用于增强视觉功能的组合物和方法与流程

用于增强视觉功能的组合物和方法
1.交叉引用
2.本技术要求2020年5月29日提交的美国临时专利申请第63/032,241号的权益，该申请通过引用整体并入本文。
3.关于联邦资助的研究的声明
4.本发明是根据美国国家卫生研究院(national institutes of health)颁发的ey018241在政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利。
5.引言
6.色素性视网膜炎(rp)由于光感受器的退化而导致失明，但不会影响其他视网膜细胞，这让人们希望在幸存的细胞中表达光活化信号传导蛋白可以恢复视力。虽然大多数努力都采用了光活化离子通道，但光活化g蛋白偶联受体(gpcr)，诸如光感受器细胞的视蛋白，代表了一种有吸引力的替代方案，它是视网膜天生的并且以高灵敏度起作用，并且可能低表达，因为它们活化放大信号级联下游的通道。事实上，最近证实视紫红质或黑视素的异位表达可恢复昏弱光下的光响应。然而，在光感受器细胞之外，视紫红质产生缓慢的光响应，而黑视素产生甚至更慢的光响应。在视紫红质的情况下，即使是在固定的视觉刺激下，动力学已经太慢而无法支持图案化视觉。
7.本领域需要用于增强视觉功能的组合物和方法。


技术实现要素：

8.本公开提供了一种缀合物，其包含亲和剂、支链接头和两个或更多个可光致异构调控因子。本公开提供了包含所述缀合物的组合物，以及包含所述组合物的设备。本公开提供了用于增强视觉功能的方法，所述方法包括将所述缀合物施用给有需要的个体。
附图说明
9.图1a-1k描绘了本公开缀合物的实施方案的合成方案。
10.图2a-2j描绘了portl对mglur2光活化的影响。
11.图3a-3c描绘了单价bgag
12,460
对表达大鼠snap-mglur2或人snap-mglur6的hek293细胞中的girk光电流的影响。
12.图4a-4d描绘了多支链bgag
12,460
对hek293细胞中girk通道的snap-mglur2活化的效力和敏感性的影响。
13.图5a-5d描绘了在玻璃体内注射aav2 4yf hsyn-snap-mglu r2后，rd1小鼠的rgc中snap-mglur2的表达。
14.图6a-6f描绘了视网膜神经节细胞(rgc)或on-双极细胞(on-bc)中的
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2对rd1小鼠中的避光行为的影响。
15.图7a-7c描绘了rgc或on-bc rgc中的
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2对rd1小鼠中的学习的空间图形识别引导行为的影响。
16.图8a-8c描绘了β-环糊精中的
4x
bgag
12,460
对snap-mglur2 rd1小鼠中图形识别的恢
复的影响。
17.图9描绘了在玻璃体内注射
4x
bgag
12,460
后rdl小鼠中高敏度线条图形识别的恢复。
18.图10a-10c描绘了来自具有bgag
12,460
:snap-mglur2的分离的rdl视网膜的rgc或rgc中的中波锥视蛋白(mw视蛋白)的微电极阵列(mea)记录。
19.图11描绘了与mw视蛋白相比，rdl小鼠的rgc中的
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2对移动显示器中的线条图形识别的恢复的影响。
20.图12描绘了rdl小鼠的rgc或on-bc中的
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2对新物体识别的影响。
21.定义
22.除非另外指出，否则以下术语具有以下含义。任何未定义的术语都具有其本领域公认的含义。
23.术语“烷基”是指单自由基支链或非支链饱和烃链，例如具有1至40个碳原子、1至10个碳原子或1至6个碳原子。该术语以诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正己基、正癸基、十四烷基等基团为例。
24.术语“经取代的烷基”是指如上定义的烷基，其中烷基链中的一个或多个碳原子已经任选地被杂原子诸如-o-、-s(o)
n-(其中n为0至2)、-nr-(其中r是氢或烷基)置换并且具有1至5个选自以下的取代基：烷氧基、经取代的烷氧基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧基氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-so-烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-芳基、-so
2-杂芳基和-nrarb，其中ra和rb可以是相同或不同的并且选自氢、任选取代的烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基和杂环基。
25.术语“烷基氨基烷基”、“烷基氨基烯基”和“烷基氨基炔基”是指基团ranhr
b-，其中ra是如上定义的烷基并且rb是如上定义的亚烷基、亚烯基或亚炔基。
26.术语“烷芳基”或“芳烷基”是指基团：-亚烷基-芳基和-经取代的亚烷基-芳基，其中亚烷基、经取代的亚烷基和芳基在本文中定义。
27.术语“烷氧基”是指基团：烷基-o-、烯基-o-、环烷基-o-、环烯基-o-和炔基-o-，其中烷基、烯基、环烷基、环烯基和炔基如本文所定义。
28.术语“经取代的烷氧基”是指基团：经取代的烷基-o-、经取代的烯基-o-、经取代的环烷基-o-、经取代的环烯基-o-和经取代的炔基-o-，其中经取代的烷基、经取代的烯基、经取代的环烷基、经取代的环烯基和经取代的炔基如本文所定义。
29.术语“卤代烷氧基”是指基团：烷基-o-，其中烷基上的一个或多个氢原子已被卤素基团取代，并且举例而言包括诸如三氟甲氧基等基团。
30.术语“烷基烷氧基”是指基团：-亚烷基-o-烷基、亚烷基-o-经取代的烷基、经取代的亚烷基-o-烷基和经取代的亚烷基-o-经取代的烷基，其中烷基、经取代的烷基、亚烷基和经取代的亚烷基如此处定义。
31.术语“烷基硫代烷氧基”是指基团：-亚烷基-s-烷基、亚烷基-s-经取代的烷基、经取代的亚烷基-s-烷基和经取代的亚烷基-s-经取代的烷基,其中烷基、经取代的烷基、亚烷
基和经取代的亚烷基如此处定义。
32.术语“烯基”是指具有2至40个碳原子、2至10个碳原子或2至6个碳原子并且具有至少1个乙烯基不饱和位点(例如，1-6个位点)的支链或非支链不饱和烃基的单自由基。
33.术语“经取代的烯基”是指具有1至5个取代基或1至3个取代基的如上定义的烯基，所述取代基选自烷氧基、经取代的烷氧基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧基氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-so-烷基、-so-经取代的烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-经取代的烷基、-so
2-芳基和-so
2-杂芳基。
34.术语“炔基”是指具有2至40个碳原子、2至20个碳原子或2至6个碳原子并且具有至少1个乙炔(三键)不饱和位点(例如，1-6个位点)的不饱和烃的单自由基。
35.术语“经取代的炔基”是指具有1至5个取代基或1至3个取代基的如上定义的炔基，所述取代基选自烷氧基、经取代的烷氧基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧基氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-so-烷基、-so-经取代的烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-经取代的烷基、-so
2-芳基和-so
2-杂芳基。
36.术语“酰基”是指基团：hc(o)-、烷基-c(o)-、经取代的烷基-c(o)-、环烷基-c(o)-、经取代的环烷基-c(o)-、环烯基-c(o)-、经取代的环烯基-c(o)-、芳基-c(o)-、杂芳基-c(o)-和杂环-c(o)-，其中烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、杂芳基和杂环如本文所定义。
37.术语“酰基氨基”或“氨基羰基”是指基团-c(o)nrr，其中每个r独立地为氢、烷基、经取代的烷基、芳基、杂芳基、杂环或其中两个r基团连接形成杂环基团(例如，吗啉基)，其中烷基、经取代的烷基、芳基、杂芳基和杂环如本文所定义。
38.术语“氨基酰基”是指基团-nrc(o)r，其中每个r独立地为氢、烷基、经取代的烷基、芳基、杂芳基或杂环，其中烷基、经取代的烷基、芳基、杂芳基和杂环如本文所定义。
39.术语“氨基酰氧基”或“烷氧基羰基氨基”是指基团-nrc(o)or，其中每个r独立地为氢、烷基、经取代的烷基、芳基、杂芳基或杂环，其中烷基、经取代的烷基、芳基、杂芳基和杂环如本文所定义。
40.术语“酰氧基”是指烷基-c(o)o-、经取代的烷基-c(o)o-、环烷基-c(o)o-、经取代的环烷基-c(o)o-、芳基-c(o)o-、杂芳基-c(o)o-和杂环-c(o)o-，其中烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、芳基、杂芳基和杂环如本文所定义。
41.术语“芳基”是指具有单环(例如苯基)或多个缩合(稠合)环(例如萘基或蒽基)的6至20个碳原子的不饱和芳族碳环基团。示例性芳基包括苯基、萘基等。除非芳基取代基的定义另有限制，否则此类芳基可任选地被1至5个取代基或1至3个取代基取代，所述取代基选自酰氧基、羟基、硫醇、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、经取代的烷基、经取代的烷氧基、经取代的烯基、经取代的炔基、经取代的环烷基、经取代的环烯基、氨基、经取
代的氨基、氨基酰基、酰氨基、烷芳基、芳基、芳氧基、叠氮基、羧基、羧基烷基、氰基、卤基、硝基、杂芳基、杂芳氧基、杂环、杂环氧基、氨基酰氧基、氧酰基氨基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、-so-烷基、-so-经取代的烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-经取代的烷基、-so
2-芳基、-so
2-杂芳基和三卤甲基。
42.术语“芳氧基”是指基团芳基-o-，其中芳基如以上所定义，包括如本文所定义的任选取代的芳基。
[0043]“氨基”是指基团-nh2。
[0044]
术语“经取代的氨基”是指基团-nrr，其中每个r独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、烯基、经取代的烯基、环烯基、经取代的环烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、杂芳基和杂环，条件是两个r都不是氢。
[0045]
术语“羧基烷基”或“烷氧基羰基”是指基团
“‑
c(o)o-烷基”、
“‑
c(o)o-经取代的烷基”、
“‑
c(o)o-环烷基”、
“‑
c(o)o-经取代的环烷基”、
“‑
c(o)o-烯基”、
“‑
c(o)o-经取代的烯基”、
“‑
c(o)o-炔基”和
“‑
c(o)o-经取代的炔基”，其中烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、烯基、经取代的烯基、炔基和经取代的炔基炔基如本文所定义。
[0046]
术语“环烷基”是指具有单个环或多个缩合环的3至20个碳原子的环状烷基。举例而言，此类环烷基包括单环结构诸如环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等，或多环结构诸如金刚烷基等。
[0047]
术语“经取代的环烷基”是指具有1至5个取代基或1至3个取代基的环烷基，所述取代基选自烷氧基、经取代的烷氧基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧基氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-so-烷基、-so-经取代的烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-经取代的烷基、-so
2-芳基和-so
2-杂芳基。
[0048]
术语“环烯基”是指具有单个环和至少一个内部不饱和点的4至20个碳原子的环状烯基。合适的环烯基的实例包括例如环丁-2-烯基、环戊-3-烯基、环辛-3-烯基等。
[0049]
术语“经取代的环烯基”是指具有1至5个取代基或1至3个取代基的环烯基，所述取代基选自烷氧基、经取代的烷氧基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧基氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-so-烷基、-so-经取代的烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-经取代的烷基、-so
2-芳基和-so
2-杂芳基。
[0050]
术语“卤基”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
[0051]
术语“杂芳基”是指在至少一个环(如果存在多于一个环)内具有1至15个碳原子和1至4个选自氧、氮和硫的杂原子的芳基。除非杂芳基取代基的定义另有限制，否则此类杂芳基可任选地被1至5个取代基或1至3个取代基取代，所述取代基选自酰氧基、羟基、硫醇、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、经取代的烷基、经取代的烷氧基、经取代的烯基、经取代的炔基、经取代的环烷基、经取代的环烯基、氨基、经取代的氨基、氨基酰基、酰氨
基、烷芳基、芳基、芳氧基、叠氮基、羧基、羧基烷基、氰基、卤基、硝基、杂芳基、杂芳氧基、杂环、杂环氧基、氨基酰氧基、氧酰基氨基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、-so-烷基、-so-经取代的烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-经取代的烷基、-so
2-芳基和-so
2-杂芳基和三卤甲基。
[0052]
术语“杂芳烷基”是指基团-亚烷基-杂芳基，其中亚烷基和杂芳基在本文中定义。此类杂芳烷基的实例以吡啶基甲基、吡啶基乙基、吲哚基甲基等为例。
[0053]
术语“杂芳基氧基”是指基团杂芳基-o-。
[0054]
术语“杂环”或“杂环基”是指具有单个环或多个缩合环，在环内具有1至40个碳原子和1至10个杂原子，例如1至4个选自氮、硫、磷和/或氧的杂原子的单自由基饱和或不饱和基团。除非杂环取代基的定义另有限制，否则此类杂环基团可以任选地被1至5个取代基或1至3个取代基取代，所述取代基选自烷氧基、经取代的烷氧基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧基氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-so-烷基、-so-经取代的烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-经取代的烷基、-so
2-芳基和-so
2-杂芳基。
[0055]
氮杂芳基和杂环的实例包括但不限于吡咯、噻吩、呋喃、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲哚嗪、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喏啉、喹唑啉、噌啉、喋啶、咔唑、咔啉、啡啶、吖啶、啡啉、异噻唑、吩嗪、异噁唑、啡噁嗪、吩噻嗪、咪唑啶、咪唑啉、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吲哚啉、吗啉、四氢呋喃基、四氢噻吩等以及n-烷氧基-含氮杂环。
[0056]
术语“杂环氧基”是指基团杂环基-o-。
[0057]
术语“杂环基硫”是指基团杂环基-s-。
[0058]
术语“杂环烯”是指由如本文定义的杂环形成的双自由基基团并且以基团：2,6-吗啉基、2,5-吗啉基等为例。
[0059]
术语“杂芳基氨基”是指5元芳环，其中一个或两个环原子是n，其余环原子是c。杂芳基氨基环可以稠合到环烷基、芳基或杂芳基环上，并且它可以任选地被一个或多个取代基，例如一个或两个取代基取代，所述取代基选自烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、卤基、氰基、酰基、氨基、经取代的氨基、酰氨基、-or(其中r是氢、烷基、烯基、环烷基、酰基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基)，或-s(o)nr，其中n为0至2的整数且r为氢(条件是n为0)、烷基、烯基、环烷基、氨基、杂环、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基。
[0060]
术语“杂环氨基”是指4至8个环原子的饱和单价环状基团，其中至少一个环原子为n并且任选地含有一个或两个选自n、o或s(o)n的附加环杂原子(其中n是0至2的整数)，其余环原子为c，其中一个或两个c原子可以任选地被羰基置换。杂环氨基环可以稠合到环烷基、芳基或杂芳基环上，并且它可以任选地被一个或多个取代基，例如一个或两个取代基取代，所述取代基选自烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、卤基、氰基、酰基、氨基、经取代的氨基、酰氨基、-or(其中r是氢、烷基、烯基、环烷基、酰基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基)，或-s(o)nr[其中n为0至2的整数且r为氢(条件是n为0)、烷基、烯基、环烷基、氨基、杂环、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基]。
[0061]
术语“氧酰基氨基”或“氨基羰氧基”是指基团-oc(o)nrr，其中每个r独立地为氢、烷基、经取代的烷基、芳基、杂芳基或杂环，其中烷基、经取代的烷基、芳基、杂芳基和杂环如本文所定义。
[0062]
术语“硫醇”是指基团-sh。
[0063]
术语“硫代烷氧基”或“烷硫基”是指基团-s-烷基。
[0064]
术语“经取代的硫代烷氧基”是指基团-s-经取代的烷基。
[0065]
术语“硫代芳氧基”是指基团芳基-s-，其中芳基如以上所定义，包括也如以上所定义的任选取代的芳基。
[0066]
术语“硫代杂芳氧基”是指基团杂芳基-s-，其中杂芳基如以上所定义，包括也如以上所定义的任选取代的芳基。
[0067]
至于任何上述含有一个或多个取代基的基团，当然应理解，此类基团不含任何空间上不切实际和/或合成上不可行的取代或取代模式。另外，实施方案的化合物包括由这些化合物的取代产生的所有立体化学异构体。
[0068]
术语“药学上可接受的盐”是指保留生物有效性并且不是生物学或其他方面不希望的盐。在许多情况下，实施方案的化合物能够由于氨基和/或羧基或与之类似的基团的存在而形成酸式盐和/或碱式盐。
[0069]
药学上可接受的碱加成盐可以由无机碱和有机碱制备。仅举例而言，衍生自无机碱的盐包括钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐和镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐，诸如烷基胺、二烷基胺、三烷基胺、经取代的烷基胺、二(经取代的烷基)胺、三(经取代的烷基)胺、烯基胺、二烯基胺、三烯基胺、经取代的烯基胺、二(经取代的烯基)胺、三(经取代的烯基)胺、环烷基胺、二(环烷基)胺、三(环烷基)胺、经取代的环烷基胺、二取代的环烷基胺、三取代环烷基胺、环烯基胺、二(环烯基)胺、三(环烯基)胺、经取代环烯基胺、二取代的环烯基胺、三取代环烯基胺、芳基胺、二芳基胺、三芳基胺、杂芳基胺、二杂芳基胺、三杂芳基胺、杂环胺、二杂环胺、三杂环胺、混合的二胺和三胺，其中胺上的至少两个取代基是不同的并且选自烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、杂芳基、杂环等。还包括其中两个或三个取代基与氨基氮一起形成杂环基团或杂芳基的胺。仅举例而言，合适的胺的实例包括异丙胺、三甲胺、二乙胺、三(异丙)胺、三(正丙)胺、乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、氨丁三醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因(procaine)、海巴胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、n-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、吗啉、n-乙基哌啶等。
[0070]
药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸和有机酸制备。衍生自无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等的盐。衍生自有机酸的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等的盐。
[0071]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可在本文中互换用于指任何长度的氨基酸聚合物。这些术语还涵盖已被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、磷酸化或与标记组分缀合。
[0072]
一个多肽与另一个多肽具有一定的“序列同一性”百分比，这意指当比对时，在比较两个序列时相同的碱基或氨基酸的百分数。可以许多不同方式确定序列相似性。为了确
定序列同一性，可以使用可在万维网ncbi.nlm.nih.gov/blast/获得的方法和计算机程序(包括blast)比对序列。另一种比对算法是fasta，可在美国威斯康星州麦迪逊(madison,wisconsin,usa，它是牛津分子集团公司(oxford molecular group,inc.)的全资子公司)的遗传学计算小组(gcg)包中获得。在methods in enzymology，第266卷：computer methods for macromolecular sequence analysis(1996)，doolittle编辑，美国加利福尼亚州圣地亚哥学术出版社(academic press,inc.)(哈考特布莱斯公司(harcourt brace&co.)分部)中描述了其他比对技术。特别感兴趣的是允许序列中存在空位的比对程序。smith-waterman是一种容许序列比对中存在空位的算法。参见meth.mol.biol.70:173-187(1997)。此外，使用needleman和wunsch比对方法的gap程序可用于比对序列。参见j.mol.biol.48:443-453(1970)。
[0073]
感兴趣的是使用smith waterman的局部同源算法(advances in applied mathematics 2:482-489(1981)以确定序列同一性的bestfit程序。空位产生罚分通常范围将为1至5，通常为2至4并且在许多实施方案中为3。空位延伸罚分通常范围将为约0.01至0.20，在许多情况下将为0.10。该程序具有由输入的待比较序列确定的默认参数。可以使用程序确定的默认参数确定序列同一性。该程序也可从美国威斯康星州麦迪逊的遗传学计算小组(gcg)包中获得。
[0074]
另一个感兴趣的程序是fastdb算法。fastdb在current methods in sequence comparison and analysis,macromolecule sequencing and synthesis,selected methods and applications,第127-149页,1988,alan r.liss,inc.中进行了描述。百分比序列同一性由fastdb基于以下参数计算：
[0075]
错配罚分:1.00；
[0076]
空位罚分:1.00；
[0077]
空位大小罚分:0.33；和
[0078]
连接罚分:30.0。
[0079]
术语“接头”或“连键”是指连接两个基团并具有长度为100个原子或更短的骨架的连接部分。接头或连键可以是连接两个基团的共价键或长度为1至100个原子的链，例如长度为1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20个或更多个碳原子的链的共价键，其中接头可以是直链、支链、环状或单个原子。在一些情况下，接头是支化接头，支化接头是指连接三个或更多个基团的连接部分。在某些情况下，接头骨架的一个、两个、三个、四个或五个或更多个碳原子可以任选地被硫、氮或氧杂原子取代。在一些情况下，接头骨架包括连接官能团，诸如醚、硫醚、氨基、酰胺、磺酰胺、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、脲、硫脲、酯、硫酯或亚胺。骨架原子之间的键可以是饱和的或不饱和的，并且在一些情况下，接头骨架中存在不超过一个、两个或三个不饱和键。接头可以包括一个或多个取代基，例如具有烷基、芳基或烯基。接头可以包括但不限于聚乙二醇；醚、硫醚、叔胺、烷基，这些可以是直链或支链的，例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)等。接头骨架可以包括环状基团，例如芳基、杂环或环烷基，其中环状基团的2个或更多个原子，例如2、3或4个原子包括在骨架中。接头可以是可切割的或不可切割的。
[0080]
术语“聚环氧乙烷”、“peo”、“聚乙二醇”和“peg”可互换使用，并且是指包括用式
‑‑
(ch2‑‑
ch2‑‑o‑‑
)
n-描述的链的聚合基团或其衍生物。在一些实施方案中，“n”为5000或更
小，例如1000或更小，500或更小，200或更小，100或更小，50或更小，40或更小，30或更小，20或更小，15或更小，例如3至15，或10至15。
[0081]
术语“视网膜细胞”在本文中可以指构成视网膜的任何细胞类型，诸如视网膜神经节细胞；无长突细胞；水平细胞；双极细胞；和光感受器细胞，包括视杆细胞和视锥细胞。
[0082]
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白、保留与抗原(例如，与靶配体结合多肽)特异性结合的抗体片段(包括但不限于fab、fv、scfv和fd片段)、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体(scab)、单结构域抗体(sdab)、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体、纳米抗体、双特异性抗体、多特异性抗体，以及包含抗体的抗原结合(本文也称为抗原结合)部分和非抗体蛋白的融合蛋白。该术语还涵盖fab'、fv、f(ab')2和/或保留与抗原的特异性结合的其他抗体片段，以及单克隆抗体。
[0083]
如本文所用，术语“纳米抗体”(nb)是指衍生自天然存在的重链抗体的最小抗原结合片段或单个可变结构域(v
hh
)，并且是本领域技术人员已知的。它们源自骆驼科动物中所见的仅重链的抗体。在“骆驼科动物”家族中发现了没有多肽轻链的免疫球蛋白。“骆驼科动物”包括旧世界骆驼科动物(双峰骆驼(camelus bactrianus)和单峰骆驼(camelus dromedarius))和新世界骆驼科动物(例如，美洲驼(llama paccos)、大羊驼(llama glama)、原驼(llama guanicoe)和小羊驼(llama vicugna))。单可变结构域重链抗体在本文中称为纳米抗体或v
hh
抗体。
[0084]
软骨鱼类也具有重链抗体(ignar；“免疫球蛋白新抗原受体”)，从中可以获得称为v
nar
片段的单结构域抗体。因此，在某些情况下，亲和剂是ignar。
[0085]“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双链抗体；线性抗体(zapata等人(1995)protein eng.8(10):1057-1062)；结构域抗体(dab；holt等人(2003)trends biotechnol.21:484)；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的称为“fab”片段的抗原结合片段(每个片段均具有单个抗原结合位点)和残留的“fc”片段(反映能够容易结晶的名称)。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的f(ab')2片段。抗体片段包括例如scfv、sdab、dab、fab、fab'、fab'2、f(ab')2、fd、fv、feb和smip。sdab的实例是骆驼vhh和软骨鱼vnar。
[0086]“fv”是含有完全的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在这种构型中，每个可变结构域的三个互补决定区(cdr)相互作用以限定v
h-v
l
二聚体表面上的抗原结合位点。六个cdr共同对抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原有特异性的三个cdr的半个fv)也具有识别和结合抗原的能力，但是亲和力低于整个结合位点。
[0087]“单链fv”或“sfv”或“scfv”抗体片段包含抗体的vh和v
l
结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。在一些实施方案中，fv多肽还包含介于vh和v
l
结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得sfv能够形成抗原结合所需的结构。sfv的综述，参见pluckthun，于the pharmacology of monoclonal antibodies中，第113卷，rosenburg和moore编辑，springer-verlag,new york，第269-315页(1994)。
[0088]
术语“双链抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含重链可
变结构域(vh)，其与同一多肽链中的轻链可变结构域(v
l
)连接(v
h-v
l
)。通过使用太短而不允许同一链上两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双链抗体在例如ep 404,097；wo 93/11161；和hollinger等人(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-6448中有更全面的描述。
[0089]
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等指获得期望的药理和/或生理效应。所述效应就完全或部分预防疾病或其症状而言，可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的副作用而言，可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防所述疾病在可易患所述疾病或处于获得所述疾病的风险中但尚未诊断为患有所述疾病的受试者中发生；(b)抑制所述疾病，即阻止其发展；或(c)减轻所述疾病，即引起所述疾病消退；以及(d)代替由所述疾病引起丧失的功能。
[0090]
