组装双组分病毒样颗粒的方法与流程

本公开一般涉及自组装蛋白质纳米结构，特别是制备纳米结构的方法，包含基于纳米结构的疫苗。

背景技术：

1、基于蛋白质的病毒样颗粒(pbvlp)(也称为纳米结构)为对称呈现蛋白质或其它大分子提供了有用的平台。其可以与由病毒衣壳蛋白(例如，来自无包膜病毒)或脂质包埋蛋白(例如，从包膜病毒提取或使用与脂质混合的重组膜蛋白制备)制成的常规vlp区分开来。后者通常没有定义的对称性。由于在病毒衣壳上附着蛋白质的挑战，前者通常在其显示蛋白质的能力方面受到限制。

2、vlp的一种应用(尤其是对于pbvlp)通常是作为疫苗。研究实验表明，与常规亚单位疫苗和非对称vlp相比，pbvlp上显示的抗原引发更强的抗体应答。

3、bale等人,《科学(science)》353:389-394(2016)公开了各种双组分二十面体pbvlp，包含一组由指定为组分a(compa)和组分b(compb)的蛋白质组分制成的pbvlp。

4、本领域仍然需要表达、纯化和组装基于蛋白质的病毒样颗粒的方法。本公开满足了此需要。

技术实现思路

1、本发明一般涉及组装和纯化pbvlp的方法。

2、本文提供了一种制备纳米结构的方法，所述方法包括在使剪切应力最小化的条件下将组分a(compa)蛋白添加到包括组分b(compb)蛋白的溶液中，从而形成compa:compb复合物。在一些实施例中，所述compa:compb复合物是具有二十面体对称性的复合物。在一些实施例中，所述compa:compb复合物是pbvlp。

3、在一些实施例中，本公开提供了一种制备纳米结构的方法，所述方法包括在使剪切应力最小化的条件下将融合蛋白添加到包括组分b(compb)蛋白的溶液中，其中所述融合蛋白包括与抗原蛋白连接的compa蛋白，从而形成compa:compb复合物。

4、在一些实施例中，使剪切应力最小化的所述条件包括在所述溶液的表面之下将所述compa蛋白添加到所述compb蛋白中。

5、在一些实施例中，使剪切应力最小化的所述条件包括在没有机械混合的情况下混合所述溶液。

6、在一些实施例中，使剪切应力最小化的所述条件包括在没有搅拌棒的情况下混合所述溶液。

7、在一些实施例中，使剪切应力最小化的所述条件包括在没有叶轮的情况下混合所述溶液。

8、在一些实施例中，使剪切应力最小化的所述条件包括使用轨道搅拌混合所述溶液。

9、在一些实施例中，使剪切应力最小化的所述条件包括使用微流体混合器混合所述溶液。在一些实施例中，所述微流体混合器是ignitetm筒或其任何等效物。

10、在一些实施例中，所述方法包括将过量的所述compa蛋白添加到所述compb蛋白中。在一些实施例中，所述方法包括将所述compa蛋白添加到所述compb蛋白中，其中所述compa蛋白的摩尔浓度与所述compb蛋白的摩尔浓度基本相等。

11、在一些实施例中，所述方法提供在没有明显沉淀的情况下的compa和compb的混合。在一些实施例中，相对于compa和compb的溶液的机械混合，所述方法提供在没有明显沉淀的情况下的compa和compb的混合。

12、在一些实施例中，所述方法提供了所述compa:compb复合物的形成，其量为总蛋白质的至少约40％，例如，如通过尺寸排阻色谱法测量的。在一些实施例中，所述方法提供了所述compa:compb复合物的形成，其量为总蛋白质的约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％或约95％，例如，如通过尺寸排阻色谱法测量的。

13、在一些实施例中，所述方法进一步包括通过用1,000kda膜或其等效物过滤所述溶液来从过量的compa、过量的compb和/或其它杂质中纯化所述compa:compb复合物。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过用具有约300kda至3,000kda孔径的亲水性膜过滤所述溶液来从过量的compa、过量的compb和/或其它杂质中纯化所述compa:compb复合物。在一些实施例中，所述孔径为约800kda、约900kda，约1000kda、约1100kda、约1200kda、约1300kda、约1400kda或约1500kda。在一些实施例中，所述亲水性膜包括选自以下的材料：pvd纤维素、复合再生纤维素(crc)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、尼龙和聚醚砜。

