplan-meier)曲线(n＝178)。p值指示比较3组表达vgll1的患者的os与具有低或不存在的vgll1表达的那些患者的os的对数秩显著性检验结果。(》100tpm显示最低总体存活且《1.5tpm显示最高总体存活)。下图：来自md anderson转移性pdac患者肿瘤的独立队列的患者来源的异种移植物(pdx)(n＝37)在免疫缺陷小鼠中生长后经受rnaseq分析。图形显示对应于os时间和对应的vgll1转录本表达将pdx样本分层为3组。
26.图4a-图4d：从患者mp015的外周血生成vgll1抗原特异性ctl。(图4a)概述用于从人供体pbmc生成vgll1特异性cd8+ t细胞的实验程序的示意图。(图4b)用自体lseletpgky(seq id no:93)肽脉冲的树突细胞(dc)刺激通过白细胞去除术从pdac患者mp015中分离的pbmc。在两次刺激(顶行)后，对cd8
+
和vgll1四聚体阳性细胞进行分选并使用标准快速扩增方案(rep)扩增。由于第一次rep后抗原特异性细胞数目少，因此对vgll1特异性t细胞进行重新分选和第二次扩增。第二次rep产生19.6
×
109个vgll1特异性ctl，在个性化etc治疗同情ind方案下，患者mp015以输注形式安全地接受了这些ctl。(图4c)使用对应于24种不同特异性的vβ抗体对扩增的vgll1特异性ctl进行tcr库分析。(图4d)在标准
51
cr释放测定中测试从患者mp015扩增的vgll1特异性t细胞的功能，以评估用滴定量的lseletpgky(seq id no:93)肽以5:1的效应物与靶标(e:t)比率脉冲mel888黑色素瘤细胞(vgll1-阴性hla-a*0101-阳性)的特异性裂解。
27.图5a-图5b：vgll1特异性ctl识别并杀灭多种同种异体胰腺癌细胞系。(图5a)在标
准
51
cr释放测定中，将来自患者mp015的扩增的vgll1特异性cd8+ t细胞与一组hla-a*0101阳性pdac肿瘤细胞系共培养，以测量在不同效应物与靶标(e:t)细胞比率下的细胞毒性活性。将wm793黑色素瘤细胞(vgll1阴性hla-a*0101阳性)用作阴性对照系。vgll1-ctl稳健地杀灭最初分离vgll1肽的自体类器官细胞系mp015，并且还表现出针对四个表达hla-a*0101的同种异体pdac细胞系的细胞毒性活性。结果显示六个重复样品的平均值和标准偏差，并且数据代表最少4个重复实验。(图5b)显示所测试的所有五个pdac细胞系中vgll1蛋白质的表达的蛋白质印迹分析。
28.图6a-图6d：vgll1特异性t细胞识别并杀灭多种肿瘤类型，但对原发组织细胞系的识别降低。(图6a)在标准
51
cr释放测定中，将vgll1特异性cd8+ t细胞与来源于卵巢癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌或胃癌的13种不同的表达hla-a*0101的肿瘤细胞系共培养，以测量在不同效应物与靶标(e:t)细胞比率下的细胞毒性活性。将5个hla-a*0101阴性细胞系(ebc1、ht1197、ht1376、gt-5和mkn74)慢病毒转导以稳定表达hla-a*0101；与hla-a*0101转导的对应物(黑线)相比，显示vgll1-ctl对亲代细胞系(灰线)的杀灭。(图6b)显示来源于卵巢癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌或胃癌的肿瘤细胞系中的vgll1蛋白质表达的蛋白质印迹分析。(图6c)在标准
51
cr释放测定中，将vgll1特异性ctl与来源于膀胱、乳腺、肺气道或皮肤黑素细胞的表达hla-a*0101的原发组织细胞共培养，以测量细胞毒性活性。vgll1-ctl测定结果显示六个重复样品的平均值和标准偏差，并且数据代表最少2个重复实验。(图6d)如通过蛋白质印迹分析评估的原代细胞系中的vgll1蛋白质表达。
29.图7：免疫沉淀的hla i类的数量与pdac肿瘤样本重量相关。在组织裂解和使用mab w6/32对总hla i类进行免疫沉淀之前，对来自pdac患者的手术肿瘤切除物(n＝34)或患者来源的异种移植物(n＝3)进行称重。基于蛋白质印迹分析，通过按0(未检测到)到4(检测到的最高水平)的等级评估hla i类条带强度(预期大小42-44kd)，对回收的hla i类进行定量。图形显示通过蛋白质印迹条带强度标绘的样本重量；虚线标示样本具有低于预期的hla i类回收，表明肿瘤hla表达降低。
30.图8：检测到的pdac相关肽的总数与回收的hla i类的数量相关。通过蛋白质印迹分析，通过按0(未检测到)到4(检测到的最高水平)的等级评估hla i类条带强度(大小42-44kd)，对从pdac患者来源的手术切除物(n＝34)、异种移植物(n＝3)或类器官细胞系(n＝2)中回收的hla i类进行定量。通过串联ms分析从免疫沉淀的hla i类中洗脱的肽，并对照swissprot人蛋白质组数据库进行搜索。图形显示如通过蛋白质印迹分析的对照hla i类强度标绘的独特高质量肽匹配的数目。
31.图9：从panc-1005细胞系洗脱vgll1衍生肽。从pdac细胞系panc10.05中分离的hla-a*0101限制性vgll1衍生肽的质谱(上图)。与合成的经同位素标记的肽lseletpgky(seq id no:93)(含有13c/15n标记的赖氨酸残基)共洗脱且与其ms片段化谱匹配的天然肽(下图)。
32.图10：与其他乳腺癌亚型相比，vgll1优先在基底样乳腺癌中表达。将tcga乳腺癌患者细分为5个主要亚型(luma、lumb、基底样、her2过表达和正常样)，并通过rnaseq分析来分析其肿瘤vgll1表达。每个点代表一个tcga患者样品，并且vgll1转录本表达以每千碱基转录本每百万作图读段的片段(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads,fpkm)表示。
33.图11：来源于多种癌症类型的肿瘤细胞系中的vgll1基因表达。来自癌细胞系百科全书(cancer cell line encyclopedia,ccle)的众多种肿瘤细胞系(n＝679)的基因表达微阵列分析显示，除了相当大百分比的乳腺癌、胃癌、卵巢癌细胞和肺癌细胞系外，vgll1还由大多数pdac和膀胱癌细胞系表达。在来源于黑色素瘤、甲状腺癌或造血系统癌的细胞系中未发现vgll1表达。vgll1抗原阳性的阈值是背景信号的3倍。
34.图12a-图12d：高肿瘤vgll1表达与多种癌症类型中降低的存活相关。根据如通过rnaseq分析确定的肿瘤vgll1表达，将tcga癌症患者分层为三组。卡普兰-迈耶曲线显示(图12a)胃腺癌(》10tpm显示最低总体存活且《1.5显示最高总体存活)、(图12b)乳腺癌(》50tpm显示最低总体存活且《1.5显示最高总体存活)、(图12c)卵巢浆液性腺癌和(图12d)膀胱尿路上皮癌患者的各组的总体存活(os)。p值指示比较具有最低和最高vgll1表达的组的os的对数秩显著性检验结果。
35.图13a-图13b：从多个正常供体pbmc生成hla-a*0101限制性vgll1抗原特异性ctl。(图13a)从两个健康供体的pbmc诱导vgll1特异性cd8 t细胞。在2周内用lseletpgky(seq id no:93)肽脉冲的树突细胞刺激表达hla-a*0101的供体pbmc两次。由aria分选仪分选vgll1四聚体阳性cd8
+ t细胞(上图)，并使用标准快速扩增方案(rep)扩增分选的t细胞。(图13b)使用对应于24种不同特异性的vβ抗体进行扩增的vgll1特异性ctl的tcr库分析。
36.图14：pdac患者mp015显示在vgll1-ctl疗法之前vgll1抗原表达的缺失。来自pdac患者mp015肺肿瘤转移的rnaseq分析揭示2013年11月与2015年12月之间的vgll1转录本表达缺失。
37.图15：通过流式细胞术确认靶细胞系上的hla-a*0101表面表达。用于本研究中的所有肿瘤细胞系和正常原代细胞均用荧光团标记的hla-a*0101特异性mab染色，并通过流式细胞术进行分析，以确认天然内源性hla-a*0101表面表达(灰色直方图)，然后用作vgll1特异性ctl测定中的靶标。使用慢病毒表达载体转导五个肿瘤细胞系以表达hla-a*0101。
38.图16：用hla-i类特异性抗体阻断vgll1-ctl杀灭。将扩增的vgll1特异性cd8
+ t细胞与hla-a*0101阳性pdac肿瘤细胞系panc10.05在标准
51
cr释放试验中共培养，以测量不同效应物与靶(e:t)细胞比率下的细胞毒性活性。添加hla i类阻断抗体w6/32在很大程度上消除了vgll1-ctl杀灭，证实抗肿瘤ctl活性受hla i类限制。
39.图17：表达tcr的t细胞可有效杀灭用肽脉冲的mel888hlaa1细胞。用vgll1 tcr转导pbmc，以靶向用肽脉冲的mel888hlaa1细胞。
40.图18：克隆的vgll1 tcr可识别内源性表达的抗原。mel888a1细胞是hla
+
vgll1-，而panc细胞是hlaa1
+
vgll1
+
。
具体实施方式
41.基于细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的癌症免疫疗法已显示出通过靶向肿瘤相关抗原(taa)诱导临床消退的巨大前景。为了扩大胰腺导管腺癌(pdac)的taa范围，从35名pdac患者的肿瘤样本进行hla i类结合肽的串联质谱分析。这使得鉴别出衍生自共转录活化物vestigial样1(vgll1)的共有hla-a*0101限制性肽，vgll1是一种新型的推定taa，其表现出在多种肿瘤类型中的过表达以及在必需正常组织中低或缺失的转录本表达。从男性pdac患者的血液中分离并扩增vgll1特异性ctl，其显示出以抗原特异性方式识别并杀灭大多数
hla-a*0101同种异体肿瘤细胞系的能力，这些细胞系不仅来源于pdac，而且还来源于膀胱癌、卵巢癌、胃癌、肺癌和基底样乳腺癌。基因表达谱型分析(profiling)揭示，vgll1是一组独特的癌症-胎盘抗原(cpa)的成员，其可能构成多种不同癌症类型患者的免疫治疗性taa靶标。研究将vgll1鉴别为来自胰腺洗脱的肿瘤相关抗原，如国际专利公开号wo2018/067869中所述；该国际专利整体并入本文。
42.使用这些肽表位，从识别hla匹配的同种异体肿瘤细胞系上的内源性呈递抗原的胰腺患者外周血单核细胞(pbmc)中生成抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，导致肿瘤细胞杀灭。来自这些抗原特异性ctl的t细胞受体(tcr)被克隆和测序，并且可以各种形式代表用于靶向癌症患者中的癌症(诸如胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、胃肿瘤和乳腺肿瘤)的强大工具。因此，本文提供的这些vgll1特异性tcr可用于靶向实体癌(例如，胰腺癌、卵巢癌、胃癌和乳腺癌)。
43.因此，本公开提供特异性结合vgll1(诸如vgll1肽表位(lseletpgky:seq id no:93))的tcr(例如，seq id no:1-92)。本公开还提供编码这些tcr的核苷酸序列、包含可用于修饰幼稚t细胞并生成vgll1特异性t细胞的核苷酸序列的表达载体。本公开进一步提供vgll1特异性t细胞用于疗法(诸如用于癌症患者的过继细胞疗法)的用途，所述癌症患者诸如恶性细胞表达vgll1抗原的hla-a*0101阳性癌症患者。本文提供的抗原特异性t细胞(诸如ctl)可用于靶向实体癌。
44.i.定义
45.如本文所用，就指定组分来说，“基本上不含”在本文中用于意指没有任何指定组分被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此由组合物的任何意外污染产生的指定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选用标准分析方法不能检测到任何量的指定组分的组合物。
46.如本文说明书中所用，“一(a或an)”可意指一或多。如本文权利要求书中所用，当结合词语“包含”使用时，词语“一(a或an)”可意指一或多于一。
47.在权利要求书中，除非明确指示是指仅二选一或两种选择相互排斥，否则术语“或”的使用用于意指“和/或”，但本公开支持指仅二选一及“和/或”的定义。如本文所用的“另一”可意指至少第二或更多。
48.术语“基本上”应理解为方法或组合物仅包括指定的步骤或材料，以及不实质影响那些方法和组合物的基本和新颖特征的步骤或材料。
49.如本文所用，“基本上不含”指定物质或材料的组合物或介质含有≤30％、≤20％、≤15％、更优选≤10％、甚至更优选≤5％或最优选≤1％的所述物质或材料。
50.如本文所用的术语“基本上”或“大约”可用于修饰任何定量的比较、值、测量或另一表示，该定量表示可允许变化而不导致与其有关的基本功能的变化。
51.术语“约”通常是指在如使用用于测量所述值的标准分析技术确定的所述值的标准偏差内。这些术语还可通过引用所述值的加或减5％来使用。
[0052]“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指为了获得疾病或健康相关病况的治疗益处的目的而向受试者施用或施加治疗剂或对受试者进行程序或用药程式(modality)。例如，治疗可包括施用t细胞疗法。
[0053]“受试者”和“患者”是指人或非人，诸如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在具体
实施方案中，受试者是人。
[0054]
如本技术通篇中所用的术语“治疗益处”或“治疗有效”是指促进或增强受试者在该病况的医学治疗方面的健康的任何东西。这包括但不限于疾病体征或症状的频率或严重程度的降低。例如，癌症的治疗可涉及例如肿瘤大小的减小、肿瘤侵袭性的降低、癌症生长速率的降低或转移的预防。癌症的治疗还可指延长患有癌症的受试者的存活。
[0055]“抗癌”剂能够例如通过以下方式对受试者中的癌细胞/肿瘤产生负面影响：促进对癌细胞的杀灭、诱导癌细胞的凋亡、降低癌细胞的生长速率、降低转移的发生率或次数、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的进展、或增加患有癌症的受试者的寿命。
[0056]
短语“药学上或药理学上可接受的”是指当视情况向动物(诸如人)施用时不产生不利的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开，本领域技术人员将已知包含抗体或另外的活性成分的药物组合物的制备。此外，对于人(例如，人)的施用来说，应当理解，制剂应当满足fda生物制品标准局(fdaoffice of biologic standards)所要求的对无菌性、致热原性、一般安全性和纯度的标准。
[0057]
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括如本领域普通技术人员已知的任何和所有的水性溶剂(例如，水、醇/水溶液、盐水溶液、胃肠外媒介物，诸如氯化钠、林格氏右旋糖(ringer's dextrose)等)、非水性溶剂(例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯)、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘结剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、流体和营养补充剂、此类材料和它们的组合。根据众所周知的参数调整药物组合物中各种组分的ph值和准确浓度。
[0058]
术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于受试者的物理离散单位，每个单位含有预定量的治疗组合物，该预定量经计算以与其施用(即适当的途径和治疗方案)联合产生上文所讨论的期望反应。根据治疗次数和单位剂量两者，待施用的量取决于期望的作用。向患者或受试者施用的本实施方案的组合物的实际剂量的量可由身体因素和生理因素来确定，所述身体因素和生理因素诸如受试者的体重、年龄、健康和性别、所治疗疾病的类型、疾病渗透的程度、先前或同时的治疗干预、患者的特发病、施用途径，以及具体治疗物质的效力、稳定性和毒性。例如，剂量还可包括每次施用约1μg/kg/体重到约1000mg/kg/体重(该范围包括中间剂量)或更多，以及其中可推导出的任何范围。在从本文所列数字可导出的范围的非限制性示例中，可施用约5μg/kg/体重到约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重到约500mg/kg/体重等的范围。负责施用的从业者无论如何都将确定组合物中的活性成分的浓度和用于单个受试者的适当剂量。在一些实施方案中，抗原特异性t细胞输注的剂量可包含约1亿到约300亿个细胞，诸如100亿、150亿或200亿个细胞。
[0059]
术语“肿瘤相关抗原”、“肿瘤抗原”和“癌细胞抗原”在本文中可互换使用。在每种情况下，这些术语是指由癌细胞特异性或优先表达的蛋白质、糖蛋白或碳水化合物。
[0060]
如本文所用的术语“嵌合抗原受体(car)”可指例如人工t细胞受体、嵌合t细胞受体或嵌合免疫受体，并且涵盖将人工特异性移植到特定免疫效应细胞上的工程改造受体。car可用于将单克隆抗体的特异性赋予t细胞，从而允许生成大量特异性t细胞，例如用于过继性细胞疗法。在特定实施方案中，例如，car指导细胞对肿瘤相关抗原的特异性。在一些实
施方案中，car包含细胞内活化结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区的细胞外结构域。在具体方面，car包含来源于单克隆抗体的单链可变片段(scfv)与cd3-ζ跨膜结构域和胞内结构域(endodomain)融合的融合物。其他car设计的特异性可能来源于受体(例如，肽)的配体或模式识别受体，诸如dectin。在某些情况下，可修改抗原识别结构域的间距以减少活化诱导的细胞死亡。在某些情况下，car包含用于另外的共刺激信号传导的结构域，诸如cd3ζ、fcr、cd27、cd28、cd137、dap10和/或ox40。在一些情况下，分子可与car共表达，包括共刺激分子、用于成像的报道基因(例如，用于正电子发射断层摄影术)、在添加前药后有条件地消融t细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体。
[0061]
与另一序列具有一定百分比(例如，80％、85％、90％或95％)的"序列同一性"或“同源性”的多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)意指在比对时，该百分比的碱基(或氨基酸)在这两个序列的比较中是相同的。该比对和百分比同源性或序列同一性可使用本领域内已知的软件程序来确定，所述程序例如当代分子生物学方案(current protocols in molecular biology)(f.m.ausubel等编辑，1987)增刊30，第7.7.18部分，表7.7.1中所述的那些。优选地，将默认参数用于比对。优选的比对程序是blast，使用默认参数。具体地说，优选的程序是blastn和blastp，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤＝无；股＝两者；截止值＝60；期望值＝10；矩阵＝blosum62；描述＝50个序列；排序方式＝高得分；数据库＝非冗余，genbank+embl+ddbj+pdb+genbank cds翻译+swissprotein+spupdate+pir。
[0062]
ii.vgll1 tcr方法和组合物
[0063]
在一些实施方案中，本公开提供vgll1特异性tcr。tcr可包含seq id no:16-19、39-41、62-64或86-87的α链cdr和/或seq id no:21-23、44-46、67-69或90-92的β链cdr。tcr可包含与seq id no:15、38、61或84具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或相似性的α可变链和/或与seq id no:20、43、66或89具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或相似性的β可变链。tcr可包含与seq id no:13、36、59或82具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或相似性的氨基酸序列。
