用于治疗扩张型心肌病的NRF2激活剂的制作方法

本发明涉及扩张型心肌病的治疗，特别涉及nrf2激活剂的用途。

背景技术：

1、尽管进行了治疗，心肌病和心力衰竭仍然是全世界发病率和死亡率的主要病因之一。扩张型心肌病(dcm或cmd)的特征在于心肌运动功能减退和心腔扩张。扩张型心肌病期间发生的心脏重塑包括与存在纤维化相关的心肌细胞损伤，它们彼此密不可分。对心肌细胞的损伤包括收缩能力的降低和结构的改变，这会导致细胞凋亡和纤维化的扩大，从而取代坏死的心肌细胞。成纤维细胞的增殖阻止了心肌细胞的代偿性肥大。这些表现在临床上将转化为心脏功能的下降。这种严重的并发症可能导致死亡。

2、病因特别包括遗传，以及多种毒性剂、代谢剂或感染剂。冠状动脉疾病和高血压可能起作用，但不是主要病因。在许多情况下，病因仍不清楚。涉及心肌细胞的确切机制取决于疾病的病因。在遗传诱导的扩张型心肌病中，涉及的大部分基因编码心肌细胞的结构元件，包括涉及细胞粘附和信号传导途径的细胞外基质或高尔基体蛋白(层粘连蛋白、fukutin)；涉及细胞连接的桥粒蛋白(桥粒糖蛋白、斑珠蛋白)；涉及钙稳态的肌质网蛋白(ryr2、atp2a2、受磷蛋白)；涉及心肌结构组织的核包膜蛋白(核纤层蛋白a/c)；涉及细胞骨架完整性和肌力传递的细胞骨架蛋白(肌营养不良蛋白、肌钙蛋白、α-辅肌动蛋白、结蛋白、肌聚糖)；以及涉及肌力的产生和传递的肌节蛋白(肌联蛋白、肌钙蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白)。在杜兴氏肌营养不良症(dmd)中，其是一种由抗肌萎缩蛋白基因突变引起的肌肉疾病，临床上在15岁左右出现扩张型心肌病并且几乎影响所有20岁以后的患者。就贝克尔肌营养不良症(bmd)(dmd的等位基因形式)而言，心脏损伤在20岁时出现，并且70％的患者在35岁后受到影响。肌联蛋白(肌节的一种巨大蛋白质)引起的dmc与1/250例心力衰竭有关(burkeet al.,jci insight.2016；1(6):e86898)。

3、目前可用于治疗获得性扩张型心肌病的药物将改进症状但不治疗疾病的致病机制。开具的治疗是针对心力衰竭的那些治疗，伴随有卫生和饮食措施，例如减少酒精消耗、减少水和盐摄取以及适度和定期的体育锻炼。在药物治疗中，转化酶抑制剂(ace抑制剂)血管紧张素ii阻止血管紧张素ii的产生以降低血管收缩和血压。利尿药通过抑制肾钠重吸收从体内除去过量的盐和水。β-阻断剂或β-肾上腺素能受体拮抗剂阻断扩张型心肌病期间刺激的肾上腺素能系统介质的作用并降低心率。盐皮质激素受体拮抗剂阻断醛固酮的结合并降低血压。当心律紊乱严重时，开具抗心律失常药物如胺碘酮。也可以考虑植入起搏器和/或自动除颤器。在最严重的病例中，患者可受益于心脏移植(ponikowski,et al.2016,european heart journal,37,2129-2200)。

4、因此，这些方法对于治疗dmd和肌联蛋白病的扩张型心肌病也是有效的。目前对于这些病理没有治愈性治疗。通常在dmd中开具的皮质类固醇治疗由于减少炎症而允许改进中期肌肉表型，但是其对心脏表型的作用是有争议的。与肌营养不良蛋白和肌联蛋白相关的dmd的治疗需要每年和系统的心脏检查(心电图和超声)。特别地，当作为从儿童期起的预防性治疗时，培哚普利(一种血管紧张素转化酶抑制剂)已经显示出降低dmd患者的死亡率(duboc,d.,et al.2005.journal of the american college of cardiology 45,855-857)。

5、在治疗dmd的心脏损伤中测试的分子主要是已经用于治疗心力衰竭的分子。其它疗法旨在通过减少纤维化来治疗肌肉和心脏损伤。这是潘瑞鲁单抗(ii期试验nct02606136)，一种抗结缔组织生长因子的单克隆抗体，和他莫昔芬(i期试验nct02835079和iii期试验nct03354039)，一种抗雌激素的情况。因此，医学上需要开发用于扩张型心肌病的新治疗策略。

6、核因子红细胞相关因子2(nrf2)也称为核因子红细胞衍生-2-样2，是由nfe2l2基因编码的转录因子。nrf2是碱性亮氨酸拉链蛋白，其调节防止由损伤和炎症引发的氧化损伤的抗氧化蛋白的表达(baird,l.and dinkova-kostova,a.t,2011,arch toxicol 85,241-272)。在正常条件下，通过keap1和cullin3(cul3)将nrf2保持在细胞质中，其通过蛋白酶体中的泛素化降解nrf2。氧化应激或亲电应激破坏keap1中的关键半胱氨酸残基，这导致keap1-cul3泛素化系统的破坏。当nrf2未被泛素化时，它被转运到核中，在核中它可以与小的maf蛋白(maff、mafg、mafk)之一结合，并与许多抗氧化基因的上游启动子区域中的are结合，以刺激抗氧化基因的转录(zhi-dong ge et al.2019,int heart j；60(3):512-520)。