在本文中可互换使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于鼠科动物(大鼠、小鼠)、非人灵长类动物、人、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如，马科动物、牛科动物、绵羊科动物、猪科动物、山羊科动物)、兔类动物等。在一些情况下，个体是人。在一些情况下，个体是非人灵长类动物。在一些情况下，个体是啮齿动物，例如大鼠或小鼠。在一些情况下，个体是兔类动物，例如兔。
[0091]
术语“视网膜细胞”在本文中可以指构成视网膜的任何细胞类型，诸如视网膜神经节细胞；无长突细胞；水平细胞；双极细胞；光感受器细胞，包括视杆细胞和视锥细胞；缪勒氏胶质细胞；星形胶质细胞(例如，视网膜星形胶质细胞)；和视网膜色素上皮。
[0092]“aav”是腺相关病毒的缩写，并且可用于指病毒本身或其衍生物。除非另有要求，否则该术语涵盖所有亚型以及天然存在的形式和重组形式。缩写“raav”是指重组腺相关病毒，也称为重组aav载体(或"raav载体")。术语“aav”包括aav 1型(aav-1)、aav 2型(aav-2)、aav 3型(aav-3)、aav 4型(aav-4)、aav 5型(aav-5)、aav 6型(aav-6)、aav 7型(aav-7)、aav 8型(aav-8)、aav 9型(aav-9)、aav 10型(aav-10)、aav 11型(aav-11)、禽aav、牛aav、犬aav、马aav、灵长类aav、非灵长类aav和绵羊aav。参见，例如，mori等人(2004)virology 330:375。术语“aav”还包括嵌合aav。“灵长类aav”是指从灵长类动物中分离的aav，“非灵长类aav”是指从非灵长类哺乳动物中分离的aav，“牛aav”是指从牛类哺乳动物(例如，牛)中分离的aav，等等。
[0093]
如本文所用，“raav载体”是指包含非aav来源的多核苷酸(即，与aav异源的多核苷酸)的aav载体，例如，其中异源多核苷酸包含编码对于细胞的遗传转化而言感兴趣的基因产物(多肽或多核苷酸)的核苷酸序列。一般而言，异源多核苷酸的侧翼是至少一个，且通常是两个aav末端反向重复序列(itr)。术语raav载体涵盖raav载体颗粒和raav载体质粒两种。
[0094]“aav病毒”或“aav病毒颗粒”或“raav载体颗粒”是指由至少一种aav衣壳蛋白(通常由野生型aav的所有衣壳蛋白)和衣壳化多核苷酸aav载体组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即除野生型aav基因组以外的多核苷酸，诸如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则典型地将其称为“raav载体颗粒”或简称为“raav载体”。因此，raav颗粒的产生必然包括raav载体的产生，因为此类载体包含在raav颗粒内。
[0095]
在进一步描述本发明前，应理解本发明不限于描述的特定实施方案，因此当然可
以发生变化。还应该理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的并且不旨在为限制性的，因为本发明的范围将仅被所附权利要求所限制。
[0096]
在提供值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另外明确指出，否则介于该范围上限与下限之间的每个居间值(至下限单位的十分之一)以及该规定范围内的任何其他规定值或居间值均涵盖在本发明的范围内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内并且也涵盖在本发明内，以规定范围内任何明确排除的限值为条件。在规定范围包括限值中的一个或两个的情况下，排除那些所包括的限值中的一个或两个的范围也包括在本发明内。
[0097]
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在实践或测试本发明中也可使用与本文描述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用方式并入本文以公开和描述与所引述的出版物相关的方法和/或材料。
[0098]
必须注意，如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述(该)”包括复数指示物。因此，例如，提到“一种缀合物”包括多种此类缀合物并且提到“所述可光致异构部分”包括提到一种或多种可光致异构部分及其本领域技术人员已知的等效物，等等。还应注意，权利要求可以被草拟为排除任何任选要素。同样，该声明旨在作为与权利要求要素的叙述一起使用此类排他性术语如“只”、“仅”等，或使用“否定性”限制的前置基础。
[0099]
应了解为清楚起见，在单独实施方案的上下文中描述的所发明的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。相反，为了简明起见而在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征还可分开提供或以任何合适的子组合形式提供。关于本发明的实施方案的所有组合被明确地包括在本发明中并公开于本文中，就如同每个和每一个组合被单独且明确地公开。另外，各种实施方案的所有子组合及其要素也被明确地包括在本发明中并在本文公开，就如同每个和每一个此类子组合单独且明确地在本文公开。
[0100]
本文所论述的公布仅针对它们在本技术提交日之前的公开内容而提供。本文的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于此类出版物。此外，所提供的公布日期可不同于可能需要独立地证实的实际公布日期。
具体实施方式
[0101]
本公开提供了一种缀合物，其包含：i)靶配体结合多肽；或ii)与靶配体结合多肽结合的多肽；b)支链接头；和c)两个或更多个可光致异构调控因子，其中所述两个或更多个可光致异构调控因子中的每一个独立地包含：i)可光致异构基团；和ii)与靶配体结合多肽结合的配体。本公开提供了包含本公开的缀合物的系统和组合物。本公开提供了使用本公开的缀合物来调节靶多肽的活性和调节靶细胞或细胞群的活性的方法。
[0102]
光控开关缀合物
[0103]
本公开提供了一种缀合物，其包含：a)亲和剂，所述亲和剂特异性结合：i)靶配体结合多肽；或ii)与靶配体结合多肽结合的多肽；b)支链接头；和c)两个或更多个可光致异构调控因子，其中所述两个或更多个可光致异构调控因子中的每一个独立地包含：i)可光
致异构基团；和ii)与靶配体结合多肽结合的配体。本公开的缀合物在本文中也称为“亲和标记的光控开关”。可光致异构调控因子在本文中也称为“光控开关”。
[0104]
本公开的缀合物调节靶配体结合多肽的活性。缀合物中的每个可光致异构调控因子可以独立地与靶配体结合多肽相互作用，并且每个可光致异构调控因子中存在的配体能够以受光控制的方式与靶配体结合多肽中的配体结合位点结合。根据诸如配体、可光致异构调控因子的设计和光的波长等因素，本公开的缀合物可以增加或降低靶配体结合多肽的活性，可以调节(增加或降低)它对其他刺激的敏感性，可以将靶配体结合多肽稳定在特定构象，或者可以诱导靶配体结合多肽的构象变化。
[0105]
本公开的缀合物中存在的亲和剂与靶配体结合多肽结合，从而使缀合物中存在的配体与靶配体结合多肽接近，使得配体之一可以光依赖性方式与靶配体结合多肽中的配体结合位点结合。当本公开的缀合物与靶配体结合多肽结合时，靶配体结合多肽变成光调控多肽。
[0106]
光调控多肽所暴露的光的波长和/或强度的变化(δλ)导致配体与光调控多肽的配体结合位点的结合变化，例如导致本公开的缀合物的配体部分之一与光调控多肽的配体结合位点的结合变化。“光调控多肽所暴露的光的波长的变化”包括：1)从λ1变为λ2；2)从λ2变为λ1；3)从λ1变为黑暗(无光)；4)从黑暗变为λ1。还考虑到了从λ1到λ2，然后从λ2到λ1并返回的重复变化，例如从第一波长切换到第二波长，并再次重复返回。还考虑到了从光明到黑暗、从黑暗到光明等的重复变化。
[0107]
如上所述，本公开的缀合物包括：a)亲和剂；b)支链接头；和c)两个或更多个可光致异构调控因子。在根据本公开的缀合物中，支链接头将亲和剂连接到所述两个或更多个可光致异构调控因子。例如，支链接头可以是介于亲和剂与所述两个或更多个可光致异构调控因子之间的接头，其中支链接头包括两条或更多条臂，诸如3条或更多条臂、4条或更多条臂、5条或更多条臂、6条或更多条臂、7条或更多条臂、8条或更多条臂、9条或更多条臂或者10条或更多条臂。支链接头的每条臂可以附接到可光致异构调控因子上。本公开的缀合物的实施方案可以包括两个或更多个可光致异构调控因子，诸如3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或者10个或更多个通过支链接头连接到亲和剂的可光致异构调控因子。如上所述，缀合物中的每个可光致异构调控因子包括与靶配体结合多肽结合的配体。相应地，本公开的缀合物可以包括两个或更多个配体，诸如3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或者10个或更多个通过支链接头连接到亲和剂的配体。例如，在一些实施方案中，支链接头可以包括两条臂，其中每条臂连接到可光致异构调控因子。在这些实施方案中，亲和剂连接到所述两个可光致异构调控因子中的每一个，因此通过支链接头的单独臂连接到所述两个配体中的每一个。在其他实施方案中，支链接头可以包括四条臂，其中每条臂连接到可光致异构调控因子。在这些实施方案中，亲和剂连接到所述四个可光致异构调控因子中的每一个，因此通过支链接头的单独臂连接到所述四个配体中的每一个。
[0108]
在一些情况下，波长的变化(从λ1到λ2；从光明到黑暗；或从黑暗到光明)导致配体之一与配体结合位点的结合变化。如本文所用，“配体与配体结合位点的结合变化”或“配体之一与配体结合位点的结合变化”包括结合增加和结合减少。如本文所用，“结合增加”包括
以下一项或多项：缀合物中的可光致异构调控因子中的配体之一与配体结合位点结合的可能性增加；一种或多种配体对配体结合位点的结合亲和力增加；配体结合位点处配体局部浓度增加；以及配体结合位点中配体之一的占用率增加。如本文所用，“结合减少”包括以下一项或多项：缀合物中的可光致异构调控因子中的配体之一与配体结合位点结合的可能性降低；一种或多种配体对配体结合位点的结合亲和力降低；配体结合位点处配体局部浓度降低；以及配体结合位点中配体之一的占用率降低。如本文所用，术语“波长变化”(本公开调控因子的缀合物所暴露的“波长变化”或受体/合成光调控因子复合物所暴露的“波长变化”)是指波长从λ1到λ2的变化；从光明到黑暗的变化；或者从黑暗到光明的变化。结合的增加包括增加约10％至约20％、约20％至约50％、约50％至约2倍、约2倍至约5倍、约5倍至约10倍、约10倍至约50倍、约50倍至约102倍、约102倍至约104倍、约104倍至约106倍、约106倍至约108倍，或结合增加大于108倍。结合的减少包括减少约5％至约10％至约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％，或结合减少约90％至100％。
[0109]
例如，在一些情况下，缀合物的配体在第一光波长下具有与配体结合位点结合的第一概率；配体在第二光波长下具有与配体结合位点结合的第二概率；并且第二概率低于第一概率。在其他情况下，缀合物的配体在第一光波长下具有与配体结合位点结合的第一概率；配体在第二光波长下具有与配体结合位点结合的第二概率；并且第二概率高于第一概率。在其他情况下，缀合物的配体在暴露于光时具有与配体结合位点结合的第一概率；配体在不存在光的情况下(例如，在黑暗中)具有与配体结合位点结合的第二概率；并且第二概率低于第一概率。在其他情况下，缀合物的配体在暴露于光时具有与配体结合位点结合的第一概率；配体在不存在光的情况下具有与配体结合位点结合的第二概率并且第二概率高于第一概率。
[0110]
在一些实施方案中，因为本公开的缀合物包括两个或更多个可光致异构调控因子，并且因此包括两个或更多个配体，所以配体与配体位点结合的概率高于仅具有一个可光致异构调控因子，并因此仅具有一个配体的缀合物。由于本公开的缀合物包括两个或更多个可光致异构调控因子，因此接近配体结合位点的配体局部浓度与仅具有一个可光致异构调控因子并因此仅具有一个配体的缀合物相比，可能更高。本公开的缀合物的配体在配体结合位点附近的局部浓度增加可引起如上所述的结合增加。
[0111]
本公开的缀合物的配体在光调控多肽中的配体结合位点处的局部浓度很高。例如，本公开的缀合物的配体在主题光调控多肽中的配体结合位点处的局部浓度范围为约500nm至约50mm，例如约500nm至约10mm、约750nm至约1mm、约1μm至约750μm、约10μm至约500μm、约10μm至约250μm、约50μm至约200μm或约50μm至约150μm，诸如约100μm。在一些实施方案中，本公开的缀合物的配体在主题光调控多肽中的配体结合位点处的局部浓度范围为约500nm至约50mm，例如约500nm至约750nm、约750nm至约1mm、约1mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约20mm、约20mm至约30mm或约30mm至约50mm。
[0112]
波长变化引起配体与配体结合位点结合或更高亲和力的配体与配体结合位点结合
[0113]
在一些情况下，光调控多肽所暴露的光的波长变化引起本公开的缀合物的一种或多种配体对光调控多肽的配体结合位点的结合亲和力增加。例如，在一些情况下，光调控多
肽所暴露的光的波长变化引起结合亲和力增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约250倍、至少约500倍、至少约103倍、至少约5x103倍、至少约104倍、至少约5x104倍或更多。
[0114]
在配体是激动剂的情况下，波长的变化在一些情况下会导致光调控多肽的活化。在配体是激动剂的情况下，波长的变化在某些情况下会导致光调控多肽的减敏。相反，在配体是拮抗剂的情况下，波长的变化在一些情况下会导致对光调控多肽活化的阻断，例如，阻断游离激动剂活化光调控多肽的能力。在配体是阻断剂(例如，离子通道，或与其他生物大分子诸如多肽或核酸结合的相互作用结构域的孔隙阻断剂)的情况下，波长的变化在一些情况下会导致对多肽活性的阻断。
[0115]
以另一种方式表达，在配体是激动剂的情况下，并且在光调控多肽所暴露的光的波长变化引起缀合物的配体部分对光调控多肽的配体结合位点的更高结合亲和力的情况下，波长的变化引起从非活性状态到活性状态或到减敏状态的转变。在配体是拮抗剂的情况下，波长的变化导致从响应状态到无响应状态的转变。在配体是阻断剂的情况下，波长的变化导致从活性状态到非活性状态的转变。
[0116]
波长的变化导致配体从配体结合位点移除，或结合亲和力降低
[0117]
在一些情况下，光调控多肽所暴露的光的波长变化导致本公开的缀合物的配体从光调控多肽的配体结合位点移除，例如，配体不与配体结合位点结合。在一些情况下，光调控多肽所暴露的光的波长变化导致本公开的缀合物的一种或多种配体对光调控多肽的配体结合位点的结合亲和力降低，例如，配体对配体结合位点的结合亲和力降低。例如，在一些情况下，光调控多肽所暴露的光的波长变化导致结合亲和力降低至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多。
[0118]
在配体是激动剂的情况下，波长的变化在一些情况下会导致光调控多肽的活化。在配体是激动剂的情况下，波长的变化在一些情况下会导致光调控多肽的失活。在配体是激动剂的情况下，波长的变化在一些情况下会导致光调控多肽从减敏中恢复。相反，在配体是拮抗剂的情况下，波长的变化在一些情况下会导致配体结合位点的占用和多肽背景活性的降低，或者可替代地，受生理刺激活化的损失。在配体是拮抗剂的情况下，波长的变化在一些情况下会导致拮抗作用的去除以容许受生理刺激的活化。在配体是负向变构调节剂时，导致结合的波长变化可引起对另一种刺激的敏感性或另一种刺激的功效增加。在配体是正向变构调节剂时，导致结合的波长变化可引起对另一种刺激的敏感性或另一种刺激的功效降低。在一些情况下，配体结合位点将是这样的调节位点，其中配体的结合增加或降低对另一种刺激的敏感性或另一种刺激的功效，使得光通过控制光控开关调控因子的结合来调控该过程。在一些情况下，配体是多肽活性位点的阻断剂(例如，离子通道或与其他生物大分子诸如多肽或核酸结合的相互作用结构域的孔隙阻断剂，或酶活性位点的阻断剂)，并且波长的变化导致对多肽活性的阻断或解除阻断，以防止或容许受体正常发挥作用。
[0119]
以另一种方式表达，在配体是激动剂的情况下，并且在光调控多肽所暴露的光的波长变化引起本公开的缀合物的配体从光调控多肽的配体结合位点移除(或者不结合)的情况下，波长的变化引起从高活性状态到低活性状态或从减敏状态到响应性状态的转变。
在配体是负向变构调节剂时，导致未结合的波长变化引起对另一种刺激的敏感性或另一种刺激的功效增加。在配体是正向变构调节剂时，导致未结合的波长变化引起对另一种刺激的敏感性或另一种刺激的功效降低。在配体是拮抗剂的情况下，导致未结合的波长变化引起从无响应状态到响应状态或从非活性状态到具有一顶背景“基础”(未配体的)活性的状态的转变。在配体是阻断剂的情况下，导致未结合的波长变化引起从非活性状态到活性状态的转变。
[0120]
亲和剂
[0121]
本公开的缀合物中存在的亲和剂通过与靶配体结合多肽直接结合或通过与结合靶配体结合多肽的多肽结合，或通过与和靶配体结合多肽融合表达的融合伴侣结合将可光致异构调控因子靶向至靶配体结合多肽。
[0122]
在一些情况下，亲和剂与靶配体结合多肽特异性结合。因此，例如，在一些情况下，亲和剂以至少10-6
m、至少10-7
m、至少10-8
m、至少10-9
m或至少10-10
m的亲和力与靶配体结合多肽结合。在一些情况下，亲和剂与靶配体结合多肽直接结合。在一些情况下，亲和剂与结合靶配体结合多肽的多肽结合。
[0123]
合适的亲和剂包括但不限于与自标记多肽结合的试剂；抗体；适体；肽；和小分子。
[0124]
与自标记多肽结合的试剂
[0125]
合适的亲和剂包括核苷碱基衍生物。在一些情况下，核苷碱基衍生物的核苷碱基选自鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤。例如，核苷碱基衍生物的核苷碱基可以是鸟嘌呤、黄嘌呤或次黄嘌呤。在一些情况下，核苷碱基衍生物的核苷碱基是鸟嘌呤。在其他情况下，核苷碱基衍生物的核苷碱基可以是胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。在一些情况下，核苷碱基衍生物的核苷碱基是胞嘧啶。核苷碱基可以被衍生化以提供本公开的缀合物的亲和剂的核苷碱基衍生物。在一些情况下，亲和剂的核苷碱基衍生物是苄基核苷碱基，诸如苄基鸟嘌呤或苄基胞嘧啶。在一些情况下，亲和剂是苄基鸟嘌呤。在亲和剂是苄基鸟嘌呤的实施方案中，苄基鸟嘌呤亲和剂可以提供与snap标签的共价结合。在一些情况下，亲和剂是苄基胞嘧啶。在亲和剂是苄基胞嘧啶的实施方案中，苄基胞嘧啶亲和剂可以提供与clip标签的共价结合。在一些情况下，亲和剂是氯嘧啶；氯嘧啶可以与snap标签结合。
[0126]
合适的亲和剂还包括烷基衍生物，诸如卤代烷基衍生物，其中烷基或烷基衍生物中的一个或多个氢原子被卤素例如氟、氯或溴置换。在一些情况下，卤代烷基衍生物是氟烷烃。在一些情况下，卤代烷基衍生物是氯烷烃。在一些情况下，卤代烷基衍生物是溴烷烃。在一些情况下，亲和剂是氯烷烃，诸如cl(ch2)6(och2ch2)2。在亲和剂是氯烷烃的实施方案中，氯烷烃亲和剂可以提供与halo标签的共价结合。
[0127]
抗体
[0128]
在一些情况下，本公开的缀合物中存在的亲和剂是抗体。在一些情况下，适合包含在本公开的缀合物中的抗体与靶配体结合多肽结合。下面提供了靶配体结合多肽的实例。适合包含在本公开的缀合物中的抗体不抑制可光致异构调控因子中存在的配体与靶配体结合多肽的结合。通常，适合包含在本公开的缀合物中的抗体基本上不改变靶配体结合多肽的活性。在一些情况下，亲和剂是单链fv(scfv)。在一些情况下，亲和剂是纳米抗体。
[0129]
在一些情况下，亲和剂是与靶配体结合多肽特异性结合的抗体，其中靶配体结合多肽选自转录调控因子、离子通道、阳离子通道、配体门控离子通道、电压门控离子通道、群
体感应因子、信息素受体、神经递质受体、g蛋白偶联受体和酶。
[0130]
在一些情况下，亲和剂是与靶配体结合多肽特异性结合的抗体，其中靶配体结合多肽选自钾通道、钠通道或钙通道。
[0131]
在一些情况下，亲和剂是与靶配体结合多肽特异性结合的抗体，其中所述靶配体结合多肽选自谷氨酸受体、促代谢型谷氨酸受体(mglur)、离子型谷氨酸受体(例如，红藻氨酸受体；ampa受体；nmda受体)、离子型烟碱型乙酰胆碱受体、离子型gaba-a受体、促代谢型gaba-b受体、促代谢型多巴胺受体、离子型嘌呤能p2x受体、促代谢型嘌呤能p2y受体、促代谢型血清素受体、离子型血清素受体、离子型甘氨酸受体、阳离子通道、钾通道、钙通道、钠通道、质子通道、阴离子通道和氯通道。在一些情况下，亲和剂是与促代谢型谷氨酸受体特异性结合的抗体，其中促代谢型谷氨酸受体包括例如mglur2、mglur3、mglur5、mglur6等。
[0132]
作为一个非限制性实例，亲和剂是与mglur2特异性结合的scfv。作为另一个非限制性实例，亲和剂是与mglur2特异性结合的纳米抗体。作为另一个非限制性实例，亲和剂是与mglur3特异性结合的scfv。作为另一个非限制性实例，亲和剂是与mglur3特异性结合的纳米抗体。作为另一个非限制性实例，亲和剂是与mglur5特异性结合的scfv。作为另一个非限制性实例，亲和剂是与mglur5特异性结合的纳米抗体。作为另一个非限制性实例，亲和剂是与mglur6特异性结合的scfv。作为另一个非限制性实例，亲和剂是与mglur6特异性结合的纳米抗体。
[0133]
小分子
[0134]
适合用作本公开的缀合物中的亲和剂的小分子包括分子量小于2kda、小于1kda、小于500道尔顿、小于250道尔顿、小于200道尔顿、小于100道尔顿、小于75道尔顿或小于50道尔顿的小分子。例如，适合用作本公开的缀合物中的亲和剂的小分子可具有10道尔顿至2kda，例如10道尔顿至25道尔顿、25道尔顿至50道尔顿、50道尔顿至100道尔顿、100道尔顿至150道尔顿、150道尔顿至250道尔顿、250道尔顿至500道尔顿、500道尔顿至1kda或1kda至2kda的分子量。
[0135]
适合用作本公开的缀合物中的亲和剂的小分子通常不是靶配体结合多肽的配体。适合用作本公开的缀合物中的亲和剂的小分子通常在除配体所结合的位点以外的位点与靶配体结合多肽结合，并且基本上不抑制配体与靶配体结合多肽的结合。
[0136]
适体
[0137]
适合用作亲和剂的适体包括rna适体、dna适体和肽适体。适合包含在本公开的缀合物中的适体不抑制可光致异构调控因子中存在的配体与靶配体结合多肽的结合。通常，适合包含在本公开的缀合物中的适体基本上不改变靶配体结合多肽的活性。
[0138]
核酸适体可具有约10个核苷酸至约200个核苷酸，例如10个核苷酸(nt)至15nt、10nt至15nt、15nt至20nt、20nt至25nt、25nt至50nt、50nt至75nt、75nt至100nt、100nt至150nt或150nt至200nt的长度。核酸适体可具有约10个核苷酸至约50个核苷酸的长度。核酸适体可具有约10个核苷酸至约25个核苷酸的长度。
[0139]
可以使用任何已知的方法制备dna适体。例如，可以使用dna-selex方法。在selex方法中，通过增加轮数或使用竞争性物质来设置严格的选择条件，浓缩并选择对靶多肽表现出更强结合潜力的适体。因此，通过调整selex的轮数和/或改变竞争条件，可以获得具有不同结合力的适体，具有不同结合模式的适体，以及具有相同结合力或结合模式但具有不
同碱基序列的适体。selex方法包括通过聚合酶链式反应进行扩增的过程；通过在该过程中使用锰离子等引起突变，可以进行具有更高多样性的selex。可以使用标准技术产生对多肽(或多肽的一部分)具有特异性的适体，这些技术例如在ogawa,a.等人，bioorg.med.chem,lett,14:4001-4004,2004；和jayasena,s.d.,clinical chemistry 45:1628-1650,1999中描述的那些。
[0140]
核酸适体可以包括天然存在的核苷酸，也可以包括非天然存在的核苷酸。仅包括天然存在的核苷酸的dna适体包括由具有任何天然碱基即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸组成的dna适体。仅包括天然存在的核苷酸的rna适体包括由具有任何天然碱基即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的核糖核苷酸组成的rna组成的rna适体。非天然存在的核苷酸包含非天然存在的碱基、磷酸基团和糖。非天然存在的碱基(或“人工碱基”)是指人工构建的碱基类似物，其具有与构成天然核苷酸的天然碱基相似的特性，并且可以与其伴侣碱基类似物(称为“互补人工碱基”)形成人工碱基配对，如同在天然碱基中一样。术语“人工碱基配对”是指在一对互补人工碱基之间形成的碱基配对，如同在一对互补的天然碱基即腺嘌呤和胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶或鸟嘌呤和胞嘧啶中一样。人工碱基配对包括经由在天然碱基之间的碱基配对中发现的氢键的化学键、经由人工碱基之间基于分子结构的缔合的物理键以及经由疏水相互作用的堆叠效应。
[0141]
适体可以修饰为包含一个或多个部分，诸如：2'-o-甲基部分；2
’‑
nh2部分；等等。
[0142]
结合多种多肽的适体是本领域已知的。例如，适体数据库可在互联网www(dot)aptagen(dot)com/aptamer-index/aptamer-list获得。另外，如上所述，本领域技术人员可以容易地设计结合感兴趣的靶配体结合多肽的适体。
[0143]
支链接头
[0144]
如上所述，本公开的缀合物包括：a)亲和剂；b)支链接头；和c)两个或更多个可光致异构调控因子。支链接头是将亲和剂连接到缀合物的两个或更多个可光致异构调控因子的接头。因此，支链接头可以连接到亲和剂并且可以包括两条或更多条臂，每条臂独立地包含可光致异构调控因子。例如，支链接头可以在第一末端连接到亲和剂并且可以在第二末端包括两条或更多条臂，其中所述两条或更多条臂中的每一条臂独立地连接到可光致异构调控因子。在一些情况下，支链接头包括两条或更多条臂，诸如3条或更多条臂、4条或更多条臂、5条或更多条臂、6条或更多条臂、7条或更多条臂、8条或更多条臂、9条或更多条臂或10条或更多条臂，其中每条臂独立地连接到可光致异构调控因子。此外，如上所述，本发明的缀合物的每个可光致异构调控因子包括可光致异构基团。因此，支链接头可包括两条或更多条臂，诸如3条或更多条臂、4条或更多条臂、5条或更多条臂、6条或更多条臂、7条或更多条臂、8条或更多条臂、9条或更多条臂或10条或更多条臂，其中每条臂独立地连接到可光致异构基团。另外，如上所述，本公开的缀合物的每个可光致异构调控因子包括与靶配体结合多肽结合的配体。因此，支链接头可包括两条或更多条臂，诸如3条或更多条臂、4条或更多条臂、5条或更多条臂、6条或更多条臂、7条或更多条臂、8条或更多条臂、9条或更多条臂或10条或更多条臂，其中每条臂独立地包含配体。在一些情况下，支链接头包括两条臂。在一些情况下，支链接头包括四条臂。而且，在一些情况下，本公开的缀合物的支链接头将包含4-10条臂，或4-9条臂，或4-8条臂，或4-7条臂，或4-6条臂，或4-5条臂，或5-10条臂，或5-9条臂，或5-8条臂，或5-7条臂，或5-6条臂，或6-10条臂，或6-9条臂，或6-8条臂，或6-7条臂，
其中每条臂独立地包含配体。在其他更具体的实施方案中，本公开的缀合物的支链接头将包含4条臂，其中每条臂独立地包含与感兴趣的靶配体结合多肽结合的配体。
[0145]
本公开的缀合物的支链接头可以是任何合适的支链接头，其将亲和剂连接至所述两个或更多个可光致异构调控因子。支链接头可以包括合适的官能团，其为亲和剂和相应的可光致异构调控因子提供方便的连接化学性质。例如，可以使用任何类型的官能团将支链接头连接到亲和剂和/或可光致异构调控因子，诸如但不限于酰胺、醚、胺、酯官能团等。在一些实施方案中，酰胺官能团在支链接头于亲和剂和/或可光致异构调控因子之间提供方便的连接化学性质。
[0146]
在一些情况下，支链接头包含式(bl)的部分：
[0147][0148]
其中n是1至10的整数。
[0149]
在一些情况下，亲和剂在所述部分的左侧附接至式(bl)的支链接头，即在波浪线指示的位置附接至所述部分左侧的酰胺基团。如以上所讨论的，本公开的支链接头可以包括两条或更多条臂，其中每条臂连接到单独的可光致异构调控因子。在一些情况下，n为1并且支链接头附接到2个可光致异构调控因子。在一些情况下，n为2并且支链接头附接到3个可光致异构调控因子。在一些情况下，n为3并且支链接头附接到4个可光致异构调控因子。在一些情况下，n为4并且支链接头附接到5个可光致异构调控因子。在一些情况下，n为5并且支链接头附接到6个可光致异构调控因子。在一些情况下，n为6并且支链接头附接到7个可光致异构调控因子。在一些情况下，n为7并且支链接头附接到8个可光致异构调控因子。在一些情况下，n为8并且支链接头附接到9个可光致异构调控因子。在一些情况下，n为9并且支链接头附接到10个可光致异构调控因子。在一些情况下，n为10并且支链接头附接到11个可光致异构调控因子。
[0150]
例如，在其中n为1的式(bl)的部分中，所述部分包括一个戊二酰胺基团，即在式(bl)的括号内表示的基团。在这种情况下，当n为1时，在所述部分右侧示出两条臂，其中每条臂包含一个酰胺官能团。在式(bl)的部分中，戊二酰胺基团的每条臂包括酰胺官能团，所述酰胺官能团可以在由所述部分右侧的波浪线指示的相应附接点处连接到可光致异构调控因子。因此，当n为1时，每条臂包含一个可光致异构调控因子，使得支链接头附接到两个可光致异构调控因子。
[0151]
在其他实施方案中，n可以为3。在这种情况下，式(bl)的部分包括三个戊二酰胺基团，其中第二戊二酰胺基团在波浪线指示的附接点处附接到式(bl)的部分的第一戊二酰胺基团的右上侧酰胺官能团上，并且第三戊二酰胺基团在波浪线指示的附接点处附接到式(bl)的部分的第一个戊二酰胺基团的右下侧酰胺官能团上。另外，第二戊二酰胺基团包括两条臂，其中每条臂附接到相应的可光致异构调控因子，第三戊二酰胺基团包括两条臂，其中每条臂附接到相应的可光致异构调控因子。因此，当n为3时，式(bl)的支链接头包括四条
臂，每条臂均包含可光致异构调控因子，使得支链接头附接到四个可光致异构调控因子。
[0152]
在其他情况下，在式(bl)的部分中，n将介于1-10、或1-9、或1-8、或1-7、或1-6、或1-5、或1-4之间。在其他情况下，在式(bl)的部分中，n将介于2-10、或2-9、或2-8、或2-7、或2-6、或2-5、或2-4之间。在其他情况下，在式(bl)的部分中，n将介于3-10、或3-9、或3-8、或3-7、或3-6、或3-5、或3-4之间。在其他情况下，在式(bl)的部分中，n将介于4-10、或4-9、或4-8、或4-7、或4-6、或4-5之间。在其他情况下，在式(bl)的部分中，n将介于5-10、或5-9、或5-8、或5-7、或5-6之间。在其他情况下，在式(bl)的部分中，n将介于6-10、或6-9、或6-8、或6-7之间。
[0153]
可光致异构调控因子
[0154]
如上所述，本公开的缀合物中存在的可光致异构调控因子包含：i)可光致异构基团；和ii)与靶配体结合多肽结合的配体。
[0155]
可光致异构基团
[0156]
如上所述，本公开的缀合物中存在的可光致异构调控因子包含：i)可光致异构基团；和ii)与靶配体结合多肽结合的配体。
[0157]
可光致异构基团在本领域中是已知的，并且任何已知的可光致异构基团均可包括在本公开的缀合物中存在的可光致异构调控因子中。合适的可光致异构基团包括但不限于偶氮苯、环状偶氮苯和偶氮杂芳烃及其衍生物；螺吡喃及其衍生物；三苯甲烷及其衍生物；4,5-环氧-2-环戊烯及其衍生物；俘精酸酐及其衍生物；硫靛及其衍生物；二芳基乙烯及其衍生物；二烯丙基乙烯及其衍生物；过度拥挤的烯烃及其衍生物；和蒽及其衍生物。在一些情况下，合适的可光致异构基团是如本文实施例中所示的可光致异构基团。