[0064]
本文还提供了编码本文提供的vgll1 tcr的α链和/或β链的多核苷酸。编码本文tcr的多核苷酸可包含seq id no:4-6、27-29、50-52或73-75的α链cdr和/或seq id no:10-12、33-35、56-58或79-81的β链cdr。tcr可由与seq id no:1、24、47或70具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或相似性的α链和/或与seq id no:7、30、53或76具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或相似性的β链编码。tcr可由与seq id no:3、26、49或72具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或相似性的α可变链和/或与seq id no:9、32、55或78具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或相似性的β可变链编码。
[0065]
本文tcr的抗原结合区可作为包含抗原结合区的细胞外结构域包括在嵌合抗原受体(car)中。可将tcr转染到可用于过继性细胞转移疗法中的细胞(例如，自体或同种异体细胞)中。在一些实施方案中，将car人源化以降低免疫原性(hcar)。
[0066]
下面提供了vgll1 tcr序列。
[0067]
vgll1 tcr 1号trav19*01j56*01/trbvc1 5-6*01j1-1α链
[0068]
tctagaccgccatgggtcgacgccaccatgaacatgctgactgccagcctgttgagggcagtcatagcctccatctgtgttgtatccagcatggctcagaaggtaactcaagcgcagactgaaatttctgtggtggagaaggaggatgtgaccttggactgtgtgtatgaaacccgtgatactacttattacttattctggtacaagcaaccaccaagtggagaattggttttccttattcgtcggaactcttttgatgagcaaaatgaaataagtggtcggtattcttggaacttccagaaatccaccagttccttcaacttcaccatcacagcctcacaagtcgtggactcagcagtatacttctgtgctctgagtcctggagccaatagtaagctgacatttggaaaaggaataactctgagtgttagaccagatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc(seq id no:1)
[0069]
vgll1 tcr 1号α链信号肽
[0070]
atgaacatgctgactgccagcctgttgagggcagtcatagcctccatctgtgttgtatccagcatggct(seq id no:2)
[0071]
vgll1 tcr 1号α链v区
[0072]
cagaaggtaactcaagcgcagactgaaatttctgtggtggagaaggaggatgtgaccttggactgtgtgtatgaaacccgtgatactacttattacttattctggtacaagcaaccaccaagtggagaattggttttccttattcgtcggaactcttttgatgagcaaaatgaaataagtggtcggtattcttggaacttccagaaatccaccagttccttcaacttcaccatcacagcctcacaagtcgtggactcagcagtatacttctgtgctctgagtcctggagccaatagtaagctgacatttggaaaaggaataactctgagtgttagaccag(seq id no:3)
[0073]
vgll1 tcr 1号α链cdr1
[0074]
acccgtgatactacttattac(seq id no:4)
[0075]
vgll1 tcr 1号α链cdr2
[0076]
cggaactcttttgatgagcaaaat(seq id no:5)
[0077]
vgll1 tcr 1号α链cdr3
[0078]
tgtgctctgagtcctggagccaatagtaagctgacattt(seq id no:6)
[0079]
vgll1 tcr 1号β链
[0080]
atgggccccgggctcctctgctgggcactgctttgtctcctgggagcaggcttagtggacgctggagtcacccaaagtcccacacacctgatcaaaacgagaggacagcaagtgactctgagatgctctcctaagtctgggcatgacactgtgtcctggtaccaacaggccctgggtcaggggccccagtttatctttcagtattatgaggaggaagagagacagagaggcaacttccctgatcgattctcaggtcaccagttccctaactatagctctgagctgaatgtgaacgccttgttgctgggggactcggccctctatctctgtgccagcagcgtcgggacaggtatcactgaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgtagaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacccgtcaccca
gatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggctttacctcggtgtcctaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcctgctagggaaggccaccctgtatgctgtgctggtcagcgcccttgtgttgatggccatggtcaagagaaaggatttctgactcgagaagcttgcggccgcggatccgataaaataa(seq id no:7)
[0081]
vgll1 tcr 1号β链信号肽
[0082]
atgggccccgggctcctctgctgggcactgctttgtctcctgggagcaggcttagtggacgct(seq id no:8)
[0083]
vgll1 tcr 1号β链v区
[0084]
ggagtcacccaaagtcccacacacctgatcaaaacgagaggacagcaagtgactctgagatgctctcctaagtctgggcatgacactgtgtcctggtaccaacaggccctgggtcaggggccccagtttatctttcagtattatgaggaggaagagagacagagaggcaacttccctgatcgattctcaggtcaccagttccctaactatagctctgagctgaatgtgaacgccttgttgctgggggactcggccctctatctctgtgccagcagcgtcgggacaggtatcactgaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgtag(seq id no:9)
[0085]
vgll1 tcr 1号β链cdr1
[0086]
tctgggcatgacact(seq id no:10)
[0087]
vgll1 tcr 1号β链cdr2
[0088]
tattatgaggaggaagag(seq id no:11)
[0089]
vgll1 tcr 1号β链cdr3
[0090]
tgtgccagcagcgtcgggacaggtatcactgaagctttcttt(seq id no:12)
[0091]
vgll1 tcr 1号氨基酸序列
[0092]
mnmltasllraviasicvvssmaqkvtqaqteisvvekedvtldcvyetrdttyylfwykqppsgelvflirrnsfdeqneisgryswnfqkstssfnftitasqvvdsavyfcalspganskltfgkgitlsvrpdiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwssrakrsgsgatnfsllkqagdveenpgpmgpgllcwallcllgaglvdagvtqspthliktrgqqvtlrcspksghdtvswyqqalgqgpqfifqyyeeeerqrgnfpdrfsghqfpnysselnvnalllgdsalylcassvgtgiteaffgqgtrltvvedlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsvsyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf(seq id no:13)
[0093]
vgll1 tcr 1号α链信号肽
[0094]
mnmltasllraviasicvvssm(seq id no:14)
[0095]
vgll1 tcr 1号α链v区
[0096]
aqkvtqaqteisvvekedvtldcvyetrdttyylfwykqppsgelvflirrnsfdeqneisgryswnfqkstssfnftitasqvvdsavyfcalspganskltfgkgitlsvrpdiq(seq id no:15)
[0097]
vgll1 tcr 1号α链cdr1
[0098]
trdttyy(seq id no:16)
[0099]
vgll1 tcr 1号α链cdr2
[0100]
rnsfdeqn(seq id no:17)
[0101]
vgll1 tcr 1号α链cdr3
[0102]
calspganskltf(seq id no:18)
[0103]
vgll1 tcr 1号β链信号肽
[0104]
mgpgllcwallcllg(seq id no:19)
[0105]
vgll1 tcr 1号β链v区
[0106]
aglvdagvtqspthliktrgqqvtlrcspksghdtvswyqqalgqgpqfifqyyeeeerqrgnfpdrfsghqfpnysselnvnalllgdsalylcassvgtgiteaffgqgtrltvve(seq id no:20)
[0107]
vgll1 tcr 1号β链cdr1
[0108]
sghdt(seq id no:21)
[0109]
vgll1 tcr 1号β链cdr2
[0110]
yyeeee(seq id no:22)
[0111]
vgll1 tcr 1号β链cdr3
[0112]
cassvgtgiteaff(seq id no:23)
[0113]
vgll1 tcr 2号trav13-1*02j10/trbvc1 5-6*01j1-1α链
[0114]
tctagaccgccatgggtcgacgccaccatgacatccattcgagctgtatttatattcctgtggctgcagctggacttggtgaatggagagaatgtggagcagcatccttcaaccctgagtgtccaggagggagacagcgctgttatcaagtgtacttattcagacagtgcctcaaactacttcccttggtataagcaagaacttggaaaaagacctcagcttattatagacattcgttcaaatgtgggcgaaaagaaagaccaacgaattgctgttacattgaacaagacagccaaacatttctccctgcacatcacagagacccaacctgaagactcggctgtctacttctgtgcagcaaggggactcacgggaggaggaaacaaactcacctttgggacaggcactcagctaaaagtggaactcaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacggacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc(seq id no:24)
[0115]
vgll1 tcr2号α链信号肽
[0116]
atgacatccattcgagctgtatttatattcctgtggctgcagctggacttggtgaat(seq id no:25)
[0117]
vgll1 tcr2号α链v区
[0118]
ggagagaatgtggagcagcatccttcaaccctgagtgtccaggagggagacagcgctgttatcaagtgtacttattcagacagtgcctcaaactacttcccttggtataagcaagaacttggaaaaagacctcagcttattatagacattcgttcaaatgtgggcgaaaagaaagaccaacgaattgctgttacattgaacaagacagccaaacatttctccctgcacatcacagagacccaacctgaagactcggctgtctacttctgtgcagcaaggggactcacgggaggaggaaacaaactcacctttgggacaggcactcagctaaaagtggaactca(seq id no:26)
[0119]
vgll1 tcr2号α链cdr1
[0120]
gacagtgcctcaaactac(seq id no:27)
[0121]
vgll1 tcr2号α链cdr2
[0122]
attcgttcaaatgtgggcgaa(seq id no:28)
[0123]
vgll1 tcr2号α链cdr3
[0124]
tgtgcagcaaggggactcacgggaggaggaaacaaactcaccttt(seq id no:29)
[0125]
vgll1 tcr2号β链
[0126]
atgggccccgggctcctctgctgggcactgctttgtctcctgggagcaggcttagtggacgctggagtcacccaaagtcccacacacctgatcaaaacgagaggacagcaagtgactctgagatgctctcctaagtctgggcatgacactgtgtcctggtaccaacaggccctgggtcaggggccccagtttatctttcagtattatgaggaggaagagagacagagaggcaacttccctgatcgattctcaggtcaccagttccctaactatagctctgagctgaatgtgaacgccttgttgctgggggactcggccctctatctctgtgccagcagcgtcgggacaggtatcactgaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgtagaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggctttacctcggtgtcctaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcctgctagggaaggccaccctgtatgctgtgctggtcagcgcccttgtgttgatggccatggtcaagagaaaggatttctgactcgagaagcttgcggccgcggatccgataa(seq id no:30)
[0127]
vgll1 tcr2号β链信号肽
[0128]
atgggccccgggctcctctgctgggcactgctttgtctcctgggagcaggcttagtggacgct(seq id no:31)
[0129]
vgll1 tcr2号β链v区
[0130]
ggagtcacccaaagtcccacacacctgatcaaaacgagaggacagcaagtgactctgagatgctctcctaagtctgggcatgacactgtgtcctggtaccaacaggccctgggtcaggggccccagtttatctttcagtattatgaggaggaagagagacagagaggcaacttccctgatcgattctcaggtcaccagttccctaactatagctctgagctgaatgtgaacgccttgttgctgggggactcggccctctatctctgtgccagcagcgtcgggacaggtatcactgaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgtag(seq id no:32)
[0131]
vgll1 tcr2号β链cdr1
[0132]
tctgggcatgacact(seq id no:33)
[0133]
vgll1 tcr2号β链cdr2
[0134]
tattatgaggaggaagag(seq id no:34)
[0135]
vgll1 tcr2号β链cdr3
[0136]
tgtgccagcagcgtcgggacaggtatcactgaagctttcttt(seq id no:35)
[0137]
vgll1 tcr2号氨基酸序列
[0138]
mtsiravfiflwlqldlvngenveqhpstlsvqegdsavikctysdsasnyfpwykqelgkrpqliidirsnvgekkdqriavtlnktakhfslhitetqpedsavyfcaargltgggnkltfgtgtqlkvelniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwssrakrsgsgatnfsllkqagdveenpgpmgpgllcwallcllgaglvdagvtqspthliktrgqqvtlrcspksghdtvswyqqalgqgpqfifqyyeeeerqrgnfpdrfsghqfpnysselnvnalllgdsalylcassvgtgiteaffgqgtrltvvedlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsvsyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf(seq id no:36)
[0139]
vgll1 tcr2号α链信号肽
[0140]
mtsiravfiflwlqldlvng(seq id no:37)
[0141]
vgll1 tcr2号α链v区
[0142]
enveqhpstlsvqegdsavikctysdsasnyfpwykqelgkrpqliidirsnvgekkdqriavtlnktakhfslhitetqpedsavyfcaargltgggnkltfgtgtqlkvelniq(seq id no:38)
[0143]
vgll1 tcr2号α链cdr1
[0144]
dsasny(seq id no:39)
[0145]
vgll1 tcr2号α链cdr2
[0146]
irsnvge(seq id no:40)
[0147]
vgll1 tcr2号α链cdr3
[0148]
caargltgggnkltf(seq id no:41)
[0149]
vgll1 tcr2号β链信号肽
[0150]
mgpgllcwallcllgaglvda(seq id no:42)
[0151]
vgll1 tcr2号β链v区
[0152]
gvtqspthliktrgqqvtlrcspksghdtvswyqqalgqgpqfifqyyeeeerqrgnfpdrfsghqfpnysselnvnalllgdsalylcassvgtgiteaffgqgtrltvve(seq id no:43)