7、nrf2活性由许多机制调节，表明严格控制对于正常细胞功能是必需的，并且nrf2的低活化和高活化二者均表明在心血管疾病的不同方面发挥作用。特别地，一些研究已经显示nrf2活化可以减少纤维化，特别是通过抑制ros/tgfβ1/smad2/3途径(cai,s.a.,etal.2018,frontiers in pharmacology 9；chen,r.-r.,et al.2019,chemico-biologicalinteractions 302,11-21；xian,s.et al.2020.exp ther med 19,2067-2074)。已表明nrf2降解与小鼠中扩张型心肌病表型有关(jiang,x.et al.2018.redox biol,19,134-146)。然而，nrf2激活剂用于治疗特定扩张型心肌病的用途从未被公开。

8、发明概述

9、本发明人开发并表征了遗传诱导的扩张型心肌病deltamex5的小鼠模型，其中缺失肌联蛋白的倒数第二个外显子。使用作为扩张型心肌病的严重模型的deltamex5小鼠模型，本发明人已经表明nrf2的过表达诱导心脏纤维化和心脏肥大的显著改进，表明nrf2的活化代表扩张型心肌病的治疗方法，特别是遗传诱导的心肌病(如肌联蛋白病)，对于遗传诱导的心肌病如肌联蛋白病，由于基因的大小，基因转移方法是不可能的。

10、本发明涉及用于治疗扩张型心肌病的nrf2激活剂，优选包含编码人nrf2或变体的转基因的核酸构建体。在一个优选实施方案中，所述核酸构建体包含选自下组的心脏启动子：人心肌肌钙蛋白t启动子(tnnt2)、α肌球蛋白重链启动子(α-mhc)、肌球蛋白轻链2v启动子(mlc-2v)、肌球蛋白轻链2a启动子(mlc-2a)、carp基因启动子、α-心肌肌动蛋白启动子、α-原肌球蛋白启动子、心肌肌钙蛋白c启动子、心肌肌球蛋白结合蛋白c启动子、肉瘤/内质网ca2+atp酶(serca)启动子、结蛋白启动子、mh启动子、ck8启动子和mhck7启动子；优选人心肌肌钙蛋白t启动子。在具体实施方案中，将所述核酸构建体被包装入病毒颗粒，优选腺相关病毒(aav)颗粒。被包装入aav颗粒的所述核酸构建体优选包含aav-2血清型的5’-itr和3’-itr或对应于所选aav颗粒血清型的5’itr和3’itr。在一个具体实施方案中，所述aav颗粒优选包含衍生自选自下组的aav血清型的aav衣壳蛋白：aav-1、6、8、9和aav9.rh74血清型，更优选aav-9.rh74血清型。在一个具体实施方案中，所述病毒颗粒静脉内施用。

11、根据本发明，所述扩张型心肌病是由选自下组的基因中的突变引起的遗传诱导的心肌病：层粘连蛋白、emrin、fukutin、fukutin相关蛋白、桥粒芯胶蛋白、斑珠蛋白、利阿诺定受体2、肌浆网ca(2+)atp酶2亚型α、受磷蛋白、核纤层蛋白a/c、肌营养不良蛋白、telethonin、辅肌动蛋白、结蛋白、肌聚糖、肌联蛋白、肌球蛋白、rna结合基序蛋白20、bcl-2相关的永生基因3、桥粒斑蛋白、钠通道、心脏肌动蛋白、心脏肌钙蛋白和tafazzin；优选由肌联蛋白或肌营养不良蛋白基因的突变引起。

12、另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含如上所述的nrf2激活剂和药用赋形剂。

13、发明详述

14、本公开涉及用于在有需要的受试者中治疗扩张型心肌病的nrf2激活剂。

15、“nrf2激活剂”是指增加nrf2表达和/或生物活性的任何试剂，特别是导致nrf2蛋白的刺激的和/或增加的核易位并引起随后的靶基因(如nad(p)h醌氧化还原酶1(nqo1)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(gclc)、硫氧还蛋白1(srxn1)、硫氧还蛋白还原酶1(txnrd1)、血红素加氧酶-1(hmox-1)、谷胱甘肽s-转移酶(gst)、udp-葡萄糖醛酸基转移酶(ugt))的增加的试剂。特别地，所述nrf2激活剂对应于keap1抑制剂。

16、nrf2表达和/或活性可以通过包括但不限于以下的试剂来增加：化学制品、已知修饰基因表达的化合物、修饰或未修饰的多核苷酸(包括寡核苷酸)、多肽、肽、小rna分子和mirna。这种试剂是本领域公知的。

17、nrf2活性的增加可以通过本领域任何熟知的方法(如免疫组化或蛋白质印迹检测)通过用所述试剂处理的细胞中的nrf2核易位来测定。nrf2活性的增加还可以通过测量用所述nrf2激活剂处理的细胞中nrf2靶基因的表达水平来测定。在一个更具体的实施方案中，靶基因选自下组：nad(p)h醌氧化还原酶1(nqo1)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(gclc)、硫氧还蛋白1(srxn1)、硫氧还蛋白还原酶1(txnrd1)、血红素加氧酶-1(hmox-1)、谷胱甘肽s-转移酶(gst)、udp-葡萄糖醛酸基转移酶(ugt)。当靶基因的表达水平比未处理的细胞低至少1.5倍，或低2，3，4，5倍时，细胞中nrf2活性增加。