[0158]
合适的螺吡喃衍生物包括但不限于1,3,3-三甲基吲哚基苯并二氢吡喃并螺烷；1,3,3-三甲基吲哚-6'-硝基苯并二氢吡喃并螺烷；1,3,3-三甲基吲哚-6'-溴苯并二氢吡喃并螺烷；1-正-癸基-3,3-二甲基吲哚-6'-硝基苯并二氢吡喃并螺烷；1-正-十八烷基-1-3,3-二甲基吲哚-6'-硝基苯并二氢吡喃并螺烷；3',3'-二甲基-6-硝基-1'-[2-(苯基氨基甲酰基)乙基]螺；[2h-1-苯并吡喃-2,2'-吲哚啉]；1,3,3-三甲基吲哚-8'-甲氧基苯并二氢吡喃并螺烷；和1,3,3-三甲基吲哚-β-萘并二氢吡喃并螺烷。同样适合使用的是对应于螺吡喃或螺吡喃衍生物的部花青形式。
[0159]
合适的三苯基甲烷衍生物包括但不限于孔雀石绿衍生物。具体来说，可以提到，例如，双[二甲基氨基)苯基]苯甲醇、双[4-(二乙基氨基)苯基]苯甲醇、双[4-(二丁基氨基)苯基]苯甲醇和双[4-(二乙基氨基)苯基]苯基甲烷。
[0160]
合适的4,5-环氧-2-环戊烯衍生物包括例如2,3-二苯基-1-二氢茚酮氧化物和2',3'-二甲基-2,3-二苯基-1-二氢茚酮氧化物。
[0161]
合适的偶氮苯化合物包括，例如具有与侧链交联的偶氮苯残基的化合物，例如其中4-羧基偶氮苯与聚乙烯醇的羟基酯型键合或4-羧基偶氮苯与聚烯丙胺的氨基酰胺型键合的化合物。同样合适的是在主链中具有偶氮苯残基的偶氮苯化合物，例如通过酯型键合双(4-羟基苯基)二甲基甲烷(也称为双酚a)和4,4'-二羧基偶氮苯或通过酯型键合乙二醇和4,4'-二羧基偶氮苯形成的那些偶氮苯化合物。
[0162]
适合用于主题缀合物和可光致异构调控因子中的合适的环状偶氮苯和偶氮杂芳烃化合物包括但不限于11,12-二羟基二苯并[c,g][1,2]二氮芳辛-5-氧化物，
[0163][0164]
杂二氮芳辛(诸如hammerich等人j.am.chem.soc.,2016,138(40)，第13111
–
13114页描述的那些光控开关)和偶氮杂芳烃光控开关，诸3-吡唑(3pzh或3pzme)、5-吡唑(5pzh或5pzme)、3-吡咯(3pyh或3pyme)、三唑和四唑(tet或3tri)，如calbo等人j.am.chem.soc.,2017,139(3),第1261
–
1274页所述，其公开内容以引用方式并入本文。
[0165]
合适的俘精酸酐衍生物包括但不限于亚异丙基俘精酸酐和亚金刚烷基俘精酸酐。
[0166]
合适的二烯丙基乙烯衍生物包括例如1,2-二氰基-1,2-双(2,3,5-三甲基-4-噻吩基)乙烷；2,3-双(2,3,5-三甲基-4-硫乙基)马来酸酐；1,2-二氰基-1,2-双(2,3,5-三甲基-4-硒基)乙烷；2,3-双(2,3,5-三甲基-4-硒基)马来酸酐；和1,2-二氰基-1,2-双(2-甲基-3-n-甲基吲哚)乙烷。
[0167]
合适的二芳基乙烯衍生物包括但不限于经取代的全氟环戊烯-双-3-噻吩和双-3-噻吩基马来酰亚胺。
[0168]
合适的过度拥挤的烯烃包括但不限于顺式-2-硝基-7-(二甲氨基)-9-(2’,3
’‑
二氢-1’h-萘并[2,1-b]噻喃-1
’‑
亚基)-9h-噻吨和反式-二甲基-[1-(2-硝基-噻吨-9-亚基)-2,3-二氢-1h-苯并[f]硫色烯-8-基]胺。文献中描述了过度拥挤的烯烃。参见例如，terwiel等人(2005)org.biomol.chem.3:28-30；和geertsema等人(1999)agnew chem.int.ed.engl.38:2738。
[0169]
其他合适的可光致异构基团包括例如亲和标记中常用的反应性基团，包括重氮酮、芳基叠氮化物、二氮烯和二苯甲酮。
[0170]
在一些情况下，缀合物的可光致异构基团(例如，如本文所定义的)是下式的偶氮苯(例如，偶氮苯光控开关)：
[0171][0172]
其中：
[0173]
r1和r6是选自以下的一个或多个任选取代基：氢、c
1-10
烷基、经取代的c
1-10
烷基、-nr
10r11
、
–
nr
12
c(o)r
13
、-nr
12
c(o)or
13
、-nr
12
c(o)nr
12r13
、c
2-10
烯基、经取代的c
2-10
烯基、c
2-10
炔基、经取代的c
2-10
炔基、c
6-20
芳基、经取代的c
6-20
芳基、杂芳基、杂环、杂环氧基、杂环硫基、杂芳基氨基、杂环氨基、c
4-10
环烷基、经取代的c4-10环烷基、c
4-10
环烯基、经取代的c
4-10
环烯基、氰基、卤基、-or
10
、-c(o)or
10
、-sr
10
、-s(o)r
10
、-s(o)2r
10
；
[0174]
x为1至5的整数；
[0175]
y为1至5的整数；并且
[0176]
其中r
10-r
13
如下所定义，
[0177]
或其药学上可接受的盐。
[0178]
在一些情况下，本公开的缀合物中存在的可光致异构基团是式1的化合物：
[0179][0180]
其中：
[0181]
q1为
–
ch
2-或-c(＝o)-；
[0182]
q2是配体(或标记或反应性基团或第二亲和剂)，如根据本公开所述；
[0183]
每个r1独立地选自氢、c
1-10
烷基、经取代的c
1-10
烷基、-nr
10r11
、
–
nr
12
c(o)r
13
、-nr
12
c(o)or
13
、-nr
12
c(o)nr
12r13
、c
2-10
烯基、经取代的c
2-10
烯基、c
2-10
炔基、经取代的c
2-10
炔基、c
6-20
芳基、经取代的c
6-20
芳基、杂芳基、杂环、杂环氧基、杂环硫基、杂芳基氨基、杂环氨基、c
4-10
环烷基、经取代的c4-10环烷基、c
4-10
环烯基、经取代的c
4-10
环烯基、氰基、卤基、-or
10
、-c(o)or
10
、-sr
10
、-s(o)r
10
、-s(o)2r
10
；
[0184]
w为1至10的整数；
[0185]
x为1至5的整数；
[0186]
y为1至4的整数；
[0187]
r2选自氢、c
1-10
烷基、经取代的c
1-10
烷基、c
2-10
烯基、经取代的c
2-10
烯基、c
2-10
炔基、经取代的c
2-10
炔基、c
6-20
芳基、经取代的c
6-20
芳基、c
4-10
环烷基、经取代的c
4-10
环烷基、c
4-10
环烯基和经取代的c
4-10
环烯基；
[0188]
每个r6独立地选自氢、c
1-10
烷基、经取代的c
1-10
烷基、-nr
10r11
、
–
nr
12
c(o)r
13
、c
2-10
烯基、经取代的c
2-10
烯基、c
2-10
炔基、经取代的c
2-10
炔基、c
6-20
芳基、经取代的c
6-20
芳基、杂芳基、杂环、杂环氧基、杂环硫基、杂芳基氨基、杂环氨基、c
4-10
环烷基、经取代的c
4-10
环烷基、c
4-10
环烯基、经取代的c
4-10
环烯基、氰基、卤基、-or
10
、-c(o)or
10
、-sr
10
、-s(o)r
10
、-s(o)2r
10
；
[0189]r10
和r
11
各自独立地选自氢、c
1-10
烷基、经取代的c
1-10
烷基、c
2-10
烯基、经取代的c
2-10
烯基、c
2-10
炔基、经取代的c
2-10
炔基、c
6-20
芳基、经取代的c
6-20
芳基、c
4-10
环烷基、经取代的c
4-10
环烷基、c
4-10
环烯基和经取代的c
4-10
环烯基；
[0190]r12
选自氢、c
1-10
烷基、经取代的c
1-10
烷基、c
2-10
烯基、经取代的c
2-10
烯基、c
2-10
炔基、经取代的c
2-10
炔基、c
6-20
芳基、经取代的c
6-20
芳基、c
4-10
环烷基、经取代的c
4-10
环烷基、c
4-10
环烯基和经取代的c
4-10
环烯基；并且
[0191]r13
选自氢、c
1-10
烷基、经取代的c
1-10
烷基、c
2-10
烯基、经取代的c
2-10
烯基、c
2-10
炔基、经取代的c
2-10
炔基、c
6-c
10
芳基、经取代的c
6-20
芳基、c
4-10
环烷基、经取代的c
4-10
环烷基、c
4-10
环烯基、经取代的c
4-10
环烯基、-ch
2-n(ch2ch3)
3+
和-ch
2-so3ˉ
；
[0192]
或其药学上可接受的盐。
[0193]
在式1的某些实施方案中，q1为
–
ch
2-。在式1的某些实施方案中，q1为-c(＝o)-。
[0194]
在式1的一些情况下，一个r1经由接头连接到亲和剂(例如，如本文所述)。在一些情况下，接头包括支链接头(例如，如本文所述)。
[0195]
在一些情况下，本公开的缀合物中存在的可光致异构基团是式2的化合物：
[0196][0197]
其中
[0198]
q2是配体(或标记或反应性基团或第二亲和剂)，如根据本公开所述；
[0199]
每个r1独立地选自氢、c
1-10
烷基、经取代的c
1-10
烷基、-nr
10r11
、
–
nr
12
c(o)r
13
、-nr
12
c(o)or
13
、-nr
12
c(o)nr
12r13
、c
2-10
烯基、经取代的c
2-10
烯基、c
2-10
炔基、经取代的c
2-10
炔基、c
6-20
芳基、经取代的c
6-20
芳基、杂芳基、杂环、杂环氧基、杂环硫基、杂芳基氨基、杂环氨基、c
4-10
环烷基、经取代的c
4-10
环烷基、c
4-10
环烯基、经取代的c
4-10
环烯基、氰基、卤基、-or
10
、-c(o)or
10
、-sr
10
、-s(o)r
10
、-s(o)2r
10
；
[0200]
w为1至10的整数；
[0201]
x为1至5的整数；
[0202]
y为1至4的整数；
[0203]
r2选自氢、c
1-10
烷基、取代的c
1-10
烷基、c
2-10
烯基、取代的c
2-10
烯基、c
2-10
炔基、取代的c
2-10
炔基、c
6-20
芳基、取代的c
6-20
芳基、c
4-10
环烷基、取代的c
4-10
环烷基、c
4-10
环烯基和取代的c
4-10
环烯基；
[0204]
每个r6独立地选自氢、c
1-10
烷基、经取代的c
1-10
烷基、-nr
10
r11、
–
nr
12
c(o)r
13
、c
2-10
烯基、经取代的c
2-10
烯基、c
2-10
炔基、经取代的c
2-10
炔基、c
6-20
芳基、经取代的c
6-20
芳基、杂芳基、杂环、杂环氧基、杂环硫基、杂芳基氨基、杂环氨基、c
4-10
环烷基、经取代的c
4-10
环烷基、c
4-10
环烯基、经取代的c
4-10
环烯基、氰基、卤基、-or
10
、-c(o)or
10
、-sr
10
、-s(o)r
10
、-s(o)2r
10
；
[0205]r10
和r
11
各自独立地选自氢、c
1-10
烷基、经取代的c
1-10
烷基、c
2-10
烯基、经取代的c
2-10
烯基、c
2-10
炔基、经取代的c
2-10
炔基、c
6-20
芳基、经取代的c
6-20
芳基、c
4-10
环烷基、经取代的c
4-10
环烷基、c
4-10
环烯基和经取代的c
4-10
环烯基；
[0206]r12
选自氢、c
1-10
烷基、经取代的c
1-10
烷基、c
2-10
烯基、经取代的c
2-10
烯基、c
2-10
炔基、经取代的c
2-10
炔基、c6-20芳基、经取代的c6-20芳基、c
4-10
环烷基、经取代的c
4-10
环烷基、c
4-10
环烯基和经取代的c
4-10
环烯基；并且
[0207]r13
选自氢、c
1-10
烷基、经取代的c
1-10
烷基、c
2-10
烯基、经取代的c
2-10
烯基、c
2-10
炔基、经取代的c
2-10
炔基、c
6-c
10
芳基、经取代的c
6-20
芳基、c
4-10
环烷基、经取代的c
4-10
环烷基、c
4-10
环烯基、经取代的c
4-10
环烯基、-ch
2-n(ch2ch3)
3+
和-ch
2-so3ˉ
；
[0208]
或其药学上可接受的盐。
[0209]
在式2的一些情况下，一个r1基团经由接头连接到亲和剂(例如，如本文所述)。在一些情况下，接头包括支链接头(例如，如本文所述)。
[0210]
在一些情况下，本公开的缀合物中存在的可光致异构基团是式3的化合物：
[0211][0212]
其中：
[0213]
q2是配体(或标记或反应性基团或第二亲和剂)，如根据本公开所述；
[0214]
w为1至10的整数；
[0215]
r1选自氢、c
1-10
烷基、-nr
10r11
、-nr
12
c(o)r
13
、-nr
12
c(o)or
13
和-nr
12
c(o)nr
12r13
；
[0216]
r2为氢或c
1-10
烷基；
[0217]r10
和r
11
独立地选自氢和c
1-10
烷基；
[0218]r12
为氢或c
1-10
烷基；并且
[0219]r13
选自氢、c
1-10
烷基、c
1-8
烯基、c
6-10
芳基和经取代的c
1-10
烷基，
[0220]
或其药学上可接受的盐。
[0221]
在式3的某些实施方案中，r1为c
1-10
烷基，诸如c
1-8
烷基，例如c
1-6
烷基、c
1-5
烷基或c
1-4
烷基。在式3的一些实施方案中，r1为c
1-4
烷基。
[0222]
在式3的某些实施方案中，r1为-nr
10r11
。
[0223]
在式3的某些实施方案中，r1为-nr
12
c(o)r
13
。
[0224]
在某些实施方案中，r2为h。
[0225]
在式3的一些情况下，r1基团经由接头连接到亲和剂(例如，如本文所述)。在一些情况下，接头包括支链接头(例如，如本文所述)。例如，在r1为-nr
10r11
的实施方案中，r1基团可以经由接头通过r
10
基团或r
11
基团连接到亲和剂。在其他情况下，在r1为-nr
12
c(o)r
13
的情况下，r1基团可以经由接头通过r
13
基团连接到亲和剂。
[0226]
在式1、式2或式3的一些情况下，q2是配体，如根据本公开所述。
[0227]
在式1、式2或式3的一些情况下，q2是标记，如根据本公开所述。例如，标记可以是可检测的标记，诸如荧光团，如本文所述。
[0228]
在式1、式2或式3的一些情况下，q2是反应性基团，如根据本公开所述。
[0229]
在式1、式2或式3的一些情况下，q2是第二亲和剂，如根据本公开所述。
[0230]
在一些情况下，本公开的缀合物中存在的可光致异构基团是如下所示的偶氮苯化合物：
[0231]
(“偶氮苯380”)
[0232]
(“偶氮苯460”)
[0233]
其中波浪线指示与缀合物其余部分的附接点。例如，偶氮苯左侧的波浪线可以指示与接头(例如，如本文所述的支链接头)的附接点，并且偶氮苯右侧的波浪线可以指示与如本文所述的配体的附接点。
[0234]
在一些情况下，可光致异构基团是偶氮苯，诸如在wo 2019/060785中发现的偶氮苯可光致异构基团，其公开内容以引用方式整体并入本文。
[0235]
配体
[0236]
如上所述，本公开的缀合物中存在的可光致异构调控因子包含：i)可光致异构基团；和ii)与靶配体结合多肽结合的配体。
[0237]
如本文所用，术语“配体”是指与多肽结合并实现多肽的活性变化，和/或实现多肽的构象变化，和/或影响另一种多肽与所述多肽的结合，或影响另一配体对所述多肽的影响的分子(例如，小分子、肽或蛋白质)。配体包括激动剂、部分激动剂、反向激动剂、拮抗剂、变构调节剂和阻断剂。
[0238]
在一些情况下，配体是天然存在的配体。在其他情况下，配体是合成配体。在一些情况下，配体是内源配体。在一些情况下，配体是激动剂。在一些情况下，配体是反向激动剂。在其他情况下，配体是部分激动剂。在其他情况下，配体是拮抗剂。在其他情况下，配体是变构调节剂。在其他情况下，配体是阻断剂。术语“拮抗剂”通常是指与配体结合多肽结合并抑制配体结合多肽的结合的试剂。“拮抗剂”可以是与正构位点(激动剂结合的相同位点)或变构位点结合或靠近但不活化配体结合多肽的试剂；相反，拮抗剂通常排除激动剂的结合或阻碍激动剂的活化，从而防止或阻碍活化。“变构调节剂”可以是与远离正构配体结合位点的变构位点结合的试剂，其中变构配体的结合降低对正构配体的敏感性或正构配体的功效(负向变构调节剂)，或增加对正构配体的敏感性或正构配体的功效(正向变构调节剂)。术语“阻断剂”是指直接作用于活性位点、孔隙或变构位点的试剂。适合本文使用的配体与配体结合多肽的配体结合位点可逆性结合。
[0239]
部分地基于靶配体结合多肽以及对靶配体结合多肽的期望影响来选择配体。例如，激素结合转录因子的配体在一些情况下将是激素，或激素的合成类似物，或干扰或调节正或负激素结合或作用的配体。四环素反式活化因子的配体在一些情况下将是四环素或其合成类似物。酶的配体在一些情况下将是酶的合成激动剂或拮抗剂。在一些情况下，配体将会阻断配体结合位点。酶或离子通道的配体在一些情况下将是酶活性位点或离子通道孔隙的阻断剂。配体门控离子通道或g蛋白偶联受体或其他膜相关受体或可溶性受体的配体在一些情况下将是天然存在的配体，或配体的合成型式，例如配体的合成类似物，或干扰或正向或负向调节该配体的结合或作用的配体。
[0240]
在一些情况下，配体是小分子配体。小分子配体可具有在约50道尔顿至约3000道尔顿范围内的分子量，例如约50道尔顿至约75道尔顿、约75道尔顿至约100道尔顿、约100道尔顿至约250道尔顿、约250道尔顿至约500道尔顿、约500道尔顿至约750道尔顿、约750道尔顿至约1000道尔顿、约1000道尔顿至约1250道尔顿、约1250道尔顿至约1500道尔顿、约1500道尔顿至约2000道尔顿、约2000道尔顿至约2500道尔顿或约2500道尔顿至约3000道尔顿。
[0241]
在其他情况下，配体是肽配体。肽配体可具有约1kda至约20kda范围内的分子量，例如约1kda至约2kda、约2kda至约5kda、约5kda至约7kda、约7kda至约10kda、约10kda至约12kda、约12kda至约15kda或约15kda至约20kda。肽配体可具有2个氨基酸至20个氨基酸的
长度，例如肽配体可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度。肽配体可具有2个氨基酸至5个氨基酸、5个氨基酸至10个氨基酸、10个氨基酸至15个氨基酸或15个氨基酸至20个氨基酸的长度。肽配体可以长于20个氨基酸，例如至多200个氨基酸。
[0242]
合适的配体包括但不限于：阻断或活化配体结合蛋白的功能的配体，其中配体结合蛋白包括离子和大分子渗透通道；受体(包括但不限于结合递质的离子型受体；结合激素的离子型受体；代谢型受体和其他g蛋白偶联受体(包括但不限于mglur受体，诸如mglur2、mglur3、mglur5和mglur6)；受体酪氨酸激酶；生长因子受体；和通过与可溶性或膜结合或细胞外小分子或蛋白质结合进行信号传导的其他膜受体)；转运体(包括但不限于离子转运体、有机分子转运体、肽转运体和蛋白质转运体)；酶(包括但不限于激酶；磷酸酶；泛素连接酶；乙酰化酶；氧化还原酶；脂肪酶；向蛋白质添加脂质部分或去除脂质部分的酶；蛋白酶；和修饰核酸的酶，包括但不限于连接酶、解旋酶、拓扑异构酶和端粒酶)；马达蛋白(包括驱动蛋白、动力蛋白和其他基于微管的马达蛋白、肌球蛋白和其他基于肌动蛋白的马达蛋白、dna和rna聚合酶以及其他轨迹沿着多核苷酸的马达蛋白)；支架蛋白；衔接蛋白；细胞骨架蛋白；和其他在细胞内定位或组织蛋白质结构域和上层结构的蛋白质。
[0243]
合适的配体包括但不限于起全身麻醉剂作用的配体；起局部麻醉剂作用的配体；起镇痛剂作用的配体；合成和半合成的阿片类镇痛剂(例如，菲、苯基庚胺、苯基哌啶、吗啡喃和苯并吗啡烷)，其中示例性的阿片类镇痛剂包括吗啡、羟考酮、芬太尼(fentanyl)、喷他佐辛(pentazocine)、氢化吗啡酮、哌替啶、美沙酮、左啡诺(levorphanol)、羟吗啡酮、烯丙左吗喃(levallorphan)、可待因、二氢可待因、氢可酮、丙氧芬、纳美芬(nalmefene)、纳洛啡(nalorphine)、纳洛酮(naloxone)、纳曲酮(naltrexone)、丁丙诺啡(buprenorphine)、布托啡诺(butorphanol)、纳布啡(nalbuphine)和喷他佐辛；离子型谷氨酸受体激动剂和拮抗剂，例如n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体激动剂、拮抗剂和变构调节剂、红藻氨酸(ka)受体激动剂和拮抗剂以及变构调节剂α-氨基-3-羟基-5-甲基异噁唑-4-丙酸(ampa)受体激动剂和拮抗剂和变构调节剂，以及促代谢型谷氨酸受体激动剂和拮抗剂和变构调节剂；非阿片类镇痛剂，例如乙酰水杨酸、三水杨酸胆碱镁、对乙酰氨基酚、布洛芬(ibuprofen)、非诺洛芬(fenoprofen)、二氟尼柳(diflusinal)和萘普生(naproxen)；毒蕈碱受体激动剂；毒蕈碱受体拮抗剂；乙酰胆碱受体激动剂；乙酰胆碱受体拮抗剂；血清素受体激动剂；血清素受体拮抗剂；酶抑制剂；苯二氮类药物，例如氯二氮平(chlordiazepoxide)、氯氮卓(clorazepate)、地西泮(diazepam)、氟西泮(flurazepam)、劳拉西泮(lorazepam)、奥沙西泮(oxazepam)、替马西泮(temazepam)或三唑仑(triazolam)；巴比妥酸盐镇静剂，例如异戊巴比妥(amobarbital)、阿普巴比妥(aprobarbital)、仲丁巴比妥(butabarbital)、布他比妥(butabital)、甲苯比妥(mephobarbital)、美沙比妥(metharbital)、美索比妥(methohexital)、戊巴比妥(pentobarbital)、苯巴比妥(phenobartital)、司可巴比妥(secobarbital)、他布比妥(talbutal)、硫戊比妥(theamylal)或硫喷妥(thiopental)；具有镇静作用的h1拮抗剂，例如苯海拉明(diphenhydramine)、吡拉明(pyrilamine)、异丙嗪(promethazine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)或氯环利嗪(chlorcyclizine)；nmda受体拮抗剂，例如右美沙芬((+)-3-羟基-n-甲基吗啡喃)或其代谢物右啡烷((+)-3-羟基-n-甲基吗啡喃)、克他命(ketamine)、美金刚、吡咯喹啉醌、顺式-4-(膦酰基甲基)-2-哌啶羧酸、
布地平(budipine)、托吡酯(topiramate)、奈美胺(neramexane)或培净福太(perzinfotel)；α-肾上腺素能药物，例如多沙唑嗪(doxazosin)、坦索罗辛(tamsulosin)、可乐定(clonidine)、胍法辛(guanfacine)、右美托咪定(dexmetatomidine)、莫达非尼(modafinil)、酚妥拉明(phentolamine)、特拉唑嗪(terazasin)、哌唑嗪(prazasin)或4-氨基-6,7-二甲氧基-2-(5-甲烷-磺酰胺-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-基)-5-(2-吡啶基)喹唑啉；三环抗抑郁药，例如地昔帕明(desipramine)、丙咪嗪(imipramine)、阿米替林(amitriptyline)或去甲替林(nortriptyline)；抗惊厥药，例如卡马西平(carbamazepine)、拉莫三嗪(lamotrigine)、托吡酯(topiratmate)或丙戊酸盐；速激肽(nk)拮抗剂，特别是nk-3、nk-2或nk-1拮抗剂，例如(α-r,9r)-7-[3,5-双(三氟甲基)苄基]-8,9,10,11-四氢-9-甲基-5-(4-甲基苯基)-7h-[1,4]二氮芳辛[2,1-g][1,7]-萘啶-6-13-二酮(tak-637)、5-[[(2r,3s)-2-[(1r)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙氧基-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基]-甲基]-1,2-二氢-3h-1,2,4-三唑-3-酮(mk-869)、阿瑞匹坦(aprepitant)、拉奈匹坦(lanepitant)、达匹坦(dapitant)或3-[[2-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]-甲基氨基]-2-苯基哌啶(2s,3s)；毒蕈碱拮抗剂，例如奥昔布宁(oxybutynin)、托特罗定(tolterodine)、丙哌维林(propiverine)、曲司氯铵(tropsium chloride)、达非那新(darifenacin)、索利那新(solifenacin)、替米维林(temiverine)或异丙托铵(ipratropium)；环氧合酶-2(cox-2)选择性抑制剂，例如塞来昔布(celecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)、帕瑞昔布(parecoxib)、伐地昔布(valdecoxib)、德拉昔布(deracoxib)、依托考昔(etoricoxib)或鲁米昔布(lumiracoxib)；香草素受体激动剂(例如树脂毒素(resinferatoxin))或拮抗剂(例如辣椒平(capsazepine))；β-肾上腺素能药物，诸如普萘洛尔(propranolol)；5-ht受体激动剂或拮抗剂，例如5-ht1b/1d激动剂，诸如依立曲坦(eletriptan)、舒马曲坦(sumatriptan)、那拉曲坦(naratriptan)、佐米曲坦(zolmitriptan)或利扎曲坦(rizatriptan)；5-ht2a受体拮抗剂，诸如r(+)-α-(2,3-二甲氧基-苯基)-1-[2-(4-氟苯基乙基)]-4-哌啶甲醇(mdl-100907)；等等。
[0244]
适合na
+
通道的配体包括但不限于利多卡因(lidocaine)、奴佛卡因(novocaine)、塞罗卡因(xylocaine)、利诺卡因(lignocaine)、奴佛卡因、卡波卡因(carbocaine)、依替卡因(etidocaine)、普鲁卡因(procaine)、潘妥卡因(prontocaine)、丙胺卡因(prilocaine)、布比卡因(bupivacaine)、沙呋卡因(cinchocaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、奎尼丁(quinidine)、氟卡尼(flecainide)、普鲁卡因、n-[[2'-(氨基磺酰基)联苯-4-基]甲基]-n'-(2,2'-双噻吩-5-基甲基)琥珀酰胺(bpbts)、qx-314、蛤蚌毒素、河豚毒素和iii型芋螺毒素。适合na
+
通道的配体还包括但不限于河豚毒素、蛤蚌毒素、胍、多胺(例如精胺、尸胺、腐胺、μ-芋螺毒素和δ-芋螺毒素。
[0245]
适合k
+
通道的配体包括但不限于季铵(例如，四乙基铵、四丁基铵、四戊基铵)、4-氨基吡啶、磺酰脲、格列本脲(glibenclamide)；甲苯磺丁脲(tolbutamide)；酚妥拉明(phentolamine)、奎宁、奎尼丁、肽毒素(例如，卡律蝎毒素、agitoxin-2、蜂毒明肽(apamin)、树木毒素(dendrotoxin)、vstx1、hanatoxin-1、hanatoxin-2和tityus毒素k-α。
[0246]
适合cng和hcn通道的配体包括但不限于1-顺式地尔硫卓和zd7288。适合甘氨酸受体的配体包括但不限于番木虌碱(strychnine)和印防己毒素(picrotoxin)。
[0247]
适合烟碱型乙酰胆碱受体的配体包括但不限于：(+)-筒箭毒碱、甲基牛扁碱
(methyllycaconitine)、加拉明(gallamine)、烟碱；类毒素a、地棘蛙素(epibatidine)、abt-94、柳珊瑚毒素(lophotoxin)、野靛碱(cytisine)、六甲铵(hexamethonium)、美加明(mecamylamine)和二氢-β-刺桐碱。适合毒蕈碱乙酰胆碱受体的配体包括但不限于如美国专利第7,439,255号中描述的毒蕈碱乙酰胆碱受体拮抗剂；af267b(参见，例如，美国专利第7,439,251号)；苯基炔丙氧基-1,2,5-噻二唑-奎宁环；卡巴胆碱(carbachol)；哌仑西平(pirenzapine)；迁移他汀(migrastatin)；如美国专利第7,232,841号中描述的化合物；等等。
[0248]
适合gaba受体的配体包括但不限于蝇蕈醇(muscimol)、thip、procabide、荷包牡丹碱(bicuculine)、印防己毒素、加巴嗪(gabazine)、加巴喷丁(gabapentin)、地西泮、氯硝西泮(clonazepam)、氟马西尼(flumazenil)、β-咔啉羧酸乙酯、巴氯芬(baclofen)、氟氯芬(faclofen)和巴比妥酸盐。
[0249]
在一些情况下，例如在靶配体结合多肽是mglur的情况下，配体是谷氨酸。在一些情况下，在靶配体结合多肽是mglur受体的情况下，配体将是mglur受体(包括但不限于mglur2、mglur3、mglur5和mglur6)的天然存在的或合成的配体。
[0250]
许多合适的配体是本领域技术人员已知的；并且配体的选择将部分取决于配体所结合的靶标(例如，受体、离子通道、酶等)。
[0251]
荧光团
[0252]
在一些情况下，本公开的缀合物包含荧光团。例如，如上所述，q2可以是标记，诸如荧光团。荧光团的实例包括但不限于：alexa染料(例如，alexa350、alexa405、alexa430、alexa488、alexa500、alexa514、alexa532、alexa546、alexa555、alexa568、alexa594、alexa610、alexa633、alexa635、alexa647、alexa660、alexa680、alexa700、alexa750、alexa790等)、atto染料(例如，atto 390、atto 425、atto 465、atto 488、atto 495、atto 514、atto 520、atto 532、atto rho6g、atto 542、atto 550、atto 565、atto rho3b、atto rho11、atto rho12、atto thio12、atto rho101、atto 590、atto 594、atto rho13、atto 610、atto 620、atto rho14、atto 633、atto 647、atto 647n、atto 655、atto oxa12、atto 665、atto 680、atto 700、atto 725、atto 740)、dylight染料、花青染料(例如，cy2、cy3、cy3.5、cy3b、cy5、cy5.5、cy7、cy7.5)、fluoprobes染料、sulfo cy染料、seta染料、iris染料、setau染料、srfluor染料、square染料、异硫氰酸荧光素(fitc)、四甲基异硫氰罗丹明(tritc)、四甲基罗丹明(tmr)、硅若丹明(sir)、德克萨斯红、俄勒冈绿、太平洋蓝、太平洋绿和太平洋橙。
[0253]
靶配体结合多肽
[0254]
如上所述，本公开的缀合物包括与靶配体结合多肽结合的配体。
[0255]
合适的靶配体结合蛋白包括离子和大分子渗透通道；受体(包括但不限于结合递质的离子型受体；结合激素的离子型受体；促代谢型受体和其他g蛋白偶联受体；受体酪氨酸激酶；生长因子受体；和通过与可溶性或膜结合或细胞外小分子或蛋白质结合进行信号传导的其他膜受体)；转运体(包括但不限于离子转运体、有机分子转运体、肽转运体和蛋白质转运体)；酶(包括但不限于激酶；磷酸酶；泛素连接酶；乙酰化酶；氧化还原酶；脂肪酶；向
蛋白质添加脂质部分或去除脂质部分的酶；蛋白酶；和修饰核酸的酶，包括但不限于连接酶、解旋酶、拓扑异构酶和端粒酶)；马达蛋白(包括驱动蛋白、动力蛋白和其他基于微管的马达蛋白、肌球蛋白和其他基于肌动蛋白的马达蛋白、dna和rna聚合酶以及其他轨迹沿着多核苷酸的马达蛋白)；支架蛋白；衔接蛋白；细胞骨架蛋白；和其他在细胞内定位或组织蛋白质结构域和上层结构的蛋白质。
[0256]