[0153]
vgll1 tcr2号β链cdr1
[0154]
sghdt(seq id no:44)
[0155]
vgll1 tcr2号β链cdr2
[0156]
yyeeee(seq id no:45)
[0157]
vgll1 tcr2号β链cdr3
[0158]
cassvgtgiteaff(seq id no:46)
[0159]
vgll1 tcr 3号trav13-1*02j1301/trbvc1 5-6*01j1-1α链tctagaccgccatgggtcgacgccaccatgacatccattcgagctgtatttatattcctgtggctgcagctggacttggtgaatggagagaatgtggagcagcatccttcaaccctgagtgtccaggagggagacagcgctgttatcaagtgtacttattcagacagtgcctcaaactacttcccttggtataagcaagaacttggaaaaagacctcagcttattatagacattcgttcaaatgtgggcgaaaagaaagaccaacgaattgctgttacattgaacaagacagccaaacatttctccctgcacatcacagagacccaacctgaagactcggctgtctacttctgtgcagcaattcctaattctgggggttaccagaaagttacctttggaattggaacaaagctccaagtcatcccaaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc(seq id no:47)
[0160]
vgll1 tcr 3号α链信号肽
[0161]
atgacatccattcgagctgtatttatattcctgtggctgcagctggacttggtgaat(seq id no:48)
[0162]
vgll1 tcr 3号α链v区
[0163]
ggagagaatgtggagcagcatccttcaaccctgagtgtccaggagggagacagcgctgttatcaagtgtacttattcagacagtgcctcaaactacttcccttggtataagcaagaacttggaaaaagacctcagcttattatagacattcgttcaaatgtgggcgaaaagaaagaccaacgaattgctgttacattgaacaagacagccaaacatttctccctgcacatcacagagacccaacctgaagactcggctgtctacttctgtgcagcaattcctaattctgggggttaccagaaagttacctttggaattggaacaaagctccaagtcatcccaaa(seq id no:49)
[0164]
vgll1 tcr 3号α链cdr1
[0165]
gacagtgcctcaaactac(seq id no:50)
[0166]
vgll1 tcr 3号α链cdr2
[0167]
attcgttcaaatgtgggcgaa(seq id no:51)
[0168]
vgll1 tcr 3号α链cdr3
[0169]
tgtgcagcaattcctaattctgggggttaccagaaagttaccttt(seq id no:52)
[0170]
vgll1 tcr 3号β链
[0171]
atgggccccgggctcctctgctgggcactgctttgtctcctgggagcaggcttagtggacgctggagtcacccaaagtcccacacacctgatcaaaacgagaggacagcaagtgactctgagatgctctcctaagtctgggcatgacactgtgtcctggtaccaacaggccctgggtcaggggccccagtttatctttcagtattatgaggaggaagagagacagagaggcaacttccctgatcgattctcaggtcaccagttccctaactatagctctgagctgaatgtgaacgccttgttgctgggggactcggccctctatctctgtgccagcagcgtcgggacaggtatcactgaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgtagaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggctttacctcggtgtcctaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcctgctagggaaggccaccctgtatgctgtgctggtcagcgcccttgtgttgatggccatggtcaagagaaaggatttctgactcgagaagcttgcggccgcggatccgataaa(seq id no:53)
[0172]
vgll1 tcr 3号β链信号肽
[0173]
atgggccccgggctcctctgctgggcactgctttgtctcctgggagcaggcttagtggacgct(seq id no:54)
[0174]
vgll1 tcr 3号β链v区
[0175]
ggagtcacccaaagtcccacacacctgatcaaaacgagaggacagcaagtgactctgagatgctctcctaagtctgggcatgacactgtgtcctggtaccaacaggccctgggtcaggggccccagtttatctttcagtattatgaggaggaagagagacagagaggcaacttccctgatcgattctcaggtcaccagttccctaactatagctctgagctgaatgtgaacgccttgttgctgggggactcggccctctatctctgtgccagcagcgtcgggacaggtatcactgaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgtag(seq id no:55)
[0176]
vgll1 tcr 3号β链cdr1
[0177]
tctgggcatgacact(seq id no:56)
[0178]
vgll1 tcr 3号β链cdr2
[0179]
tattatgaggaggaagag(seq id no:57)
[0180]
vgll1 tcr 3号β链cdr3
[0181]
tgtgccagcagcgtcgggacaggtatcactgaagctttcttt(seq id no:58)
[0182]
vgll1 tcr 3号氨基酸序列
[0183]
mtsiravfiflwlqldlvngenveqhpstlsvqegdsavikctysdsasnyfpwykqelgkrpqliidirsnvgekkdqriavtlnktakhfslhitetqpedsavyfcaaipnsggyqkvtfgigtklqvipniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwssrakrsgsgatnfsllkqagdveenpgpmgpgllcwallcllgaglvdagvtqspthliktrgqqvtlrcspksghdtvswyqqalgqgpqfifqyyeeeerqrgnfpdrfsghqfpnysselnvnalllgdsalylcassvgtgiteaffgqgtrltvvedlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsvsyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf(seq id no:59)
[0184]
vgll1 tcr 3号α链信号肽
[0185]
mtsiravfiflwlqldlvng(seq id no:60)
[0186]
vgll1 tcr 3号α链v区
[0187]
enveqhpstlsvqegdsavikctysdsasnyfpwykqelgkrpqliidirsnvgekkdqriavtlnktakhfslhitetqpedsavyfcaaipnsggyqkvtfgigtklqvipni(seq id no:61)
[0188]
vgll1 tcr 3号α链cdr1
[0189]
dsasny(seq id no:62)
[0190]
vgll1 tcr 3号α链cdr2
[0191]
irsnvge(seq id no:63)
[0192]
vgll1 tcr 3号α链cdr3
[0193]
caaipnsggyqkvtf(seq id no:64)
[0194]
vgll1 tcr 3号β链信号肽
[0195]
mgpgllcwallcllgaglvda(seq id no:65)
[0196]
vgll1 tcr 3号β链v区
[0197]
gvtqspthliktrgqqvtlrcspksghdtvswyqqalgqgpqfifqyyeeeerqrgnfpdrfsghqfpnysselnvnalllgdsalylcassvgtgiteaffgqgtrltvv(seq id no:66)
[0198]
vgll1 tcr 3号β链cdr1
[0199]
sghdt(seq id no:67)
[0200]
vgll1 tcr 3号β链cdr2
[0201]
yyeee(seq id no:68)
[0202]
vgll1 tcr 3号β链cdr3
[0203]
cassvgtgiteaff(seq id no:69)
[0204]
vgll1 tcr 4号trav23 j12/trbv5-6*01fj1-1*01fα链
[0205]
tctagaccgccatgggtcgacgccaccatggacaagatcttaggagcatcatttttagttctgtggcttcaactatgctgggtgagtggccaacagaaggagaaaagtgaccagcagcaggtgaaacaaagtcctcaatctttgatagtccagaaaggagggatttcaattataaactgtgcttatgagaacactgcgtttgactactttccatggtaccaacaattccctgggaaaggccctgcattattgatagccatacgtccagatgtgagtgaaaagaaagaaggaagattcacaatctccttcaataaaagtgccaagcagttctcattgcatatcatggattcccagcctggagactcagccacc
tacttctgtgcagccgtaagatacaacttcaacaaattttactttggatctgggaccaaactcaatgtaaaaccaaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc(seq id no:70)
[0206]
vgll1 tcr 4号α链信号肽
[0207]
atggacaagatcttaggagcatcatttttagttctgtggcttcaactatgctgggtgagtggc(seq id no:71)
[0208]
vgll1 tcr 4号α链v区
[0209]
caacagaaggagaaaagtgaccagcagcaggtgaaacaaagtcctcaatctttgatagtccagaaaggagggatttcaattataaactgtgcttatgagaacactgcgtttgactactttccatggtaccaacaattccctgggaaaggccctgcattattgatagccatacgtccagatgtgagtgaaaagaaagaaggaagattcacaatctccttcaataaaagtgccaagcagttctcattgcatatcatggattcccagcctggagactcagccacctacttctgtgcagccgtaagatacaacttcaacaaattttactttggatctgggaccaaactcaatgtaaaaccaa(seq id no:72)
[0210]
vgll1 tcr 4号α链cdr1
[0211]
aacactgcgtttgactac(seq id no:73)
[0212]
vgll1 tcr 4号α链cdr2
[0213]
atacgtccagatgtgagtgaa(seq id no:74)
[0214]
vgll1 tcr 4号α链cdr3
[0215]
tgtgcagccgtaagatacaacttcaacaaattttacttt(seq id no:75)
[0216]
vgll1 tcr 4号β链
[0217]
atgggccccgggctcctctgctgggcactgctttgtctcctgggagcaggcttagtggacgctggagtcacccaaagtcccacacacctgatcaaaacgagaggacagcaagtgactctgagatgctctcctaagtctgggcatgacactgtgtcctggtaccaacaggccctgggtcaggggccccagtttatctttcagtattatgaggaggaagagagacagagaggcaacttccctgatcgattctcaggtcaccagttccctaactatagctctgagctgaatgtgaacgccttgttgctgggggactcggccctctatctctgtgccagcagcgtcgggacaggtatcactgaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgtagaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggctttacctcggtgtcctaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcctgctagggaaggccaccctgtatgctgtgctggtcagcgcccttgtgttgatggccatggtcaagagaaaggatttctgactcgagaagcttgcggccgcggatccgataaa(seq id no:76)
[0218]
vgll1 tcr 4号β链信号肽
[0219]
atgggccccgggctcctctgctgggcactgctttgtctcctgggagcaggcttagtggacgct(seq id no:77)
[0220]
vgll1 tcr 4号β链v区
[0221]
ggagtcacccaaagtcccacacacctgatcaaaacgagaggacagcaagtgactctgagatgctctcctaagtctgggcatgacactgtgtcctggtaccaacaggccctgggtcaggggccccagtttatctttcagtattatgaggaggaagagagacagagaggcaacttccctgatcgattctcaggtcaccagttccctaactatagctctgagctgaatgtgaacgccttgttgctgggggactcggccctctatctctgtgccagcagcgtcgggacaggtatcactgaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgtag(seq id no:78)
[0222]
vgll1 tcr 4号β链cdr1
[0223]
tctgggcatgacact(seq id no:79)
[0224]
vgll1 tcr 4号β链cdr2
[0225]
tattatgaggaggaagag(seq id no:80)
[0226]
vgll1 tcr 4号β链cdr3
[0227]
tgtgccagcagcgtcgggacaggtatcactgaagctttcttt(seq id no:81)
[0228]
vgll1 tcr 4号氨基酸序列
[0229]
mdkilgasflvlwlqlcwvsgqqkeksdqqqvkqspqslivqkggisiincayentafdyfpwyqqfpgkgpalliairpdvsekkegrftisfnksakqfslhimdsqpgdsatyfcaavrynfnkfyfgsgtklnvkpniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwssrakrsgsgatnfsllkqagdveenpgpmgpgllcwallcllgaglvdagvtqspthliktrgqqvtlrcspksghdtvswyqqalgqgpqfifqyyeeeerqrgnfpdrfsghqfpnysselnvnalllgdsalylcassvgtgiteaffgqgtrltvvedlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsvsyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf(seq id no:82)
[0230]
vgll1 tcr 4号α链信号肽
[0231]
mdkilgasflvlwlqlcwvsg(seq id no:83)
[0232]
vgll1 tcr 4号α链v区
[0233]
qqkeksdqqqvkqspqslivqkggisiincayentafdyfpwyqqfpgkgpalliairpdvsekkegrftisfnksakqfslhimdsqpgdsatyfcaavrynfnkfyfgsgtklnvkpniq(seq id no:84)
[0234]
vgll1 tcr 4号α链cdr1
[0235]
ntafdy(seq id no:85)
[0236]
vgll1 tcr 4号α链cdr2
[0237]
irpdvse(seq id no:86)
[0238]
vgll1 tcr 4号α链cdr3
[0239]
caavrynfnkfyf(seq id no:87)
[0240]
vgll1 tcr 4号β链信号肽
[0241]
mgpgllcwallcllgaglvda(seq id no:88)
[0242]
vgll1 tcr 4号β链v区
[0243]
gvtqspthliktrgqqvtlrcspksghdtvswyqqalgqgpqfifqyyeeeerqrgnfpdrfsghqfpnysselnvnalllgdsalylcassvgtgiteaffgqgtrltvv(seq id no:89)
[0244]
vgll1 tcr 4号β链cdr1
[0245]
sghdt(seq id no:90)
[0246]
vgll1 tcr 4号β链cdr2
[0247]
yyeeee(seq id no:91)
[0248]
vgll1 tcr 4号β链cdr3
[0249]
cassvgtgiteaff(seq id no:92)
[0250]
在一些实施方案中，宿主细胞，诸如本公开的t细胞(例如，cd4
+
t细胞、cd8
+
t细胞、γδt细胞和treg)、nk细胞、不变nk细胞、nkt细胞、间充质干细胞(msc)或诱导性多能干(ips)细胞可经遗传工程改造以表达抗原受体，诸如工程改造的tcr和/或car。因此，本文进一步提供经工程改造以表达本文提供的vgll1特异性tcr的细胞，诸如t细胞、nk细胞、不变nk细胞、nkt细胞、msc或ips细胞。例如，自体或同种异体细胞(例如，从脐带分离的细胞)经修饰以表达对癌抗原具有抗原特异性的tcr。这些非t细胞效应免疫细胞可表达tcr以及cd3分子或与tcr连接的其他信号传导结构域，这将起始这些细胞中的信号转导。本领域已知适合的修饰方法。参见例如sambrook和ausubel(见上文)。例如，可使用heemskerk等hum gene ther.19:496-510(2008)和johnson等blood 114:535-46(2009)中所述的转导技术转导t细胞以表达对癌抗原具有抗原特异性的tcr。
[0251]
在一些实施方案中，可通过使用本文提供的vgll1 tcr(例如，seq id no:1-92)来生成抗原特异性细胞。在该方法中，将tcr序列插入载体(例如，逆转录病毒或慢病毒载体)中，该载体被引入宿主细胞(诸如t细胞(例如，cd4