18、mrna的表达水平可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法测定。例如，首先根据标准方法提取样品中所含的核酸，例如使用裂解酶或化学溶液，或根据制造商的说明书通过核酸结合树脂提取。然后，通过杂交(例如，northern印迹分析)和/或扩增(例如，rt-pcr)检测提取的mrna。

19、靶基因的表达水平也可以通过技术人员已知的任何合适的方法来测定。例如，可以通过半定量蛋白质印迹、酶标记和介导的免疫测定(如elisa)、生物素/抗生物素蛋白型测定、放射免疫测定、免疫电泳、质谱或免疫沉淀或通过蛋白质或抗体阵列来测量蛋白质的量。

20、在另一个具体实施方案中，nrf2活性的增加可以通过测量nrf2的表达水平来测定。当nrf2的表达水平比未处理的细胞高至少1.5倍，或2，3，4，5倍时，细胞中nrf2的调节活性增加。nrf2的表达水平可以通过如上所述的本领域技术人员已知的任何合适的方法测定。

21、nrf2激活剂是本领域公知的，并且可以选自下组：亲电子化合物、蛋白质-蛋白质相互作用(ppi)抑制剂和多靶标药物。在一个具体实施方案中，所述nrf2激活剂是亲电化合物，作为非限制性实例，其可以选自下组：甲基巴多索隆(cddo-me)、rta-408(omaveloxolone)、富马酸二甲酯、alks-8700、奥替普拉、熊去氧胆酸、莱菔硫烷、sulforadex(sfx-01)、ith12674、姜黄素、白藜芦醇、槲皮素、染料木黄酮、andeographolide和cxa-10。作为非限制性实例，nrf2激活剂还可以是选自下组的蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂：肽、rs-5,苯磺酰基-嘧啶酮2,n-苯基-苯磺酰胺和1,4-二苯基-1,2,3-三唑，或选自下组的典型nrf2激活剂：莱菔硫烷(sfn)和叔丁基氢醌(tbhq)。

22、转基因

23、在优选实施方案中，本公开涉及通过基因疗法治疗扩张型心肌病。术语“基因疗法”是指治疗受试者，其包括将基因/核酸递送到个体的细胞中，目的是治疗疾病。通常使用递送媒介物(也称为载体)实现基因的递送。病毒和非病毒载体可用于将基因递送至患者细胞。

24、因此，在一个实施方案中，nrf2激活剂是受试者中编码nrf2或其变体的转基因。

25、本文所用的术语“转基因”是指编码基因产物的外源dna或cdna。基因产物可以是rna、肽或蛋白质。除了基因产物的编码区之外，转基因可以包括促进或增强表达的一个或多个元件或与促进或增强表达的一个或多个元件相关，例如启动子、增强子、应答元件、报告元件、绝缘子元件、聚腺苷酸化信号和/或其它功能元件。本公开的实施方案可以利用任何已知的合适的启动子、增强子、应答元件、报告元件、绝缘子元件、聚腺苷酸化信号和/或其他功能元件。合适的元件和序列是本领域技术人员公知的。

26、术语“核酸序列”和“核苷酸序列”可以互换使用，指由单体核苷酸组成或包含单体核苷酸的任何分子。核酸可以是寡核苷酸或多核苷酸。核苷酸序列可以是dna或rna。核苷酸序列可以是化学修饰的或人工的。核苷酸序列包括肽核酸(pna)、吗啉代和锁核酸(lna)以及乙二醇核酸(gna)和苏阿糖核酸(tna)。通过改变分子的主链，这些序列中的每一个与天然存在的dna或rna不同。也可以使用硫代磷酸酯核苷酸。其它脱氧核苷酸类似物包括甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、n3'p5'-氨基磷酸酯和寡核糖核苷酸硫代磷酸酯以及它们的2'-0-烯丙基类似物和2'-0-甲基核苷酸甲基膦酸酯，它们可用于本公开的核酸中。

27、根据本公开的转基因可以是编码nfr2蛋白，特别是天然哺乳动物，优选人nfr2蛋白或其变体的任何核酸序列。

28、基因核因子，红细胞2样2(nfe2l2)(基因id：4780)，也称为nrf2、hebp1，编码六种人nrf2蛋白亚型，亚型1(登录号：np_006155.2)、亚型2(登录号：np_001138885.1)、亚型3(登录号：np_001138885.1)、亚型4(登录号：np_001300831.1)、亚型5(登录号：np_001300832.1)和亚型6(登录号：np_001300833.1)。优选地，人nrf2蛋白包含或由亚型1或a的氨基酸序列组成。

29、许多不同哺乳动物nrf2蛋白的编码序列是已知的，包括但不限于人、猪、黑猩猩、狗、牛、小鼠、兔或大鼠，并且可以容易地在序列数据库中找到。或者，本领域技术人员可以基于多肽序列容易地测定编码序列。

30、在一个优选实施方案中，所述转基因包含nrf2蛋白的编码序列，其可选自下组人核因子的参考序列：红细胞2样2(nfe2l2)转录物变体1(登录号：nm_006164.5)、转录物变体2(登录号：nm_001145412.3)、转录物变体3(登录号：nm_001145413.3)、转录物变体4(登录号：nm_001313900.1)、转录物变体5(登录号：nm_001313901.1)、转录物变体6(登录号：nm_001313902.1)、转录物变体7(登录号：nm_001313903.1)和转录物变体8(登录号：nm_001313904.1)。