在一些情况下，靶配体结合多肽是转录调控因子、离子通道、阳离子通道、配体门控离子通道、电压门控离子通道、群体感应因子、信息素受体、神经递质受体、g蛋白偶联受体(gpcr)或酶。在一些情况下，靶配体结合多肽是阳离子通道，例如钾通道、钠通道或钙通道。在一些情况下，靶配体结合多肽是谷氨酸受体、促代谢型谷氨酸受体、离子型谷氨酸受体、离子型烟碱型乙酰胆碱受体、离子型gaba-a受体或离子型嘌呤能p2x受体。在一些情况下，靶配体结合多肽选自谷氨酸受体、促代谢型谷氨酸受体(mglur)、离子型谷氨酸受体(例如，红藻氨酸受体；ampa受体；nmda受体)、离子型烟碱型乙酰胆碱受体、离子型gaba-a受体、促代谢型gaba-b受体、促代谢型多巴胺受体、离子型嘌呤能p2x受体、促代谢型嘌呤能p2y受体、促代谢型血清素受体、离子型血清素受体、离子型甘氨酸受体、阳离子通道、钾通道、钙通道、钠通道、质子通道、阴离子通道和氯通道。
[0257]
在一些情况下，靶配体结合多肽选自促代谢型谷氨酸受体，其中促代谢型谷氨酸受体包括例如mglur2、mglur3、mglur5、mglur6等。
[0258]
结合靶配体结合多肽的多肽
[0259]
如上所述，本公开的缀合物包括亲和剂，其结合：i)靶配体结合多肽；或ii)结合靶配体结合多肽的多肽。
[0260]
在一些情况下，结合靶配体结合多肽的多肽是融合多肽，其包含：i)结合靶配体结合多肽的抗体；ii)结合缀合物中存在的亲和剂的多肽。例如，结合缀合物中存在的亲和剂的多肽可以是snap多肽(其中亲和剂是苄基鸟嘌呤)、clip多肽(其中亲和剂是苄基胞嘧啶)或halo多肽(其中亲和剂是氯烷烃)。
[0261]
示例性缀合物
[0262]
在一些情况下，本公开的缀合物是具有式i的化合物：
[0263]
(a)-(x1)
n-(b)-[(x2)
m-(c)-(x3)
p-(d)]q(式i)
[0264]
其中：
[0265]
a是亲和剂；
[0266]
x1当存在时是第一接头，其中n为0或1；
[0267]
b是支链接头；
[0268]
x2当存在时是第二接头，其中m为0或1；
[0269]
c是可光致异构基团；
[0270]
x3当存在时是第三接头，其中p为0或1；
[0271]
d是配体；并且
[0272]
q为2至10的整数。
[0273]
合适的亲和剂是在本公开中描述的那些。例如，如本公开中所述，亲和剂可以是但不限于苄基鸟嘌呤、苄基胞嘧啶、氯烷烃、抗体、适体、小分子或肽等。在一些情况下，亲和剂是对靶配体结合多肽具有特异性的抗体。合适的抗体的非限制性实例包括，例如，对靶配体
结合多肽具有特异性的纳米抗体(例如，特异性结合mglur2的纳米抗体)；和对靶配体结合多肽具有特异性的scfv抗体(例如，特异性结合mglur2的scfv)。
[0274]
x1当存在时是第一接头，其中n为0或1。例如，当n为0时，x1不存在，并且a直接连接到b。在其他情况下，n为1并且x1存在。类似地，x2当存在时是第二接头，其中m为0或1。例如，当m为0时，则x2不存在，并且b直接连接到c。在其他情况下，m为1并且x2存在。类似地，x3当存在时是第三接头，其中p为0或1。例如，当p为0时，则x3不存在，并且c直接连接到d。在其他情况下，p为1并且x3存在。在一些情况下，x1、x2和x3中的至少一者存在。在一些情况下，x1、x2和x3中仅一者存在。在一些情况下，x1和x2存在而x3不存在。在一些情况下，x1和x3存在而x2不存在。在一些情况下，x2和x3存在而x1不存在。在一些情况下，x1、x2和x3存在。
[0275]
适于x1、x2和/或x3的接头包括但不限于聚碳链；聚(乙二醇)；肽；等等。在一些情况下，接头是c
1-c
25
烷基。在一些情况下，接头是经取代的c
1-c
25
烷基。在一些情况下，接头是聚(乙二醇)(peg)，其中peg包含2至50个乙二醇单体；例如，peg包含2至5、5至10、10至15、15至20、20至25、25至30、30至35、35至40、40至45或45至50个乙二醇单元。例如，接头可以是peg，其中peg包含12个乙二醇单体(即，peg12)。在一些情况下，接头是2个氨基酸至50个氨基酸的肽；例如，2个氨基酸至5个氨基酸、5个氨基酸至10个氨基酸、10个氨基酸至15个氨基酸、15个氨基酸至20个氨基酸、20个氨基酸至25个氨基酸、25个氨基酸氨基酸至30个氨基酸，或30个氨基酸至50个氨基酸。在一些情况下，接头是长度为2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的肽。
[0276]
合适的支链接头包括在本公开中描述的那些。例如，合适的支链接头包括包含1个或多个(例如，1至10个)戊二酰胺基团的支链接头，如本文所述。其他合适的支链接头包括但不限于树枝状结构，诸如聚酰胺胺(pamam)树状大分子、聚乙二醇(peg)树状大分子等。
[0277]
合适的可光致异构基团包括在本公开中描述的那些，诸如但不限于选自以下的部分：偶氮苯、环状偶氮苯、偶氮杂芳烃、俘精酸酐、螺吡喃、三苯甲烷、硫靛、二芳基乙烯和过度拥挤的烯烃。在一些情况下，可光致异构基团是偶氮苯(例如，如本文所述)。
[0278]
合适的配体包括在本公开中描述的那些。在一些情况下，配体是激动剂、拮抗剂、变构调节剂或阻断剂(例如，如本文所述)。
[0279]
在式i的其他实施方案中，d是如本公开中描述的标记、反应性基团或第二亲和剂。
[0280]
在一些情况下，缀合物具有式(a)-(x1)
n-(b)-[(x2)
m-(c)-(d)]q。
[0281]
在一些情况下，缀合物具有式(a)-(x1)
n-(b)-[(c)-(d)]q。
[0282]
在一些情况下，缀合物具有式(a)-(b)-[(x2)
m-(c)-(x3)
p-(d)]q。
[0283]
在一些情况下，缀合物具有式(a)-(b)-[(x2)
m-(c)-(d)]q。
[0284]
在一些情况下，缀合物具有式(a)-(x1)
n-(b)-[(x2)
m-(c)-(x3)
p-(d)]q。
[0285]
合适的a、b、c和d部分的任何组合，有或无第一接头(x1)、第二接头(x2)或第三接头(x3)，可用于根据本公开的缀合物中。缀合物的实例包括但不限于这样的缀合物，其中：
[0286]
(i)a是苄基胞嘧啶，b是包含戊二酰胺的支链接头，c是偶氮苯，d是谷氨酸，并且q为2；
[0287]
(ii)a是苄基胞嘧啶，x1是peg(例如，peg12)，b是包含戊二酰胺的支链接头，c是偶氮苯，d是谷氨酸，并且q为2；
[0288]
(iii)a是苄基胞嘧啶，x1是peg(例如，peg12)，b是包含戊二酰胺的支链接头，c是
偶氮苯380，d是谷氨酸，并且q为2；
[0289]
(iv)a是苄基胞嘧啶，x1是peg(例如，peg12)，b是包含戊二酰胺的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为2；
[0290]
(v)a是氯烷烃，b是包含戊二酰胺的支链接头，c是偶氮苯，d是谷氨酸，并且q为2；
[0291]
(vi)a是氯烷烃，x1是peg(例如，peg12)，b是包含戊二酰胺的支链接头，c是偶氮苯，d是谷氨酸，并且q为2；
[0292]
(vii)a是氯烷烃，x1是peg(例如，peg12)，b是包含戊二酰胺的支链接头，c是偶氮苯380，d是谷氨酸，并且q为2；
[0293]
(viii)a是氯烷烃，x1是peg(例如，peg12)，b是包含戊二酰胺的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为2；
[0294]
(ix)a是苄基鸟嘌呤，b是包含戊二酰胺的支链接头，c是偶氮苯，d是谷氨酸，并且q为2；
[0295]
(x)a是苄基鸟嘌呤，b是包含戊二酰胺的支链接头，x2是peg(例如，peg12)，c是偶氮苯，d是谷氨酸，并且q为2；
[0296]
(xi)a是苄基鸟嘌呤，b是包含戊二酰胺的支链接头，x2是peg(例如，peg12)，c是偶氮苯380，d是谷氨酸，并且q为2；
[0297]
(xii)a是苄基鸟嘌呤，b是包含戊二酰胺的支链接头，x2是peg(例如，peg12)，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为2；
[0298]
(xiii)a是苄基鸟嘌呤，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，c是偶氮苯，d是谷氨酸，并且q为4；
[0299]
(xiv)a是苄基鸟嘌呤，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，x2是peg(例如，peg12)，c是偶氮苯，d是谷氨酸，并且q为4；
[0300]
(xv)a是苄基鸟嘌呤，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，x2是peg(例如，peg12)，c是偶氮苯380，d是谷氨酸，并且q为4；
[0301]
(xvi)a是苄基鸟嘌呤，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，x2是peg(例如，peg12)，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0302]
等等。
[0303]
合适的a、b、c和d部分的任何组合，有或无第一接头(x1)、第二接头(x2)或第三接头(x3)，可用于根据本公开的缀合物中。缀合物的实例包括但不限于这样的缀合物，其中：
[0304]
(i)a是对靶配体结合多肽具有特异性的抗体，b是包含戊二酰胺的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为2；
[0305]
(ii)a是对靶配体结合多肽具有特异性的抗体，b是包含戊二酰胺的支链接头，x2是peg(例如，peg12或peg28)，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为2；
[0306]
(iii)a是对靶配体结合多肽具有特异性的抗体，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0307]
(iv)a是对靶配体结合多肽具有特异性的抗体，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，x2是peg(例如，peg12或peg28)，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0308]
(v)a是对促代谢型谷氨酸受体(mglur)具有特异性的抗体，b是包含戊二酰胺的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为2；
[0309]
(vi)a是对mglur(例如，mglur2、mglur3、mglur4、mglur5或mglur6)具有特异性的抗体，b是包含戊二酰胺的支链接头，x2是peg(例如，peg12或peg28)，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为2；
[0310]
(vii)a是对mglur(例如，mglur2、mglur3、mglur4、mglur5或mglur6)具有特异性的抗体，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0311]
(vii)a是对mglur(例如，mglur2、mglur3、mglur4、mglur5或mglur6)具有特异性的抗体，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，x2是peg(例如，peg12或peg28)，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0312]
(vii)a是对mglur2(例如，mglur2、mglur3、mglur4、mglur5或mglur6)具有特异性的抗体，b是包含戊二酰胺的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为2；
[0313]
(ix)a是对mglur2具有特异性的抗体，b是包含戊二酰胺的支链接头，x2是peg(例如，peg12或peg28)，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为2；
[0314]
(x)a是对mglur2具有特异性的抗体，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0315]
(xi)a是对mglur2具有特异性的抗体，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，x2是peg(例如，peg12或peg28)，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0316]
(xii)a是对mglur2具有特异性的纳米抗体，b是包含戊二酰胺的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为2；
[0317]
(xiii)a是对mglur2具有特异性的纳米抗体，b是包含戊二酰胺的支链接头，x2是peg(例如，peg12或peg28)，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为2；
[0318]
(xiv)a是对mglur2具有特异性的纳米抗体，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0319]
(xv)a是对mglur2具有特异性的纳米抗体，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，x2是peg(例如，peg12或peg28)，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0320]
(xii)a是对mglur2具有特异性的scfv，b是包含戊二酰胺的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为2；
[0321]
(xiii)a是对mglur2具有特异性的scfv，b是包含戊二酰胺的支链接头，x2是peg(例如，peg12或peg28)，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为2；
[0322]
(xiv)a是对mglur2具有特异性的scfv，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0323]
(xv)a是对mglur2具有特异性的scfv，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，x2是peg(例如，peg12或peg28)，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0324]
(xvi)a是对mglur(例如，mglur2、mglur3、mglur4、mglur5或mglur6)具有特异性的抗体，x1是peg(例如，peg12或peg28)，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0325]
(xvii)a是对mglur(例如，mglur2、mglur3、mglur4、mglur5或mglur6)具有特异性的scfv，x1是peg(例如，peg12或peg28)，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0326]
(xviii)a是对mglur(例如，mglur2、mglur3、mglur4、mglur5或mglur6)具有特异性
的纳米抗体，x1是peg(例如，peg12或peg28)，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0327]
(xix)a是对mglur4具有特异性的纳米抗体，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0328]
(xx)a是对mglur4具有特异性的纳米抗体，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，x2是peg(例如，peg12或peg28)，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0329]
(xxi)a是对mglur4具有特异性的纳米抗体，x1是peg(例如，peg12或peg28)，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0330]
(xxii)a是对mglur5具有特异性的纳米抗体，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0331]
(xxiii)a是对mglur5具有特异性的纳米抗体，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，x2是peg(例如，peg12或peg28)，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0332]
(xxiv)a是对mglur5具有特异性的纳米抗体，x1是peg(例如，peg12或peg28)，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0333]
(xxv)a是对mglur6具有特异性的纳米抗体，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0334]
(xxvi)a是对mglur6具有特异性的纳米抗体，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，x2是peg(例如，peg12或peg28)，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0335]
(xxvii)a是对mglur6具有特异性的纳米抗体，x1是peg(例如，peg12或peg28)，b是包含三个戊二酰胺部分的支链接头，c是偶氮苯460，d是谷氨酸，并且q为4；
[0336]
等等。
[0337]
包含光控开关缀合物和融合多肽的组合物和组合
[0338]
在一些情况下，本公开提供了包含以下的组合物和/或组合：a)本公开的光控开关缀合物；和b)包含与光控开关缀合物中存在的亲和剂结合的多肽的融合多肽，或包含编码融合多肽的核苷酸序列的多核苷酸。光控开关缀合物和融合多肽或融合多核苷酸可以是相同组合物的一部分并且一起施用给受试者。可替代地，光控开关缀合物和融合多肽或融合多核苷酸可以是治疗方法的一部分，所述治疗方法包括在不同时间和/或通过不同的施用方式或模式施用的试剂的组合。在一些情况下，本公开的组合物包含：a)本公开的光控开关缀合物；和b)融合多肽(或编码融合多肽的多核苷酸)，其包含：i)配体(例如，本公开的光控开关缀合物中存在的配体)的受体；ii)融合伴侣，其中所述融合伴侣是结合光控开关缀合物中存在的亲和部分的多肽。在一些情况下，本公开的组合物包含：a)本公开的光控开关缀合物；和b)第一融合多肽(或编码第一融合多肽的多核苷酸)，其包含：i)配体(例如，本公开的光控开关缀合物中存在的配体)的受体；和ii)融合伴侣，其中所述融合伴侣展示被第二融合多肽中存在的抗体结合的表位，所述第二融合多肽包含：i)结合第一融合多肽的融合伴侣中存在的表位的抗体；和ii)结合光控开关缀合物中存在的亲和部分的多肽。
[0339]
包含光控开关缀合物和单个融合多肽的组合物
[0340]
在一些情况下，本公开的组合物或组合包含：a)本公开的光控开关缀合物；和b)融合多肽(包含编码融合多肽的核苷酸序列的多核苷酸)，所述融合多肽包含与光控开关缀合物中存在的亲和剂结合的多肽。在一些情况下，融合多肽包含：a)配体(例如，本公开的光控
开关缀合物中存在的配体)的受体；b)融合伴侣，其中所述融合伴侣是snap多肽、clip多肽或halo多肽。例如，在一些情况下，所述配体的受体是谷氨酸受体、促代谢型谷氨酸受体(mglur)、离子型谷氨酸受体(例如，红藻氨酸受体；ampa受体；nmda受体)、离子型烟碱型乙酰胆碱受体、离子型gaba-a受体、促代谢型gaba-b受体、促代谢型多巴胺受体、离子型嘌呤能p2x受体、促代谢型嘌呤能p2y受体、促代谢型血清素受体、离子型血清素受体、离子型甘氨酸受体、阳离子通道、钾通道、钙通道、钠通道、质子通道、阴离子通道和氯通道。
[0341]
在一些情况下，本公开的组合物或组合包含：a)本公开的缀合物；和b)包含编码融合多肽的核苷酸序列的核酸。所述核酸可以是表达载体。所述核苷酸序列可以与启动子可操作地连接。表达载体可以是例如重组病毒表达载体。作为非限制性实例，表达载体可以是腺相关病毒(aav)载体，其中所述重组aav载体包含编码融合多肽的异源核苷酸序列。所述重组aav载体还可以包含编码变体衣壳蛋白的核苷酸序列，其中所述变体衣壳蛋白提供对视网膜细胞的感染。在一些情况下，重组aav载体将施用于眼。在一些情况下，重组aav载体将经玻璃体内施用于眼。
[0342]
在一些情况下，本公开的组合物或组合包含：a)本公开的光控开关缀合物，其中所述亲和剂是如上所述的核苷碱基衍生物(例如，苄基鸟嘌呤；苄基胞嘧啶；氯烷烃；氯嘧啶等)；和b)融合多肽，其包含：i)对靶配体结合多肽具有特异性的抗体(例如，scfv或纳米抗体)；和ii)与缀合物中存在的亲和剂结合的多肽(例如，snap多肽；clip多肽；halo多肽等)。在一些情况下，本公开的组合物或组合包含：a)本公开的光控开关缀合物，其中所述亲和剂是如上所述的核苷碱基衍生物(例如，苄基鸟嘌呤；苄基胞嘧啶；氯烷烃；氯嘧啶等)；和b)融合多肽，其包含：i)对mglur具有特异性的纳米抗体或scfv；和ii)与缀合物中存在的亲和剂结合的多肽(例如，snap多肽；clip多肽；halo多肽等)。在一些情况下，本公开的组合物或组合包含：a)本公开的光控开关缀合物，其中所述亲和剂是如上所述的核苷碱基衍生物(例如，苄基鸟嘌呤；苄基胞嘧啶；氯烷烃；氯嘧啶等)；和b)融合多肽，其包含：i)对mglur2、mglur3、mglur5或mglur5具有特异性的纳米抗体或scfv；和ii)与缀合物中存在的亲和剂结合的多肽(例如，snap多肽；clip多肽；halo多肽等)。
[0343]
包含光控开关缀合物和两个融合多肽的组合物
[0344]
在一些情况下，融合多肽包含：a)配体(例如，本公开的光控开关缀合物中存在的配体)的受体；和b)融合伴侣，其中所述融合伴侣是被抗体特异性结合的抗原。在一些情况下，所述抗体是融合多肽，其包含：a)抗体；和b)融合伴侣，其中所述融合伴侣是snap多肽、clip多肽或halo多肽。其他合适的融合伴侣包括例如表位标签(例如，血凝素标签、flag标签、聚(his)标签等)。也适合使用的是基于卤基的寡核苷酸结合因子(hob)多肽。参见，例如，kossman等人(2016)chembiochem.17:1102。hob多肽结合氯己基部分。也适合使用的是甲氧苄啶(tmp)标签，它是大肠杆菌(e.coli)二氢叶酸还原酶(dhfr)的工程化形式，与甲氧苄啶衍生物形成非共价高亲和力复合物。参见，例如，gallagher等人(2009)acs chem.biol.4:547；及jing和cornish(2013)acs chem.biol.8:1704。
[0345]
snap
[0346]
在一些情况下，snap多肽包含与以下氨基酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：mdkdcemkrttldsplgklelsgce qglhri
iflgkgtsaadavevpapaavlggpeplmqatawlnayfhqpeaieefpvpalhhpvfqqesftrqvlwkllkvvkfgevisyshlaalagnpaataavktalsgnpvpilipchrvvqgdldvggyegglavkewllaheghrlgkpglg(seq id no:1)。snap多肽结合o
6-苄基鸟嘌呤(bg)。
[0347]
在一些情况下，snap多肽包含与以下氨基酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：dkdcemkrttldsplgklelsgceq glheikllgkgtsaadavevpapaavlggpeplmqatawlnayfhqpeaieefpvpalhhpvfqqesftrqvlwkllkvvkfgevisyqqlaalagnpaataavktalsgnpvpilipchrvvsssgavggyegglavkewllaheghrlgkpglg(seq id no:4)。
[0348]
在一些情况下，snap多肽或其变体与苄基鸟嘌呤结合。
[0349]
clip
[0350]
clip多肽可包含与以下氨基酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：mdkdcemkrttldsplgklelsgceqglhriif lgkgtsaadavevpapaavlggpepliqatawlnayfhqpeaieefpvpalhhpvfqqesftrqvlwkllkvvkfgeviseshlaalvgnpaataavntaldgnpvpilipchrvvqgdsdvgpylgglavkewllaheghrlgkpglg(seq id no:2)。clip多肽可结合o
2-苄基胞嘧啶(bc)。
[0351]
halo
[0352]
halo多肽可包含与以下氨基酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：maeigtgfpfdphyvevlgermhyvdvgprdg tpvlflhgnptssyvwrniiphvapthrciapdligmgksdkpdlgyffddhvrfmdafiealgleevvlvihdwgsalgfhwakrnpervkgiafmefirpiptwdewpefaretfqafrttdvgrkliidqnvfiegtlpmgvvrpltevemdhyrepflnpvdreplwrfpnelpiagepanivalveeymdwlhqspvpkllfwgtpgvlippaeaarlakslpnckavdigpglnllqednpdligseiarwlstleisg(seq id no:3)。halo多肽结合氯烷烃。
[0353]
载体
[0354]
本公开还提供了包含本文所述的组合物和/或组合的表达载体、递送载体和其他载体。
[0355]
表达载体包括但不限于适于通过任何方式将本公开的组合物体外或离体递送至本公开的细胞的任何载体。在一些实施方案中，表达载体包含质粒。在一些情况下，将质粒电穿孔到本公开的细胞中。当用于在体外或离体引入组合物时，本公开的表达载体还可以包括本公开的递送载体。
[0356]
递送载体包括但不限于，当处于体内或原位时(在完好眼睛的情况下)，适合将本公开的组合物体内递送至本公开的细胞的任何载体。本公开的递送载体包括但不限于病毒载体和非病毒载体。示例性的病毒载体包括但不限于任何血清型的腺相关载体。示例性的非病毒载体包括但不限于脂质载体、聚合物载体和颗粒载体。脂质载体包括但不限于脂质体、脂质纳米颗粒、胶束、脂质聚合物囊泡和外来体。聚合物载体包括但不限于聚合物囊泡、脂质纳米颗粒和纳米颗粒。颗粒载体包括但不限于所有几何形状和组成的纳米颗粒。
[0357]
在一些情况下，本公开的递送载体包含本公开的组合物，包括包含编码启动子的
序列的组合物，编码启动子的序列可操作地连接至编码感兴趣的多肽的多核苷酸。在本公开的递送载体的一些实施方案中，所述载体是病毒载体。在一些情况下，病毒载体是腺相关载体(aav)。在一些情况下，aav是重组aav(raav)。在一些情况下，raav包含从第一血清型的aav分离或衍生的序列和从第二血清型的aav分离或衍生的序列。在一些情况下，raav包含从第一血清型的aav分离或衍生的衣壳序列和从第二血清型的aav分离或衍生的衣壳插入序列。示例性的aav血清型包括但不限于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9及其任何组合。在一些情况下，本公开的aav载体包含从aav2、aav4、aav5和aav8中的一种或多种分离或衍生的序列。在一些情况下，本公开的aav载体包含来自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8和aav9中的一种或多种的野生型序列。在一些情况下，本公开的aav载体包含从aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8和aav9中的一种或多种分离或衍生的衣壳序列。在一些情况下，本公开的aav载体包含从aav2和aav4分离或衍生的衣壳序列。在一些情况下，本公开的aav载体包含从aav2和aav5分离或衍生的衣壳序列。在一些情况下，本公开的aav载体包含从aav2和aav8分离或衍生的衣壳序列。在一些情况下，本公开的aav载体包含重组或嵌合衣壳序列，其包含从aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8和aav9分离或衍生的两个或更多个序列。
[0358]
在本公开的某些具体实施方案中，经修饰的腺相关载体(aav)如在wo2018/022905和/或美国申请序列号63/032,206中所述那样使用，其内容以引用方式整体并入本文。
[0359]
在一些情况下，递送载体(包括aav载体)靶向视网膜细胞类型。在一些情况下，递送载体(包括aav载体)对视网膜细胞类型具有嗜性。在一些情况下，所述视网膜细胞类型是神经元。在一些情况下，所述视网膜细胞类型是视网膜神经节细胞。在一些情况下，所述视网膜细胞类型是水平细胞。在一些情况下，所述视网膜细胞类型是无长突细胞。在一些情况下，所述视网膜细胞类型是双极细胞。在一些情况下，所述视网膜细胞类型是光感受器细胞。在一些情况下，所述视网膜细胞类型不是光感受器。光感受器细胞包括视杆细胞和视锥细胞。
[0360]
在一些情况下，所述细胞是视网膜神经元或其祖细胞。在一些实施方案中，所述祖细胞是神经皱襞细胞、早期视网膜祖细胞(rpc)、晚期rpc、胚胎干细胞(esc)、诱导多能干细胞(ipsc)或视网膜色素上皮(rpe)细胞。在一些实施方案中，本公开的esc既不是从人胚胎或人组织分离的，也不是衍生的。
[0361]
在一些情况下，本公开的组合物可以递送至分化细胞和/或能够成为分化细胞类型的祖细胞。
[0362]
调控元件
[0363]
在一些情况下，编码本公开的多肽的核苷酸序列将可操作地连接至一个或多个转录调控元件。例如，在一些情况下，编码感兴趣的基因产物的核苷酸序列可操作地连接至启动子，诸如组成型启动子。在其他情况下，编码感兴趣的基因产物的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子。在一些情况下，编码感兴趣的基因产物的核苷酸序列可操作地连接至组织特异性或细胞类型特异性调控元件。例如，在一些情况下，编码感兴趣的基因产物的核苷酸序列可操作地连接至视网膜细胞特异性启动子。例如，在一些情况下，编码感兴趣的基因产物的核苷酸序列可操作地连接至光感受器特异性调控元件(例如，光感受器特异性启动子)，例如赋予可操作地连接的基因在光感受器细胞中选择性表达的调控元件。合适的光
感受器特异性调控元件包括例如视紫红质启动子；视紫红质激酶启动子(young等人(2003)ophthalmol.vis.sci.44:4076)；β磷酸二酯酶基因启动子(nicoud等人(2007)j.gene med.9:1015)；色素性视网膜炎基因启动子(nicoud等人(2007)同上)；光感受器间类视黄醇结合蛋白(irbp)基因增强子(nicoud等人(2007)同上)；irbp基因启动子(yokoyama等人(1992)exp eye res.55:225)。
[0364]