14、在一些实施例中，所述1,000kda膜是复合再生纤维素(crc)膜。

15、在一些实施例中，所述1,000kda膜是1000kda膜或其等效物。

16、在一些实施例中，所述过滤包括切向流过滤(tff)。在一些实施例中，所述过滤提供纯度为约80％或更高的所述compa:compb复合物，如通过占总蛋白质的重量百分比测量的。在一些实施例中，所述过滤提供纯度为约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的所述compa:compb复合物，如通过占总蛋白质的重量百分比测量的。在一些实施例中，所述过滤提供纯度为约90％至99％的所述compa:compb复合物，如通过占总蛋白质的重量百分比测量的。

17、在一些实施例中，所述方法不包括用疏水性膜(例如，pellicon biomax1000kda)、丁基对流相互作用介质(cim)柱、captocore700柱或其等效物纯化所述溶液。

18、在一些实施例中，所述方法是连续或半连续过程。

19、在一些实施例中，在所述添加步骤之前连续产生所述compa蛋白。

20、在一些实施例中，所述compb蛋白作为一个或多个冷冻批次提供。

21、在一些方面，本公开提供了一种制备纳米结构的方法，所述方法包括(i)提供包括第一蛋白质的第一入口流体流和包括第二蛋白质的第二入口流体流，以及(ii)使所述第一入口流体流与所述第二入口流体流接触以形成出口流，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的混合发生在所述出口流中，从而形成包括所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的蛋白质复合物。在一些实施例中，所述方法包括(i)提供包括第一蛋白质的第一入口流体流和包括第二蛋白质的第二入口流体流，其中所述第一蛋白质包括compa蛋白，并且其中所述第二蛋白质包括compb蛋白；以及(ii)使所述第一入口流体流与所述第二入口流体流接触以形成出口流，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的混合发生在所述出口流中，从而形成包括所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的基于蛋白质的vlp(pbvlp)复合物。

22、在一些实施例中，所述第一入口流体流和所述第二入口流体流以三通配置连接以形成所述出口流，任选地其中所述三通配置是t形或y形配置。在一些实施例中，所述第一入口流体流和所述第二入口流体流连接以形成所述出口流，其中所述出口流通过静态混合器(例如，管道混合器)，其中所述第一蛋白质(例如，compa)和所述第二蛋白质(例如，compb)的混合在所述出口流通过所述静态混合器时发生，从而形成包括所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的复合物(例如，pbvlp复合物)。

23、在一些实施例中，使用微流体混合器将所述第一入口流体流和所述第二入口流体流连接以形成所述出口流。在一些实施例中，所述微流体混合器是ignitetm筒或其任何等效物。在一些实施例中，所述微流体混合器包括一个或多个被动混合元件以促进所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的混合。在一些实施例中，所述出口流包括超过所述第二蛋白质(例如，compb)的摩尔浓度的所述第一蛋白质(例如，compa)的摩尔浓度。在一些实施例中，所述出口流包括基本上等于所述第二蛋白质(例如，compb)的摩尔浓度的所述第一蛋白质(例如，compa)的摩尔浓度。

24、在一些实施例中，所述第一蛋白质(例如，compa)和所述第二蛋白质(例如，compb)的混合在所述第一蛋白质、所述第二蛋白质、所述复合物或其组合没有明显沉淀的情况下发生。

25、在一些实施例中，所述复合物以总蛋白质的至少约40％的量形成，例如，如通过尺寸排阻色谱法测量的。在一些实施例中，所述方法提供了所述compa:compb复合物的形成，其量为总蛋白质的约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％或约95％，例如，如通过尺寸排阻色谱法测量的。

26、在一些实施例中，所述方法进一步包括通过用1,000kda膜或其等效物过滤所述溶液来从过量的第二蛋白质和/或其它杂质中纯化所述复合物。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过用具有约300kda至3,000kda孔径的亲水性膜过滤所述溶液来从过量的compa、过量的compb和/或其它杂质中纯化所述compa:compb复合物。在一些实施例中，所述孔径为约800kda、约900kda，约1000kda、约1100kda、约1200kda、约1300kda、约1400kda或约1500kda。在一些实施例中，所述亲水性膜包括选自以下的材料：pvd纤维素、复合再生纤维素(crc)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、尼龙和聚醚砜。