31、在一个具体实施方案中，根据本公开的转基因可以是编码nfr2蛋白变体的任何核酸序列。

32、优选地，如本文所用，术语“变体”是指具有与天然序列具有至少70,75,80,85,90,95或99％序列同一性的氨基酸序列的多肽。如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性”是指来自两个多肽序列的比对的位置上的匹配(相同氨基酸残基)的数目(％)。通过在比对时比较序列来测定序列同一性，以便使重叠和同一性最大化，而使序列空位最小化。特别地，取决于两个序列的长度，可以使用多种数学全局或局部比对算法中的任一种来测定序列同一性。优选使用全局比对算法(例如needleman和wunsch算法；needleman和wunsch,1970)，其在整个长度上最佳比对序列，而基本上不同长度的序列优选使用局部比对算法(例如smith和waterman算法(smith和waterman，1981)或altschul算法(altschul等人，1997；altschul等人，2005)。用于测定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以本领域技术人员已知的各种方式实现，例如，使用可在互联网网站(如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/)上获得的可公开获得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。出于本文的目的，％氨基酸序列同一性值是指使用成对序列比对程序emboss needle产生的值，其使用needleman-wunsch算法产生两个序列的最佳全局比对，其中所有搜索参数设置为默认值，即评分矩阵＝blosum62，空位开放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罚分＝假，末端空位开放＝10和末端空位延伸＝0.5。

33、更优选地，术语“变体”是指具有与天然序列相差少于30，25，20，15，10或5个取代、插入和/或缺失的氨基酸序列的多肽。在优选实施方案中，变体与天然序列的不同之处在于一个或多个保守取代，优选地少于15、10或5个保守取代。保守取代的实例在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)的组中。变体的nrf2活性可通过如上所述的本领域技术人员已知的任何方法评估。

34、在具体实施方案中，所述转基因可以是编码nrf2蛋白或其变体的优化序列。

35、术语“密码子优化的”是指将表达人偏倚的密码子(即在人基因中是常见的，但在其它哺乳动物基因或非哺乳动物基因中是不常见的)改变为不表达人偏倚的同义密码子(编码相同氨基酸的密码子)。因此，密码子的改变不会导致所编码蛋白质的任何氨基酸改变。

36、核酸构建体

37、在具体实施方案中，所述转基因包含在核酸构建体中。

38、本文所用的术语“核酸构建体”是指使用重组dna技术产生的人造核酸分子。核酸构建体是单链或双链的核酸分子，其已被修饰以包含核酸序列的片段，这些片段以天然不存在的方式组合和并列。核酸构建体通常是“载体”，即用于将外源产生的dna递送到宿主细胞中的核酸分子。

39、优选地，核酸构建体包含与指导所述转基因在心脏细胞中表达的一个或多个控制序列可操作地连接的转基因。

40、控制序列可以包括被心脏细胞识别的启动子。启动子含有转录控制序列，其在导入宿主细胞后介导nrf2蛋白的表达。启动子可以是在细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子。启动子可以是组成型或诱导型启动子，优选组成型启动子，并且更优选强组成型启动子。

41、启动子也可以是组织特异性的，特别是心脏细胞特异性的。在一个具体实施方案中，本公开的核酸构建体还包含可操作地连接至如上所述的转基因的心脏特异性启动子。在本公开的上下文中，“心脏特异性启动子”是在心脏中比在机体的任何其它组织中更有活性的启动子。典型地，心脏特异性启动子的活性在心脏中显著高于在其它组织中。例如，这种启动子的活性可以多至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍或至少10倍(例如，与其在其它细胞或组织中驱动表达的能力相比，通过其在给定组织中驱动表达的能力来测定)。因此，心脏特异性启动子允许与其连接的基因在心脏中的活性表达，并阻止其在其它细胞或组织中的表达。

42、合适的启动子的实例包括但不限于人肌钙蛋白t基因启动子(tnnt2)、α肌球蛋白重链启动子(α-mhc)、肌球蛋白轻链2启动子(mlc-2)、α-心肌肌动蛋白启动子、α-原肌球蛋白启动子、心肌肌钙蛋白c启动子、心肌肌球蛋白结合蛋白c启动子、肉瘤/内质网ca2+atp酶(serca)启动子、结蛋白启动子、mh启动子、ck8启动子和mhck7启动子。优选地，所述启动子是人心肌肌钙蛋白t启动子。肌肉杂合启动子(mh启动子)公开于例如piekarowicz et al.,molecular therapy,2019,15,157-169。ck8是肌肉肌酸激酶启动子/增强子元件(et al.,mol.ther.,2011,19,1331-1341)。mhck7启动子基于肌肉肌酸激酶(ck)和α-肌球蛋白重链基因的增强子/启动子区(salva et al.,mol.ther.,2007,15,320-329)。

43、控制序列还可以包括适当的转录起始、终止和增强子序列；有效的rna加工信号(如剪接和聚腺苷酸化信号)；稳定细胞质mrna的序列；提高翻译效率的序列(即，kozak共有序列)；和/或增强蛋白质稳定性的序列。大量的表达控制序列，例如天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的，是本领域已知的，并且可以用于驱动编码nrf2的核酸序列的表达。典型地，编码nrf2的转基因与转录启动子和转录终止子可操作地连接。

44、除了以下实施例中具体描述的特定递送系统之外，各种递送系统是已知的，并且可用于施用如上所述的核酸构建体，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达nrf2编码序列的重组细胞、受体介导的胞吞作用、作为逆转录病毒或其它载体的一部分的治疗性核酸的构建等中。