合适的启动子包括但不限于cag启动子(miyazaki等人(1989)gene 79:269)；巨细胞病毒(cmv)启动子；谷氨酸促代谢型受体6(grm6)启动子(cronin等人(2014)embo mol.med.6:1175)；昴宿星团启动子(portales-casamar等人(2010)proc.natl.acad.sci.usa 107:16589)；胆碱乙酰转移酶(chat)启动子(misawa等人(1992)j.biol.chem.267:20392)；囊泡谷氨酸转运体(v-glut)启动子(zhang等人(2011)brain res.1377:1)；谷氨酸脱羧酶(gad)启动子(rasmussen等人(2007)brain res.1144:19；ritter等人(2016)j.gene med.18:27)；胆囊收缩素(cck)启动子(ritter等人(2016)j.gene med.18:27)；小清蛋白(pv)启动子；生长抑素(sst)启动子；神经肽y(npy)启动子；和血管活性肠肽(vip)启动子。合适的启动子包括但不限于红锥视蛋白启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子和glur启动子(例如，glur6启动子；也称为grm6)。合适的启动子包括但不限于卵黄状黄斑营养不良2(vmd2)基因启动子和光感受器间类视黄醇结合蛋白(irbp)基因启动子。同样适合使用的是l7启动子(oberdick等人(1990)science248:223)、thy-1启动子、恢复蛋白启动子(wiechmann和howard(2003)curr.eye res.26:25)、钙结合蛋白启动子和β-肌动蛋白启动子。合适的启动子包括合成的(非天然存在的)启动子/增强子组合。
[0365]
根据本公开有用的其他合适的启动子包括，例如，γ-突触核蛋白(sncg)启动子(例如，chaffiol等人(2017)mol.ther.25(11)2546)、cbh启动子(例如，grey等人(2011)hum.gene ther.22(9):1143-53)、minicag启动子(例如，gray等人(2011)hum.gene ther.22(9):1143-53)、神经丝重(nefh)启动子(millington-ward等人(2020)sci.rep.10:16515)、g蛋白偶联受体激酶1(grk1)启动子(例如，khani等人(2007)invest.ophthalmol.vis.sci.48(9):3954-61)、视黄醛结合蛋白1(rlbp1)启动子(例如，choi等人(2015)mol.ther.methods clin.dev.2:15022；vogel等人(2007)invest.ophthalmol.vis.sci.48,3872-3877)、卵黄状黄斑营养不良2(vmd2)启动子(例如，conlon等人(2013)hum.gene ther.clin.dev.24,23
–
28)、突触蛋白i(syn1)启动子(例如，kugler等人(2003))、enhsyn1启动子(例如，hioki等人(2007)gene ther.14(11):872-82)或其功能片段或变体。
[0366]
在本公开的一些实施方案中，所述组合物还包含以下中的一种或多种：包含增强子的序列、包含内含子或其任何部分的序列、包含外显子或其任何部分的序列、包含kozak序列的序列、包含转录后响应元件(pre)的序列、包含反向末端重复(itr)序列的序列、包含长末端重复(ltr)序列的序列和聚a序列。
[0367]
在本公开的组合物的一些实施方案中，所述组合物还包含连接元件。本公开的连接元件可以将编码启动子的序列连接至编码感兴趣的多肽的序列。可替代地或另外，本公开的连接元件可以将组合物可逆或不可逆地连接至表面、标签、标记(可检测的或序列条形码)、配体、表位、捕获探针、可选择标志物或本公开的递送媒介物中的一种或多种。
[0368]
组合物
[0369]
实施方案还提供了包含本公开的缀合物的组合物。包含本公开的缀合物的组合物可包括以外的一种或多种：盐，例如nacl、mgcl2、kcl、mgso4等；缓冲剂，例如tris缓冲液、n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-(2-乙磺酸)(hepes)、2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)、2-(n-吗啉)乙磺酸钠盐(mes)、3-(n-吗啉)丙磺酸(mops)、n-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(taps)等；增溶剂；洗涤剂，例如非离子型洗涤剂诸如吐温-20(tween-20)、nonidet-p40等；核酸酶抑制剂；等等。
[0370]
药物组合物
[0371]
本公开提供了包含本公开的缀合物或本公开的组合物的药物组合物。在一些情况下，所述药物组合物适合施用给有需要的个体。在一些情况下，所述药物组合物适合施用给有需要的个体，其中所述个体是人。
[0372]
包含本公开的缀合物或组合物的药物组合物可以单独地或与其他补充活性剂组合施用给患者。所述药物组合物可以使用多种方法中的任一种来制造，包括但不限于常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制备、磨细、乳化、包封、包埋和冻干。所述药物组合物可以呈多种形式中的任一种，包括但不限于无菌溶液、悬浮液、乳液、冻干剂、片剂、丸剂、丸粒剂、胶囊、粉剂、糖浆、酏剂或任何其他适合施用的剂型。
[0373]
包含本公开的缀合物或组合物的药物组合物可任选地包含利于将活性成分加工成药学上可接受的组合物的药学上可接受的载剂。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指在施用时基本上没有长期或永久有害作用的任何载剂，并且涵盖诸如“药学上可接受的媒介物、稳定剂、稀释剂、助剂或赋形剂”等术语。此类载剂通常与活性化合物混合，或容许稀释或包裹活性化合物，并且可以是固体、半固体或液体试剂。应当理解，活性成分可以是可溶的或者可以在所需载剂或稀释剂中作为悬浮液递送。可以使用多种药学上可接受的载剂中的任何一种，包括但不限于水性介质，诸如蒸馏水、去离子水、盐水；溶剂；分散介质；包衣；抗菌剂和抗真菌剂；等渗剂和吸收延迟剂；或任何其他非活性成分。药理学上可接受的载剂的选择可以取决于施用模式。除非任何药理学上可接受的载剂与活性成分不相容，否则考虑将其用于药学上可接受的组合物中。此类药物载剂的特定用途的非限制性实例可在以下找到：“pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems”(howard c.ansel等人编辑，lippincott williams&wilkins publishers，1999年第7版)；“remington:the science and practice of pharmacy”(alfonso r.gennaro编辑，lippincott,williams&wilkins，2000年第20版)；“goodman&gilman’s the pharmacological basis of therapeutics”joel g.hardman等人编辑，mcgraw-hill professional，2001年第10版增刊)；和“handbook of pharmaceutical excipients”(raymond c.rowe等人，apha publications，2003年第4版)。
[0374]
主题药物组合物可以任选地包括但不限于其他药学上可接受的组分，包括但不限于缓冲剂、防腐剂、张度调节剂、盐、抗氧化剂、生理物质、药理物质、填充剂、乳化剂、润湿剂、甜味剂或调味剂等。可以使用各种缓冲剂和用于调节ph的方式制备本说明书中公开的药物组合物，条件是所得制剂是药学上可接受的。此类缓冲剂包括但不限于乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水和硼酸盐缓冲剂。应理解，酸或碱可用于根据需要调节组合物的ph。药学上可接受的抗氧化剂包括但不限于偏亚硫酸
氢钠、硫代硫酸钠、乙酰半胱氨酸、丁基化羟基苯甲醚以及丁基化羟基甲苯。有用的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯丁醇、硫柳汞、醋酸苯汞、硝酸苯汞和稳定的氧氯组合物，例如puritetm。适合包含在主题药物组合物中的张度调节剂包括但不限于盐，诸如氯化钠、氯化钾、甘露醇或甘油以及其他药学上可接受的张度调节剂。应当理解，药理学领域中已知的这些和其他物质可以包含在主题药物组合物中。
[0375]
可充当药学上可接受的载剂的材料的一些实例包括(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)黄芪粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液(ringer's solution)；(19)乙醇；(20)ph缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；和(22)药物配制剂中采用的其他无毒相容性物质。
[0376]
本公开的缀合物或组合物可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起配制。多种药学上可接受的赋形剂是本领域已知的，本文无需详细讨论。药学上可接受的赋形剂已经在多个出版物中充分描述，包括，例如a.gennaro(2000)“remington:the science and practice of pharmacy,”第20版，lippincott,williams,&wilkins；pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems(1999)h.c.ansel等人编辑，第7版，lippincott,williams,&wilkins；及handbook of pharmaceutical excipients(2000)a.h.kibbe等人编辑，第3版，amer.pharmaceutical assoc。
[0377]
药学上可接受的赋形剂，诸如媒介物、佐剂、载剂或稀释剂，对公众来说是容易获得的。而且，药学上可接受的辅助物质，诸如ph调节剂和缓冲剂、张度调节剂、稳定剂、湿润剂等对公众来说是容易获得的。
[0378]
在本公开的方法(如下所述)中，本公开的缀合物或组合物可以使用能够引起期望的疾病状况或症状减轻的任何便利方式施用于宿主。因此，本公开的缀合物或组合物可以掺入用于治疗性施用的多种配制剂中。更具体地，本公开的缀合物或组合物可以通过与适当的药学上可接受的载剂或稀释剂组合配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，诸如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。
[0379]
本公开的缀合物或组合物可单独使用或与制备片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊的适当添加剂组合使用，例如与常规添加剂，诸如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合使用；与粘合剂，诸如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶组合使用；与崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠组合使用；与润滑剂，诸如滑石粉或硬脂酸镁组合使用；并且如果需要，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂组合使用。此类制剂可以用于口服施用。
[0380]
本公开的缀合物或组合物可以通过将它们在水性或非水溶剂诸如植物油或其他类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂族酸或丙二醇的酯中且如果需要与常规添加剂诸如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂一起溶解、悬浮或乳化，配制成注射用制剂。适合注射的配制剂可以通过玻璃体内、眼内、肌内、皮下、舌下施用或其他施用途径施
用，例如注射到牙龈组织或其他口腔组织中。此类配制剂也适合局部施用。
[0381]
在一些情况下，本公开的缀合物或组合物经由玻璃体内注射进行施用。在一些情况下，本公开的缀合物或组合物经由眼内施用进行施用。在一些情况下，本公开的缀合物或组合物经由视网膜下注射进行施用。
[0382]
本公开的缀合物或组合物可以呈气雾剂配制剂利用以经由吸入施用。本公开的缀合物或组合物可以配制到加压可接受的推进剂中，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
[0383]
此外，本公开的缀合物或组合物可通过与多种基质诸如乳化基质或水溶性基质混合制成栓剂。本公开的缀合物或组合物可以经由栓剂经直肠施用。栓剂可以包括媒介物，诸如可可脂、碳蜡和聚乙二醇，它们在体温下熔化，但在室温下固化。
[0384]
可以提供用于口服或直肠施用的单位剂型，诸如糖浆、酏剂和悬浮液，其中每个剂量单位，例如茶匙、汤匙、片剂或栓剂，含有预定量的含有一种或多种抑制剂的组合物。类似地，用于注射或静脉内施用的单位剂型可以在组合物中包含本公开的缀合物，作为在无菌水、生理盐水或另一种药学上可接受的载剂中的溶液。
[0385]
如本文所用的术语“单位剂型”是指适合作为用于人类和动物受试者的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有预定量的本公开的缀合物，经计算其量足以与药学上可接受的稀释剂、载剂或媒介物联合产生期望效果。本公开的缀合物的规格取决于所采用的特定化合物和要达到的效果，以及与宿主中的每种化合物相关的药效学。
[0386]
本公开的缀合物或组合物可以作为注射剂施用。可注射组合物制备成液体溶液或悬浮液；也可以制备适于在注射前溶解或悬浮在液体媒介物中的固体形式。所述制剂也可以乳化或将活性成分包封在脂质体媒介物中。
[0387]
本公开的缀合物或组合物可以与药学上可接受的赋形剂一起配制在药物组合物中。在一些情况下，主题药物组合物将适合施用给受试者，例如，将是无菌的。例如，在一些情况下，主题药物组合物将适合施用给人类受试者，例如，在组合物是无菌的并且不含可检测的热原和/或其他毒素的情况下。
[0388]
本公开的缀合物或组合物可以配制成适合施用于个体的眼部的药物组合物。例如，本公开的缀合物或组合物可以配制成适合玻璃体内施用的药物组合物。
[0389]
本公开的缀合物或组合物可以与增加缀合物的体内半衰期的药学上可接受的赋形剂一起配制成药物组合物中。例如，在一些情况下，本公开的组合物包含：i)本公开的缀合物或组合物；和ii)环糊精。
[0390]
合适的环糊精包括例如α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、2,6-二-o-乙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精、甲基化环糊精(例如，甲基化β-环糊精；例如，在所有c-2和c-6位置上具有甲基的β-环糊精，称为dimeb)；crysmeb；rameb；等等)、七-(2,3,6-三-o-甲基)-β-环糊精(trimeb)、麦芽糖基-β-环糊精等。在一些情况下，本公开的组合物包含：i)本公开的缀合物或组合物；和ii)环糊精。在一些情况下，本公开的组合物包含：i)本公开的缀合物或组合物；和ii)β-环糊精。在一些情况下，本公开提供了通过将试剂与环糊精组合配制来将所述试剂经玻璃体内施用给需要所述试剂的受试者的方法。如本文所证明，在玻璃体内施用连同环糊精一起配制的本公开的缀合物之后，可以实现优良的体内功效和/或治疗效果的持久性。
[0391]
在一些情况下，本公开的组合物包含：i)本公开的缀合物或组合物；和ii)烷基糖
苷。在一些情况下，烷基糖苷选自十一烷基麦芽糖苷、十二烷基麦芽糖苷、十三烷基麦芽糖苷、十四烷基麦芽糖苷、蔗糖单-十二烷酸酯、蔗糖单-十三烷酸酯和蔗糖单-十四烷酸酯。
[0392]
在一些情况下，本公开的缀合物或组合物通过连续递送系统递送。术语“连续递送系统”在本文中与“受控递送系统”可互换使用，并且涵盖与导管、注射设备等组合的连续(例如，受控)递送设备(例如，泵)，其中多种递送设备是本领域已知。
[0393]
在一些情况下，本公开的缀合物或组合物存在于(例如，包封在)胶束(例如，纳米胶束)、纳米颗粒或脂质体中。例如，在一些情况下，本公开的缀合物存在于(例如，包封在)包含聚羟乙基天冬酰胺(phea)和聚乙二醇化phea的共聚物的纳米胶束中。作为另一个实例，在一些情况下，本公开的缀合物存在于(例如，包封在)包含聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)共聚物的纳米胶束中。作为另一个实例，在一些情况下，本公开的缀合物存在于(例如，包封在)纳米颗粒中，所述纳米颗粒包含白蛋白、海藻酸钠、壳聚糖、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)、聚(乳酸)(pla)和聚己内酯中的一种或多种。作为另一个实例，在一些情况下，本公开的缀合物存在于(例如，包封在)脂质体中，所述脂质体包含二-十二烷基二甲基溴化铵、硬脂胺或n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵。
[0394]
方法
[0395]
本公开的缀合物可用于调节靶配体结合多肽的活性。本公开的缀合物可用于调节包含本公开的缀合物的细胞的活性，其中所述细胞包含靶配体结合多肽。因此本公开提供了一种调节靶配体结合多肽的活性的方法；和一种调节包含本公开的缀合物的细胞的活性的方法，其中所述细胞包含靶配体结合多肽。在一些情况下，本公开的方法包括将缀合物(或包含缀合物的细胞或组织)暴露于适当的光照条件，使得配体与靶配体结合多肽的配体结合位点结合。在一些情况下，本公开的方法包括将缀合物(或包含缀合物的细胞或组织)暴露于适当的光照条件，使得配体不与靶配体结合多肽的配体结合位点结合。
[0396]
本公开提供了一种调节靶配体结合多肽的活性的方法，所述方法包括：a)使靶配体结合多肽与本公开的缀合物接触，产生光可调控的多肽；并且b)将光可调控的多肽暴露于引起配体与光可调控的多肽结合的波长的光，其中配体与光可调控的多肽的结合会调节光可调控的多肽的活性。本公开提供了一种调节靶配体结合多肽的活性的方法，所述方法包括：a)使靶配体结合多肽与本公开的缀合物接触，产生光可调控的多肽；并且b)将光可调控的多肽暴露于引起配体从光可调控的多肽的配体结合位点释放的波长的光，其中配体从光可调控的多肽的配体结合位点释放会调节光可调控的多肽的活性。
[0397]
靶配体结合多肽(或光可调控的多肽)的“调节活性”包括增加多肽的活性；抑制多肽的活性；使多肽对另一种(例如，非光)刺激敏感)；降低多肽对另一种刺激的敏感性；增加另一种刺激活化多肽的功效；降低另一种刺激活化多肽的功效。所述活性取决于受调节的多肽。例如，在一些情况下，配体是激动剂，并且配体与靶配体结合多肽(或光可调控的多肽)的结合引起靶配体结合多肽(或光可调控的多肽)的活化。在其他情况下，配体是拮抗剂，并且配体与靶配体结合多肽(或光可调控的多肽)的结合引起靶配体结合多肽(或光可调控的多肽)的抑制、减敏或失活。
[0398]
靶配体结合多肽包括但不限于转录调控因子、离子通道、阳离子通道、配体门控离子通道、电压门控离子通道、群体感应因子、信息素受体、神经递质受体、酶、酶、运动蛋白、转运体、膜转运蛋白、g蛋白偶联受体、g蛋白、受体酪氨酸激酶、支架蛋白、衔接蛋白、细胞骨
架蛋白、粘附蛋白、膜靶向蛋白、指导分泌的蛋白和蛋白的定位或蛋白相互作用结构域。在一些情况下，靶配体结合多肽是阳离子通道。在一些情况下，靶配体结合多肽是阴离子通道。在一些情况下，靶配体结合多肽是钾通道。在一些情况下，靶配体结合多肽是钠通道。在一些情况下，靶配体结合多肽是钙通道。
[0399]
在一些情况下，靶配体结合多肽处于无细胞组合物中；即，靶配体结合多肽不存在于细胞中。
[0400]
在一些情况下，靶配体结合多肽存在于体外细胞中。在一些情况下，靶配体结合多肽存在于体内细胞中。
[0401]
在靶配体结合多肽存在于细胞中的情况下，细胞可以是任何类型的细胞。例如，所述细胞可以是哺乳动物细胞，例如人细胞、非人灵长类动物细胞、啮齿动物细胞等。所述细胞可以是视网膜细胞、肌肉细胞、神经元细胞、血细胞(例如，有核血细胞)、上皮细胞、内皮细胞、皮肤细胞、肺细胞等。
[0402]
在一些情况下，靶配体结合多肽存在于细胞中。在一些情况下，所述细胞是视网膜细胞。在一些情况下，所述细胞是无长突细胞。在一些情况下，所述细胞是神经节细胞(例如，视网膜神经节细胞(rgc))。在一些情况下，所述细胞是双极细胞。在一些情况下，所述细胞是缪勒氏细胞(mueller cell)。在一些情况下，所述细胞是on-双极细胞(on-bc)。在一些情况下，所述细胞是off-双极细胞。
[0403]
本公开提供了一种调节靶细胞活性的方法，所述方法包括将靶细胞暴露于光，其中所述靶细胞包含本公开的缀合物和靶配体结合多肽，其中光具有引起配体与靶配体结合多肽结合的波长，并且其中所述配体与靶配体结合多肽的结合会调节靶细胞的活性。本公开提供了一种调节靶细胞活性的方法，所述方法包括将靶细胞暴露于光，其中所述靶细胞包含本公开的缀合物和靶配体结合多肽，其中光具有引起配体从靶配体结合多肽释放的波长，并且其中所述配体从靶配体结合多肽的结合释放会调节靶细胞的活性。在一些情况下，所述细胞是靶细胞群。在一些情况下，所述靶细胞或细胞群存在于组织中。
[0404]
本公开提供了一种向通常不直接对光响应的视网膜细胞引入对光的敏感性或增强已具光敏性的视网膜细胞的光响应的方法，所述方法包括将视网膜细胞暴露于光，其中所述视网膜细胞包含本公开的缀合物和靶配体结合多肽，其中光具有引起配体与靶配体结合多肽结合的波长，并且其中所述配体与靶配体结合多肽的结合会调节视网膜细胞响应于光的活性。例如，视网膜细胞中的靶多肽可以是促代谢型谷氨酸受体，诸如无长突细胞中的mglur2或mglur8或者双极细胞中的mglur6或mglur7或者神经节细胞中的mglur4。在这些情况下，合适的可光致异构部分-配体的组合可以是具有d立体异构体连键的偶氮苯-谷氨酸盐。参见，例如，broichhagen等人(2015)acs central science 1,383
–
393；和levitz等人(2017)proc.natl.acad.sci.usa 114,e3546-e3554。作为其他实例，靶多肽可以是离子型谷氨酸受体，诸如双极细胞、无长突细胞或神经节细胞中的gluk2、gluk5、glun2a或glun2b。在这些情况下，合适的可光致异构部分-配体的组合可以是具有l立体异构体连键的偶氮苯-谷氨酸盐(参见，例如，volgraf等人(2006)nature chem.bio.2:47；volgraf等人(2007)j.am.chem.soc.129:260；和berlin等人(2016)elife 5:e12040)或atg(参见，例如，laprell等人(2015)nat.commun.6:8076。作为另一个实例，靶多肽可以是离子型谷氨酸受体，诸如glura1。在这种情况下，合适的可光致异构部分-配体的组合可以是shubqx-3(参
见，例如，barber等人(2017)chem.sci.8:611)。作为另一个实例，靶多肽可以是无长突细胞或神经节细胞中的离子型烟碱型乙酰胆碱受体，并且配体可以是ac-5、maach、hochpe、mg-624或mahoch(参见，例如，tochitsky等人(2012)nat.chem.4:105。作为另一个实例，靶多肽可以是无长突细胞或神经节细胞中的离子型gaba-a受体，并且配体可以是pag-2a、pag-2b或pag-3c。作为另一个实例，靶多肽可以是神经节细胞中的离子型p2x受体，并且配体可以是mea-tma(参见，例如，lemoine等人(2013)proc.natl.acad.sci.usa 110:20813。
[0405]
本公开提供了治疗特征在于对光的响应性降低的眼病的方法，所述方法包括将本公开的缀合物或包含本公开的缀合物的组合物(例如，药物组合物)施用至患有所述眼病的个体的眼部。在一些情况下，经由玻璃体内注射将所述缀合物或包含所述缀合物的组合物(例如，药物组合物)施用于个体。在一些情况下，经由眼内施用将所述缀合物或包含所述缀合物的组合物(例如，药物组合物)施用于个体。在一些情况下，经由视网膜下注射将所述缀合物或包含所述缀合物的组合物(例如，药物组合物)施用于个体。
[0406]
特征在于对光的响应性降低的眼病包括但不限于遗传性视网膜退行性疾病，诸如色素性视网膜炎和年龄相关性黄斑变性。适合用本公开的方法治疗的眼病包括但不限于色素性视网膜炎、黄斑变性、视网膜劈裂症和莱伯氏先天性黑蒙(leber’s congenital amaurosis)，以及糖尿病性视网膜病。
[0407]
用于增强视觉功能的方法
[0408]
本公开提供了用于增强或恢复个体眼部的视觉功能的方法。所述方法包括向个体的眼部施用有效量的本公开的缀合物或组合物。
[0409]
将本公开的缀合物或组合物施用于个体的眼部可以为个体提供图形化视觉和图像识别。图像识别可以是静态图像和/或移动图像的。
[0410]
在一些情况下，向个体的眼部施用有效量的本公开的缀合物或组合物提供约10-5
w/cm2至约10w/cm2的光强度下的图像识别。在一些情况下，向个体的眼部施用有效量的本公开的缀合物或组合物提供小于5w/cm2，例如小于3w/cm2，小于2w/cm2或小于1w/cm2的光强度下的图像识别。例如，向个体的眼部施用有效量的本公开的缀合物或组合物提供约10-5
w/cm2至约10-1
w/cm2、约10-4
w/cm2至约10-2
w/cm2、约10-4
w/cm2至约1w/cm2、约10-4
w/cm2至约10-1
w/cm2或约10-4
w/cm2至约5x 10-1
w/cm2的光强度下的图像识别。在一些情况下，向个体的眼部施用有效量的本公开的缀合物或组合物提供约10-5
w/cm2至约10-4
w/cm2、约10-4
w/cm2至约10-3
w/cm2、约10-3
w/cm2至约10-2
w/cm2、约10-2
w/cm2至约10-1
w/cm2或约10-1
w/cm2至约1w/cm2的光强度下的图像识别。
[0411]
在一些情况下，本公开的缀合物包含如以上所讨论的“460偶氮苯”。在一些情况下，包含“460偶氮苯”的本公开的缀合物提供的“关闭”动力学是包含“偶氮苯380”的缀合物赋予视网膜细胞的“关闭”动力学的至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1,000倍、至少2,000倍、至少3,000倍、至少4,000倍、至少5,000倍、至少7,500倍、至少10,000倍或超过10,000倍。“关闭”动力学是指在移除光时(在黑暗中)关闭光响应的动力学。例如，在一些情况下，包含“460偶氮苯”的本公开的缀合物提供的“关闭”动力学小于10秒、小于5秒、小于1秒、小于900毫秒(ms)、小于小于800ms、小于700ms、小于600ms、小于500ms或小于400ms。在一些情况下，包含“460偶氮苯”的本公开的缀合物提供的“关闭”动力学为约100ms至约200ms、约200ms至约300ms、约300ms至约400ms、约400ms至约500ms、约
500ms至约600ms、约600ms至约700ms、约700ms至约800ms、约800ms至约900ms、约900ms至约1秒、约1秒至约5秒或约5秒至约10秒。
[0412]
在一些情况下，本公开的缀合物包含如以上所讨论的“460偶氮苯”。包含“460偶氮苯”的本公开的缀合物提供可见光(例如，蓝光)的激发。因此，向眼部施用包含“460偶氮苯”的本公开的缀合物提供眼部对可见光的响应性。
[0413]
本公开的缀合物或组合物以有效将个体的视觉功能与施用缀合物之前的视觉功能相比增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少2倍、至少5倍、至少10倍或超过10倍的量施用。视觉功能的测试在本领域中是已知的，并且任何已知的测试都可以应用于评估视觉功能。
[0414]
在一些情况下，本公开的缀合物提供当图像以大于约4厘米/秒(cm/s)、大于约5cm/s、大于约6cm/s、大于约7cm/s或大于约8cm/s的速度移动时，对移动图像的视觉检测。在一些情况下，本公开的缀合物提供当图像以大于8cm/s，例如8cm/s至约9cm/s、9cm/s至10cm/s、10cm/s至12cm/s、12cm/s至14cm/s或14cm/s至约16cm/s的速度移动时，对移动图像的视觉检测。
[0415]
在一些情况下，本公开的缀合物是在实施例中称为
4x
bgag
12,460
(并且在图1j和图4a中描绘)的缀合物。
4x
bgag
12,460
缀合物可以提供增强的视觉功能。
4x
bgag
12,460
缀合物可以提供图形化视觉和图像识别。图像识别可以是静态图像和/或移动图像的。在一些情况下，
4x
bgag
12,460
缀合物提供当图像以大于约4厘米/秒(cm/s)、大于约5cm/s、大于约6cm/s、大于约7cm/s或大于约8cm/s的速度移动时，对移动图像的视觉检测。在一些情况下，
4x
bgag
12460
缀合物提供当图像以大于8cm/s，例如8cm/s至约9cm/s、9cm/s至10cm/s、10cm/s至12cm/s、12cm/s至14cm/s或14cm/s至约16cm/s的速度移动时，对移动图像的视觉检测。在一些情况下，
4x
bgag
12,460
缀合物提供是单价bgag
12,460
的100倍至250倍的光敏度。
[0416]
在一些情况下，经由玻璃体内注射将本公开的缀合物或包含所述缀合物的组合物(例如，药物组合物)施用于个体。在一些情况下，经由眼内施用将所述缀合物或包含所述缀合物的组合物(例如，药物组合物)施用于个体。在一些情况下，经由视网膜下注射将所述缀合物或包含所述缀合物的组合物(例如，药物组合物)施用于个体。
[0417]
在一些情况下，向个体施用多个剂量的本公开的缀合物或组合物。施用频率可根据多种因素中的任一种，例如症状的严重程度等变化。例如，在一些情况下，施用本公开的缀合物或组合物每6周一次、每5周一次、每月一次、每4周一次、每月两次、每月三次、每隔一周一次(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一天一次(qod)、每天一次(qd)、每天两次(qid)或每天三次(tid)。
[0418]
本公开的缀合物或组合物可以在约1天至约1年或超过1年的时间段内施用于个体。例如，本公开的缀合物可以施用于个体持续1周至2周、2周至1个月、1个月至4个月、4个月至6个月、6个月至1年或超过1年的时间段。
[0419]
适合用本公开的方法治疗的个体包括由于视杆和视锥光感受器的损失而视觉功能降低的个体。在一些情况下，所述个体患有遗传性视网膜退行性疾病，诸如色素性视网膜炎、视网膜劈裂症和莱伯氏先天性黑蒙。在一些情况下，所述个体患有选自以下的眼部疾病(例如，遗传性眼部疾病)：色素性视网膜炎、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、视网膜劈裂症和莱伯氏先天性黑蒙及糖尿病性视网膜病。适合用本公开的方法治疗的个体包括患有视网
膜变性病状的个体，其中自然光敏感性丧失并且视力因此受到损害，但其中视网膜回路中晚期的神经元(例如输出到脑部的双极细胞或无长突中间神经元或神经节细胞)未受影响并且可以通过引入锥视蛋白而直接使其对光敏感。
[0420]
适合用本公开的方法治疗的个体包括具有外伤性或急性视网膜损伤，没有基因或遗传基础的个体。例如，在一些情况下，所述个体已经经历了由钝伤，诸如爆炸性损伤(例如，在军事战役中)引起的，或由头部撞击(例如，在车祸过程中)或其他导致头部撞击的事故引起的视网膜脱离。在一些情况下，由于视网膜从底层rpe创伤性脱离，光感受器损失，但内部视网膜神经元是完好的。适合用本公开的方法治疗的个体包括由于急性光损伤、激光暴露或化学毒性而具有光感受器损失的个体。
[0421]
设备
[0422]
本公开提供了包含本公开的缀合物或组合物的设备。
[0423]
本公开的设备可以包括：a)包含本公开的组合物(包含本公开的缀合物的组合物)的容器；和b)用于将所述组合物引入个体眼部中的工具。在一些情况下，用于将所述组合物引入个体眼部中的工具包括针头。在一些情况下，所述容器包括注射器。所述设备在一些情况下将是无菌的。在一些情况下，所述设备是可植入的。