+ t细胞、cd8
+ t细胞、γδt细胞和treg)、nk细胞、不变的nk细胞、nkt细胞、msc或ips细胞)中，以生成可用于针对癌症患者的过继性细胞疗法的抗原特异性细胞。
[0252]
可使用本领域技术人员已知的许多公认的基因转移方法中的任一种来构建工程改造的免疫细胞。在某些实施方案中，使用基于病毒载体的基因转移方法以引入编码vgll1特异性tcr的核酸来构建工程改造细胞。基于病毒载体的基因转移方法可包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒或腺相关病毒载体。在某些实施方案中，使用基于非病毒载体的基因转移方法以引入编码vgll1特异性tcr的核酸来构建工程改造细胞。用于tcr的载体可包含α链多肽和β链多肽，它们可通过接头结构域或ires序列连接。在某些实施方案中，基于非病毒载体的基因转移方法包括选自由以下组成的组的基因编辑方法：锌指核酸酶(zfn)、转录活化物样效应物核酸酶(talen)和聚簇规则间隔的短回文重复(crispr)/crispr相关蛋白质9(cas9)核酸酶。在某些实施方案中，基于非病毒载体的基因编辑方法包括选自由以下组成的组的转染或转化方法：脂质转染、核转染、病毒体(virosome)、脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸dna、人工病毒粒体和试剂增强的dna吸收。
[0253]
编码全长tcrα和β(或γ和δ)链的rna的电穿孔可用作替代方案，以克服由逆转录病毒转导的tcr链与内源性tcr链配对引起的自身反应性的长期问题。即使此类替代配对发生在瞬时转染策略中，可能生成的自身反应性t细胞通常也会在一段时间后失去这种自身反应性，因为引入的tcrα和β链只是瞬时表达。当引入的tcrα和β链表达减少时，只剩下正常的自体t细胞。当通过稳定的逆转录病毒转导引入全长tcr链时，情况并非如此，这不会丢失引入的tcr链，从而引起患者持续存在自身反应性。
[0254]
示例性抗原受体(包括car和重组tcr)以及用于工程改造受体并将受体引入细胞中的方法包括描述于例如国际专利申请公开号wo200014257、wo2013126726、wo2012/
129514、wo2014031687、wo2013/166321、wo2013/071154、wo2013/123061、美国专利申请公开号us2002131960、us2013287748、us20130149337、美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118以及欧洲专利申请号ep2537416中的那些和/或由sadelain等，cancer discov.2013年4月；3(4):388-398；davila等(2013)plos one 8(4):e61338；turtle等，curr.opin.immunol.,2012年10月；24(5):633-39；wu等，cancer,2012年3月18(2):160-75所述的那些。在一些方面，遗传工程改造的抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的car和如国际专利申请公开号wo/2014055668a1中所述的car。
[0255]
a.t细胞受体
[0256]
在一些实施方案中，遗传工程改造的抗原受体包括重组tcr和/或从天然存在的t细胞克隆的tcr。“t细胞受体”或“tcr”是指含有可变α和β链(也分别被称为tcrα和tcrβ)或可变γ链和δ链(也分别被称为tcry和tcrδ)并且能够特异性地结合与mhc受体结合的抗原肽的分子。在一些实施方案中，tcr呈αβ形式。
[0257]
通常，以αβ和γδ形式存在的tcr通常在结构上相似，但表达它们的t细胞可能具有不同的解剖学位置或功能。tcr可见于细胞的表面上或以可溶形式存在。通常，tcr见于t细胞(或t淋巴细胞)的表面上，其中它通常负责识别与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合的抗原。在一些实施方案中，tcr还可含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短的胞质尾部(参见例如janeway等，免疫生物学：健康和疾病中的免疫系统(immunobiology:the immune system in health and disease)，第3版，current biology publications，第433页，1997)。例如，在一些方面，tcr的每条链可具有一个n终端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、一个跨膜区和一个位于c终端的短胞质尾部。在一些实施方案中，tcr与参与介导信号转导的cd3复合物的不变蛋白质缔合。除非另有说明，否则术语“tcr”应理解为涵盖其功能性tcr片段。该术语还涵盖完整或全长tcr，包括αβ形式或γδ形式的tcr。
[0258]
因此，出于本文的目的，对tcr的提及包括任何tcr或功能性片段，诸如tcr的结合在mhc分子中结合的特异性抗原肽(即，mhc-肽复合物)的抗原结合部分。tcr的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(其可互换使用)是指含有tcr的一部分结构域，但与全tcr结合的抗原(例如mhc-肽复合物)结合的分子。在一些情况下，抗原结合部分含有tcr的可变结构域，诸如tcr的可变a链和可变β链，足以形成用于结合特定mhc-肽复合物的结合位点，诸如通常在每条链含有三个互补决定区处。
[0259]
在一些实施方案中，tcr链的可变结构域缔合而形成类似于免疫球蛋白的环或互补决定区(cdr)，其通过形成tcr分子的结合位点而赋予抗原识别并确定肽特异性并确定肽特异性。通常，与免疫球蛋白一样，cdr由框架区(fr)隔开(参见例如jores等，pnas u.s.a.87:9138,1990；chothia等，embo j.7:3745,1988；还参见lefranc等，dev.comp.immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，cdr3是负责识别加工抗原的主要cdr，尽管还证明α链的cdr1与抗原肽的n终端部分相互作用，而β链的cdr1与肽的c终端部分相互作用。cdr2被认为识别mhc分子。在一些实施方案中，β链的可变区可含有又一超变(hv4)区。
[0260]
在一些实施方案中，tcr链含有恒定结构域。例如，类似免疫球蛋白，tcr链(例如，a-链、β-链)的细胞外部分可含有两个免疫球蛋白结构域，即一个位于n终端的可变结构域
(例如，va或vp；基于kabat编号(kabat等，"具有免疫学意义的蛋白质序列(sequences of proteins of immunological interest)"，美国卫生与人类服务部，公共卫生服务，国立卫生研究院(us dept.health and human services,public health service national institutes of health)，1991，第5版)通常是氨基酸1到116)和一个与细胞膜相邻的恒定结构域(例如，a-链恒定结构域或ca，基于kabat通常是氨基酸117到259，β链恒定结构域或cp，基于kabat通常是氨基酸117到295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的tcr的细胞外部分含有两个膜近侧恒定结构域和两个含有cdr的膜远侧可变结构域。tcr结构域的恒定结构域含有短的连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，所述二硫键构成两条链之间的连接。在一些实施方案中，tcr可在α和β链的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得tcr在恒定结构域中含有两个二硫键。
[0261]
在一些实施方案中，tcr链可含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，tcr链含有胞质尾部。在一些情况下，所述结构允许tcr与其他分子(如cd3)缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的tcr可将蛋白质锚定在细胞膜中并与cd3信号传导器或复合物的不变亚基缔合。
[0262]
通常，cd3是多蛋白质复合物，其可具有三条不同链(γ、δ和ε)(哺乳动物中)和ζ链。例如，在哺乳动物中，该复合物可含有一条cd3γ链、一条cd3δ链、两条cd3ε链，和cd3ζ链的同二聚体。cd3γ、cd3δ和cd3ε链是免疫球蛋白超家族中高度相关的细胞表面蛋白质，其含有单个免疫球蛋白结构域。cd3γ、cd3δ和cd3ε链的跨膜区带负电荷，这是允许这些链与带正电荷的t细胞受体链缔合的特征。cd3γ、cd3δ和cd3ε链的细胞内尾部各含有单个保守基序，称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或itam，而每个cd3ζ链具有三个。通常，itam与tcr复合物的信号传导能力有关。这些辅助分子具有带负电荷的跨膜区，并在将信号从tcr传播到细胞中发挥作用。cd3链和ζ链与tcr一起形成被称为的t细胞受体复合物。
[0263]
在一些实施方案中，tcr可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体，或者它可以是单链tcr构建体。在一些实施方案中，tcr是含有诸如通过一个或多个二硫键连接的两条单独的链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体。在一些实施方案中，鉴别用于靶抗原(例如，癌抗原)的tcr并将其引入细胞中。在一些实施方案中，编码tcr的核酸可从多种来源获得，诸如通过对可公开获得的tcr dna序列的聚合酶链式反应(pcr)扩增。在一些实施方案中，tcr获自生物来源，诸如获自细胞，诸如获自t细胞(例如细胞毒性t细胞)、t细胞杂交瘤或另一可公开获得的来源。在一些实施方案中，可从体内分离的细胞中获得t细胞。在一些实施方案中，可从患者中分离高亲和力t细胞克隆，并分离tcr。在一些实施方案中，t细胞可以是培养的t细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，已在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或hla)工程改造的转基因小鼠中生成用于靶抗原的tcr克隆。参见例如肿瘤抗原(参见例如parkhurst等(2009)clin cancer res.15:169-180和cohen等(2005)j immunol.175:5799-5808)。在一些实施方案中，将噬菌体展示用于分离针对靶抗原的tcr(参见例如varela-rohena等(2008)nat med.14:1390-1395和li(2005)nat biotechnol.23:349-354)。在一些实施方案中，tcr或其抗原结合部分可根据tcr序列的知识合成生成。
[0264]
b.嵌合t细胞受体
[0265]
在一些实施方案中，工程改造的抗原受体包括car，包括活化或刺激性car、共刺激
性car(参见wo2014/055668)和/或抑制性car(icar，参见fedorov等，sci.transl.medicine,5(215)(2013年12月)。car通常包含与一种或多种细胞内信号传导组分连接(在一些方面，经由接头和/或一个或多个跨膜结构域)的细胞外抗原(或配体)结合结构域。此类分子通常模拟或近似通过天然抗原受体的信号、通过此类受体与共刺激受体组合的信号和/或仅通过共刺激受体的信号。在一些实施方案中，car包含抗体分子的一个或多个抗原结合部分，诸如来源于单克隆抗体(mab)的可变重链(vh)和可变轻链(vl)的单链抗体片段(scfv)。
[0266]
car的抗原结合结构域的排列可以是多聚体，诸如双抗体或多聚体。多聚体可通过将轻链和重链的可变部分交叉配对成可称为的双抗体来形成。在一些实施方案中，可缩短或排除car的铰链部分(即，生成仅包括抗原结合结构域、跨膜区和细胞内信号传导结构域的car)。本发明可使用多个铰链，例如，如表1中所示。在一些实施方案中，铰链区可维持第一个半胱氨酸，或通过脯氨酸或丝氨酸取代而突变第一个半胱氨酸，或截短直到第一个半胱氨酸。fc部分可从用作抗原结合区的scfv中缺失以生成根据本发明的car。在一些实施方案中，抗原结合区可仅编码fc结构域中的一个，例如来自人免疫球蛋白的ch2或ch3结构域。一个还可能包含人免疫球蛋白的铰链区、ch2区和ch3区，这些区已被修饰以改善二聚化和寡聚化。在一些实施方案中，其铰链部分可包含8-14个氨基酸的肽(例如，12个aa的肽)、cd8α的一部分或igg4 fc或由其组成。在一些实施方案中，可使用促进寡聚化的结构域，诸如cd8α，将抗原结合结构域从细胞表面悬浮。在一些实施方案中，可使用单克隆抗体(mab)克隆2d3(例如在singh等，2008中所述的mab克隆2d3)识别的结构域，将抗原结合结构域从细胞表面悬浮。
[0267]
car的胞内结构域或细胞内信号传导结构域通常可引起或促进包含car的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化。例如，胞内结构域可促进t细胞的效应子功能，诸如例如细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。幼稚型、记忆或记忆型t细胞中的效应子功能可包括抗原依赖性增殖。术语“细胞内信号传导结构域”或“胞内结构域”是指car可转导效应子功能信号和/或指导细胞进行特化功能的部分。虽然car中通常可能包含整个细胞内信号传导结构域，但在一些情况下可能包含胞内结构域的截短部分。通常，胞内结构域包含截短的胞内结构域，其中截短的胞内结构域保留在细胞中转导效应子功能信号的能力。
[0268]
在一些实施方案中，胞内结构域包含t细胞受体的ζ链或其任何同源物(例如，η、δ、γ或ε)、mb1链、b29、fc riii、fc ri和信号传导分子的组合，诸如cd3ζ和cd28、cd27、4-1bb、dap-10、ox40和它们的组合，以及其他类似的分子和片段。可使用活化蛋白质家族的其他成员的细胞内信号传导部分，诸如fcγriii和fcεri。这些替代性跨膜和细胞内结构域的示例可见于例如以下文献中：gross等(1992)；stancovski等(1993)；moritz等(1994)；hwu等(1995)；weijtens等(1996)和hekele等(1996)，这些文献以引用方式整体并入本文。在一些实施方案中，胞内结构域可包含人cd3ζ细胞内结构域。
[0269]
抗原特异性细胞外结构域和细胞内信号传导结构域优选通过跨膜结构域连接。可包含在car中的跨膜结构域包括例如人igg4 fc铰链和fc区、人cd4跨膜结构域、人cd28跨膜结构域、跨膜人cd3ζ结构域、或半胱氨酸突变的人cd3ζ结构域、或来自人跨膜信号传导蛋白质的跨膜结构域，诸如例如cd16和cd8以及红细胞生成素受体。
[0270]
在一些实施方案中，胞内结构域包含编码共刺激受体(例如，修饰的cd28细胞内信号传导结构域，或cd28、cd27、ox-40(cd134)、dap10或4-1bb(cd137)共刺激受体)的序列。在一些实施方案中，由cd3ζ起始的主要信号、由人共刺激受体提供的额外信号两者均可包含在car中以更有效地活化转化的t细胞，这可能有助于改善过继性免疫疗法的体内持久性和成功。如表1中所述，胞内结构域或细胞内受体信号传导结构域可包含单独的cd3的ζ链，或其与fcγriii共刺激信号传导结构域(诸如例如cd28、cd27、dap10、cd137、ox40、cd2、4-1bb)的组合。在一些实施方案中，胞内结构域包含tcrζ链、cd28、cd27、ox40/cd134、4-1bb/cd137、fcεriγ、icos/cd278、il-2rβ/cd122、il-2rα/cd132、dap10、dap12和cd40中的一种或多种的部分或全部。在一些实施方案中，可在胞内结构域中包含1、2、3、4或更多个胞质结构域。例如，在一些car中，已观察到至少两个或三个融合在一起的信号传导结构域可产生加性或协同效应。
[0271]
在一些方面，可生成包含编码car的dna序列的分离的核酸片段和表达盒。可使用各种载体。在一些优选的实施方案中，载体可允许将编码car的dna递送到免疫细胞，诸如t细胞。car表达可在受调控真核启动子(诸如例如mndu3启动子、cmv启动子、ef1α启动子或泛素启动子)的控制之下。此外，如果没有其他原因，载体可含有可选标志物，以促进它们的体外操作。在一些实施方案中，car可由体外转录自dna模板的mrna表达。
[0272]
嵌合抗原受体分子是重组的，并且通过它们经由其胞质尾部存在的免疫受体活化基序(itam)结合抗原和转导活化信号的能力加以区分。利用抗原结合部分(例如，由单链抗体生成的(scfv))的受体构建体提供“通用”的额外优势，因为它们可以不依赖hla的方式结合靶细胞表面上的天然抗原。例如，可将scfv构建体与编码cd3复合物的ζ链(ζ)、fc受体γ链和sky酪氨酸激酶的细胞内部分的序列融合(eshhar等，1993；fitzer-attas等，1998)。已在若干鼠类和人抗原scfv:ζ系统中记录了重新定向的t细胞效应机制，包括通过ctl进行肿瘤识别和裂解(eshhar等，1997；altenschmidt等，1997；brocker等，1998)。
[0273]
在一些实施方案中，tcr作为抗原结合结构域(例如，作为scfv区)包含在car中，并且car进一步包含铰链区、跨膜区和胞内结构域。
[0274]
c.可溶性tcr和bite
[0275]
另外，本公开提供可用于直接治疗阳性癌症患者的可溶性tcr。可溶性双特异性t细胞接合分子(bite)可通过将vgll1 tcr连接到cd3特异性fab片段来生成。这些双特异性分子可经由其vgll1 tcr与肽/hla复合物的结合来结合肿瘤细胞表面，并且cd3特异性fab片段将交联tcr。这将导致靶细胞的细胞活化和消除。因此，这些可溶性双特异性tcr构建体可用于直接治疗癌症患者。
[0276]
最后，可溶性tcr可用作用于诊断评估肿瘤细胞中肽/mhc的探针，或用于将治疗分子引导到肿瘤部位。该可溶性tcr分子也可用诸如荧光探针或放射性探针的示踪剂进行标记，然后用于诊断评估肿瘤细胞中肽/mhc的呈现。此外，该可溶性tcr分子可与诸如毒素的治疗分子连接，然后将这些治疗分子引导到肿瘤部位，用于治疗癌症患者。
[0277]
在一些实施方案中，本公开提供可溶性tcr，诸如本文提供的vgll1特异性tcr。可溶性tcr可用于研究特异性tcr-pmhc相互作用，或用作检测感染或检测自身免疫性疾病标志物的诊断工具。可溶性tcr可应用于染色，例如对细胞进行染色，以确定在mhc背景下呈递的特定肽抗原的存在。类似地，可溶性tcr可用于将治疗剂(例如细胞毒性化合物或免疫刺
激化合物)递送到呈递特定抗原的细胞。可溶性tcr还可用于抑制t细胞，例如与自身免疫性肽抗原反应的t细胞。在一些方面，tcr与将细胞递送到肿瘤附近的另一分子连接。在其他方面，tcr递送毒素、细胞因子、共刺激配体或抑制剂配体，并将分子、细胞或化合物引导到表达肽-mhc的靶细胞。
[0278]
在一些方面，本公开提供可溶性t细胞受体(stcr)，其包含(i)tcrα链的全部或部分(例如，seq id no:1、24、47或70)，其跨膜结构域除外，和(ii)tcrβ链的全部或部分(例如，seq id no:7、30、53或76)，其跨膜结构域除外，其中(i)和(ii)各自包含tcr链的功能性可变结构域和至少一部分恒定结构域，并且通过恒定结构域残基之间不存在于天然tcr中的二硫键连接。
[0279]
在一些方面，可溶性tcr包含借助于一对c终端二聚化肽(诸如亮氨酸拉链)分别二聚到tcrβ或δ链细胞外结构域的tcrα或γ链胞外结构域。
[0280]