45、表达载体

46、如上所述的核酸构建体可以包含在表达载体中。载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有任何确保自我复制的手段。或者，载体可以是当引入宿主细胞时整合到基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。

47、合适载体的实例包括但不限于重组整合或非整合病毒载体和衍生自重组噬菌体dna、质粒dna或粘粒dna的载体。优选地，载体是重组整合或非整合病毒载体。重组病毒载体的实例包括但不限于衍生自疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺相关病毒或牛乳头瘤病毒的载体。

48、作为人基因治疗的潜在载体，aav载体获得极大的兴趣。所述病毒的有利特性包括其与任何人类疾病都缺乏关联、其能够感染分裂和非分裂细胞、以及衍生自不同组织的广泛的细胞系可以被感染。

49、aav基因组由含有4681个碱基的线性单链dna分子组成(berns and bohenzky,1987,advances in virus research(academic press,inc.)32:243-307)。基因组在每个末端包括反向末端重复序列(itr)，其作为dna复制的起点和作为病毒的包装信号以顺式起作用。itr的长度约为145bp。基因组的内部非重复部分包括两个大的开放阅读框，分别称为aav rep和cap基因。这些基因编码参与病毒体复制和包装的病毒蛋白。特别地，从aav rep基因rep78、rep68、rep52和rep40合成至少四种病毒蛋白，根据它们的表观分子量命名。aavcap基因编码至少三种蛋白vp1、vp2和vp3。对于aav基因组的详细描述，参见例如muzyczka,n.1992current topics in microbiol.and immunol.158:97-129。

50、因此，在一个实施方案中，包含上述转基因的核酸构建体还包含腺相关病毒的5'itr和3'itr序列，优选5'itr和3'itr序列。

51、如本文所用，术语“反向末端重复序列(itr)”是指位于病毒的5'-末端(5'itr)的核苷酸序列和位于3'-末端(3'itr)的核苷酸序列，其含有回文序列并且可以折叠以形成在dna复制起始期间充当引物的t形发夹结构。它们也是用于将病毒基因组整合到宿主基因组中；用于从所述宿主基因组的拯救；以及用于将病毒核酸衣壳化成成熟病毒体。载体基因组复制和其包装到病毒颗粒中需要顺式itr。

52、用于本公开的核酸构建体中的aav itr可具有野生型核苷酸序列或可通过插入、缺失或取代而改变。aav反向末端重复序列(itr)的血清型可选自任何已知的人或非人aav血清型。在特定的实施方案中，核酸构建体可以通过使用任何aav血清型的itr来进行，包括aav1、aav2、aav3(包括3a和3b型)、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、鸟aav、牛aav、犬aav、马aav、绵羊aav和现在已知或以后发现的任何其它aav血清型或工程化aav。

53、在一个实施方案中，核酸构建体还包含aav-2血清型的5'itr和3'itr或对应于所选aav颗粒血清型的5'itr和3'itr。

54、另一方面，如上所述的核酸构建体可以通过使用合成5'itr和/或3'itr；以及使用来自不同血清型病毒的5'itr和3'itr来进行。病毒载体复制所需的所有其它病毒基因可以如下所述在病毒生产细胞(包装细胞)中以反式提供。因此，它们在病毒载体中的包含是任选的。

55、在一个实施方案中，本公开的核酸构建体或病毒载体包含病毒的5′itr、ψ包装信号和3′itr。“ψ包装信号”是病毒基因组的顺式作用核苷酸序列，其在一些病毒(例如腺病毒，慢病毒…)中对于复制期间将病毒基因组包装到病毒衣壳中的过程是必需的。

56、重组aav病毒颗粒的构建通常是本领域已知的并且已经描述于例如us 5,173,414和us5,139,941；wo 92/01070,wo 93/03769,lebkowski et al.(1988)molec.cell.biol.8:3988-3996；vincent et al.(1990)vaccines 90(cold springharbor laboratory press)；carter,b.j.(1992)current opinion in biotechnology 3:533-539；muzyczka,n.(1992)current topics in microbiol.and immunol.158:97-129；和kotin,r.m.(1994)human gene therapy 5:793-801。

57、病毒颗粒

58、在一个实施方案中，本公开涉及包含如上所述的核酸构建体或表达载体的病毒颗粒。

59、本公开的核酸构建体或表达载体可以包装到病毒衣壳中以产生“病毒颗粒”，也称为“病毒载体颗粒”。在具体实施方案中，将如上所述的核酸构建体或表达载体包装到aav衍生的衣壳中以产生“腺相关病毒颗粒”或“aav颗粒”。本公开涉及包含本公开的核酸构建体或表达载体并且优选包含腺相关病毒的衣壳蛋白的病毒颗粒。

60、术语aav载体颗粒涵盖任何基因工程化的重组aav载体颗粒或突变型aav载体颗粒。重组aav颗粒可以通过将包括来源于特定aav血清型的itr的核酸构建体或病毒表达载体包封在由对应于相同或不同血清型aav的天然或突变cap蛋白形成的病毒颗粒上来制备。

61、腺相关病毒的病毒衣壳蛋白包括衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。不同aav血清型的衣壳蛋白序列之间的差异导致使用不同的细胞表面受体用于细胞进入。与其它胞内加工途径结合，这对每种aav血清型产生不同的组织向性。

62、已经开发了几种技术来修饰和改进天然存在的aav病毒颗粒的结构和功能性质(bünning h et al.j gene med,2008；10:717–733；paulk et al.mol ther.2018；26(1):289-303；wang l et al.mol ther.2015；23(12):1877-87；vercauteren et al.molther.2016；24(6):1042-1049；zinn e et al.,cell rep.2015；12(6):1056-68)。