[0424]
本公开的非限制性方面的实例
[0425]
方面集合a
[0426]
上述本主题的各方面，包括实施方案，单独或与一个或多个其他方面或实施方法组合可以是有益的。在不限制前面的描述的情况下，下文提供了本公开的某些非限制性方面。如本领域技术人员在阅读本公开时将显而易见的，每个单独编号的方面可以与前面或以下单独编号的方面中的任何一个一起使用或组合。这旨在为所有此类方面的组合提供支持，并且不限于下面明确提供的方面的组合：
[0427]
方面1.一种缀合物，其包含：
[0428]
a)特异性结合以下的亲和剂：
[0429]
i)靶配体结合多肽；或者
[0430]
ii)与靶配体结合多肽结合的多肽；
[0431]
b)支链接头；和
[0432]
c)两个或更多个可光致异构调控因子，每个可光致异构调控因子独立地包含：
[0433]
i)可光致异构基团；和
[0434]
ii)与所述靶配体结合多肽结合的配体。
[0435]
方面2.如方面1所述的缀合物，其中所述亲和剂包含苄基鸟嘌呤。
[0436]
方面3.如方面1所述的缀合物，其中所述亲和剂包含氯烷烃。
[0437]
方面4.如方面1所述的缀合物，其中所述亲和剂包含苄基胞嘧啶。
[0438]
方面5.如方面1所述的缀合物，其中所述亲和剂包含抗体。
[0439]
方面6.如方面1所述的缀合物，其中所述亲和剂包含适体。
[0440]
方面7.如方面1所述的缀合物，其中所述亲和剂包含小分子或肽。
[0441]
方面8.如方面1-7中任一项所述的缀合物，其中所述支链接头包含两条或更多条臂，每条臂独立地包含可光致异构调控因子。
[0442]
方面9.如方面8所述的缀合物，其中所述支链接头包含两条臂。
[0443]
方面10.如方面8所述的缀合物，其中所述支链接头包含四条臂。
[0444]
方面11.如方面1-10中任一项所述的缀合物，其中所述支链接头包含式(bl)的部分：
[0445][0446]
其中n是1至10的整数。
[0447]
方面12.如方面11所述的缀合物，其中n为1。
[0448]
方面13.如方面11所述的缀合物，其中n为3。
[0449]
方面14.如方面1-13中任一项所述的缀合物，其中所述可光致异构基团包含选自以下的部分：偶氮苯、环状偶氮苯、偶氮杂芳烃、俘精酸酐、螺吡喃、三苯甲烷、硫靛、二芳基乙烯和过度拥挤的烯烃。
[0450]
方面15.如方面14所述的缀合物，其中所述可光致异构基团包含包含偶氮苯。
[0451]
方面16.如方面1-15中任一项所述的缀合物，其中所述配体是激动剂、拮抗剂、变构调节剂或阻断剂。
[0452]
方面17.如方面1-16中任一项所述的缀合物，其中所述靶配体结合多肽选自转录调控因子、离子通道、阳离子通道、配体门控离子通道、电压门控离子通道、群体感应因子、信息素受体、神经递质受体、g蛋白偶联受体和酶。
[0453]
方面18.如方面17所述的缀合物，其中所述阳离子通道是钾通道、钠通道或钙通道。
[0454]
方面19.如方面1-16中任一项所述的缀合物，其中所述靶配体结合多肽是谷氨酸受体、促代谢型谷氨酸受体、离子型谷氨酸受体、离子型烟碱型乙酰胆碱受体、离子型gaba-a受体、促代谢型gaba-b受体、促代谢型多巴胺受体、离子型嘌呤能p2x受体、促代谢型嘌呤能p2y受体、促代谢型血清素受体、离子型血清素受体、离子型甘氨酸受体、阳离子通道、钾通道、钙通道、钠通道、质子通道、阴离子通道或氯通道。
[0455]
方面20.一种系统，其包括：
[0456]
a)根据方面1-19中任一项的缀合物；
[0457]
b)融合多肽，其包含：
[0458]
i)靶配体结合多肽，其包含所述缀合物中存在的所述配体的结合位点；和
[0459]
ii)结合所述亲和剂的异源融合伴侣。
[0460]
方面21.如方面20所述的系统，其中所述异源融合伴侣包含与seq id no:1中列出的snap多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0461]
方面22.如方面20所述的系统，其中所述异源融合伴侣包含与seq id no:2中列出的clip多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0462]
方面23.如方面20所述的系统，其中所述异源融合伴侣包含与seq id no:3中列出的halo多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0463]
方面24.一种系统，其包括：
[0464]
a)根据方面1-19中任一项的缀合物；
[0465]
b)包含编码融合多肽的核苷酸序列的核酸，所述融合多肽包含：
[0466]
i)靶配体结合多肽，其包含所述配体的结合位点；和
[0467]
ii)结合所述亲和剂的异源融合伴侣。
[0468]
方面25.如方面24所述的系统，其中所述异源融合伴侣包含与seq id no:1中列出的snap多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0469]
方面26.如方面24所述的系统，其中所述异源融合伴侣包含与seq id no:3中列出的halo多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0470]
方面27.如方面24所述的系统，其中所述异源融合伴侣包含与seq id no:2中列出的clip多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0471]
方面28.如方面24-27中任一项所述的系统，其中所述核酸存在于重组腺病毒相关病毒(aav)病毒体中。
[0472]
方面29.如方面28所述的系统，其中所述aav病毒体包含与包含相应野生型衣壳多肽的aav病毒体相比，提供所述aav病毒体对枧网膜细胞增加的感染性的变体衣壳多肽。
[0473]
方面30.一种系统，其包括：
[0474]
a)根据方面1-19中任一项的缀合物；
[0475]
b)第一融合多肽，其包含：
[0476]
i)靶配体结合多肽，其包含所述配体的结合位点；和
[0477]
ii)异源多肽；和
[0478]
c)第二融合多肽，其包含：
[0479]
i)结合所述异源多肽的抗体；和
[0480]
ii)结合所述亲和剂的异源融合伴侣。
[0481]
方面31.如方面30所述的系统，其中结合所述亲和剂的所述异源融合伴侣包含与seq id no:1中列出的snap多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0482]
方面32.如方面30所述的系统，其中结合所述亲和剂的所述异源融合伴侣包含与seq id no:3中列出的halo多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0483]
方面33.如方面30所述的系统，其中结合所述亲和剂的所述异源融合伴侣包含与seq id no:2中列出的clip多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0484]
方面34.如方面30-33中任一项所述的系统，其中所述抗体是单链fv或纳米抗体。
[0485]
方面35.如方面30-34中任一项所述的系统，其中所述异源多肽是表位标签。
[0486]
方面36.一种系统，其包括：
[0487]
a)根据方面1-19中任一项的缀合物；
[0488]
b)融合多肽，其包含：
[0489]
i)与所述靶配体结合多肽特异性结合的抗体；和
[0490]
ii)与所述亲和剂结合的多肽，其中所述多肽选自snap多肽、halo多肽和clip多
肽。
[0491]
方面37.一种调节靶多肽的活性的方法，所述方法包括：
[0492]
a)使所述靶多肽与如方面1-19中任一项所述的缀合物接触，产生光可调控的多肽；并且
[0493]
b)将所述光可调控的多肽暴露于引起所述配体与所述光可调控的多肽结合的波长的光，其中所述配体与所述光可调控的多肽的结合会调节所述光可调控的多肽的活性。
[0494]
方面38.如方面37所述的方法，其中所述配体是激动剂，并且其中所述配体与所述光可调控的多肽的结合会引起所述光可调控的多肽的活化。
[0495]
方面39.如方面37所述的方法，其中所述配体是拮抗剂，并且其中所述配体与所述光可调控的多肽的结合会引起所述光可调控的多肽的抑制、减敏或失活。
[0496]
方面40.如方面37-39中任一项所述的方法，其中所述靶多肽选自转录调控因子、离子通道、阳离子通道、配体门控离子通道、电压门控离子通道、群体感应因子、信息素受体、神经递质受体、酶、酶、运动蛋白、转运体、膜转运蛋白、g蛋白偶联受体、g蛋白、受体酪氨酸激酶、支架蛋白、衔接蛋白、细胞骨架蛋白、粘附蛋白、膜靶向蛋白、指导分泌的蛋白和蛋白的定位或蛋白相互作用结构域。
[0497]
方面41.如方面40所述的方法，其中所述阳离子通道是钾通道、钠通道或钙通道。
[0498]
方面42.如方面37-41中任一项所述的方法，其中所述靶多肽处于细胞中。
[0499]
方面43.如方面42所述的方法，其中所述细胞是体内的。
[0500]
方面44.如方面43所述的方法，其中所述细胞是视网膜细胞。
[0501]
方面45.一种增加视网膜细胞对光的敏感性的方法，所述方法包括：
[0502]
使所述视网膜细胞暴露于光，其中所述视网膜细胞包含如方面1-19中任一项所述的缀合物，或如方面20-36中任一项所述的系统，其中所述光具有引起所述配体与所述光可调控的多肽结合的波长，并且其中所述配体与所述光可调控的多肽的结合增加所述视网膜细胞对光的敏感性。
[0503]
方面46.一种赋予视网膜细胞光响应性的方法，所述方法包括向所述视网膜细胞中引入如方面1-19中任一项所述的缀合物，或如方面20-36中任一项所述的系统。
[0504]
方面47.一种治疗特征在于对光的响应性降低的眼病的方法，所述方法包括将如方面1-19中任一项所述的缀合物或如方面20-36中任一项所述的系统施用于患有所述眼病的个体的眼部。
[0505]
方面48.如方面47所述的方法，其中所述眼病是遗传性视网膜退行性疾病。
[0506]
方面49.如方面48所述的方法，其中所述疾病是色素性视网膜炎或年龄相关性黄斑变性。
[0507]
方面50.一种组合物，其包含：
[0508]
a)根据方面1-19中任一项的缀合物；和
[0509]
b)药学上可接受的赋形剂。
[0510]
方面51.如方面50所述的组合物，其中所述组合物是无菌且无热原的。
[0511]
方面52.如方面50或方面51所述的组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂包含环糊精。
[0512]
方面53.如方面52所述的组合物，其中所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊
精或衍生化环糊精。
[0513]
方面54.如方面50-53中任一项所述的组合物，其中所述缀合物包封在纳米颗粒内。
[0514]
方面55.如方面54所述的组合物，其中所述纳米颗粒是纳米胶束、脂质体、纳米球或纳米胶囊。
[0515]
方面56.一种医疗设备，其包括：
[0516]
a)包含根据方面50-55中任一项的组合物的容器；和
[0517]
b)用于将所述组合物引入个体眼中的工具。
[0518]
方面57.如方面56所述的设备，其中用于将所述组合物引入个体眼中的所述工具包括针头。
[0519]
方面58.如方面56或方面57所述的设备，其中所述容器包括注射器。
[0520]
方面59.如方面56-58中任一项所述的设备，其中所述设备是无菌的。
[0521]
方面60.一种缀合物，其包含：
[0522]
a)亲和剂；
[0523]
b)支链接头；和
[0524]
c)两个或更多个可光致异构调控因子，每个可光致异构调控因子独立地包含：
[0525]
i)可光致异构基团；和
[0526]
ii)标记、反应性基团或第二亲和剂。
[0527]
方面集合b
[0528]
上述本主题的各方面，包括实施方案，单独或与一个或多个其他方面或实施方法组合可以是有益的。在不限制前面的描述的情况下，下文提供了本公开的某些非限制性方面。如本领域技术人员在阅读本公开时将显而易见的，每个单独编号的方面可以与前面或以下单独编号的方面中的任何一个一起使用或组合。这旨在为所有此类方面的组合提供支持，并且不限于下面明确提供的方面的组合：
[0529]
方面1.一种用于眼内施用的组合物，所述组合物包含：
[0530]
a)缀合物，其包含：
[0531]
a)特异性结合以下的亲和剂：
[0532]
i)靶配体结合多肽；或者
[0533]
ii)与靶配体结合多肽结合的多肽；
[0534]
b)支链接头；和
[0535]
c)两个或更多个可光致异构调控因子，每个可光致异构调控因子独立地包含：
[0536]
i)可光致异构基团；和
[0537]
ii)与所述靶配体结合多肽结合的配体；和
[0538]
b)适于眼内施用的药学上可接受的赋形剂。
[0539]
方面2.如方面1所述的组合物，其中所述亲和剂包含苄基鸟嘌呤。
[0540]
方面3.如方面1所述的组合物，其中所述亲和剂包含氯烷烃。
[0541]
方面4.如方面1所述的组合物，其中所述亲和剂包含苄基胞嘧啶。
[0542]
方面5.如方面1所述的组合物，其中所述亲和剂包含抗体。
[0543]
方面6.如方面1所述的组合物，其中所述亲和剂包含适体。
[0544]
方面7.如方面1所述的组合物，其中所述亲和剂包含小分子或肽。
[0545]
方面8.如方面1-7中任一项所述的组合物，其中所述支链接头包含两条或更多条臂，每条臂独立地包含可光致异构调控因子。
[0546]
方面9.如方面8所述的组合物，其中所述支链接头包含两条臂。
[0547]
方面10.如方面8所述的组合物，其中所述支链接头包含四条臂。
[0548]
方面11.如方面1-10中任一项所述的组合物，其中所述支链接头包含式(bl)的部分：
[0549][0550]
其中n是1至10的整数。
[0551]
方面12.如方面11所述的组合物，其中n为1。
[0552]
方面13.如方面11所述的组合物，其中n为3。
[0553]
方面14.如方面1-13中任一项所述的组合物，其中所述可光致异构基团包含选自以下的部分：偶氮苯、环状偶氮苯、偶氮杂芳烃、俘精酸酐、螺吡喃、三苯甲烷、硫靛、二芳基乙烯和过度拥挤的烯烃。
[0554]
方面15.如方面14所述的组合物，其中所述可光致异构基团包含包含偶氮苯。
[0555]
方面16.如方面1-15中任一项所述的组合物，其中所述配体是激动剂、拮抗剂、变构调节剂或阻断剂。
[0556]
方面17.如方面1-16中任一项所述的组合物，其中所述靶配体结合多肽选自转录调控因子、离子通道、阳离子通道、配体门控离子通道、电压门控离子通道、群体感应因子、信息素受体、神经递质受体、g蛋白偶联受体和酶。
[0557]
方面18.如方面17所述的组合物，其中所述阳离子通道是钾通道、钠通道或钙通道。
[0558]
方面19.如方面1-16中任一项所述的组合物，其中所述靶配体结合多肽是谷氨酸受体、促代谢型谷氨酸受体、离子型谷氨酸受体、离子型烟碱型乙酰胆碱受体、离子型gaba-a受体、促代谢型gaba-b受体、促代谢型多巴胺受体、离子型嘌呤能p2x受体、促代谢型嘌呤能p2y受体、促代谢型血清素受体、离子型血清素受体、离子型甘氨酸受体、阳离子通道、钾通道、钙通道、钠通道、质子通道、阴离子通道或氯通道。
[0559]
方面20.如方面1-19中任一项所述的组合物，其中所述可光致异构基团包含响应于可见光异构化的偶氮苯。
[0560]
方面21.如方面1-20中任一项所述的组合物，其中所述配体是谷氨酸。
[0561]
方面22.如方面5所述的组合物，其中所述抗体是单链fv(scfv)或纳米抗体。
[0562]
方面23.如方面22所述的组合物，其中所述抗体对促代谢型谷氨酸受体(mglur)具有特异性，任选地其中所述mglur是mglur2、mglur3、mglur4、mglur5或mglur6。
[0563]
方面24.如方面1-23中任一项所述的组合物，其中所述组合物是无菌且无热原的。
[0564]
方面25.如方面1-24中任一项所述的组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂包含环糊精。
[0565]
方面26.如方面25所述的组合物，其中所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羟丙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精或衍生化环糊精。
[0566]
方面27.如方面1-26中任一项所述的组合物，其中所述缀合物包封在纳米颗粒内。
[0567]
方面28.如方面54所述的组合物，其中所述纳米颗粒是纳米胶束、脂质体、纳米球或纳米胶囊。
[0568]
方面29.一种用于眼内施用的组合物，所述组合物包含：
[0569]
a)一种系统，其包含：
[0570]
a)如方面1-23中任一项所述的缀合物；
[0571]
b)融合多肽，其包含：
[0572]
i)靶配体结合多肽，其包含所述缀合物中存在的所述配体的结合位点；和
[0573]
ii)结合所述亲和剂的异源融合伴侣；和
[0574]
b)适于眼内施用的药学上可接受的赋形剂。
[0575]
方面30.如方面29所述的组合物，其中所述异源融合伴侣包含与seq id no:1或seq id no:4中列出的snap多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0576]
方面31.如权利要求29所述的组合物，其中所述异源融合伴侣包含与seq id no:2中列出的clip多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0577]
方面32.如权利要求29所述的组合物，其中所述异源融合伴侣包含与seq id no:3中列出的halo多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0578]
方面33.一种用于眼内施用的组合物，所述组合物包含：
[0579]
a)一种系统，其包含：
[0580]
a)如权利要求1-23中任一项所述的缀合物；
[0581]
b)包含编码融合多肽的核苷酸序列的核酸，所述融合多肽包含：
[0582]
i)靶配体结合多肽，其包含所述配体的结合位点；和
[0583]
ii)结合所述亲和剂的异源融合伴侣；和
[0584]
b)适于眼内施用的药学上可接受的赋形剂。
[0585]
方面34.如权利要求33所述的组合物，其中所述异源融合伴侣包含与seq id no:1或seq id no:4中列出的snap多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0586]
方面35.如权利要求33所述的组合物，其中所述异源融合伴侣包含与seq id no:3中列出的halo多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0587]
方面36.如权利要求33所述的组合物，其中所述异源融合伴侣包含与seq id no:2中列出的clip多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0588]
方面37.如权利要求33-36中任一项所述的组合物，其中所述核酸存在于重组腺病毒相关病毒(aav)病毒体中。
[0589]
方面38.如权利要求32所述的组合物，其中所述aav病毒体包含与包含相应野生型衣壳多肽的aav病毒体相比，提供所述aav病毒体对枧网膜细胞增加的感染性的变体衣壳多
肽。
[0590]
方面39.一种用于眼内施用的组合物，所述组合物包含：
[0591]
a)一种系统，其包含：
[0592]
a)如方面1-23中任一项所述的缀合物；
[0593]
b)第一融合多肽，其包含：
[0594]
i)靶配体结合多肽，其包含所述配体的结合位点；和
[0595]
ii)异源多肽；和
[0596]
c)第二融合多肽，其包含：
[0597]
i)结合所述异源多肽的抗体；和
[0598]
ii)结合所述亲和剂的异源融合伴侣；和
[0599]
b)适于眼内施用的药学上可接受的赋形剂。
[0600]
方面40.如方面39所述的组合物，其中结合所述亲和剂的所述异源融合伴侣包含与seq id no:1或seq id no:4中列出的snap多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0601]
方面41.如方面39所述的组合物，其中结合所述亲和剂的所述异源融合伴侣包含与seq id no:3中列出的halo多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0602]
方面42.如方面39所述的组合物，其中结合所述亲和剂的所述异源融合伴侣包含与seq id no:2中列出的clip多肽氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0603]
方面43.如方面39-42中任一项所述的组合物，其中所述抗体是单链fv或纳米抗体。
[0604]
方面44.如方面39-43中任一项所述的组合物，其中所述异源多肽是表位标签。
[0605]
方面45.一种用于眼内施用的组合物，所述组合物包含：
[0606]
a)一种系统，其包含：
[0607]
a)如方面1-23中任一项所述的缀合物；
[0608]
b)融合多肽，其包含：
[0609]
i)与所述靶配体结合多肽特异性结合的抗体；和
[0610]
ii)与所述亲和剂结合的多肽，其中所述多肽选自snap多肽、halo多肽和clip多肽；和
[0611]
b)适于眼内施用的药学上可接受的赋形剂。
[0612]
方面46.一种增加视网膜细胞对光的敏感性的方法，所述方法包括：
[0613]
使所述视网膜细胞暴露于光，其中所述视网膜细胞包含如方面1-23中任一项叙述的缀合物，或如方面29-45中任一项叙述的系统，其中所述光具有引起所述配体与所述光可调控的多肽结合的波长，并且其中所述配体与所述光可调控的多肽的结合增加所述视网膜细胞对光的敏感性。
[0614]
方面47.一种赋予视网膜细胞光响应性的方法，所述方法包括向所述视网膜细胞中引入如方面1-23中任一项叙述的缀合物，或如方面29-45中任一项所述的系统。
[0615]
方面48.一种治疗特征在于对光的响应性降低的眼病的方法，所述方法包括将根
据方面1-29中任一项的组合物或根据方面29-45中任一项的组合物施用给患有所述眼病的个体。
[0616]
方面49.如方面48所述的方法，其中所述眼病是遗传性视网膜退行性疾病。
[0617]
方面50.如方面49所述的方法，其中所述疾病是色素性视网膜炎或年龄相关性黄斑变性。
[0618]
方面51.一种医疗设备，其包括：
[0619]
a)包含根据方面1-29中任一项的组合物，或根据方面29-45中任一项的组合物的容器；和
[0620]
b)用于将所述组合物引入个体眼中的工具。
[0621]
方面52.如方面51所述的设备，其中用于将所述组合物引入个体眼中的所述工具包括针头。
[0622]
方面53.如方面51或方面52所述的设备，其中所述容器包括注射器。
[0623]
方面54.如方面51-53中任一项所述的设备，其中所述设备是无菌的。
[0624]
实施例
[0625]
提出以下实施例以便向本领域的普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，而非意图限制本发明人视为其发明的范围，也非意图表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。已努力确保关于所用数字(例如量、温度等)的精确性，但是应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份为重量份，分子量为重均分子量，温度是以摄氏度计且压力为大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌肉内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下等。
[0626]
实施例1：2x bgag和4xbgag的制备
[0627]
材料和方法
[0628]
通用化学方法
[0629]
所有反应都在图1a-1k中的方案s1
–
s11中概述。
[0630]
用于色谱和反应的溶剂以经分子筛干燥或以hplc级购买。除非另外指出，否则所有其他试剂从商业来源无需进一步纯化使用。lc-ms在连接到配备waters acquity uplc beh c18(1.7μm，50
×
2.1mm)的nexera uhplc系统的shimadzu ms2020上进行。缓冲液a：在h2o中的0.1％ fa，缓冲液b：乙腈。典型梯度是从10％ b持续0.5分钟
→
在4.5分钟内梯度渐变为90％ b
→
90％ b持续0.5分钟
→
在0.5分钟内梯度渐变为99％ b，流量1ml/min。
[0631]
使用与shimadzu nexera系统联用的bruker maxis ii etd进行高分辨率质谱(hrms)。经由brukers otofcontrol 4.1和hystar 4.1sr2(4.1.31.1)软件控制仪器。采集速率设置为3hz并将以下源参数用于正模式电喷雾电离：端板偏移量＝500v；毛细管电压＝3800v；雾化器气体压力＝45psi；干气流量＝10l/min；干燥温度＝250℃。转移、四极杆和碰撞池设置取决于质量范围并考虑到相应分析物的分子量进行微调。对于内部校准，使用钠格式团簇。样品经由快速液相色谱法脱盐。supelco titan
tm c18 uhplc柱，1.9μm，孔径，20
×
2.1mm以及从10％到98％含0.1％ fa的mecn水溶液的2分钟梯度(h2o:carl roth gmbh+co.kgultra lc-ms；用于lc-ms的超等级mecn:merck kgaa
乙腈；用于lc-ms的fa-merck kgaa甲酸98％-100％)用于分离。根据分析物的电离效率选择样品在10％ acn水溶液(超等级)中的稀释度和进样量。因此，柱上上样量在0.25
–
5.0ng之间。用bruker的dataanalysis4.4sr1软件对记录的光谱进行自动化内部重校准和数据分析。
[0632]
在配备2998pda检测器的waters e2695系统上进行制备型rp-hplc，以在supelcoc18hplc柱(5μm，250
×
21.2mm)上收集产品(在220nm、280nm、360nm或460nm下)。缓冲液a：在h2o中的0.1％ tfa，缓冲液b：乙腈。典型梯度是从10％ b持续5分钟
→
在45分钟内梯度渐变为90％ b
→
90％ b持续5分钟
→
在5分钟内梯度渐变为99％ b，流量8ml/min。化合物1、2、25和bg-cooh、bc-dbco先前已有描述(broichhagen等人，2015；levitz等人，2017)。
[0633]
缩写：dipea：n,n-二异丙基乙胺；dbu：1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯；dmf：n,n-二甲基甲酰胺；dmso：二甲亚砜；fa：甲酸；su：琥珀酰亚胺基；tfa：三氟乙酸；tstu：o-(n-琥珀酰亚胺基)-n,n,n
′
,n
′‑
四甲基脲鎓四氟硼酸酯。
[0634]
注释和观察：nhs酯稳定性：tstu是选择用于合成bgag的偶联试剂，通常在几分钟内将酸转化为其相应的nhs酯。虽然大多数nhs酯在原位使用而无需纯化，但它们可以通过rp-hplc分离(参见化合物4)并立即冻干。建议分装并储存在-20℃下，以避免导致分解的反复冻融循环。fmoc脱保护：fmoc是广泛用于固相肽合成的标准胺保护基团，其中酰胺偶联(在dmf中与活化剂偶联)和随后的脱保护(在dmf中用哌啶脱保护)以高产率反复进行。受此启发并且为了减少劳动和纯化步骤，在dmf中用tstu作为活化剂进行肽偶联，并且在酰胺偶联完成后，将5体积％的哌啶直接添加到反应混合物中。经证明这在我们手中对所有基于结构1的蓝移偶氮苯化合物可靠有效，但在将这种方法与基于结构2的红移偶氮苯化合物一起使用时会产生复杂的反应混合物。使用通过rp-hplc纯化的含fmoc的化合物从tstu中去除dmf、dipea和脲副产物，并且采用在mecn中的dbu作为脱保护试剂。事实上，这是红移化合物很好耐受的，并且在以下程序中使用时会注意到这一点。bg、bc和卤代-同族体(halo-congeners)对酸的稳定性：bgag需要将nhboc基团最终脱保护为游离胺，并且tfa是选择的脱保护剂，然而，经证实o-苄基化鸟嘌呤和胞嘧啶碱基对强酸不稳定。发现如果用预冷的tfa保持在冰上，tfa可以与含bg的化合物一起使用，并且它的去除不是在旋转蒸发器中进行的，而是通过在通风良好的化学罩中施加温和的氮气流来进行的。含bc的化合物无法安然无恙地经受住这种处理，并且这就是nhboc基团被提前脱保护并且应变促进的炔烃叠氮化物点击反应以另一种正交方式进行的原因。然而，卤代基团对纯tfa是惰性的。
[0635]
生成nhs酯的通用方案a：向1ml小瓶中装入1.0当量的溶解在dmf中的酸(1ml/10mg)并添加4.0当量的dipea，之后一次性添加1.1当量的tstu(对于量《1mg的tstu，因为不使tstu过载至关重要，所以制备储备溶液)。使活性nhs酯形成15分钟，并且无需进一步纯化即可使用。
[0636]
肽偶联和原位fmoc脱保护的通用程序b：向1ml小瓶中装入1.0当量的溶解在dmf中的胺(1ml/10mg)和4.0当量的dipea。滴加预先形成的nhs酯(部分1.3)并允许在室温下搅拌反应混合物。根据lcms完成转化后(通常《30分钟)，将5体积％的哌啶添加到反应混合物中并允许再搅拌反应10分钟，之后通过添加5体积％的hoac和10体积％的水将反应猝灭并进行rp-hplc。
[0637]
肽偶联进行支化的通用程序c：向1ml小瓶中装入3.0当量的溶解在dmf中的胺(1ml/10mg)和8.0当量的dipea。将双nhs酯4(1.0当量)溶解在相同量的dmf中，并在剧烈搅拌下缓慢滴加。添加的顺序和速度对于产生最小量的副产物(即酰亚胺，琥珀酸单酰胺)至关重要。根据lcms完全转化后，将反应物直接脱保护或猝灭并进行rp-hplc(参见下文)。
[0638]
boc脱保护的通用程序d：向15ml falcon管中装入boc保护的化合物并放入冰浴中。添加纯的预冷(4℃)tfa。将反应混合物涡旋以确保均匀并放回冰上15分钟，之后在温和的氮气流下去除所有挥发物。将残留物溶于dmf/水(9/1)中并进行rp-hplc。注意：添加tfa后，含偶氮苯的反应混合物变成深红色。
[0639]
合成
[0640]
5-((2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙基)氨基)-5-氧代戊酸(卤代-cooh)
[0641]
向4ml dram小瓶中装入100mg(310μmol，1.0当量)halonhboc并添加1ml纯tfa。允许溶液在室温下静置5分钟，之后在温和的氮气流下去除所有挥发物。添加1ml dmf和160μldipea，之后一次性添加35.3mg(310μmol，1.0当量)戊二酸酐。将反应混合物孵育过夜，之后将其用160μl hoac猝灭，用水稀释并进行rp-hplc，在冻干后以88％产率获得92mg(274μmol)呈透明油状物的所需产物。hrms(esi)：c
15h29
clno5[m+h]
+
计算值：338.1729，实测值：338.1728。
[0642]
(((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)-d-谷氨酸双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(4)
[0643]
向4ml dram小瓶中装入300mg(812μmol，1.0当量)溶解在3ml dmso和850μl dipea中的(((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基-d-谷氨酸(3)，之后一次性添加978mg(3.25mmol，4.0当量)tstu。将反应混合物剧烈搅拌1小时，之后通过添加850μl hoac和200μl水将其猝灭并进行制备型rp-hplc。冻干后获得呈白色粉末的所需产物，产率为35％(161mg，286μmol)。注意：强烈建议从hplc系统洗脱后立即冷冻干燥，以抑制水解。将产物等分以避免使nhs酯水解的多个冻融循环。hrms(esi)：c