本公开的可溶性tcr可以基本上纯的形式提供，或作为纯化的或分离的制剂提供。例如，其可以基本上不含其他蛋白质的形式提供。
[0281]
本公开的多个可溶性tcr可以多价复合物的形式提供。因此，在一个方面，本公开提供多价tcr复合物，其包含如本文所述的多个可溶性tcr。多个可溶性tcr中的每一个优选是相同的。
[0282]
在其最简单的形式中，根据本公开的多价tcr复合物包含优选经由接头分子彼此缔合(例如共价或以其他方式连接)的两个或三个或四个或更多个t细胞受体分子的多聚体。适合的接头分子包括但不限于多价附着分子，诸如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和外抗生物素蛋白(extravidin)，每种分子都有四个用于生物素的结合位点。因此，生物素化的tcr分子可形成具有多个tcr结合位点的tcr多聚体。多聚体中tcr分子的数目将取决于与用于制备多聚体的接头分子的数量有关的tcr的数量，并且还取决于任何其他生物素化分子的存在或不存在。优选的多聚体是二聚体、三聚体或四聚体tcr复合物。
[0283]
用于本方法中的适合结构包括膜结构，诸如脂质体；和固体结构，优选粒子，诸如珠粒，例如胶乳珠粒。可用t细胞受体分子外部包被的其他结构也是适合的。优选地，用t细胞受体多聚体而不是用单个t细胞受体分子包被所述结构。
[0284]
在脂质体的情况下，t细胞受体分子或其多聚体可附着到膜或以其他方式与膜缔合。用于此的技术对于本领域技术人员来说是众所周知的。
[0285]
本公开的多价tcr复合物中可包含标记物或另一部分，诸如毒性部分或治疗部分。例如，经混合分子多聚体中可包含标记物或另一部分。此类多聚体分子的一个示例是含有三个tcr分子和一个过氧化物酶分子的四聚体。此可通过将tcr和酶以3:1的摩尔比混合以生成四聚体复合物并从不含正确分子比率的任何复合物中分离出期望的复合物来实现。这些混合分子可含有任何分子组合，条件是位阻不损害或不显著损害分子的期望功能。链霉抗生物素蛋白分子上结合位点的定位适于混合四聚体，因为不太可能发生位阻。
[0286]
本公开的tcr(或其多价复合物)可替代地或另外地与治疗剂缔合(例如，共价或以其他方式连接)，所述治疗剂可以是例如用于细胞杀灭中的毒性部分，或免疫刺激剂，诸如白介素或细胞因子。与非多聚体t细胞受体异二聚体相比，本公开的多价tcr复合物可具有增强的对tcr配体的结合能力。因此，根据本公开的多价tcr复合物特别可用于体外或体内
追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，并且还可用作用于产生具有此类用途的其他多价tcr复合物的中间体。因此，tcr或多价tcr复合物可以药学上可接受的制剂形式提供以供体内使用。
[0287]
本公开还提供用于将治疗剂递送到靶细胞的方法，该方法包括在允许tcr或多价tcr复合物附着到靶细胞的条件下，使潜在靶细胞与根据本公开的tcr或多价tcr复合物接触，所述tcr或多价tcr复合物对tcr配体是特异性的并且具有与其缔合的治疗剂。
[0288]
具体地说，可溶性tcr或多价tcr复合物可用于将治疗剂递送到呈递特定抗原的细胞的位置。这在许多情况下都是有用的，特别是针对肿瘤。可递送治疗剂，使其在局部发挥作用，而不仅仅是对其结合的细胞发挥作用。因此，一种特定的策略设想了与对肿瘤抗原特异的t细胞受体或多价tcr复合物连接的抗肿瘤分子。
[0289]
许多治疗剂可用于该用途，例如放射性化合物、酶(例如穿孔素)或化学治疗剂(例如顺铂)。为了确保在期望位置发挥毒性作用，毒素可在与链霉抗生物素蛋白连接的脂质体内，以使化合物缓慢释放。这将防止体内转运期间的损伤效应，并确保毒素在tcr与相关抗原呈递细胞结合后具有最大效应。
[0290]
本公开的可溶性tcr可用于通过结合特异性tcr配体从而抑制t细胞活化来调节t细胞活化。涉及t细胞介导的炎症和/或组织损伤的自身免疫性疾病将适于该方法，例如i型糖尿病。此用途需要了解相关pmhc呈现的特定肽表位。
[0291]
还设想了本公开的可溶性tcr和/或多价tcr复合物在制备用于治疗癌症或自身免疫性疾病的组合物中的用途。
[0292]
还提供了治疗癌症或自身免疫性疾病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本公开的可溶性tcr和/或多价tcr复合物。
[0293]
正如在抗癌和自身免疫疗法中常见的那样，本公开的可溶性tcr可与其他药剂组合使用，用于治疗癌症和自身免疫性疾病，以及在类似患者组中发现的其他相关病况。
[0294]
iii.过继性细胞转移疗法
[0295]
本文提供用于治疗个体的癌症或延缓其进展的方法，其包括向个体施用有效量的抗原特异性细胞(例如，自体或同种异体t细胞(例如，调节性t细胞、cd4
+ t细胞、cd8
+ t细胞或γ-δt细胞)、nk细胞、不变nk细胞、nkt细胞、msc或ips细胞)疗法，诸如vgll1特异性细胞疗法。本文还提供了采用遗传工程改造的tcr转导的t细胞(例如，表达包含seq id no:1-92中的一个的tcr)的过继性t细胞疗法。在一些实施方案中，向受试者(例如，人患者)提供与第二疗法(诸如化学疗法、放射疗法、手术或第二免疫疗法)组合的过继性细胞转移疗法。
[0296]
本公开的实施方案涉及获得tcr工程改造细胞并将其作为靶向癌细胞的免疫疗法施用于受试者。具体地说，tcr工程改造细胞是抗原特异性细胞(例如，vgll1特异性细胞)。在过去的二十年里，已经描述了几种用于衍生、活化和扩增功能性抗肿瘤效应细胞的基本方法。这些包括：自体细胞，诸如肿瘤浸润性淋巴细胞(til)；使用自体dc、淋巴细胞、人工抗原呈递细胞(apc)或包被有t细胞配体和活化抗体的珠粒、或借助于捕获靶细胞膜所分离的细胞而离体活化的t细胞；天然表达抗宿主肿瘤t细胞受体(tcr)的同种异体细胞；以及被称为“t体”的非肿瘤特异性的自体或同种异体细胞，其被遗传地重编程或“重新定向”以表达展示抗体样肿瘤识别能力的肿瘤反应性tcr或嵌合tcr分子。这些方法产生了许多可用于本文所述方法中的t细胞制备和免疫方案。
[0297]
a.t细胞制备
[0298]
在一些实施方案中，t细胞来源于血液、骨髓、淋巴或淋巴器官。在一些方面，细胞是人细胞。细胞通常是原代细胞，诸如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的细胞。在一些实施方案中，所述细胞包括一种或多种t细胞亚组或其他细胞类型，诸如全部t细胞群体、cd4
+
细胞、cd8
+
细胞和其亚群，诸如由功能、活化状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或持续能力、抗原特异性、抗原受体的类型、在特定器官或隔室中的存在、标志物或细胞因子分泌谱和/或分化程度定义的那些。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。在一些方面，诸如对于现有技术，细胞是多能的和/或多潜能的，诸如干细胞，诸如诱导性多能干细胞(ipsc)。在一些实施方案中，所述方法包括如本文所述从受试者中分离细胞，制备、加工、培养和/或工程改造它们，以及在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一患者中。
[0299]
在t细胞(例如，cd4
+
和/或cd8
+ t细胞)的亚型和亚群中有幼稚t(tn)细胞、效应t细胞(t
eff
)、记忆t细胞和其亚型(诸如干细胞记忆t(tscm)细胞、中枢记忆t(tcm)细胞、效应记忆t(tem)细胞或终末分化效应记忆t细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、未成熟t细胞、成熟t细胞、辅助t细胞、细胞毒性t细胞、粘膜相关不变的t(mait)细胞、天然存在和适应性调节性t(treg)细胞、辅助t细胞(诸如th1细胞、th2细胞、th3细胞、th17细胞、th9细胞、th22细胞、滤泡辅助t细胞)、α/βt细胞和δ/γt细胞。
[0300]
在一些实施方案中，使一种或多种t细胞群体富集或耗尽对特定标志物(诸如表面标志物)呈阳性或对特定标志物呈阴性的细胞。在一些情况下，此类标志物是在某些t细胞群体(例如，非记忆细胞)上不存在或以相对低的水平表达，但在某些其他t细胞群体(例如，记忆细胞)上以相对更高的水平存在或表达的标志物。
[0301]
在一些实施方案中，通过在非t细胞(诸如b细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标志物(诸如cd14)的负向选择，从pbmc样品中分离t细胞。在一些方面，使用cd4
+
或cd8
+
选择步骤来分离cd4
+
辅助t细胞和cd8
+
细胞毒性t细胞。此类cd4
+
和cd8
+
群体可通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应t细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标志物的正向或负向选择而进一步分选为亚群。
[0302]
在一些实施方案中，诸如通过基于与相应亚群相关的表面抗原的正向或负向选择，使cd8
+ t细胞进一步富集或耗尽幼稚干细胞、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞。在一些实施方案中，进行对中枢记忆t(t
cm
)细胞的富集以增加功效，诸如改善施用后的长期存活、扩增和/或植入，在一些方面，这在此类亚群中特别稳健。参见terakura等，(2012)blood.1:72-82；wang等，(2012)j immunother.35(9):689-701。
[0303]
在一些实施方案中，t细胞是自体t细胞。在该方法中，从患者获得肿瘤样品并获得单细胞悬浮液。可以任何适合的方式(例如，机械地(使用例如gentlemacs
tm
解离器(miltenyi biotec,auburn,calif.)将肿瘤解聚)或酶促地(例如，胶原酶或dna酶))获得单细胞悬浮液。在白介素-2(il-2)中培养肿瘤酶促消化物的单细胞悬浮液。培养细胞直到铺满(例如，约2
×
106个淋巴细胞)，例如约5到约21天，优选约10到约14天。
[0304]
可将培养的t细胞汇集并快速扩增。快速扩增在约10到约14天时段内提供抗原特异性t细胞的数目至少约50倍(例如，50、60、70、80、90或100倍或更多倍)的增加。更优选地，快速扩增在约10到约14天的时段内提供至少约200倍(例如，200、300、400、500、600、700、
800、900倍或更多倍)的增加。
[0305]
可通过如本领域已知的多种方法中的任一种来实现扩增。例如，在饲养淋巴细胞和白介素-2(il-2)或白介素-15(il-15)、优选il-2存在下，使用非特异性t细胞受体刺激可快速扩增t细胞。非特异性t细胞受体刺激物可包括约30ng/ml的okt3，即小鼠单克隆抗cd3抗体(得自ortho-raritan,n.j.)。或者，可通过在t细胞生长因子(诸如il-2)存在下，用癌症的一种或多种抗原(包括其抗原部分，诸如一个或多个表位，或细胞)(诸如人白细胞抗原a1(hla-a1)结合肽)体外刺激外周血单核细胞(pbmc)来快速扩增t细胞，所述抗原可任选地从载体表达。通过用脉冲到表达hla-a1的抗原呈递细胞上的癌症的一种或多种相同抗原进行再刺激，快速扩增体外诱导的t细胞。或者，例如，可用辐照的自体淋巴细胞或用辐照的hla-a1+同种异体淋巴细胞和il-2再刺激t细胞。
[0306]
自体t细胞可经修饰以表达促进自体t细胞生长和活化的t细胞生长因子。适合的t细胞生长因子包括例如白介素(il)-2、il-7、il-15和il-12。本领域已知适合的修饰方法。参见例如sambrook等，分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)，第3版，cold spring harbor press,cold spring harbor,n.y.2001；和ausubel等，分子生物学的现行方案(current protocols in molecular biology)，greene publishing associates and john wiley&sons,ny,1994。在具体方面，修饰的自体t细胞以高水平表达t细胞生长因子。t细胞生长因子编码序列(诸如il-12的编码序列)在本领域中容易获得，启动子也是如此，其与t细胞生长因子编码序列的可操作连接促进高水平表达。
[0307]
b.治疗方法
[0308]
本文进一步提供用于治疗个体的癌症或延缓其进展的方法，其包括向个体施用有效量的抗原特异性t细胞疗法，诸如vgll1特异性t细胞疗法。本文还提供了采用遗传工程改造的tcr转导的t细胞(将tcr与其他生物反应蛋白质(例如，抗cd3)缀合)的过继性t细胞疗法。在另外的实施方案中，提供用于治疗癌症的方法，其包括用纯化的肿瘤抗原或免疫显性肿瘤抗原特异性肽免疫受试者。
[0309]
预期用于治疗的癌症的示例包括肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、肺瘤前病变、结肠癌、黑色素瘤和膀胱癌。另外的示例性癌症包括但不限于肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、肺瘤前病变、结肠癌、黑色素瘤和膀胱癌。癌症的其他示例包括黑色素瘤、恶性黑色素瘤、结肠癌、淋巴瘤、肉瘤、母细胞瘤、肾癌、胃肠肿瘤、神经胶质瘤、前列腺肿瘤、膀胱癌、直肠肿瘤、胃癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、子宫癌、宫颈癌、急性髓性白血病(aml)、急性淋巴样白血病(all)、慢性髓性白血病(cml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、白血病、肝细胞瘤、各种病毒诱导的肿瘤(诸如例如乳头状瘤病毒诱导的癌(例如宫颈癌)、腺癌、疱疹病毒诱导的肿瘤(例如伯基特氏淋巴瘤(burkitt's lymphoma)、ebv诱导的b细胞淋巴瘤)、乙型肝炎诱导的肿瘤(肝细胞癌)、htlv-1和htlv-2诱导的淋巴瘤)、听神经瘤、肺癌、小细胞肺癌、咽癌、肛门癌、胶质母细胞瘤、直肠癌、星状细胞瘤、脑瘤、视网膜母细胞瘤、基底细胞瘤、脑转移、髓母细胞瘤、阴道癌、胰腺癌、睾丸癌、霍奇金氏综合征(hodgkin's syndrome)、脑膜瘤、施耐博格病(schneeberger disease)、垂体瘤、蕈样肉芽肿、类癌、神经鞘瘤、鳞状细胞癌(spinalioma)、伯基特氏淋巴瘤、喉癌、肾癌、胸腺瘤、子宫体癌、骨癌、非
霍奇金氏淋巴瘤、尿道癌、cup综合征、头/颈肿瘤、少突神经胶质瘤、外阴癌、肠癌、结肠癌、食管癌、疣累及(wart involvement)、小肠肿瘤、颅咽管瘤(craniopharyngeomas)、卵巢癌、生殖器肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、肝转移癌、阴茎癌、舌癌、胆囊癌、白血病、浆细胞瘤、眼睑肿瘤和前列腺癌。
[0310]
在一些实施方案中，t细胞是自体的。然而，细胞可以是同种异体的。在一些实施方案中，t细胞是从患者自身中分离的，因此所述细胞是自体的。如果t细胞是同种异体的，则可从若干供体中汇集t细胞。以足以控制、减少或消除所治疗疾病的症状和体征的量将所述细胞施用于所关注的受试者。
[0311]
在一些实施方案中，可在t细胞疗法之前向受试者施用非清髓性淋巴耗竭化学疗法。非清髓性淋巴耗竭化学疗法可以是可通过任何适合的途径施用的任何适合的此类疗法。非清髓性淋巴耗竭化学疗法可包括例如施用环磷酰胺和氟达拉滨，特别是如果癌症是可转移的黑色素瘤。施用环磷酰胺和氟达拉滨的示例性途径是静脉内。同样，可施用任何适合剂量的环磷酰胺和氟达拉滨。在具体方面，施用约60mg/kg的环磷酰胺两天，之后施用约25mg/m2氟达拉滨五天。
[0312]
在某些实施方案中，将促进自体t细胞生长和活化的t细胞生长因子与自体t细胞同时施予受试者，或随后施予自体t细胞。t细胞生长因子可以是促进自体t细胞生长和活化的任何适合的生长因子。适合的t细胞生长因子的示例包括白介素(il)-2、il-7、il-15和il-12，它们可单独使用或以各种组合使用，诸如il-2和il-7、il-2和il-15、il-7和il-15、il-2、il-7和il-15、il-12和il-7、il-12和il-15、或il-12和il2。il-12是优选的t细胞生长因子。
[0313]
t细胞可经静脉内、肌内、皮下、局部、经口、经皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。t细胞疗法的适当剂量可基于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、个体的临床状况、个体的临床史和对治疗的应答以及主治医师的判断来确定。
[0314]
明确预期瘤内注射或注射到肿瘤脉管系统中针对离散的、实体的、可触及的肿瘤。局部、区域或全身施用也可能是适当的。对于》4cm的肿瘤，待施用的体积将为约4-10ml(特别是10ml)，而对于《4cm的肿瘤，将使用约1-3ml(特别是3ml)的体积。作为单剂量递送的多次注射包含约0.1到约0.5ml的体积。
[0315]
c.药物组合物
[0316]
在所选实施方案中，预期表达如本文所公开的tcr的细胞、含有tcr的可变区的蛋白质或编码本公开的tcr的可变区的dna可包含在疫苗组合物中并被施予受试者以在受试者中诱导针对癌症(诸如表达vgll1的癌症)的治疗性免疫应答。用于受试者的药物用途的疫苗组合物可包含本文所公开的肿瘤抗原肽(例如，vgll1)组合物和药学上可接受的载体。用于受试者的药物用途的治疗组合物可包含本文所公开的tcr组合物(诸如可溶性tcr(任选地附着到成像剂))和药学上可接受的载体。
[0317]
如本文所用，"保护性免疫应答"是指哺乳动物宿主的免疫系统对癌症的应答。保护性免疫应答可为癌症的治疗提供治疗效果，例如，减小肿瘤大小、增加存活等。
[0318]
医学领域的普通技术人员将了解，向动物或人患者施用的治疗组合物的实际剂量可由身体因素和生理因素来确定，所述身体因素和生理因素诸如体重、病况的严重程度、所治疗疾病的类型、先前或同时进行的治疗干预、患者的特发病和施用途径。负责施用的从业
者无论如何都将确定组合物中的活性成分的浓度和用于单个受试者的适当剂量。
[0319]
本文所公开的治疗组合物可经静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、局部(topically,locally)以及通过吸入、注射、输注、连续输注、灌洗和局部灌注施用。治疗组合物还可经由导管、以乳膏形式、以脂质组合物形式、通过冲击微粒递送或通过本领域普通技术人员已知的其他方法或前述的任何组合施予受试者(参见例如雷明顿：药学科学与实践(remington:the science and practice of pharmacy)，第21版，lippincott williams and wilkins,2005，以引用方式并入本文)。
[0320]
尽管本领域普通技术人员已知的任何适合的载体均可用于本发明的药物组合物中，但载体的类型将根据施用方式而变化。对于胃肠外施用，诸如皮下注射，载体优选包括水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。对于口服施用，可采用任何上述载体或固体载体，诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。可生物降解的微球(例如，聚乳酸半乳糖苷(polylactic galactide))也可用作用于本发明药物组合物的载体。适合的可生物降解的微球公开于例如美国专利4,897,268和5,075,109中。
[0321]
在一些实施方案中，可通过微结构化透皮或冲击微粒递送来施用疫苗组合物。作为用于疫苗制剂的载体的微结构是用于疫苗应用的理想配置，并且在本领域中广为人知(gerstel和place 1976(美国专利3,964,482)；ganderton和mcainsh 1974(美国专利3,814,097)；美国专利5,797,898、5,770,219和5,783,208以及美国专利申请2005/0065463)。在这些实施方案中，支撑衬底可包括但不限于微胶囊、微粒、微球、纳米胶囊、纳米粒子、纳米球或它们的组合。