63、因此，在根据本公开的aav病毒颗粒中，包括给定aav血清型的itr的核酸构建体或病毒表达载体包装到例如：a)由衍生自相同或不同aav血清型的衣壳蛋白构成的病毒颗粒；b)由来自不同aav血清型或突变体的衣壳蛋白的混合物构成的嵌合病毒颗粒；c)由已被不同aav血清型或变体之间的结构域交换截短的衣壳蛋白构成的嵌合病毒颗粒。

64、本领域技术人员将理解，根据本公开使用的aav病毒颗粒可以包含衍生自任何aav血清型的衣壳蛋白，所述aav血清型包括aav1、aav2、aav3(包括3a和3b型)、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav2i8、aavrh10、aavrh39、aavrh43、aavrh74、aav-lk03、aav2g9、aav.php、aav-anc80、aav3b和aav9.rh74(如wo2019/193119中所公开)。

65、对于基因转移到人心脏细胞中，aav血清型1、6、8、9和aav9.rh74是优选的。aav血清型9和aav9.rh74特别适合在心肌细胞/心肌细胞中诱导表达。在一个特定实施方案中，aav病毒颗粒包含本公开的核酸构建体或表达载体，优选来自aav9或aav9.rh74血清型的衣壳蛋白。

66、药物组合物

67、根据本公开的nrf2激活剂、核酸构建体、表达载体或病毒颗粒优选以包含治疗有效量的根据本公开的nrf2激活剂、核酸构建体、表达载体或病毒颗粒的药物组合物的形式使用。

68、在本公开的上下文中，治疗有效量是指足以逆转、减轻或抑制该术语适用的疾病或病症的进展，或逆转、减轻或抑制该术语适用的疾病或病症的一种或多种症状的进展的剂量。

69、有效剂量的确定和调整取决于多种因素，例如所使用的组合物、施用途径、所考虑个体的身体特征(例如性别、年龄和体重)、同时用药以及其他医学领域技术人员将承认的因素。

70、在本公开的各种实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体和/或媒介物。

71、“药学上可接受的载体”是指当酌情施用于哺乳动物，尤其是人时不产生不利、过敏或其它不适当的反应的媒介物。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。

72、优选地，药物组合物包含载体，其对于能够注射的制剂是药学上可接受的。这些可特别是等渗、无菌的盐水溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的，尤其是冷冻干燥的组合物，视情况而定，其在添加时使用无菌水或生理盐水构成可注射溶液。

73、适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或悬浮液。溶液或悬浮液可包含与病毒载体相容且不阻止病毒载体颗粒进入靶细胞的添加剂。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是流动的，程度是注射器能够容易注射。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。合适溶液的实例是缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(pbs)或林格乳酸盐。

74、扩张型心肌病的治疗

75、根据本公开的nrf2激活剂、核酸构建体、表达载体或病毒颗粒用于治疗任何扩张型心肌病(dcm)。

76、扩张型心肌病(cmd)的特征在于心脏扩张和收缩功能降低。cmd是心肌病的最常见形式，并且占在1-10岁的患者中进行的所有心脏移植的一半以上。dcm的病因特别包括遗传学，以及多种毒性剂、代谢剂或感染剂。毒性剂或代谢剂特别包括酒精和可卡因滥用和化疗剂，例如多柔比星和钴；甲状腺疾病；炎性疾病，例如结节病和结缔组织疾病；心动过速诱导的心肌病；自身免疫机制；妊娠并发症；和硫胺素缺乏。感染剂特别包括由克氏锥虫引起的查加斯病和急性病毒性心肌炎的后遗症，例如柯萨奇b型病毒和其它肠道病毒。在20-30％的病例中存在可遗传的模式。大多数家族性cmd谱系显示常染色体显性遗传模式，通常出现在生命的第二或第三个十年中(由levitas et al.,europ.j.hum.genet.,2010,18:1160-1165总结)。

77、在遗传诱导的扩张型心肌病中，涉及的大部分基因编码心肌细胞的结构元件，包括涉及细胞粘附和信号传导途径的细胞外基质或高尔基体蛋白(层粘连蛋白、fukutin)；涉及细胞连接的桥粒蛋白(桥粒糖蛋白、斑珠蛋白)；涉及钙稳态的肌质网蛋白(ryr2、serca2a(atp2a2)、受磷蛋白)；涉及心肌结构组织的核包膜蛋白(核纤层蛋白a/c)；涉及细胞骨架完整性和肌力传递的细胞骨架蛋白(肌营养不良蛋白、肌钙蛋白、α-辅肌动蛋白、结蛋白、肌聚糖)；以及涉及肌力的产生和传递的肌节蛋白(肌联蛋白、肌钙蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白)。

78、已经发现许多基因中的突变导致不同形式的扩张型心肌病(cmd)。这些特别包括：

79、－cmd1a，由染色体1q22上的核纤层蛋白a/c基因(lmna)(omim#150330)中的杂合突变；或层粘连蛋白α2(lama2或merosin)基因(omim#156225；marques et al.,neuromuscul.disord.,2014,doi.org/10.10106/)中的杂合突变引起的扩张型心肌病-1a(omim#115200)；