28h26
n3o
10
[m+h]
+
计算值：564.1613，实测值：564.1614。
[0644]
(2s,2's,4s,4's)-4,4'-(((((1e,1'e)-(((2,2'-(((r)-2-氨基戊二酰基)双(氮烷二基))双(乙酰基))双(氮烷二基))双(4,1-亚苯基))双(二氮烯-2,1-二基))双(4,1-亚苯基))双(氮烷二基))双(4-氧代丁烷-4,1-二基))双(2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊二酸)(5)
[0645]
根据通用程序c制备5并通过向反应混合物中添加5体积％的哌啶进行原位脱保护。使反应物再搅拌10分钟，之后通过添加5体积％的hoac和10体积％的水将其猝灭并进行rp-hplc。hrms(esi)：c
61h79n13o18
[m+2h]
2+
计算值：640.7828，实测值：640.7835。
[0646]
(2s,4s)-2-(4-((4-((e)-(4-((r)-1-氨基-41-((2-((4-((e)-(4-((5s,7s)-7-((叔丁氧基羰基)氨基)-5,7-二羧基庚酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)-39,44-二氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂-40,45-二氮杂四十七烷-47-酰氨)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)-4-((叔丁氧羰基)氨基)戊二酸(6)
[0647]
根据通用程序b制备6，第一步在50℃下进行。hrms(esi)：c
88h132n14o31
[m+2h]
2+
计算值：940.4586，实测值：940.4582。
[0648]
(2s,4s)-2-(4-((4-((e)-(4-((r)-1-(4-(((2-氨基-9h-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苯基)-49-((2-((4-((e)-(4-((5s,7s)-7-((叔丁氧羰基)氨基)-5,7-二羧基庚酰氨基)苯
1-基]苯基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)氨基甲酰基]丁酰氨基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基}乙酰氨基)苯基]二氮烯-1-基]苯基}氨基甲酰基)丙基]-4-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}戊二酸(14)
[0670]
根据通用程序b制备14，其中bg-coosu根据通用程序a制备，不添加哌啶。hrms(esi)：c
253h1385n37o93
[m+4h]
4+
计算值：1360.1807，实测值：1360.1804。
[0671]
(2s,4s)-2-氨基-4-[3-({4-[(1e)-2-[4-(2-{1-[(4r)-4-[(38-{[({4-[(1e)-2-{4-[(5s,7s)-7-氨基-5,7-二羧基庚酰氨基]苯基}二氮烯-1-基]苯基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)氨基甲酰基]-4-[(2r)-2-(4-{[(4-{[(2-氨基-9h-嘌呤-6-基)氧基]甲基}苯基)甲基]氨基甲酰基}丁酰氨基)-4-{[(1r)-1,3-双[(38-{[({4-[(1e)-2-{4-[(5s,7s)-7-氨基-5,7-二羧基庚酰氨基]苯基}二氮烯-1-基]苯基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)氨基甲酰基]丙基]氨基甲酰基}丁酰氨基]丁酰氨基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基}乙酰氨基)苯基]二氮烯-1-基]苯基}氨基甲酰基)丙基]戊二酸(
4x
b gag
12
)
[0672]
根据通用程序d制备
4x
bgag
12
。hrms(esi)：c
233h363n37o85
[m+6h]
6+
计算值：840.2541，实测值：840.2533。
[0673]
(2s,4s)-2-(4-((4-((e)-(4-((r)-1-叠氮基-41-((2-((4-((e)-(4-((5s,7s)-7-((叔丁氧基羰基)氨基)-5,7-二羧基庚酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)-39,44-二氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂-40,45-二氮杂四十七烷-47-酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)-4-((叔丁氧羰基)氨基)戊二酸(15)
[0674]
根据通用程序b制备15，不添加哌啶用于脱保护。将粗品进行rp-hplc并收集含偶氮苯的级分，干燥并进行下一步而无需进一步表征。
[0675]
(2s,4s)-2-氨基-4-(4-((4-((e)-(4-((r)-41-(3-((2-((4-((e)-(4-((5s,7s)-7-氨基-5,7-二羧基庚酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-3-氧代丙基)-1-叠氮基-39,42-二氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂-40,43-二氮杂四十五烷-45-酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)戊二酸(16)
[0676]
根据通用程序d制备16。hrms(esi)：c
78h115n16o27
[m+3h]
3+
计算值：569.2700，实测值：569.2705。
[0677]
(2s,4s)-2-氨基-4-(4-((4-((e)-(4-((r)-41-(3-((2-((4-((e)-(4-((5s,7s)-7-氨基-5,7-二羧基庚酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-3-氧代丙基)-1-(8-(4-((4-(((4-氨基嘧啶-2-基)氧基)甲基)苄基)氨基)-4-氧代丁酰基)-8,9-二氢-3h-二苯并[b,f][1,2,3]三唑并[4,5-d]氮杂环辛四烯-3-基)-39,42-二氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂-40,43-二氮杂四十五烷-45-酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)戊二酸(
2x
bcag
12
)
[0678]
向4ml dram小瓶中装入溶解在meoh中的16。一次性添加bc-dbco并将反应混合物孵育过夜，之后在温和的氮气流下去除所有挥发物。将粗品溶解于dmf和水(9/1)中并进行rp-hplc纯化以在冻干后获得呈黄色粉末的
2x
bcag
12
。hrms(esi)：c
109h142n21o30
[m+3h]
3+
计算
值：742.0082，实测值：742.0080。
[0679]
(2s,4s)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-(4-((4-((e)-(4-(61-氯-4,44,48-三氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,52,55-十四氧杂-3,43,49-三氮杂六十一烷酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)戊二酸(17)
[0680]
根据通用程序b制备17，其中卤代基-coosu根据通用程序a制备，不添加哌啶。hrms(esi)：c
70h117
cln8o
25
[m+2h]
2+
计算值：753.3913，实测值：753.3917。
[0681]
(2s,4s)-2-氨基-4-(4-((4-((e)-(4-(61-氯-4,44,48-三氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,52,55-十四氧杂-3,43,49-三氮杂六十一烷酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)戊二酸(clag
12
)
[0682]
根据通用程序d制备clag
12
。hrms(esi)：c
65h109
cln8o
23
[m+2h]
2+
计算值：702.3642，实测值：702.3642。
[0683]
(2s,4s)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-(4-((4-((e)-(4-((r)-5-(3-((2-((4-((e)-(4-((5s,7s)-7-((叔丁氧基羰基)氨基)-5,7-二羧基庚酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-3-氧代丙基)-64-氯-4,7,47,51-四氧代-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,55,58-十四氧杂-3,6,46,52-四氮杂六十四烷酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)戊二酸(18)
[0684]
根据通用程序b制备18，其中卤代基-coosu根据通用程序a制备，不添加哌啶。hrms(esi)：c
103h158
cln
15o35
[m+2h]
2+
计算值：1100.5377，实测值：1100.5370。
[0685]
(2s,4s)-2-氨基-4-(4-((4-((e)-(4-((r)-5-(3-((2-((4-((e)-(4-((5s,7s)-7-氨基)-5,7-二羧基庚酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-3-氧代丙基)-64-氯-4,7,47,51-四氧代-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,55,58-十四氧杂-3,6,46,52-四氮杂六十四烷酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)戊二酸(
2x
clag
12
)
[0686]
根据通用程序d制备
2x
clag
12
。hrms(esi)：c
93h142
cln
15o31
[m+2h]
2+
计算值：1000.4852，实测值：1000.4853。
[0687]
(2s,4s)-2-(4-((4-((e)-(4-((1-氨基-39-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂-40-氮杂四十二烷-42-基)氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)戊二酸(19)
[0688]
根据通用程序b制备19，不添加哌啶。相反，在rp-hplc纯化后获得fmoc保护的化合物，干燥并重新溶解在mecn中，添加5％dbu。将反应混合物孵育1小时，之后通过添加hoac和水将其猝灭并进行rp-hplc。hrms(esi)：c
55h93
n7o
20
[m+2h]
2+
计算值：585.8232，实测值：585.8232。
[0689]
(2s,2's,4s,4's)-4,4'-(((((1e,1'e)-((((r)-45-氨基-4,44,48,88-四氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85-二十四氧杂-3,43,49,89-四氮杂九十一烷-1,91-二基)双(氮烷二基))双(4,1-亚苯基))双(二氮烯-2,1-二基))双(4,1-亚苯基))双(氮烷二基))双(4-氧代丁烷-4,1-二基))双(2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊二酸)(20)
[0690]
根据通用程序b制备20，不添加哌啶。相反，在rp-hplc纯化后获得fmoc保护的化合物，干燥并重新溶解在mecn中，添加5％dbu。将反应混合物孵育1小时，之后通过添加hoac和
水将其猝灭并进行rp-hplc。hrms(esi)：c
115h190n15o42
[m+3h]
3+
计算值：818.1069，实测值：818.1075。
[0691]
(2s,2's,4s,4's)-4,4'-(((((1e,1'e)-((((r)-45-(5-((4-(((2-氨基-9h-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苄基)氨基)-5-氧代戊酰氨基)-4,44,48,88-四氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85-二十四氧杂-3,43,49,89-四氮杂九十一烷-1,91-二基)双(氮烷二基))双(4,1-亚苯基))双(二氮烯-2,1-二基))双(4,1-亚苯基))双(氮烷二基))双(4-氧代丁烷-4,1-二基))双(2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊二酸)(21)
[0692]
根据通用程序b制备21，其中bg-coosu根据通用程序a制备，第一步在50℃下进行，并且不添加哌啶。hrms(esi)：c
133h208n21o45
[m+3h]
3+
计算值：940.1549，实测值：940.1546。
[0693]
(2s,2's,4s,4's)-4,4'-(((((1e,1'e)-((((r)-45-(5-((4-(((2-氨基-9h-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苄基)氨基)-5-氧代戊酰氨基)-4,44,48,88-四氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85-二十四氧杂-3,43,49,89-四氮杂九十一烷-1,91-二基)双(氮烷二基))双(4,1-亚苯基))双(二氮烯-2,1-二基))双(4,1-亚苯基))双(氮烷二基))双(4-氧代丁烷-4,1-二基))双(2-氨基戊二酸)(
2x
bgag
12,460
)
[0694]
根据通用程序d制备
2x
bgag
12,460
。hrms(esi)：c
123h193n21o41
[m+4h]
4+
计算值：655.3418，实测值：655.3416。
[0695]
(2s,4s)-2-(4-((4-((e)-(4-((1-氨基-39-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂-40-氮杂四十二烷-42-基)氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)戊二酸二甲酯(23)
[0696]
根据通用程序b制备23，不添加哌啶。相反，在rp-hplc纯化后获得fmoc保护的化合物，干燥并重新溶解在mecn中，添加5％dbu。将反应混合物孵育1小时，之后通过添加hoac和水将其猝灭并进行rp-hplc。hrms(esi)：c
57h97
n7o
20
[m+2h]
2+
计算值：599.8389，实测值：599.8387。
[0697]
4,4'-(((((1e,1'e)-((((r)-45-氨基-4,44,48,88-四氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85-二十四氧杂-3,43,49,89-四氮杂九十一烷-1,91-二基)双(氮烷二基))双(4,1-亚苯基))双(二氮烯-2,1-二基))双(4,1-亚苯基))双(氮烷二基))双(4-氧代丁烷-4,1-二基))(2s,2's,4s,4's)-双(2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊二酸四甲酯)(24)
[0698]
根据通用程序b制备24，不添加哌啶。相反，在rp-hplc纯化后获得fmoc保护的化合物，干燥并重新溶解在mecn中，添加5％dbu。将反应混合物孵育1小时，之后通过添加hoac和水将其猝灭并进行rp-hplc。hrms(esi)：c
119h198n15o42
[m+3h]
3+
计算值：836.7945，实测值：836.7940。
[0699]
(2s,4s)-2-[3-({4-[(1e)-2-{4-[(2-{1-[(4r)-4-[(2r)-2-氨基-4-{[(1r)-1,3-双[(38-{[2-({4-[(1e)-2-{4-[(5s,7s)-7-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-8-甲氧基-5-(甲氧基羰基)-8-氧代辛酰氨基]苯基}二氮烯-1-基]苯基}氨基)乙基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)氨基甲酰基]丙基]氨基甲酰基}丁酰氨基]-4-[(38-{[2-({4-[(1e)-2-{4-[(5s,7s)-7-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-8-甲氧基-5-(甲氧基羰基)-8-氧代辛酰氨基]苯基}二氮烯-1-基]苯基}氨基)乙基]氨基甲酰基}-3,6,
9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)氨基甲酰基]丁酰氨基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基}乙基)氨基]苯基}二氮烯-1-基]苯基}氨基甲酰基)丙基]-4-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}戊二酸1,5-二甲酯(25)
[0700]
根据通用程序b制备25，不添加哌啶。相反，在rp-hplc纯化后获得fmoc保护的化合物，干燥并重新溶解在mecn中，添加5％dbu。将反应混合物孵育1小时，之后通过添加hoac和水将其猝灭并进行rp-hplc。hrms(esi)：c
243h399n31o86
[m+4h]
4+
计算值：1282.4460，实测值：1282.4447。
[0701]
(2s,4s)-2-[3-({4-[(1e)-2-{4-[(2-{1-[(4r)-4-[(2r)-2-(4-{[(4-{[(2-氨基-9h-嘌呤-6-基)氧基]甲基}苯基)甲基]氨基甲酰基}丁酰氨基)-4-{[(1r)-1,3-双[(38-{[2-({4-[(1e)-2-{4-[(5s,7s)-7-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-8-甲氧基-5-(甲氧基羰基)-8-氧代辛酰氨基]苯基}二氮烯-1-基]苯基}氨基)乙基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)氨基甲酰基]丙基]氨基甲酰基}丁酰氨基]-4-[(38-{[2-({4-[(1e)-2-{4-[(5s,7s)-7-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-8-甲氧基-5-(甲氧基羰基)-8-氧代辛酰氨基]苯基}二氮烯-1-基]苯基}氨基)乙基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)氨基甲酰基]丁酰氨基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基}乙基)氨基]苯基}二氮烯-1-基]苯基}氨基甲酰基)丙基]-4-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}戊二酸1,5-二甲酯(26)
[0702]
向4ml dram小瓶中装入25(1.0当量)、bg-cooh(1.1当量)并溶解在dipea(4.0当量)和dmf中，之后一次性添加hbtu(1.2当量)。将混合物孵育2小时，之后通过添加5体积％的hoac将其猝灭并进行rp-hplc。hrms(esi)：c
261h417n37o89
[m+4h]
4+
计算值：1374.2328，实测值：1374.2305。
[0703]
(2s,4s)-2-氨基-4-[3-({4-[(1e)-2-{4-[(2-{1-[(4r)-4-[(38-{[2-({4-[(1e)-2-{4-[(5s,7s)-7-氨基-5,7-二羧基庚酰氨基]苯基}二氮烯-1-基]苯基}氨基)乙基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)氨基甲酰基]-4-[(2r)-2-(4-{[(4-{[(2-氨基-9h-嘌呤-6-基)氧基]甲基}苯基)甲基]氨基甲酰基}丁酰氨基)-4-{[(1r)-1,3-双[(38-{[2-({4-[(1e)-2-{4-[(5s,7s)-7-氨基-5,7-二羧基庚酰氨基]苯基}二氮烯-1-基]苯基}氨基)乙基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)氨基甲酰基]丙基]氨基甲酰基}丁酰氨基]丁酰氨基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基}乙基)氨基]苯基}二氮烯-1-基]苯基}氨基甲酰基)丙基]戊二酸(
4x
bgag
12,460
)
[0704]
向15ml falcon管中装入26并溶解在meoh/1m lioh(1/1)中并使其在室温下静置1小时，通过添加5体积％的hoac将其猝灭并进行rp-hplc。将含偶氮苯的级分(27)合并并冻干，并根据程序1.6在0℃下纯tfa中进行最终脱保护。hrms(esi)：c
233h372n37o81
[m+7h]
7+
计算值：712.3736，实测值：712.3733。
[0705]
1-(6-(((s)-5-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-羧基戊基)氨基)-6-氧代己基)-3,3-二甲基-2-((1e,3e)-5-((z)-1,3,3-三甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3h-吲哚-1-鎓(30)
[0706]
向圆底烧瓶中装入35.0mg(72.4μmol，1.0当量)的1-(5-羧基戊基)-3,3-二甲基-2-((1e,3e)-5-((z)-1,3,3-三甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3h-吲哚-1-鎓
(29)(ueno等人，2011)，其溶解在1.5ml dmso和50μl dipea中。一次性添加tstu(21.8mg，72.4μmol，1.0当量)并将混合物孵育30分钟，之后一次性添加32.0mg(86.8μmol，1.2当量)的fmoc-lys-oh(28)。将反应混合物再孵育一小时，之后通过添加50μl hoac将其猝灭并进行rp-hplc，在冻干后获得26mg(32.2μmol)呈蓝色粉末的所需产物，产率为45％。hrms(esi)：c
53h61
n4o5[m]
+
计算值：833.4636，实测值：833.4639。
[0707]
1-(6-(((s)-5-氨基-6-((2-((4-((e)-(4-((5s,7s)-7-((叔丁氧基羰基)氨基)-5,7-二羧基庚酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-6-氧代己基)氨基)-6-氧代己基)-3,3-二甲基-2-((1e,3e)-5-((z)-1,3,3-三甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3h-吲哚-1-鎓(31)。
[0708]
根据通用程序b制备31。hrms(esi)：c
66h85n10o10
[m]
+
计算值：1177.6445，实测值：1177.6452。
[0709]
1-((s)-1-氨基-41-((2-((4-((e)-(4-((5s,7s)-7-((叔丁氧基羰基)氨基)-5,7-二羧基庚酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)-39,47-二氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂-40,46-二氮杂五十二烷-52-基)-3,3-二甲基-2-((1e,3e)-5-((z)-1,3,3-三甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3h-吲哚-1-鎓(32)
[0710]
根据通用程序b制备32，第一步在50℃下进行。hrms(esi)：c
93h139n11o23
[m+h]
2+
计算值：889.5033，实测值：889.5037。
[0711]
1-((s)-1-(4-(((2-氨基-9h-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苯基)-49-((2-((4-((e)-(4-((5s,7s)-7-((叔丁氧基羰基)氨基)-5,7-二羧基庚酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)-3,7,47,55-四氧代-11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44-十二氧杂-2,8,48,54-四氮杂六十碳烷-60-基)-3,3-二甲基-2-((1e,3e)-5-((z)-1,3,3-三甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3h-吲哚-1-鎓(33)
[0712]
根据通用程序b制备33，其中bg-coosu根据通用程序a制备，不添加哌啶。hrms(esi)：c
111h158n17o24
[m+2h]
3+
计算值：715.3859，实测值：715.3859。
[0713]
1-((s)-49-((2-((4-((e)-(4-((5s,7s)-7-氨基-5,7-二羧基庚酰氨基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)-1-(4-(((2-氨基-9h-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苯基)-3,7,47,55-四氧代-11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44-十二氧杂-2,8,48,54-四氧杂六十碳烷-60-基)-3,3-二甲基-2-((1e,3e)-5-((z)-1,3,3-三甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3h-吲哚-1-鎓(bgag
12-cy5)
[0714]
根据通用程序d制备bgag
12-cy5。hrms(esi)：c
106h150n17o24
[m+2h]
3+
计算值：682.0351，实测值：682.0354。
[0715]
缩写：dipea：n,n-二异丙基乙胺；dbu：1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯；dmf：n,n-二甲基甲酰胺；dmso：二甲亚砜；fa：甲酸；su：琥珀酰亚胺基；tfa：三氟乙酸；tstu：o-(n-琥珀酰亚胺基)-n,n,n
′
,n
′‑
四甲基脲鎓四氟硼酸酯。
[0716]
hek细胞和培养的神经元的电生理学
[0717]
如先前所述(farrants等人，2018)，在转染后24-48小时进行来自hek 293t细胞的全细胞膜片钳记录。简言之，在高钾(120mm)溶液中进行-60mv下的电压钳记录，以在受体活化后能够有大的向内电流。
[0718]
转染后4-6天(11-15div)在含有以下物质(以mm计)的细胞外溶液中对培养的皮层神经元进行全细胞膜片钳记录：138nacl、1.5kcl、1.2mgcl2、2.5cacl2、10葡萄糖和5hepes，ph 7.4。细胞内溶液含有(以mm计)：140葡萄糖酸钾、10nacl、5egta、2mgcl2、1cacl2、10hepes、2mgatp和0.3na2gtp，ph 7.2。对于超极化测量，在光控开关之前通过电流注入将细胞调节到-60mv。仅分析静息电位≤-40mv的细胞。
[0719]
除非另外指出，否则将细胞与1-10μm的portl在适当的细胞外记录溶液中在37℃下孵育45-60分钟。如先前所述(levitz等人，2017)确定标记效率。使用coolled pe-4000通过40
×
物镜向整个视野施加照明。样品平面的光强度为1-2mw/mm2。使用pclamp软件进行数据采集和照明控制两者。所有药物均购自tocris并使用重力驱动的灌注系统进行施加。
[0720]
结果
[0721]
设计了光控开关、正交、远程拴系的配体(“portl”)。具体来说，针对基于snap、clip、halo和纳米抗体的标记策略设计并表征了支链portl。
[0722]
进行与snap-mglur2缀合的苄基鸟嘌呤-偶氮苯-谷氨酸酯(“bgag
n”，其中n＝bg(苄基鸟嘌呤)和偶氮苯(a)之间聚(乙二醇)(peg)重复序列的数目)的原型系统的分析。
[0723]
portl系统的主要优点是能够通过化学部分的灵活混合和匹配来设计和合成portl(图2a)。为了实现对用clip标记的mglur2的高效光学控制，合成了具有正交标记的snap变体(gautier等人，2008)，“双bcag
12”(
2x
bcag
12
)(方案s6(图1f))。与
2x
bgag
12
类似，
2x
bcag
12
实现了对clip-mglur2的近乎完全的光学控制(图2b-2d)。支化并未改变
2x
bcag
12
的特异性，当施加于表达snap-mglur2的细胞时没有显示出光电流(相对于1mm谷氨酸为2.8
±
0.3％，n＝3个细胞)。
[0724]
为了进一步将portl库扩展到第三种自标记，使用正交自杀酶卤代-标签，该酶与烷基氯特异性反应(los等人，2008)。合成clag
12
(方案s1、s7(图1a和图1g))；并且克隆显示出正常谷氨酸敏感性的n端卤代标记的mglur2构建体。基于使卤代-靶向portl支化将增强光控开关的假设，合成了“双clag
12”(
2x
clag
12
)(方案s8(图1h)；图2e)。两种portl都显示出mglur2的光活化，具有与bgag相同的光谱特性(图2f)，但卤代-mglur2的光活化效率通过支化得以加强(图2f、图2g)。表征
2x
clag
12
的标记效率；发现与snap标签的bgag标记类似的浓度依赖性，其中1μm标记足以达到饱和。该结果将卤代-标签引入支链portl方法中并将工具包扩展到三个不同的正交蛋白质标签。
[0725]
基于偶氮苯的光控开关的关键优点是能够调谐化合物的光化学特性。先前报道的红移bgag
12,460
允许mglur2的可见光诱导的、快弛豫的光活化，这在一些环境中是有利的，包括对于视力恢复应用是有利的(berry等人(2017)nature commun.8:1862)。然而，bgag
12,460
显示出比bgag
12
更弱的snap-mglur2活化，这可能是由于光稳态下顺式的数目减少(hull等人，2018)。合成“双bgag