[0322]
用作本文所公开的tcr(诸如可溶性tcr)的支撑衬底的微结构或冲击粒子可包含生物可降解材料和非生物可降解材料，并且此类支撑衬底可包含合成聚合物、二氧化硅、脂质、碳水化合物、蛋白质、凝集素、离子次试剂、交联剂和本领域中可获得的其他微结构组分。用于将本发明的肽固定到由此类材料构成的支撑衬底的方案和试剂在商业上和本领域中可广泛获得。
[0323]
在其他实施方案中，疫苗组合物包含本文所公开的固定化或包封的tcr或可溶性tcr和支撑衬底。在这些实施方案中，支持衬底可包括但不限于脂质微球、脂质纳米粒子、醇质体(ethosome)、脂质体、脂质体、泡囊(niosome)、磷脂、鞘脂体(sphingosome)、表面活性剂、转移体(transferosome)、乳液或其组合。脂质体以及其他脂质纳米载体制剂和脂质微载体制剂的形成和使用通常是本领域普通技术人员已知的，并且脂质体、微粒、纳米胶囊等的使用已在治疗剂的递送方面得到广泛应用(例如，美国专利5,741,516，其以引用方式整体明确并入本文)。已经综述了作为潜在药物载体的脂质体和脂质体样制剂的许多方法，包括肽包封(美国专利5,567,434、5,552,157、5,565,213、5,738,868和5,795,587，其各自以引用方式整体明确并入)。
[0324]
除了本文所述的递送方法之外，还预期许多替代技术用于施用所公开的疫苗组合物。作为非限制性示例，疫苗组合物可通过以下施用：已在美国专利5,656,016中使用并描述的用于增强药物渗透进入并通过循环系统的速率和功效的超声促渗(sonophoresis)(即超声)、骨内注射(美国专利5,779,708)或反馈控制递送(美国专利5,697,899)，并且本段中
的每个专利均以引用方式整体明确并入本文。
[0325]
多种佐剂中的任一种可用于本公开的疫苗中以非特异性地增强免疫应答。大多数佐剂含有被设计成保护抗原免受迅速分解代谢的物质(诸如氢氧化铝或矿物油)和免疫应答的非特异性刺激物，诸如脂质a、百日咳博德特氏菌(bortadella pertussis)或结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)。适合的佐剂可作为例如弗氏不完全佐剂(freund's incomplete adjuvant)和弗氏完全佐剂(freund's complete adjuvant)(difco laboratories,detroit,mich.)以及墨克佐剂(merck adjuvant)65(merck and company,inc.,rahway,n.j.)商购获得。其他适合的佐剂包括明矾、可生物降解的微球、单磷酰基脂质a和quil a。
[0326]
可将可溶性tcr配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(用蛋白质的游离氨基形成)，并且其用无机酸(诸如例如盐酸或磷酸)或此类有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。用游离羧基形成的盐还可衍生自无机碱，诸如例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，和有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等。
[0327]
在任何情况下，所述组合物可包含各种抗氧化剂以延缓一种或多种组分的氧化。另外，可通过防腐剂产生对微生物作用的防止，所述防腐剂诸如多种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)或其组合。
[0328]
通过以下方式制备无菌可注射溶液：根据需要将活性肽以所需量与上文列举的多种其他成分一起并入适当的溶剂中，之后过滤灭菌。通常，通过将多种经灭菌活性成分并入含有基本分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，这由其经先前无菌过滤的液体介质产生活性成分加任何另外期望成分的粉末。如有必要，液体介质应被适当地缓冲，并且在注射之前，首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释物等渗。还预期用于直接注射的高度浓缩组合物的制剂，其中设想使用dmso作为溶剂以实现极其迅速的渗透，从而将高浓度的活性剂递送到小区域。
[0329]
所述组合物必须在制造和储存的条件下稳定并且针对诸如细菌和真菌的微生物的污染作用被防腐保存。应当了解，内毒素污染应在安全水平下保持最低，例如小于0.5ng/mg蛋白质。
[0330]
在具体实施方案中，可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(诸如例如单硬脂酸铝、明胶或其组合)来产生可注射组合物的延长吸收。
[0331]
d.组合疗法
[0332]
在某些实施方案中，本实施方案的组合物和方法涉及抗原肽或抗原特异性t细胞群体与至少一种另外的疗法的组合。另外的疗法可以是放射疗法、手术(例如，乳房肿瘤切除术和乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、dna疗法、病毒疗法、rna疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述疗法的组合。附加疗法可以是辅助或新辅助疗法的形式。
[0333]
在一些实施方案中，附加疗法是施用小分子酶促抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，另外的疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在减少治疗副作用的发生和/或严重程
度的药剂，诸如止吐剂等)。在一些实施方案中，附加疗法是辐射疗法。在一些实施方案中，附加疗法是手术。在一些实施方案中，附加疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，附加疗法是γ辐照。在一些实施方案中，附加疗法是靶向pbk/akt/mtor途径的疗法、hsp90抑制剂、微管蛋白抑制剂、凋亡抑制剂和/或化学预防剂。附加疗法可以是本领域已知的化学治疗剂中的一种或多种。
[0334]
相对于另外的癌症疗法，诸如免疫检查点疗法，可在各种组合之前、期间、之后或以各种组合施用t细胞疗法。施用的间隔可在同时到数分钟到数天到数周范围。在将t细胞疗法与另外的治疗剂分开提供给患者的实施方案中，通常会确保在每次递送的时间之间有相当长的时间不会过期，使得这两种化合物仍将能够对患者发挥有利的组合作用。在此类情况下，预期可在彼此相隔约12-24或72h内，并且更具体地，彼此相隔约6-12h内向患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在一些情况下，如果各自施用之间间隔几天(2、3、4、5、6或7)到几周(1、2、3、4、5、6、7、或8)，可能期望显著延长治疗时间。
[0335]
可采用各种组合。对于下面的示例，抗原特异性t细胞疗法是“a”且抗癌疗法是“b”：
[0336]
a/b/ab/a/b b/b/aa/a/b a/b/b b/a/aa/b/b/b b/a/b/b
[0337]
b/b/b/ab/b/a/b a/a/b/b a/b/a/b a/b/b/ab/b/a/a
[0338]
b/a/b/ab/a/a/b a/a/a/b b/a/a/aa/b/a/aa/a/b/a
[0339]
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，向患者施用本实施方案的任何化合物或疗法应当遵循用于施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于联合治疗的毒性的步骤。
[0340]
1.化学疗法
[0341]
可根据本实施方案使用众多种化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物根据其在细胞内的活性模式来分类，例如，它们是否以及在哪个阶段影响细胞周期。或者，药剂可基于其直接交联dna、嵌入dna中或通过影响核酸合成诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征。
[0342]
化学治疗剂的示例包括烷化剂，诸如噻替哌(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美托替呢(meturedopa)和瑞多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素；卡利司他丁(callystatin)；cc-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物kw-2189和cb1-tm1)；艾榴素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰
胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和乌拉莫司汀(uracil mustard)；亚硝基脲类，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷尼司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔抗生素类(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γli和卡奇霉素ωi1)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素a；双膦酸盐，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素(authrarnycin)、重氮丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素c(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素(chromomycini)、放线菌素d(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、阿霉素(doxorubicin)(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯并-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(诸如丝裂霉素c)、霉酚酸、诺拉霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链霉黑素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、蝶罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷；雄激素，诸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯；抗肾上腺素，诸如米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如弗林酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶(amsacrine)、阿莫斯汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；艾氟米辛(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登素类，诸如美登木素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫达醇(mopidanmol)；二胺硝呢(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；psk多糖复合物；雷佐生(razoxane)；根霉素；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2
”‑
三氯三乙胺；单端孢霉烯毒素(尤其是t-2毒素、犹孢菌素a(verracurin a)、杆孢菌素a(roridin a)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；伽胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“ara-c”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛(docetaxel)、吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位化合物，诸如顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)和
卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(etoposide)(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；长春瑞滨(vinorelbine)；诺凡特龙(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；伊立替康(irinotecan)(例如，cpt-11)；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类视黄醇类，诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；卡铂、甲基苄肼、普卡霉素(plicomycin)、吉西他滨、诺维苯(navelbine)、法呢基-蛋白质转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)和任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0343]
2.放射疗法
[0344]
导致dna损伤并已被广泛使用的其他因素包括通常已知的γ射线、x射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还预期其他形式的dna损伤因素，诸如微波、质子束辐照(美国专利号5,760,395和4,870,287)和紫外线辐照。很可能所有这些因素都会对dna、对dna前体、对dna复制和修复以及对染色体的组装和维持产生广泛的损伤。x射线的剂量范围在从每天50到200伦琴的长时间(3到4周)剂量到2000到6000伦琴的单次剂量的范围。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、发射辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的摄取。
[0345]
3.免疫疗法
[0346]
本领域技术人员应当理解，另外的免疫疗法可与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依赖于免疫效应细胞以及靶向和破坏癌细胞的分子的使用。利妥昔单抗(rituximab，)就是此类示例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可用作治疗的效应物，或者它可以募集其他细胞来实际影响细胞杀伤。抗体还可与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白a链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并用作靶向剂。或者，效应物可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性t细胞和nk细胞。
[0347]
抗体-药物缀合物已成为开发癌症疗法的突破性方法。癌症是世界上主要的死亡原因之一。抗体-药物缀合物(adc)包含与细胞杀灭药物共价连接的单克隆抗体(mab)。这种方法将mab针对其抗原靶标的高特异性与高效细胞毒性药物组合，从而产生将有效载荷(药物)递送到具有富集水平的抗原的肿瘤细胞的“武装的”mab。所述药物的靶向递送还最大限度地减少了其在正常组织中的暴露，从而降低毒性并改善的治疗指数。fda批准的两种adc药物，即2011年批准的(本妥昔单抗(brentuximab vedotin))和2013年批准的(曲妥珠单抗美坦新缀合物(trastuzumab emtansine)或t-dm1)验证了该方法。目前有30多种adc候选药物处于癌症治疗临床试验的各个阶段(leal等，2014)。随着抗体工程改造和接头-有效载荷(linker-payload)变得优化越来越成熟，新adc的发现和开发越来越依赖于适合这种方法的新靶标的鉴别和验证以及靶向mab的生成。用于adc靶标的两个标准是在肿瘤细胞中的表达上调/高水平和稳健的内化。
[0348]
在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须携带适于靶向，即不存在于大多数其他细胞上的某标志物。存在许多肿瘤标志物，并且在本实施方案的背景下，这些标记物中的任何一种都可能适于靶向。常见的肿瘤标志物包括cd20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、tag-72、hmfg、唾液酸化路易斯抗原(sialyl lewis antigen)、muca、mucb、plap、层粘连蛋白受
体、erb b和p155。免疫疗法的替代方面是将抗癌作用与免疫刺激作用组合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，诸如il-2、il-4、il-12、gm-csf、γ-ifn，趋化因子，诸如mip-1、mcp-1、il-8和生长因子，诸如flt3配体。
[0349]
目前正在研究或使用的免疫疗法的示例是免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；hui和hashimoto，1998；christodoulides等，1998)；细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ、il-1、gm-csf和tnf(bukowski等，1998；davidson等，1998；hellstrand等，1998)；基因疗法，例如tnf、il-1、il-2和p53(qin等，1998；austin-ward和villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；和单克隆抗体，例如，抗cd20、抗神经节苷脂gm2和抗p185(hollander，2012；hanibuchi等，1998；美国专利5,824,311)。预期一种或多种抗癌疗法可与本文所述的抗体疗法一起采用。
[0350]
在一些实施方案中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点要么调高信号(例如，共刺激分子)要么降低信号。免疫检查点阻断可靶向的抑制性免疫检查点包括腺苷a2a受体(a2ar)、b7-h3(也被称为cd276)、b和t淋巴细胞衰减子(btla)、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白质4(ctla-4，也被称为cd152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)、杀伤细胞免疫球蛋白(kir)、淋巴细胞活化基因3(lag3)、程序性死亡因子1(pd-1)、t细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(tim-3)和t细胞活化抑制物ig v结构域(vista)。具体地说，免疫检查点抑制剂靶向pd-1轴和/或ctla-4。