27、在一些实施例中，所述1,000kda膜是复合再生纤维素(crc)膜。

28、在一些实施例中，所述1,000kda膜是1000kda膜或其等效物。

29、在一些实施例中，所述过滤包括切向流过滤(tff)。在一些实施例中，所述过滤提供纯度为约80％或更高的所述compa:compb复合物，如通过占总蛋白质的重量百分比测量的。在一些实施例中，所述过滤提供纯度为约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的所述compa:compb复合物，如通过占总蛋白质的重量百分比测量的。在一些实施例中，所述过滤提供纯度为约90％至99％的所述compa:compb复合物，如通过占总蛋白质的重量百分比测量的。

30、在一些实施例中，所述方法不包括用疏水性膜(例如，pellicon biomax1000kda)、丁基对流相互作用介质(cim)柱、captocore700柱或其等效物纯化所述溶液。

31、在一些实施例中，所述方法是连续或半连续过程。

32、在一些实施例中，在所述添加步骤之前连续产生所述第一蛋白质。

33、在一些实施例中，所述第二蛋白质作为一个或多个冷冻批次提供。

34、在一些实施例中，所述第一组分是本文所描述的组分a(compa)和/或所述第一组分是本文所描述的组分b(compb)。在一些实施例中，所述compa包括与以下中的任一个具有至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多肽序列：seq in no:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、26、29-31、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57和59。在一些实施例中，所述compb包括与以下中的任一个具有至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多肽序列：seq in no:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、27、28、32-34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和58。在一些实施例中，所述compa和所述compb各自包括分别与以下任一项具有至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多肽序列：(i)seq id no:1和seq id no:2；(ii)seq id no:3和seq id no:4；(iii)seq id no:3和seq id no:24；(iv)seq id no:23和seq id no:4；(v)seq id no:35和seq id no:36；(vi)seq id no:5和seq id no:6；(vii)seq id no:5和seq id no:27；(viii)seq id no:5和seq id no:28；(ix)seq id no:25和seq id no:6；(x)seq id no:25和seq id no:27；(xi)seq id no:25和seq id no:28；(xii)seq id no:26和seq id no:6；(xiii)seq id no:26和seq id no:27；(xiv)seq id no:26和seq id no:28；(xv)seq id no:37和seq id no:38；(xvi)seq idno:7和seq id no:8；(xvii)seq id no:7和seq id no:32；(xviii)seq id no:7和seq idno:33；(xix)seq id no:7和seq id no:34；(xx)seq id no:29和seq id no:8；(xxi)seqid no:29和seq id no:32；(xxii)seq id no:29和seq id no:33；(xxiii)seq id no:29和seq id no:34；(xxiv)seq id no:30和seq id no:8；(xxv)seq id no:30和seq id no:32；(xxvi)seq id no:30和seq id no:33；(xxvii)seq id no:30和seq id no:34；(xxviii)seq id no:31和seq id no:8；(xxix)seq id no:31和seq id no:32；(xxx)seq id no:31和seq id no:33；(xxxi)seq id no:31和seq id no:34；(xxxii)seq id no:39和seq idno:40；(xxxiii)seq id no:9和seq id no:10；(xxxiv)seq id no:11和seq id no:12；(xxxv)seq id no:13和seq id no:14；(xxxvi)seq id no:15和seq id no:16；(xxxvii)seq id no:19和seq id no:20；(xxxviii)seq id no:21和seq id no:22；(xxxviv)seq idno:23和seq id no:24；(xl)seq id no:41和seq id no:42；(xli)seq id no:43和seq idno:44；(xlii)seq id no:45和seq id no:46；(xliii)seq id no:47和seq id no:48；(xliv)seq id no:49和seq id no:50；(xlv)seq id no:51和seq id no:44；(xlvi)seq idno:53和seq id no:52；(xlvii)seq id no:55和seq id no:54；(xlviii)seq id no:57和seq id no:56；以及(xlvix)seq id no:59和seq id no:58。