80、－9q13上的cmd1b(omim#600884)；将称为fdc基因座的基因置于d9s153和d9s152之间的间隔中。friedreich共济失调(omim#229300)通常与扩张型心肌病相关，并与调节心脏中钙通道离子传导的camp依赖性蛋白激酶(omim#176893)定位于同一区域。定位于9q22的原调蛋白(omim#190930)是特别有吸引力的候选基因。

81、－cmd1c(omim#601493)，有或无左心室非压实，由10q23上的lim结构域结合3，ldb3(或zasp)基因(omim#605906)中的突变引起；

82、－cmd1d(omim#601494)，由1q32上的肌钙蛋白t2，心脏(tnnt2)基因(omim#191045)中的突变引起；

83、－cmd1e(omim#601154)，由3p22上的scn5a基因(omim#600163)中的突变引起；

84、－cmd1f：符号cmd1f以前用于随后发现与结蛋白相关肌病或肌病，肌原纤维(mfm)相同的病症(omim#601419)；

85、－cmd1g(omim#604145)，由2q31上的肌联蛋白(ttn)基因(omim#188840)中的突变引起；

86、－2q14-q22上的cmd1h(omim#604288)；

87、－cmd1i(omim#604765)，由2q35上的结蛋白(des)基因(omim#125660)中的突变引起；

88、－cmd1j(omim#605362)，由6q23上的eya4基因(omim#603550)中的突变引起；

89、－6q12-q16上的cmd1k(omim#605582)；

90、－cmd1l(omim#606685)，由5q33上的肌聚糖delta(sgcd)基因(omim#601411)中的突变引起；

91、－cmd1m(omim#607482)，由11p15上的csrp3基因(omim#600824)中的突变引起；

92、－cmd1n(omim#607487)，由titin-cap(telethonin或tcap)基因(omim#604488)中的突变引起。

93、－cmd1o(omim#608569)，由12p12上的abcc9基因(omim#601439)中的突变引起；

94、－cmd1p(omim#609909)，由6q22上的受磷蛋白(pln)基因(omim#172405)中的突变引起；

95、－7q22.3-q31.1上的cmd1q(omim#609915)；

96、－cmd1r(omim#613424)，由15q14上的肌动蛋白α，心肌(actc1)基因(omim#102540)中的突变引起；

97、－cmd1s(omim#613426)，由14q12上的肌球蛋白重链7，心肌β(myh7)基因(omim#160760)中的突变引起；

98、－cmd1u(omim#613694)，由14q24上的psen1基因(omim#104311)中的突变引起；

99、－cmd1v(omim#613697)，由1q42上的psen2基因(omim#600759)中的突变引起；

100、－cmd1w(omim#611407)，由编码10q22上的metavinculin(vcl；omim#193065)中的突变引起；

101、－cmd1x(omim#611615)，由编码9q31上的fukutin(fktn；omim#607440)基因中的突变引起；

102、－cmd1y(omim#611878)，由15q22上的tpm1基因(omim#191010)中的突变引起；

103、－cmd1z(omim#611879)，由3p21上的肌钙蛋白c(tnnc1)基因(omim#191040)中的突变引起；

104、－cmd1aa(omim#612158)，由1q43上的辅肌动蛋白α-2(actn2)基因(omim#102573)中的突变引起；

105、－cmd1bb(omim#612877)，由18q12上的dsg2基因(omim#125671)中的突变引起；

106、－cmd1cc(omim#613122)，由1p31上的nexn基因(omim#613121)中的突变引起；

107、－cmd1dd(omim#613172)，由10q25上的rna结合基序蛋白20(rbm20)基因(omim#613171)中的突变引起；

108、－cmd1ee(omim#613252)，由14q12上的肌球蛋白重链6，心肌，alpha(myh6)基因(omim#160710)中的突变引起；

109、－cmd1ff(omim#613286)，由19q13上的肌钙蛋白i，心脏(tnni3)基因(omim#191044)中的突变引起；

110、－cmd1gg(omim#613642)，由5p15上的sdha基因(omim#600857)中的突变引起；

111、－cmd1hh(omim#613881)，由10q26上的bcl2相关永生基因3(bag3)基因(omim#603883)中的突变引起；

112、－cmd1ii(omim#615184)，由6q21上的cryab基因(omim#123590)中的突变引起；

113、－cmd1jj(omim#615235)，由6q21上的层粘连蛋白α4(lama4)基因(omim#600133)中的突变引起；

114、－cmd1kk(omim#615248)，由10q21上的mypn基因(omim#608517)中的突变引起；

115、－cmd1ll(omim#615373)，由1p36上的prdm16基因(omim#605557)中的突变引起；

116、－cmd1mm(omim#615396)，由11p11上的mybpc3基因(omim#600958)中的突变引起；

117、－cmd1nn(omim#615916)，由3p25上的raf1基因(omim#164760)中的突变引起；

118、－cmd2a(omim#611880)，由19q13上的肌钙蛋白i，心脏(tnni3)基因中的突变引起；