[0351]
免疫检查点抑制剂可以是药物，诸如小分子、重组形式的配体或受体，或者特别是抗体，诸如人抗体(例如，国际专利公开wo2015016718；pardoll,2012；两者均以引用方式并入本文)。可使用免疫检查点蛋白质的已知抑制剂或其类似物，特别是可使用嵌合的、人源化的或人形式的抗体。如本领域技术人员所知，替代和/或等效名称可用于本公开中提及的某些抗体。此类替代和/或等效名称在本公开的上下文中是可互换的。例如，已知兰博利单抗(lambrolizumab)还以替代和等效名称mk-3475和派姆单抗(pembrolizumab)为人所知。
[0352]
在一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是抑制pd-1与其配体结合配偶体结合的分子。在特定方面，pd-1配体结合配偶体是pdl1和/或pdl2。在另一实施方案中，pdl1结合拮抗剂是抑制pdl1与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，pdl1结合配偶体是pd-1和/或b7-1。在另一实施方案中，pdl2结合拮抗剂是抑制pdl2与其结合配偶体结合的分子。在特定方面，pdl2结合配偶体是pd-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白质或寡肽。示例性抗体描述于美国专利号us8735553、us8354509和us8008449中，所述美国专利均以引用方式并入本文。用于本文提供的方法中的其他pd-1轴拮抗剂是本领域已知的，诸如描述于美国专利申请号us20140294898、us2014022021和us20110008369中，所述美国专利申请均以引用的方式并入本文。
[0353]
在一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是抗pd-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗pd-1抗体选自由纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗和ct-011组成的组。在一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包含pdl1或pdl2的与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的fc区)融合的细胞外部分或pd-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是amp-224。纳武单抗(也被称为mdx-1106-04、mdx-1106、ono-4538、bms-936558和)是wo2006/121168中所述的抗pd-1抗体。
派姆单抗(也被称为mk-3475、merck 3475、兰博利单抗、和sch-900475)是wo2009/114335中所述的抗pd-1抗体。ct-011(也被称为hbat或hbat-1)是wo2009/101611中所述的抗pd-1抗体。amp-224(也被称为b7-dcig)是wo2010/027827和wo2011/066342中所述的pdl2-fc融合可溶性受体。
[0354]
在本文提供的方法中可靶向的另一免疫检查点是细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白质4(ctla-4)(也被称为cd152)。人ctla-4的完整cdna序列具有genbank保藏号l15006。ctla-4见于t细胞的表面上，并且当与抗原呈递细胞表面上的cd80或cd86结合时充当“关闭”开关。ctla4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助t细胞表面上表达并向t细胞传递抑制信号。ctla4与t细胞共刺激蛋白质cd28相似，且两种分子均与抗原呈递细胞上的cd80和cd86(也分别被称为b7-1和b7-2)结合。ctla4向t细胞传递抑制信号，而cd28传递刺激信号。细胞内ctla4也见于调节性t细胞中并且可能对其功能很重要。通过t细胞受体和cd28活化t细胞导致ctla-4(用于b7分子的抑制性受体)表达增加。
[0355]
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗ctla-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白质或寡肽。
[0356]
可使用本领域众所周知的方法生成适用于本方法中的抗人ctla-4抗体(或自其衍生的vh和/或vl结构域)。或者，可使用本领域公认的抗ctla-4抗体。例如，在本文所公开的方法中可使用以下文献中所公开的抗ctla-4抗体：us 8,119,129、wo 01/14424、wo 98/42752；wo 00/37504(cp675,206，也被称为曲美利木单抗(tremelimumab)；以前被称为替西木单抗(ticilimumab))、美国专利号6,207,156；hurwitz等，1998；camacho等，2004；和mokyr等，1998。上述出版物中的每一个的教导均在此以引用方式并入。还可使用与这些本领域公认的抗体中的任何一种竞争结合ctla-4的抗体。例如，人源化ctla-4抗体描述于国际专利申请wo2001014424、wo2000037504和美国专利号us8017114中；所述这些专利均以引用方式并入本文。
[0357]
示例性的抗ctla-4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)(也被称为10d1、mdx-010、mdx-101和)或其抗原结合片段和变体(参见例如woo 1/14424)。在其他实施方案中，所述抗体包含伊匹单抗的重链和轻链cdr或vr。因此，在一个实施方案中，所述抗体包含伊匹单抗的vh区的cdr1、cdr2和cdr3结构域，以及伊匹单抗的vl区的cdr1、cdr2和cdr3结构域。在另一实施方案中，所述抗体与上述抗体竞争结合，和/或与上述抗体结合ctla-4上的相同表位。在另一实施方案中，所述抗体与上述抗体具有至少约90％可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％可变区同一性)。
[0358]
用于调节ctla-4的其他分子包括ctla-4配体和受体(诸如美国专利号us5844905、us5885796和国际专利申请号wo 1995001994和wo1998042752中所述；全部以引用方式并入本文)和免疫粘附素(诸如美国专利号us8329867中所述，其以引用方式并入本文)。
[0359]
4.手术
[0360]
大约60％的癌症患者会接受某种类型的手术，其包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除，其中全部或部分癌性组织被物理去除、切除和/或破坏并且可与其他疗法(诸如本实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法)结合使用。肿瘤切除是指对至少一部分肿瘤的物理去除。除肿瘤切除外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科和通过显微镜控制的手术(莫氏手
术(mohs’surgery))。
[0361]
在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，体内可能会形成空腔。治疗可通过在所述区域中灌注、直接注射或局部施加另外的抗癌疗法来完成。可例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，重复此类治疗。这些治疗也可能有不同的剂量。
[0362]
5.其他药剂
[0363]
预期其他药剂可与本实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的治疗功效。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体和细胞间隙连接(gap junction)的上调的药剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其他生物剂。通过提高细胞间隙连接的数目来增加细胞间信号传导会增加对邻近过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可与本实施方案的某些方面组合使用，以改善治疗的抗过度增殖功效。预期细胞粘附抑制剂以改善本实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的示例是粘着斑激酶(fak)抑制剂和洛伐他汀(lovastatin)。进一步预期增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其他药剂(诸如抗体c225)可与本实施方案的某些方面组合使用以改善治疗功效。
[0364]
ii.制品或试剂盒
[0365]
本文还提供包含抗原特异性t细胞或tcr的制品或试剂盒。制品或试剂盒可进一步包含包装插页，所述包装插页包含用于使用抗原特异性t细胞治疗个体的癌症或延缓其进展或增强患有癌症的个体的免疫功能的说明书。本文所述的任何抗原特异性t细胞均可包含于制品或试剂盒中。适合的容器包括例如瓶、小瓶、袋和注射器。容器可由诸如玻璃、塑料(诸如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(诸如不锈钢或哈氏合金(hastelloy))的各种材料形成。在一些实施方案中，容器装有制剂并且容器上或与容器相关联的标签可指示使用说明。制品或试剂盒可进一步包括从商业和用户的角度来看期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和带有使用说明书的包装插页。在一些实施方案中，制品进一步包括一种或多种其他药剂(例如，化学治疗剂和抗肿瘤剂)。用于一种或多种药剂的适合容器包括例如瓶、小瓶、袋和注射器。
[0366]
iii.实施例
[0367]
包括以下实施例以证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当了解，以下实施例中所公开的技术代表了本发明人发现的在本发明的实施中良好地发挥作用的技术，因此可被视为构成其优选实施模式。然而，本领域技术人员根据本公开应当了解，可在不脱离本发明精神和范围的情况下对所公开的具体实施方案作出许多改变，并且仍然获得相同或类似的结果。
[0368]
实施例1
–
vestigial样是由胰腺癌和基底样乳腺癌表达的共有可靶向癌-胎盘抗原
[0369]
pdac患者肿瘤的免疫肽组分析鉴别肿瘤相关肽：为了鉴别用于pdac的基于ctl的免疫疗法的肽靶点，对来自m.d.anderson cancer center处治疗的35名pdac患者的39个肿瘤样本进行分析。这包括34个新切除的手术样本(20个转移性肿瘤和14个原发性肿瘤)，此外还有3个患者来源的异种移植物(pdx)和2个来源于转移的类器官细胞系。将肿瘤细胞裂解并进行总hla i类免疫沉淀和酸洗脱，之后进行串联质谱(ms)以分析hla结合肽。对照
swiss-prot数据库(2018年9月更新)搜索洗脱的肽片段化谱，以鉴别人蛋白质组内编码的匹配。使用几个正交参数评估单个肽匹配，包括mascot离子评分、ms1质量差异(δ质量)，以及如通过高分辨基因测序确定的与患者hla同种异型的预测结合。通过针对(1)如通过rnaseq确定的患者肿瘤组织转录本表达、(2)正常组织转录本表达(gtex portal数据库)和(3)肿瘤组织中的总体表达(tcga数据库)评价所有肽编码基因，确定作为治疗性taa靶点的进一步验证和潜在适用性(图1a)。
[0370]
除了显示出如通过蛋白质印迹分析所评估的相对低的hla i类表达的8个肿瘤(21.6％)之外，免疫沉淀的hla i类的量与所分析的新鲜肿瘤样本的大小相关(r2＝0.79)(图7，表1)。正如所预期的，hla i类蛋白质水平和与洗脱肽的swis-prot数据库匹配的数目相关(r2＝0.62，图8)。总之，所分析的39个肿瘤样本产生了总共23,245种独特的、高置信度的肽身份(identity)，其中7,966个肽(34.3％)是预计与一种或多种患者hla i类同种异型结合的8到13聚体肽。新鲜肿瘤样本产生高度可变数目的肽，范围从238到1657(平均值＝542)。对于3名患者，pdx衍生导致更大的肿瘤样本，在所有3例中产生增加数目的洗脱肽。两个患者来源的类器官细胞系(mp015)中的一个产生了最高数目的总体洗脱肽(n＝1903)，强调了在ms分析之前在体外扩大肿瘤样本所提供的定量优势(表2，图8)。
[0371]
表2.从两个hla-a*0101+pdac患者肿瘤类器官中洗脱的vgll1衍生肽。
[0372][0373][0374]
肽编码基因的表达谱型分析将vgll1鉴别为新型胰腺癌taa：为了评价任何洗脱的肽是否构成潜在的治疗性ctl靶标，参考含有来源于》50种不同人组织的rnaseq数据的gtex portal数据库，针对正常组织转录本表达对肽编码基因进行了单独评估。将正常组织(不包括睾丸)分为4组，这反映了从抗原特异性ctl的脱靶杀灭活性预期的潜在毒性(表2)。然后使用四个对应的增加严格性的表达过滤器筛选肽编码基因，以消除在ctl治疗背景下最可能诱发自身免疫毒性的候选taa(图1b)。因此，虽然在非必需组织(诸如前列腺、乳腺和脂肪组织)中允许最高达30tpm的taa转录本表达，但对诸如心脏和大脑的高度必需的组织施加1tpm的最大表达阈值，对于这些组织，ctl识别可能是致命的。使用这些严格标准，将12种taa肽视为最安全靶向，编码这些肽的基因是muc16(编码5种独特的肽)、muc19、znf717、eif5al1、rgpd1、slc30a8、mia2和vgll1(各编码1种独特的肽)。还检测到由taa msln和ido1编码的肽，但由于正常肺组织中rna转录本表达升高(分别为88tpm和16tpm，图1b)而在筛选中被排除。在被视为最安全靶向的taa中，仅发现两种肽(衍生自mia2和vgll1)由超过一名的pdac患者的肿瘤呈现(表2)。
[0375]
从pdac患者来源的类器官细胞系mp015-org和mp081-org中洗脱由vgll1唯一编码的10聚体肽lseletpgky(seq id no:93)。预测该肽以高亲和力与hla-a*0101(51nm)结合，并且rnaseq分析确认了在两种类器官系中的高vgll1转录本表达(表2)。通过靶向lc-ms确认肽的身份，其中将合成肽作为与类器官肿瘤相关肽的混合物的一部分进行分析。如图1c中所示，合成的经同位素标记的肽lseletpgky(seq id no:93)生成与从pdac类器官系mp015-org和mp081-org检测到的天然vgll1肽高度相似的片段化谱，并且也在几乎相同的lc-ms保留时间下检测到。对另外两个表达hla-a*0101的细胞系(panc10.05和bxpc3)进行的靶向ms分析证实，在panc10.05上也可检测到相同的肽，表明lseletpgky(seq id no:93)可能构成广泛共有的taa(图9)。
[0376]
vgll1由多种癌症类型表达并且与较差的总体存活相关：vgll1(也被称为tondu)首先被鉴别为果蝇中vestigial(vg)蛋白质(翅发育的关键调控物)的人同源物。由于vgll1是结合与癌症发生有关的转录因子(tef)的tea结构域家族的转录共活化物，因此在tcga中列出的31种癌症类型中进一步检查vgll1转录本的表达。如图2a中所示，与大多数正常组织相比，vgll1在许多不同的癌症中过表达，包括pdac、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌和胃癌。有趣的是，vgll1似乎优先在基底样乳腺癌中表达，而在其他乳腺癌亚型中表现出相对低的盛行率(图10)。通过对癌细胞系百科全书(ccle，图11)中列出的肿瘤细胞系的基因表达分析确认了相似的概况。根据gtex rnaseq数据库，在3种非必需组织中发现了最高的中值vgll1转录本表达：膀胱(15.3tpm)、唾液腺(3.9tpm)和乳房(1.3tpm)。必需组织中vgll1转录本的最高表达水平在正常肺(1.0tpm)、食管(0.73tpm)和肾脏(0.34tpm)中，而心脏和脑组织中的vgll1表达几乎检测不到(图2a)。总之，该数据表明vgll1可能构成针对多种癌症类型的安全、可靶向的taa。
[0377]
接下来评估肿瘤vgll1转录本表达是否与癌症患者存活相关。如图2b中所示，发现tcga pdac患者存活(n＝179)与vgll1表达反向相关：与具有低表达或不存在表达的患者相比，具有高表达的患者的总体中值存活显著更短(16个月相对于37个月，p＝0.001)。这在37名m.d.anderson pdac患者(可从中获得pdx组织)的独立队列中得到确认：与存活长于36个月的患者相比，显示少于18个月的总体存活的患者表现出显著更高的平均pdx vgll1表达(57.3tpm相对于9.6tpm，p＝0.003，图2c)。值得注意的是，与手术切除的pdac肿瘤相比，发现pdac肿瘤细胞系和pdx组织中vgll1转录本的表达高得多，可能归因于许多原位pdac肿瘤的高基质含量(图2a、图2c、表2)。高度升高的vgll1表达还与乳腺癌(p＝0.037)和胃癌(p＝0.047)中较短的总体存活时间相关，但未显示出与卵巢癌的存活时间的相关性(图13)。有趣的是，低或不存在的vgll1表达与膀胱癌中的较短存活时间(p＝0.036)相关。一种潜在的解释是，像vgll1的正常膀胱组织抗原的丢失可能指示肿瘤去分化，这与膀胱癌和许多其他肿瘤类型中的较差预后相关。
[0378]
vgll1是具有治疗潜力的一组独特的癌-胎盘抗原(cpa)的一部分：vgll1先前已被鉴别为在人胎盘发育的早期事件期间具有调控作用，并且是增殖性细胞滋养层的特异性标志物。据此，来自7个人胎盘样本的rnaseq基因表达数据显示，vgll1在该组织中以大裕度(平均值＝302.7tpm)表现出最高表达，比其在正常膀胱中的表达高近20倍(图3a)。这使得可以探讨以下概念：癌-胎盘抗原(cpa)可能构成与已用基于ctl的疗法成功靶向的癌-睾丸抗原(cta)类似的可靶向taa的独特类别。为了鉴别与vgll1具有相似表达谱的其他cpa，在
gtex、tcga和其他rnaseq数据库中搜索表现出以下属性的基因：(1)胎盘中最高的正常组织表达；(2)其他正常组织中低到不存在的表达；和(3)胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌和/或卵巢癌中升高的表达。该搜索产生另外9个基因，包括胎盘特异性1(plac1)，plac1先前被鉴别为癌症患者的体液抗肿瘤免疫靶标。
[0379]
有趣的是，绒毛膜促性腺激素(cg)β亚基3和5(cgb3/cgb5)(妊娠期间胎盘滋养层产生的cg激素复合物的组分)由于它们在胰腺癌、睾丸癌、子宫癌和膀胱癌的亚组中过表达，因此也被鉴别为潜在的cpa(图3b)。其他6种推定的cpa表现出多样的表达谱，范围从仅在一组有限的癌症类型中发现的那些(igf2bp3、adam12)到在大多数癌症类型中过表达但在正常女性生殖组织中也表现出升高表达的那些(capn6、mmp11)(图3、图14到图23)。
[0380]
尽管在该组pdac样本中检测到来源于这些基因的肽，但已在多种肿瘤类型中鉴别出来自这些推定cpa中若干的表位，并将其列入免疫表位数据库(immune epitope database,iedb)中。
[0381]