12,460”(方案s9(图1i))；观察到用双bgag
12,460
时snap-mglur2的可见光光活化增强。鉴于添加第二分支的适度改善，设计并合成具有四个偶氮苯-谷氨酸的
4x
bgag
12,460
；并且观察到产生mglur2近乎完全的光活化的进一步增强(方案s10(图1j)；图3h-j)。与bgag
12
的双稳定偶氮苯相比，基于bgag
12,460
的portl在黑暗中显示出快弛豫，这使得光活化的幅度依赖于强度。与产生关键的顺式偶氮苯群体的能力增强一致，支化增加了bgag
12,460
的光敏性。
[0726]
最后，拴系光药理学的长期目标是将此类化合物提供的光学控制并入抗体介导的
蛋白质靶向中。已经报道了由标记有portl的snap标记纳米抗体组成的“纳米抗体-光控开关缀合物”(npc)。含有抗gfp纳米抗体的npc能够光活化gfp标记的mglur2，但效率有限(farrants等人，2018)。与测试的其他系统类似，
2x
bgag
12
使npc介导的mglur2光控开关的光控开关效率翻倍。该结果进一步证实支链portl是提高光控开关效率的有效通用策略。
[0727]
图1a-1j(a)用于snap、clip和卤代基标记受体的portl的混合匹配设计的化学部分工具集。(b-d)
2x
bcag
12
(b)与bcag
12
相比增强clip-mglur2光活化的效率。*指示统计显著性(未配对t检验，p＝0.00008)。(e-g)
2x
clag
12
(e)与clag
12
(f、g)相比增强卤代基-mglur2的效率。*指示统计显著性(未配对t检验，p＝0.006)。(h-j)支化增强可见光介导(蓝条＝460nm)snap-mglur2的光活化效率。*指示统计显著性(未配对t检验；在bgag
12,460
与
2x
bgag
12,460
之间p＝0.02并且在
2x
bgag
12,460
与
4x
bgag
12,460
之间p＝0.009)。测试的细胞数目示于括号中。误差线显示s.e.m.。
[0728]
实施例2：用4xbgag恢复视力
[0729]
为了增加敏感性以便在室内强度下提供视力恢复，使用具有4个分支的bgag
12,460
型式(
4x
bgag
12,460
)，每个分支都带有光活化的谷氨酸。
4x
bgag
12,460
使培养的细胞中功效增加～2倍并且敏感性增加～5倍。玻璃体内注射aav用于将snap-mglur2引入失明rd1小鼠的rgc或on双极细胞(on-bc)中。在这些细胞类型中的每一种中
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2恢复避自然光行为并且使动物能够区分由以不同距离间隔的平行线组成的两种视觉线索。恢复的视觉引导行为对光的敏感性比1xbgag增加了100倍至约250倍—远远超过细胞培养物测量所预期的。这种增加使动物能够在室内光线强度下并使用ipad显示器执行视觉任务—这是2组成视力恢复方法的第一组成。发现
4x
bgag支持接近野生型敏度极限的线条图形识别。此外，发现
4x
bgag支持当视觉显示器以8cm/s移动时的线条图形识别以及野生型视力。
[0730]
将
4x
bgag
12,460
配制在β-环糊精中引起在单次注射后至少5周的光感恢复。基于人mglur6的变体型式(snap-mglur6)也可以受hek293细胞中的bgag
12,460
光控开关，表明它可能在on-bc中甚至更有效，其中它是光感受器细胞释放的谷氨酸的主要受体并且其含有mglur6的专门信号传导级联和效应子通道。
[0731]
4x
bgag
12,460
:snap-mglur系统合并了gpcr视蛋白的高敏感性和bgag-mglur的6个主要优点：i)稳健的光响应，ii)不存在光漂白，iii)快速的动力学，iv)在野生型(有视力的)小鼠中没有功能，表明对已经丧失光感受器输入的rgc的选择性(即缺乏对保持输入的rgc的干扰)，以及v)能够在出现不利影响的情况下中止。
[0732]
材料和方法
[0733]
动物、aav和光控开关
[0734]
小鼠实验是在加州大学动物护理及使用委员会(university of california animal care and use committee)的明确批准下进行的。wt小鼠(c57bl/6j)和rd1小鼠(c3h)购自杰克逊实验室并且以12小时光/暗循环饲养，随意摄取食物和水。将编码snap-mglur2的cdna插入已建立的病毒盒中处于人突触蛋白启动子(hsyn-1)的控制下用于在rgc中表达，或者处于小鼠grm6最小启动子的4拷贝串联体(4xgrm6)的控制下用于在on-bc中表达并包装在aav 2/2-4yf衣壳中。经由显微注射将含有10
10
–
10
12
个病毒基因组的载体以2μl体积递送至rd1小鼠眼部的玻璃体中。raav注射在p30-p60并且体内和体外实验在p90-p160。如先前所述，产生aav。
[0735]
光控开关制备
[0736]
光控开关化合物是使用broichhagen,j.等人(2015)acs cent sci 1,383-393描述的方案合成的。将200mm bgag
12,460
(l-非对映异构体)在100％医药级dmso(cryoserv；bioniche pharma)中的储备溶液1:100稀释在无菌pbs中，获得在1％ dmso中的1mm最终工作溶液。工作溶液在施用前制备，制备成原液储存在冰箱中并根据需要使用，或从记录浴中回收并储存(rt或冰箱)以供重复使用。在视网膜外植体上施加bgag
12,460
或bgag
12
以200μl体积，50μm至50nm bgag
12,460
浓度(在具有》1％ dmso的pbs中)进行。对于体内行为实验，将2-μl体积的1mm或3.5μl(玻璃体最终浓度为1μl)的bgag
12,460
溶液(在具有1％ dmso的pbs中)注射到早期用aav治疗》6周的眼部中)。对于体内浓度依赖性实验，假设小鼠眼部含有注射到眼部中的5.3μl体积和2-μl体积的3.5μm、1.825μm和0.1825μm bgag
12,460
溶液(在具有1％ dmso的pbs中)以获得1μm、500nm和50nm 62
的最终浓度。为了水合缓释，将5％在pbs中的药物级β环糊精(cyclodex)与bgag
12,460
混合，获得3μm的最终浓度并且将2μl双侧注射到小鼠眼部中。合成mag0
460
并以100μm浓度施用2μl。
[0737]
组织制备和免疫组织化学
[0738]
aav2/2-hsyn-snap-mglur2治疗后》4周的小鼠向玻璃体中注射1ul的10um bg缀合的alexa fluor-647染料。25小时后，将小鼠处死，将眼在4％多聚甲醛(ted pella)中固定(30分钟)，取出视网膜并将组织在封闭缓冲液[10％普通山羊血清、1％ bsa、0.5％ triton x-100在pbs(ph 7.4)中]中在室温下孵育2小时。使用pbs彻底洗涤视网膜并使用浸渍有dapi(细胞核染剂-蓝色)的vectashield(vector laboratories)介质固定在载玻片上。将另外共同注射了aav2/2-hsyn-liglur的视网膜暴露于针对gluk2/k3的单克隆抗体(millipore)(在4℃下在封闭缓冲液中1:500稀释过夜)，接着施加二次抗兔alexa 488抗体(invitrogen)(在室温下1:1,000稀释2小时)，如先前在gaub.等人(2014)
12
中所述。在体外依次用bg缀合的alexa fluor-647标记snap-mglur2和liglur中识别的gluk2亚基的抗体染色也使用最小程度的固定(10分钟)成功地实现。对于视网膜切片，将整标本包埋在琼脂糖(sigma)中并使用振动切片机(leica microsystems)以中等速度、最大振动和200-μm厚度进行横向切片。通过共聚焦显微术(leica tcs sp5；leica microsystems)处理和检查用于获得关于视网膜冷冻切片或整标本的免疫组织化学的视网膜组织。对于细胞计数，将视网膜冷冻切片并用dapi染色。使用具有20x物镜的zeiss lsm-880nlo airyscan显微镜获得1μm3的z堆叠图像(24张切片)，使用增加的偏移量来最小化背景并区分不同的细胞，并使用imaris软件进行分析以对3d图像中的单个细胞进行计数。
[0739]
行为分析
[0740]
进行2室明暗被动回避测试。在腔室上方安装～100μw cm-2
的白光(波长范围)或0.5-25μw cm-2
的蓝光(460/45nm)或绿光(535/50nm)，光均匀分布。使用穿梭箱上的ir传感器追踪动物移动。使用graphic state and graphic state rt(coulbourn instruments)测量并分析在明暗室中花费的时间。
[0741]
使用有安装到腔室天花板上的led屏幕的coulbourn单电击室进行恐惧条件实验，所述屏幕呈现视觉线索。动物经受配对或非配对的光提示恐惧条件，由在15分钟跨度内0.7ma的三次电击试验组成。通过coulbourn的freezeframe软件记录预期冲击时的僵化行为，并将其归一化为刺激前收集的运动行为。比较配对和非配对队列的表现，以便确定恐惧
响应是否以刺激过渡为条件。
[0742]
如先前所述
19
，使用coulbourn穿梭箱(h10-11m-sc)测定改进的主动回避，然而现在将ipad平板屏幕安装到穿梭笼壁上，每个屏幕显示两个图像中的一个，这两个图像在方向或两条线之间的距离上不同，但在其他方面具有相同的形状、大小和光强度。厌恶图像侧与0.7ma的足部电击配对。回忆后，反转光线图形以避免位置偏差，并记录在每一侧消耗的时间。通过将显示器调暗或调亮到不同强度来测试适应性。
[0743]
结果
[0744]
无支链的单价bgag
12,460
对snap标记的人mglur6起作用
[0745]
mglur6受体在on-bc中表达，而不在视网膜中的其他细胞类型中表达(dhingra和vardi 2012)wiley interdiscip.rev.membr.transp.signal 1:641)。它用作光感受器细胞释放的谷氨酸的on-bc主要受体，并具有专门的g蛋白信号传导至这种细胞类型中的效应子信号传导系统(cao等人(2011)j.neurosci.31:11521)。考虑到，对于on-bc产生bgag光活化的mglur6型式可以利用这种天然信号传导级联来产生增强的光响应。大鼠mglur6(snap-rmglur6)的n端snap标记型式连同girk通道一起在hek293细胞中表达。用bgag
12,460
标记细胞并检查对蓝(460nm)光闪烁的响应。在这些细胞中没有观察到光电流。(图3c)。人mglur6(snap-hmglur6)在hek293细胞中表达，并将细胞用bgag
12,460
标记；这一次，观察到girk光电流与用snap-mglur2时的那些一样大(图3c)。bgag
12,460
光活化snap-mglur2和snaphmglur6的相似效力表明，如果mglur6与其天然信号传导级联和效应子通道具有特权偶联，则后者可能在on-bc中更有效。
[0746]
图3a-3c.单价bgag
12,460
在hek293细胞中引发大鼠snap-mglur2和人snap-mglur6 girk光电流。图3a.第ii组和第iii组mglur，如mglur2和6，分别与神经元中的girk通道偶联，并且该系统在非神经元细胞系中重构，使得与bgag光控开关偶联的snap-mglur2或6将被光活化并诱导超极化girk电流。图3b.蓝(460nm)光使bgag
12,460
:snap-mglur2光活化并且在-60mv电压钳位的hek293细胞中引发来自共同表达的girk通道的向内k+电流，其中[k+]
in
＝[k+]
out
＝150mm。图3c.虽然光使表达snap标记的大鼠mglur2(snap-rmglur2)的bgag
12,460
hek293细胞中的girk活化，它不会活化大鼠snap-rmglur6，但它会活化人变体snap-hmglur6。
[0747]
支链多价bgag增加hek293细胞中snap-mglur2活化的功效和敏感性
[0748]
为了增加bgag
12,460
对光的敏感性，将每个受体附接位点(bg)带有一个光活化谷氨酸(ag)(即在每个mglur亚基上放置一个配体)的单个分支置换为多个分支，每个分支都带有光活化谷氨酸(从而在每个亚基产生过量的配体)(图4a)(acosta等人，2020)。在hek293细胞中，将配体数目增加到2(
2x
bgag
12,460
)和4(
4x
bgag
12,460
)会逐渐增加光诱导的受体结合和活化。
4x
bgag
12,460
的功效大致是bgag
12,460
的两倍，接近用饱和谷氨酸所达到的最大活化(图4b-4c)。重要的是，
4x
bgag
12,460
使hek293细胞中的敏感性增加(移动强度-响应曲线的中点)～5倍(图4d)。
[0749]
图4a-4d.多支链bgag
12,460
增加hek293细胞中girk通道的snap-mglur2活化效力和敏感性。图4a.
4x
bgag
12,460
由用于1:1附接到mglur的每个亚基上的snap的单个bg末端和12-peg接头的4个分支组成，每个分支都带有光控开关偶氮苯-谷氨酸(ag)。图4b.与sna-mglur2缀合的
4x
bgag
12,460
的代表性实例光活化共表达的girk通道以接近用饱和(1mm)谷氨
酸获得的最大水平。图4c.用单分支、2分支和4分支bgag
12,460
时，snap-mglur2光活化效率的依赖性，读出为girk电流。图4d.使用
4x
bgag
12,460
时，强度-响应曲线向左移动(敏感性更高)。
[0750]
4分支bgag恢复高敏感性避光
[0751]
为了检查在体外培养的细胞中看到的这种敏感性增加是否会在体内转化至视网膜，使用aav将编码snap-mglur2的基因引入失明rd1小鼠的视网膜神经节细胞(rgc)中处于人突触蛋白启动子(hsyn)下(aav2 4yf：hsyn-snap-mglur2)(图5a)。几周后，为了测量snap-mglur2的表达及其bg标记的特异性，将bg染料(图5b)注射到小鼠的玻璃体中，此时它们的光感受器细胞已经退化(图5c)。在视网膜的横截面中，主要在rgc的树突层中观察到染料(图5d)。
[0752]
图5a-5d.玻璃体内注射aav2 4yf hsyn-snap-mglur2驱动rd1小鼠中的rgc表达。图5a.aav2 4yf hsyn-snap-mglur2病毒递送构建体。图5b.mglur2上的snap标签可以用荧光bg染料标记。图5c.由于遗传性视网膜变性引起光感受器细胞层损失的视网膜示意图。图5d.从6周前注射了aav2 4yf hsyn-snap-mglur2的rd1小鼠分离并用bg染料标记的视网膜的横截面，其显示snap-mglur2的表达限于rgc的树突。
[0753]
为了确定bgag
12,460
:snap-mglur2是否可以恢复视力，另一队列接受玻璃体内注射aav2 4yf:hsyn-snap-mglur2的rd1小鼠在》6周后进行第二次玻璃体内注射
4x
bgag
12,460
。在接下来的3-6天内，以两种模式测试视力，第一种是评估动物是否能够辨别明暗，并且如果能辨别，则确定可以检测到的光强度，并且第二种是测试辨别两种不同的空间线条图形的能力。
[0754]
测试避自然光行为。2室穿梭箱在每个腔室都安装了ipad-mini，其中一个设置为完全照明的白色屏幕(88uw/cm2)而另一个设置为黑色(图6c)。有视力的小鼠畏光，并在光照腔室中消耗的时间较少，而失明rd1小鼠在两个腔室中消耗的时间相同。在rgc中表达snap-mglur2的rd1小鼠玻璃体内注射在pbs中的
4x
bgag
12,460
。在
4x
bgag
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注射后的第一周，这些小鼠在暗室中消耗的时间比在照明室中的时间更多(图6d，绿色符号)，与对照rd1同窝仔(既不表达snap-mglur2也不注射
4x
bgag
12,460
)完全不同，同窝仔在两个腔室中消耗的时间相同(图6d，紫色虚线)。
[0755]
在
4x
bgag
12,460
注射后三周，表达snap-mglur2的rd1小鼠的黑暗偏好消失(图6d，绿色符号)，与早前用单价bgag
12,460
所看到的下降一致(berry等人(2017)同上)，并且可能是由于从眼部清除了bgag
12,460
。测试了将
4x
bgag
12,460
配制在β-环糊精中是否会通过延长在眼部中的持久性来延长光感恢复的持续时间。据观察，在β-环糊精中的
4x
bgag
12,460
的确使光感恢复4周(图6d，红色符号)，这是迄今为止最长的观察期。在这一初步分析之后进行了一项更长时间的研究。发现在β-环糊精中的
4x
bgag
12,460
在玻璃体内注射后使避光恢复6周，在第7周下降到约一半并且在第8周下降到背景(图6e)。
[0756]
这些结果指示，rgc中的
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2使得先前失明的小鼠能够检测到昏暗的室内光线。这表示与早前用单价bgag
12,460
观察的相比敏感性显著增强近100倍，后者需要高得多的强度的光(5mw/cm2)，需要明亮的led光源(berry等人(2017)同上)。
[0757]
测试
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2是否也会恢复on-bc中的光感。为了测试这一点，使用相同的aav 4yf载体将编码snap-mglur2的基因引入on-bc中，但用仅在on-bc中表达的mglur6基因的on-bc选择性启动子置换hsyn启动子。使用最小grm6启动子的四个拷贝的串
联体(4xgrm6)。在rd1小鼠中玻璃体内注射aav2 4yf:4xgrm6-snap-mglur2后大约6周，玻璃体内注射在pbs中的
4x
bgag
12,460
并且使用光/暗避光测定进行测试。在注射后的第一周，这些经过治疗的rd1小鼠在暗室中消耗更多时间，但这种黑暗偏好到注射在pbs中的
4x
bgag
12,460
后第3周消失(图6d，灰色符号)。然而，如上文在rgc中所见，在β-环糊精中的配制剂将避暗的恢复延长至4周(图6d，蓝色符号)。
[0758]
因此，多价
4x
bgag
12,460
在rgc和on-bc中足够强烈地活化snap-mglur2，以支持在室内光线水平检测昏暗的光线并且在用于眼部递送类固醇的赋形剂中的配制剂在单次注射后延长作用数周。
[0759]
为了量化对光的敏感性，比较光照室的不同照明水平下在2室光/暗系统中自然避光的恢复。在25μw/cm2下观察到最大程度的避光行为，半最大响应介于5至25μw/cm2之间(图6f)，并且与早前用无支链的bgag所观察到的相比，敏感性增加～250倍。
[0760]
图6a-6f.rgc或on-bc rgc中的
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2恢复rd1小鼠的避光行为。图6a和图6b.
4x
bgag
12,460
的草图(a)和β-环糊精的分子描述(b)。图6c.具有两个ipad mini显示器的光/暗2室穿梭箱，一个白光照明(88μw/cm2)而另一个关闭。图6d.未经治疗的rd1小鼠在黑暗中消耗900s观察期的一半并且在光隔室中消耗一半(紫色虚线)。玻璃体内已经注射编码hsyn-snap-mglur2以在rgc中表达(绿色和红色)或编码4xgrm6-snap-mglur以在on-bc中表达(灰色和蓝色)的aav的rd1小鼠在注射配制在pbs(绿色和灰色)或β-环糊精(红色和蓝色)中的
4x
bgag 12,460
后1周在暗室中消耗的时间更多。然而，虽然用配制在pbs中的
4x
bgag 12,460
效果会在3周内逐渐消失，但配制在β-环糊精中时效果会持续4周。图6e.未经治疗的rd1小鼠在黑暗中消耗900s观察期的一半并且在光隔室中消耗一半(下部红色虚线)。玻璃体内已经注射编码hsyn-snap-mglur2以在rgc中表达的aav的rd1小鼠从注射配制在β-环糊精中的
4x
bgag 12,460
后1周开始在暗室中消耗更多的时间(上部红色虚线)并持续至第6周。到第8周，效果下降并且表现与未经治疗的rd1小鼠相同。图6f.在两室光/暗箱中以不同光强度进行的避光分析提供了强度-响应关系。在rgc中的
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2支持25μw/cm2下的最大避光响应并且在5至25μw/cm2之间具有半最大响应，其中0.2μw/cm2随机作用。
[0761]
4分支bgag恢复高敏感性线条图形识别
[0762]
如上所示，在rgc或on-bc中的
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2赋予高敏感性光感。有人问
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2是否会支持图形化视觉。测试了经治疗和未经治疗的rd1小鼠在学习的负关联任务中辨别两种不同的线条图形的能力。该任务在2室场所中进行，其中每个腔室的地板都是导电的，并且可以施加独立厌恶性轻微足部电击。每个腔室在其远端具有ipad mini，其显示出独特的线条图形，由两个间距之一的平行垂直线组成(1cm对比6cm)(图7b)。训练小鼠两天，在此期间，在其中一个腔室给予轻微足部电击。与足部电击相关的线条图形最初是随机分配的，但随后在2天的训练期间对该动物保持一致。第三天，未给予足部电击，并且只示出了显示器。在每次训练或测试期之前和之后彻底清洁腔室，以去除嗅觉线索。室内保持黑暗以避免室内参考视觉线索。并且厌恶和非厌恶线索在训练的第二天结束和测试当天之间切换，以避免位置偏向。如果他们有足够的视敏度来区分两种线条图形，有视力的动物会避开具有先前与足部电击相关的线条图形的一侧，而未经治疗的失明rd1显示出位置偏差，减少了它们处于训练期间已经厌恶并且在测试当天显示非厌恶性视
觉线索的一侧的时间(berry等人(2017)同上；和berry等人(2019)nature commun.10:1221)。
[0763]
在rgc中表达snap-mglur2的rd1小鼠，经过训练并且在玻璃体内注射在pbs中的
4x
bgag
12,460
后一周内进行了测试，在非厌恶视觉显示一侧消耗更多时间(图7c)。这种行为与未经治疗的rd1小鼠的行为形成鲜明对比，后者的位置偏向使它们偏爱在训练期间显示厌恶线索，但在测试期间显示非厌恶线索的腔室(图7c)。在on-bc中表达snap-mglur2并经过训练并且在玻璃体内注射在pbs中的
4x
bgag
12,460
后一周内进行了测试的rd1小鼠，在非厌恶视觉显示一侧也类似地消耗更多时间(图7c)。对具有非厌恶相关视觉线索的腔室的强烈偏好指示在rgc或on-bc中的
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2恢复空间图形识别并提供足够的敏度来区分间隔1cm与6cm的一对平行线。当
4x
bgag
12,460
配制在β-环糊精中时，玻璃体内注射后，区分这两种线条图形的能力恢复持续5周(图8a-8c)。
[0764]
由于将
4x
bgag
12,460
配制在β-环糊精中将其光感恢复延长了数周(图6d和6e)，因此有人问β-环糊精是否也会延长线条图形识别恢复的持续时间。发现在β-环糊精中的
4x
bgag
12,460
在玻璃体内注射之后5周内恢复了在on-bc或rgc中具有snap-mglur2的rd1小鼠区分示出一对间隔1cm和6cm的线条的ipad显示器的能力(图8a-8c)。与在on-bc中注射snap-mglur2后2周时相比，5周时的功效没有变化，但降低到在rgc中具有snap-mglur2的动物的约一半。
[0765]
为了进一步评估恢复的线条图形识别，将线条制作得更细并且线条之间的间隔也减小。比较间隔0.25cm或0.5cm的0.5cm宽的线条的显示器。在两室系统中，给定从决策点到ipad的距离为18cm，具有间隔0.5cm的0.5cm粗的线条的显示器相当于每度0.2个周期的视动性转鼓空间频率，并且接近野生型小鼠的敏度限值(kretschmer等人，2017)。在未治疗的rd1小鼠和在rgc中表达snap-mglur2的rd1小鼠中，在玻璃体内注射在pbs中的
4x
bgag
12,460
后，通过将间隔0.25cm或0.5cm的线条对与足部电极配对来训练小鼠。
4x
bgag
12,460
使得rd1小鼠能够执行任务并且做得与野生型小鼠一样好(图9)。
[0766]
图7a-7c.rgc或on-bc rgc中的
4x
bgag
12,460
:snap-mgl ur2恢复rd1小鼠中学习的空间图形识别引导行为。图7a.
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2的草图。图7b.配置用于使用ipad mini显示器进行厌恶相关调节的2室穿梭箱，其中在一个腔室中在白色背景上具有间隔1cm并且在另一个腔室中间隔6cm的2根平行黑色垂直条。图7c.未经治疗的rd1小鼠在厌恶侧消耗少于900s观察时间的一半，因为在训练期间对厌恶性的另一侧存在位置偏向。在
4x
bgag
12,460
注射的一周内，在rgc或on-bc中表达snap-mglur2的rd1小鼠都表现出对非厌恶性线条图形显示器的偏好。当snap-mglur2在rgc或on-bc中表达时，4xbgag支持紧密线条区别视敏度任务
[0767]
图8a-8c.图8a.
4x
bgag
12,460
和β-环糊精。图8b.配置用于厌恶相关调节的2室穿梭箱，其在每个腔室中的ipad上示出视觉线索：白色背景上间隔1cm或6cm的1cm宽的黑色条。图8c.与未经治疗的rd1对照相比，在on-bc或rgc中表达snap-mglur2的rd1小鼠中在β-环糊精中的
4x
bgag
12,460
在玻璃体内注射后2周和5周，使线条图形识别(偏爱具有非厌恶相关显示器的腔室)恢复。
[0768]
图9.
4x
bgag
12,460
恢复rd1小鼠的rgc中的高敏度线条图形识别。在pbs中的
4x
bgag
12,460
在rgc中表达snap-mglur2的rd1小鼠玻璃体内注射后，恢复线条图形识别以及
c57野生型动物中的正常视力。显示器使用间隔0.25cm或0.5cm的0.5cm宽的条，空间频率接近正常小鼠视力的分辨率限值。
[0769]
支链bgag恢复移动显示器中的线条图形识别
[0770]
预计恢复的光响应的开始、衰减和恢复的动力学会影响识别视觉图形的能力。已经提出了在照明终止后更快返回到基线和对后续光脉冲的响应性更快恢复来解释为什么rgc中的中波锥视蛋白支持静止和移动视觉显示器中的线条图形识别，而较慢的视紫红质则不支持，即使显示器静止时(berry等人(2019)同上)。因为用bgag
12,460
:snap-mglur2时的信号传导和恢复在照明终止后比中波锥视蛋白响应于光具有更短的延迟并且更快返回到基线(图10a-10c)(berry等人(2017)同上)；(berry等人(2019)同上)，有人提问bgag
12,460
:snap-mglur2是否也会支持更快移动速度下的线条图形识别。这在线条图形区别任务中进行了测试，在一个显示器中线条间隔6cm而在另一个显示器中间隔1cm，如上(图8a-8c)，除了现在线条在运动以外。发现线条显示器以4或8cm/s移动时，在rgc中具有
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2的rd1动物表现得与野生型动物一样好(图11)。相比之下，在rgc中表达中波锥视蛋白，经证实当显示器以1cm/s移动时表现良好的rd1动物(berry等人(2019)同上)，当显示器以4cm/s移动时，表现处于未经治疗的rd1动物的水平(图11)。因此，rgc中的
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2的速度限值≥8cm/s，而rgc中的中波锥视蛋白的速度限值≤4cm/s。
[0771]
图10a-10c.来自rgc中具有bgag
12,460
:snap-mglur2或中波锥视蛋白的经分离的rd1视网膜的rgc的mea记录。a)在玻璃体内注射bgag
12,460
之后，分离自以下小鼠的3个代表性视网膜中数十个rgc中对1s闪光的叠加平均响应：野生型小鼠(wt；红色)，在rg c中表达中波(mw)锥视蛋白的rd1小鼠(黑色)，和在rgc中表达snap-mglur2的rd1小鼠(蓝色)。注意wt和bgag
12,460
:snap-mglu r2中对光开始的短潜伏期响应与mw-视蛋白的延迟响应相比。b)bgag
12,460
:snap-mglur2的蓝光活化在照明期间引起持续幅度的立即抑制，接着在照明终止后出现瞬时激发性反弹。随着光脉冲的缩短(光子数目减少)，抑制和反弹激发的幅度减小但不改变动力学，从而保持短潜伏期及快速的活化和失活。(来自(berry等人(2017)同上)。c)中波锥视蛋白的绿光活化在延迟后引起瞬时激发。随着光脉冲的缩短，峰值响应的延迟增加并且失活减缓。(来自(berry等人(2019)同上)。
[0772]
图11.rd1小鼠的rgc中的
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2恢复移动显示器中的线条图形识别。配置用于厌恶相关调节的2室穿梭箱，其示出在每个腔室中的ipad上显示的视觉线索：白色背景上间隔1cm或6cm的1cm宽的黑色条，以4cm/s或8cm/s从左到右移动。
[0773]
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2恢复新物体探索
[0774]
上述实验显示，
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2使得使用计算机显示器进行图形识别成为可能。有人问
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2是否会在自然环境中作用，其中环境入射光照亮三维物体。为了解决这个问题，采用常用于测试新物体识别和探索行为的户外场所。小鼠自然避开开放空间并保持靠近环境的壁。从这些安全地点进行的探索性移动可以受到新刺激的推动。尽管小鼠在探索期间采用多种感觉方式，但已证实视力对空间导航至关重要。所述场所由容纳两个不同的新物体的立方体组成。放置小鼠靠在场所的壁上，离物体足够远，物体本身也相距足够远，使得无论动物沿壁行走还是探索其他物体，意外相遇的机会都很低。拍摄未经治疗的rd1小鼠和在rgc或on-bc中表达
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2的rd1小鼠。当它们
首次放置到所述场所中时，对它们的移动追踪10分钟。评估了最可能依赖于一定距离的视力的探索行为方面，即探索新物体的潜伏期。未经治疗的rd1小鼠对第一个物体有很长的潜伏期，并且似乎在转身时常常意外遇到该物体。数据示于图12中。在rgc或on-bc中具有snap-mglur2的rd1小鼠在玻璃体内注射在β-环糊精中的
4x
bgag
12,460
后5周具有较短的潜伏期。这些结果表明on-bc或rgc中的
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2为先前失明的动物提供在环境光下物体的自然视觉。
[0775]
图12.在rd1小鼠的rgc或on-bc中的
4x
bgag
12,460
:snap-mglur2支持新物体识别。户外行为场所容纳两个新物体。追踪小鼠以测量运动速度和探索物体的潜伏期。在未经治疗的rd1小鼠中和在on-bc或rgc中表达snap-mglur2的rd1小鼠中在玻璃体内注射在β-环糊精中的
4x
bgag
12,460
后5周，探索第一个物体的潜伏期。
[0776]
虽然已参照其特定的实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解在不背离本发明真实的精神和范围的情况下可以进行各种变化和等效物替代。另外，可做出许多修改来使具体情况、材料、物质组成、方法、一个或多个方法步骤适应于本发明的目的、精神和范围。所有此类修改意图在所附权利要求的范围内。