35、在一些实施例中，融合蛋白包括所述compa蛋白，其中所述compa蛋白与抗原蛋白连接。在一些实施例中，所述融合蛋白包括通过接头与抗原蛋白连接的compa蛋白。

36、在一些实施例中，所述抗原蛋白选自hiv env、rsv f、ebv gp350、cmv gb、cmvul128、cmv ul130、cmv ul131a、cmv gh、cmv gl、lyme ospa、百日咳毒素、登革热e(denguee)、sars s、mers s、扎伊尔埃博拉病毒gp(zaire ebolavirus gp)、苏丹埃博拉病毒gp(sudan ebolavirus gp)、马尔堡病毒gp(marburg virus gp)、汉坦病毒gn(hanta virusgn)、汉坦病毒gc(hanta virus gc)、hepb表面抗原、麻疹h、寨卡病毒包膜结构域iii(zikaenvelope domain iii)、疟疾csp、疟疾pfs25、尼帕病毒f(nipah virus f)、尼帕病毒g(nipah virus g)、轮状病毒vp4、轮状病毒vp8*、hmpv f、hmpv g、pv f、pv hn、menb fhbp、menb nada、冠状病毒s蛋白、冠状病毒rbd和menb nhba。在一些实施例中，所述抗原蛋白包括副粘病毒和/或肺病毒f蛋白或其抗原片段。在一些实施例中，所述抗原蛋白包括呼吸道合胞病毒(rsv)f蛋白或其抗原片段。在一些实施例中，所述抗原蛋白包括人偏肺病毒(hmpv)f蛋白或其抗原片段。在一些实施例中，所述抗原蛋白包括与选自选自以下的氨基酸序列具有至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的氨基酸序列：seq id no:64-136和206-209。在一些实施例中，所述抗原蛋白包括选自以下的多肽：seq id no:64-136和206-209。

37、在一些实施例中，所述融合蛋白包括定位在所述compa蛋白与所述抗原蛋白之间的肽接头。在一些实施例中，所述肽接头是gly-ser接头。在一些实施例中，所述gly-ser接头包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:213-215。在一些实施例中，所述gly-ser接头由选自以下的氨基酸序列组成：seq id no:213-215。

38、在一些实施例中，所述融合蛋白包括与选自以下的氨基酸序列具有至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的氨基酸序列：seq id no:61和167-193。在一些实施例中，所述融合蛋白包括与选自以下的氨基酸序列具有至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的氨基酸序列：seq idno:60、137-166和194-199。在一些实施例中，所述融合蛋白包括与选自以下的氨基酸序列具有至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的氨基酸序列：seq id no:200-205。

39、在一些实施例中，本公开提供了一种制备纳米结构的方法，所述方法包括在使剪切应力最小化的条件下将融合蛋白添加到包括组分b(compb)蛋白的溶液中，其中所述融合蛋白包括与抗原蛋白连接的compa蛋白，并且其中所述融合蛋白包括与选自以下的多肽具有至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的氨基酸序列：seq id no:137-205，从而形成compa:compb复合物。

40、在一些实施例中，所述方法提供了具有二十面体对称性的复合物。

41、在一些方面，本公开提供了通过本文所描述的方法产生的复合物。

42、在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括通过本文所描述的方法产生的复合物，以及药学上可接受的稀释剂。

43、在一些方面，本公开提供了一种疫苗，所述疫苗包括通过本文所描述方法产生的复合物。

44、在一些方面中，本公开提供了一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所描述的复合物、本文所描述的药物组合物或本文所描述的疫苗。在一些实施例中，所述疾病或病症是病毒感染。

45、在一些方面，本公开提供了一种在有需要的受试者体内产生免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所描述的复合物、本文所描述的药物组合物或本文所描述的疫苗。

46、在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本文所描述的复合物、本文所描述的药物组合物或本文所描述的疫苗。

47、在一些方面，本公开提供了用于作为药物的用途的本文所描述的复合物、本文所描述的药物组合物或本文所描述的疫苗。在一些实施例中，本公开提供了用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的本文所描述的复合物、本文所描述的药物组合物或本文所描述的疫苗。

48、根据下面的详细描述，本发明的另外的方面和实施例将变得显而易见。