从pdac患者mp015的外周血中扩增vgll1特异性细胞毒性t细胞：患者mp015在2011年12月首次被诊断为原发性pdac时是50岁男性。在手术切除原发性胰腺肿瘤后两年，于2013年11月进行左肺病变的胸腔镜楔形切除，用于获得类器官细胞系mp015-org。通过一系列化学治疗方案，患者的疾病被再控制了近2年，但随着疾病进展，他在m.d.anderson参加了经irb批准的细胞治疗方案，以接受自体、扩增的肿瘤抗原特异性ctl。
[0382]
2015年5月在扩增的类器官细胞系mp015-org上进行的免疫肽组分析使得鉴别出满足作为安全、可靶向taa的标准的6种hla i类结合肽(4种来源于muc16且各1种来源于znf717和vgll1)(图1b和表2)。定制的临床级四聚体可用于6个潜在靶点中的3个：两个hla-b*3502限制性muc16肽和单个hla-a*0101限制性vgll1肽。
[0383]
在白细胞去除术后，在il-21存在下，用单个肽脉冲dc刺激患者mp015 pbmc两次，之后对抗原特异性cd8+ t细胞进行基于四聚体的分选(图4a)。尽管muc16特异性ctl未能从患者pbmc中扩增，但vgll1 ctl成功扩增，在dc肽刺激2周后，vgll1四聚体阳性t细胞占cd8+的3.4％(图4b)。将细胞分选、之后采用快速扩增方案(rep)重复两次，产生近200亿个扩增的ctl，其中》90％为vgll1四聚体阳性并且表现出受限的vβ使用(图4b和图4c)。还从2名健康hla-a*0101阳性献血者中的2名成功扩增了vgll1特异性ctl，证实lseletpgky(seq id no:93)肽的一般免疫原性(图14)。
[0384]
使用标准
51
cr释放测定对来自患者mp015的扩增ctl进行了功能测试。用滴定量的vgll1肽脉冲的mel888黑色素瘤细胞(vgll1-阴性，hla-a*0101阳性)在低到10nm的肽浓度下诱发ctl识别和杀灭，表明对同源肽的相对高的亲和力(图4d)。重要的是，扩增的患者来源的ctl还显示出对自体类器官细胞系mp015-org的稳健识别，最初通过ms从该细胞系中检测到vgll1肽(图5a)。2015年10月，在cytoxan预治疗方案后，患者mp015被输注196亿个自体、扩增的vgll1特异性ctl，随后接受白介素-2和派姆单抗。尽管患者经历了短暂性发热(t细胞输注诱导的细胞因子释放的常见副作用)，但他们没有经历指示潜在ctl介导的毒性的不良事件。
[0385]
遗憾的是，2015年11月下旬的扫描显示疾病快速进展，表现为肺部病变和基于胸膜的转移性疾病的间隔性增加。令人惊讶的是，此时对基于胸膜的结节进行的活检揭示了差分化的神经内分泌肿瘤。对过去18个月收集的一系列液体活检标本的dna测序分析提供
了患者mp015癌症由于大量渐进式遗传扩增、缺失、重排和表观遗传学变化而极其快速演化的证据。肺转移瘤的rnaseq分析也表明，在2013年11月到2015年12月之间，vgll1转录本表达显著降低(35.1tpm到1.6tpm)，这为etc疗法缺乏临床应答提供了潜在的解释(图14)。患者mp015于2016年1月因其肺转移瘤进展引起的广泛并发症而死亡。
[0386]
vgll1特异性ctl表现出对多种同种异体pdac肿瘤细胞系的细胞毒性：尽管患者mp015并未从其自身vgll1特异性ctl的过继转移中获得临床益处，但这些t细胞在体外表现出的稳健抗肿瘤活性促使人们探索它们是否可能对其他pdac患者具有治疗潜力。pdac患者队列中约30％表达hla-a*0101，并且对tcga和mdacc pdac手术样本和pdx的rnaseq分析显示，43.2％到62.5％的患者以》5tpm的水平表达vgll1转录本。从这些数据，估计12％到15％的pdac患者在hla-a*0101的背景下呈现lseletpgky(seq id no:93)肽靶标，因此可潜在地受益于vgll1-ctl疗法。
[0387]
为了确定来源于患者mp015的vgll1-ctl是否可识别同种异体pdac肿瘤，使用
51
cr释放测定将一组表达hla-a*0101的pdac肿瘤细胞系作为杀灭靶标进行测试。蛋白质印迹分析用于确认vgll1蛋白质表达，且流式细胞术确认hla-a*0101在细胞系中的表面表达(图15)。对照细胞系wm793(vgll1阴性，hla-a*0101阳性)未被识别，但vgll1特异性ctl识别自体mp015-org细胞和测试的4个同种异体pdac细胞系中的4个，包括诱导panc-1005、capan-1和bxpc3的稳健杀灭(图5a和图5b)。来源于患者mp081的pdac类器官细胞也被vgll1-ctl裂解，但效率降低，可能归因于培养物内vgll1阴性细胞的过度生长。通过与泛mhc i类抗体w6/32共孵育证实vgll1-ctl特异性，该共孵育导致panc10.05识别和裂解的阻断(图27)。总之，这些结果提供了lseletpgky肽构成了可被vgll1特异性ctl有效靶向的共有pdac肿瘤抗原的证据。
[0388]
vgll1-ctl显示出针对多种肿瘤类型的活性和对原代细胞的降低识别：tcga rnaseq数据分析表明vgll1由几种癌症类型(31种中的16种)表达，最显著的是75-80％的膀胱癌、卵巢癌和基底型乳腺癌患者以及15-20％的肺癌和胃癌患者(图3b)。因此，开始确定来源于这些癌症类型的细胞系是否可成为vgll1特异性ctl的靶标(图6a)。对一组卵巢癌、基底型乳腺癌、膀胱癌、胃和肺癌细胞系的蛋白质印迹分析显示在所分析的14个细胞系中的12个细胞系中的高vgll1表达(图6b)。在天然表达hla-a*0101的8个细胞系中，vgll1-ctl杀灭3个卵巢系中的2个、3个乳腺系中的2个以及2个膀胱和肺癌系中的2个(图6a)。将另外5个hla-a*0101阴性细胞系(2个胃细胞系、2个膀胱细胞系和1个肺细胞系)转导以表达hla-a*0101，然后将它们作为vgll1-ctl的靶标进行测试。如图6a中所示，所有五种hla-a*0101转导的细胞系都对vgll1-ctl的杀灭敏感，表明从加工的内源表达的vgll1蛋白质呈递lseletpgky(seq id no:93)肽。总之，这些结果表明vgll1-ctl对于除pdac之外的至少五种其他癌症类型具有潜在的治疗价值。
[0389]
为了评估vgll1-ctl用于潜在治疗用途的安全性，他们根据gtex正常组织表达谱，针对最有可能诱发vgll1特异性反应的一组正常原代细胞进行了测试(图2a)。由于膀胱表现出最高的正常组织vgll1转录本表达，因此将两种不同的hla-a*0101阳性原代膀胱细胞系作为vgll1-ctl杀灭的靶标进行了测试。如图6c中所示，特异性裂解较低，在一个膀胱系中可检测到，但仅在最高e:t比率下可检测到。由于gtex数据库表明vgll1转录本在正常乳腺和肺中也以低水平表达，因此针对表达hla-a*0101的原代乳腺和肺气道细胞以及作为阴
性对照的原代黑素细胞测试了vgll1-ctl杀灭活性。在该组中，vgll1特异性ctl诱发了对乳腺细胞的中等高水平的杀灭，结果与如通过蛋白质印迹所评估的vgll1蛋白质水平一致(图6d)。相比之下，尽管表现出充足的hla-a*0101表面表达，但vgll1 ctl并未杀灭肺气道上皮细胞(图15)。这些结果提供了vgll1特异性t细胞不太可能识别必需正常组织的证据；然而，由于可能对一些非必需组织产生反应性，因此可能需要考虑安全问题。
[0390]
通过对来源于35名pdac患者的肿瘤样本进行无偏免疫肽组分析，将vgll1鉴别为一种新型的推定共有taa，其与必需正常组织相比，在肿瘤表达方面仅次于muc16。然而，与muc16表位相反，hla-a*0101限制性vgll1肽具有相当高的免疫原性，能够从多个pbmc供体(包括一名pdac患者)中诱发抗原特异性ctl。此类免疫原性在为癌症患者开发内源性t细胞(etc)疗法的背景下提供了显著优势。hla-a*0101在西欧和北美国家以相对高的盛行率(25-30％)表达，表明这些患者群体将最有可能受益于靶向该表位
52
。扩增的vgll1特异性ctl不仅识别并杀灭了一组同种异体pdac肿瘤系，而且还表现出对来源于其他五种癌症类型的表达a*0101的肿瘤细胞的反应性。据估计，靶向该单一vgll1表位可潜在地使大量西方癌症患者受益，包括超过20％的卵巢癌、膀胱癌或基底样乳腺癌患者，约12％的pdac患者，以及5-10％的肺癌、胃癌、宫颈癌、子宫癌或头颈癌患者(图3)。
[0391]
实施例2-材料和方法
[0392]
细胞系.使用基于癌细胞系百科全书(ccle)微阵列的基因表达分析鉴别表现出vgll1 mrna表达的人癌细胞系。从商业来源(atcc和sigma-aldrich)获得表达hla-a*0101的癌细胞系panc10.05、capan-1oaw28、ht1197、ht1376、bxpc3、ubcl-1和原代细胞系。由cold spring harbor labs的tuveson实验室生成患者来源的类器官细胞系mp015-org(hmia2d)，如前所述
33
。由maitra实验室从来源于楔形活检样本的肿瘤组织生成患者来源的类器官细胞系mp081-org。胃癌细胞系(gt-5和mkn74)是来自lee ellis博士的友好赠品。在含有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素(pen-strep)(cellgrow)和1％胰岛素-转铁蛋白-硒-a(gibco)的rpmi 1640培养基(gibco)中培养wm793、mkn74、panc1005、gt-5和oaw28细胞。将bt20和膀胱细胞系与fbs、pen-strep和1％丙酮酸钠(gibco)在等份的dmem f12k和mem alpha中培养。将所有其他细胞系在rpmi 1640、fbs和penn-strep中培养，并添加了hepes(gibco)和glutamax(gibco)。
[0393]
慢病毒转导.将一些天然表达vgll1蛋白质的hla-a*0101阴性肿瘤细胞系用慢病毒基因转移载体转导，以表达由人pgk启动子驱动的hla-a*0101，如前所述(bradley等，2015)。通过用抗人hla-a1-生物素和链霉抗生物素蛋白-fitc(us biological)染色并使用facscanto ii流式细胞仪(bd biosciences)测量荧光来评估a*0101的异位细胞表面表达。通过细胞分选分离表达生理水平和相当水平的表面hla-a*0101的肿瘤细胞，并将其用于后续实验。
[0394]
vgll1蛋白质表达.通过蛋白质印迹分析在所有细胞系中确认vgll1蛋白质表达。制备来自肿瘤和原代细胞系的细胞裂解物，并使用bca方法(thermo-fisher)对蛋白质含量进行归一化。使用标准的蛋白质印迹技术，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳运行细胞裂解物，转移，并用vgll1特异性兔多克隆抗体(ta322329,origene)探测膜。根据制造商说明书，使用酶联抗兔单克隆抗体与scientific pierce fast蛋白质印迹试剂盒使vgll1蛋白质显现。
[0395]
肽的鉴别、选择和验证.使用triton x-100裂解患者来源的腹腔镜楔形活检标本、
异种移植物(pdx)或细胞系，并将细胞裂解物在4℃下与每10mg蛋白质1μg泛-hla-abc特异性mab w6/32孵育过夜。将蛋白质a/g ultralink树脂珠粒用于使hla i类分子免疫沉淀，然后用0.1m乙酸洗脱hla结合肽。通过蛋白质印迹分析确认hla-a、b、c分离，然后通过串联质谱(ms/ms)分析hla阳性洗脱物。通过按0(不可检测)到4(最高强度)的等级对蛋白质印迹条带强度进行评级来半定量评估hla i类蛋白质回收。将肿瘤相关hla结合肽注射到hplc系统(dionex 3000rslc)中，并在ms/ms发现阶段通过在1.8μm c18(agilent technologies)上进行0.1％甲酸水-乙腈中的反相色谱加以分离。使用数据相关采集在orbitrap elite质谱仪(thermo-fisher)上分析肽。为了分析所采集的ms/ms谱，利用mascot算法对照swissprot完整人蛋白质数据库(2018年9月更新)搜索该谱，该数据库提供了与常规注释肽的潜在匹配。
[0396]
通过参考多个正交参数对单个肽匹配进行质量评估，这些参数包括mascot离子评分、与计算的肽质量(δ质量)差异测量的ms1，以及如通过高分辨基因测序及netmhc和netmhcpan算法确定的与患者hla同种异型的预测结合。通过blast搜索分析了高置信度肽匹配，以鉴别所有潜在的源基因，然后将这些基因与来源于单个肿瘤样本的rnaseq数据进行相互参考，以提供对肽身份的进一步验证(验证要求最低源基因表达为0.3个转录本每百万，tpm)。通过应用连续的rna转录本表达过滤器来消除由于正常组织表达(gtex portal rnaseq数据)而最有可能诱发自身免疫毒性的肽，针对作为潜在ctl靶标的安全性筛选洗脱的taa肽。排除睾丸和胎盘，在非必需组织中允许最大30tpm的源基因转录本表达，在“警示”组织中允许10tpm，在“风险”组织中允许3tpm，且在高度必需的“危险”组织(诸如心脏和脑)中允许1tpm。还通过分析tcga rnaseq数据针对在不同癌症类型中的表达和盛行率对推定的taa基因进行了筛选。在所选病例中，进行靶向性ms/ms分析以确认taa肽的身份。对于这些分析，通过合成肽的ms分析预先确定13c/15n同位素标记的合成肽标准品的保留时间窗口，然后使用每m/z约3da的质量窗口构建用于搜索taa肽的靶向方法。
[0397]
基因表达分析和患者存活.使用带有ribo-zero gold的illumina truseq stranded totalrna试剂盒对来源于所有pdac肿瘤样本、异种移植物和类器官细胞系的rna进行全转录组测序(rnaseq)分析，每个肿瘤rna样品(avera institute for human genetics)有大约2亿个配对端读段。通过汇集来源于正常人原发组织(gtex portal)和肿瘤组织(tcga)的rnaseq数据来确定vgll1和其他癌胎盘抗原的基因表达谱。当通过肿瘤vgll1转录本表达分层时，从tcga癌症患者的存活数据生成卡普兰-迈耶曲线。
[0398]
vgll1特异性cd8 t细胞的分离和扩增.如前所述(li等，2005)生成肿瘤抗原特异性ctl。通过用vgll1231-240肽lseletpgky(seq id no:93)脉冲的自体树突细胞(dc)将hla-a*0101阳性患者或健康供体来源的pbmc刺激两次。在第二次dc刺激后6天，将培养的细胞用vgll1231-240肽/hla-a*0101
–
pe缀合的定制四聚体(fred hutchinson cancer research center)染色，洗涤，然后用apc缀合的cd8抗体染色。洗涤细胞并通过流式细胞术(lsrfortessa x-20分析仪)进行分析。通过aria ii分选cd8和四聚体双阳性细胞，并使用快速扩增方案(rapid expansion protocol,rep)用pbmc和lcl饲养细胞扩增vgll1特异性cd8 t细胞。使用iotest beta mark tcr-vβ库试剂盒评估扩增的cd8 t细胞的tcr vβ库。
[0399]
细胞毒性t细胞测定.使用标准铬-51(
51
cr)释放试验评估vgll1特异性cd8+ t细胞的抗肿瘤杀灭。将靶细胞用100μl 51
cr标记1小时，然后洗涤并以每孔2,000个靶细胞一式三
份铺板。将vgll1特异性cd8
+
t细胞与靶细胞在不同的效应物与靶(e:t)细胞比率下孵育4小时。在孵育期后，从孔中收集上清液并用γ辐射计数器测量
51
cr。校正背景
51
cr释放并且相对于如通过triton x-100裂解的靶细胞测量的最大
51
cr释放，计算特定靶细胞裂解的百分比。
[0400]
统计学分析.使用graphpad prism 7.03版进行数据分析。使用参数检验(anova或非配对t检验)分析正态分布的数据。通过对数秩检验分析卡普兰-迈耶存活曲线。若p《0.05，则认为检验差异具有统计学意义。
[0401]
实施例3-t细胞受体的开发和表征
[0402]
克隆vgll1 tcr并表征其对靶细胞的杀伤效率。用vgll1 tcr转导pbmc，以靶向用肽脉冲的mel888hlaa1细胞。发现表达tcr的t细胞可有效杀灭用肽脉冲的mel888hlaa1细胞(图1)。另外，显示克隆的vgll1 tcr识别内源性表达的抗原(图2)。
[0403]
为了克隆t细胞受体，通过rneasy试剂盒(qiagen,74104)从vgll1特异性t细胞中分离总rna，并使用5
’‑
race技术(cdna末端快速扩增，takara，634859)合成cdna。然后使用特异性结合tcrα或tcrβ恒定区的3’端引物，通过pcr单独扩增tcrα和tcrβ链。在cdna合成期间添加与共有序列互补的5’末端引物。然后将pcr产物克隆到topo克隆载体(invitrogen,450641)中，并对30个dna克隆进行测序，以确定每条α或β链。在使用imgt数据库进行基因比对后，鉴别出1个tcrβ(trbvc1 5-6*01j1-1)和4个主要tcrα克隆(trav19*01j56*01、trav13-1*02j10、trav13-1*02j1301、trav23 j12)。对于功能测试，通过将tcrβ与不同的tcrα配对设计了4个tcrα/β克隆，并且每条α和β链由含有弗林蛋白酶(furin)和p2a切割位点的接头连接。由twist公司合成全长基因，然后通过将tcr dna片段插入sali和noti位点中而克隆到已用于若干临床试验中的pmsgv1载体中。
[0404]
用于tcr转导的逆转录病毒粒子的生成：将编码4种不同的vgll1特异性tcr的基于pmsgv1的逆转录病毒载体用于使用包装细胞系293gp生成逆转录病毒粒子，其中以rt114作为包膜蛋白质以提高t细胞转导效率。将从md anderson血库获得的正常pbmc转导并连续培养5天。然后通过流式细胞术分选出vgll1肽四聚体和cd8双阳性t细胞。根据分选后的细胞数目，将这些t细胞直接用于细胞毒性测定，或者进行t细胞复制。
[0405]
vgll1-tcr表达介导ctl细胞毒性：黑色素瘤细胞系mel888表达内源性hlaa1，但不表达可检测水平的vgll1蛋白质。将mel888用10微克肽脉冲，并以不同比率与tcr转导的效应t细胞共培养。基于铬-51释放来测量t细胞介导的靶细胞死亡。表达tcr克隆1号和3号的效应t细胞在4小时的孵育内可以低到1.25:1的效应物:靶标比率裂解20-30％的靶肿瘤细胞并且以40:1的比率裂解70-80％靶细胞。vgll1 tcr克隆2号和4号似乎稍弱，但所有四个tcr克隆之间的差异并不显著(图16)。
[0406]
进一步确定vgll1-tcr识别和裂解表达内源性vgll1的肿瘤细胞的效率。在该测定中，将表达hlaa1和vgll1两者的mel888细胞系和胰腺细胞系与tcr-4转导的t细胞以40:1和5:1的比率共培养不同时间点。30％的胰腺细胞在孵育3.5小时后被裂解，且50％的胰腺细胞在5小时后被杀灭(图17)。因此，vgll1-tcr表达介导转导的t细胞的细胞毒性活性。
[0407]
***
[0408]
根据本公开，无需过度实验即可制备和实施本文所公开和要求保护的所有方法。虽然已经按照优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但对于本领域技术人员
将显而易见的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下可对所述方法以及本文所描述的方法的步骤或步骤的顺序作出改变。更具体地，将显而易见的是，与化学上和生理学上两者均相关的某些药剂可代替本文所述的药剂，而仍将实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的代替物和修改均被认为在由所附权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念内。
[0409]
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以下参考文献以引用方式明确地并入本文中，其引用程度为它们为本文的公开提供补充性的示例性程序性细节或其他细节。
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