119、－cmd2b(omim#614672)，由7q21上的gatad1基因(omim#614518)中的突变引起；

120、－cmd2c(omim#618189)，由1p34上的ppcs基因(omim#609853)中的突变引起；

121、－cmd3a，发现先前指定的x-连锁形式与barth综合征相同(omim#302060)；和

122、－cmd3b(omim#302045)，一种cmd的x-连锁形式，由肌营养不良蛋白基因(dmd，omim#300377)中的突变引起。

123、结蛋白相关肌病或肌病，肌原纤维(mfm)(omim#601419)是指一组形态学上同质但遗传上异质的慢性神经肌肉疾病的非正式术语。mfm中骨骼肌的形态改变是由于肌节z盘和肌原纤维的分解，随后是z盘结构中涉及的多种蛋白的异常异位积累，包括结蛋白、α-b-晶状体蛋白(cryab；omim#123590)、肌营养不良蛋白(omim#300377)和肌球蛋白(ttid；omim#604103)。肌原纤维肌病-1(mfm1)由染色体2q35上的结蛋白基因(des；omim#125660)中的杂合子、纯合子或复合杂合子突变引起。mfm的其它形式包括mfm2(omim#608810)，由cryab基因(omim#123590)中的突变引起；mfm3(omim#609200)(omim#182920)，由myot基因(omim#604103)中的突变引起；mfm4(omim#609452)，由zasp基因(ldb3；omim#605906)中的突变引起；mfm5(omim#609524)，由flnc基因(omim#102565)中的突变引起；mfm6(omim#612954)，由bag3基因(omim#603883)中的突变引起；mfm7(omim#617114)，由ky基因(omim#605739)中的突变引起；mfm8(omim#617258)，由pyroxd1基因(omim#617220)中的突变引起；和mfm9(omim#603689)，由ttn基因(肌联蛋白；omim#188840)中的突变引起。

124、还发现其它基因中的突变导致不同形式的扩张型心肌病。这些包括：

125、－桥粒芯胶蛋白2(dsc2，omim#125645)，导致致心律失常性右心室发育不良11(omim#610476)和扩张型心肌病(elliott et al.,circ.vasc.genet.,2010,3,314-322)；

126、－结合斑珠蛋白(jup或斑珠蛋白；omim#173325)，导致致心律失常性右心室发育不良12(omim#611528)和扩张型心肌病(elliott et al.,circ.vasc.genet.,2010,3,314-322)；

127、－利阿诺定受体2(ryr2；omim#180902)，导致致心律失常性右心室发育不良2(omim#600996)和室性心动过速，儿茶酚胺能多晶型1(omim#604772)和扩张型心肌病(zahurul,circulation,2007,116,1569-1576)；

128、－atp酶，ca(2+)-转运慢开关(atp2a2；atp2b，肌质网ca ca(2+)atp酶亚型α(serca2a)。

129、－emerin(emd)；fukutin相关蛋白(fkrp)；tafazzin(taz)；桥粒斑蛋白(dsp)；以及钠通道，例如scn1b、scn2b、scn3b、scn4b、scn4a、scn5a等。

130、在一些实施方案中，扩张型心肌病是获得性扩张型心肌病；例如由根据本公开的毒性剂、代谢剂或感染剂引起。扩张型心肌病的病因也可能未知(特发性扩张型心肌病)。

131、在一些优选的实施方案中，所述扩张型心肌病是遗传性扩张型心肌病；优选地由选自下组的基因中的突变引起：层粘连蛋白，特别是层粘连蛋白α2(lama2)和层粘连蛋白α4(lama4)；emerin(emd)；fukutin(fktn)；fukutin相关蛋白(fkrp)；桥粒芯胶蛋白，特别是桥粒芯胶蛋白2(dsc2)；斑珠蛋白(jup)；兰诺定受体2(ryr2)；肌质网ca ca(2+)atp酶亚型α(serca2a)；受磷蛋白(pln)；核纤层蛋白a/c(lmna)；肌营养不良蛋白(dmd)；titin-cap或telethonin(tcap)；辅肌动蛋白，特别是辅肌动蛋白α-2(actn2)；结蛋白(des)；肌动蛋白，特别是心脏肌动蛋白、肌动蛋白α、心肌(actc1)；肌聚糖，特别是肌聚糖δ(sgcd)；肌联蛋白(ttn)；肌钙蛋白，特别是心肌肌钙蛋白、肌钙蛋白t2、心肌(tnnt2)；肌钙蛋白c(tnnc1)和肌钙蛋白i，心肌(tnni3)；肌球蛋白，特别是肌球蛋白重链7，心肌，β(myh7)和肌球蛋白重链6，心肌，α(myh6)；rna结合基序蛋白20(rbm20)；bcl2相关的永生基因3(bag3)；桥粒斑蛋白(dsp)；tafazzin(taz)和钠通道，如scn1b、scn2b、scn3b、scn4b、scn4a、scn5a等，优选肌营养不良蛋白(dmd)或肌联蛋白(ttn)。

132、本公开还提供了用于治疗根据本公开的扩张型心肌病的方法，其包括：向患者施用治疗有效量的如上所述的nrf2激活剂、核酸构建体或病毒颗粒或药物组合物。

133、本公开还提供了如上所述的nrf2激活剂、核酸构建体或病毒颗粒或药物组合物用于治疗根据本公开的扩张型心肌病的用途。

134、本公开还提供了如上所述的nrf2激活剂、核酸构建体或病毒颗粒或药物组合物在制备用于治疗根据本公开的扩张型心肌病的药物中的用途。

135、本公开还提供了用于治疗根据本公开的扩张型心肌病的药物组合物，其包含如上所述的nrf2激活剂、核酸构建体或病毒颗粒作为活性组分。

136、本公开还提供了包含根据本公开所述的用于治疗扩张型心肌病的nrf2激活剂、核酸构建体或病毒颗粒的药物组合物。

137、“治疗有效量”是指在实现所需治疗结果(例如减少心脏纤维化和/或改进心脏功能)所需的剂量和时间段有效的量。本公开的产品或包含其的药物组合物的治疗有效量可根据因素(如个体的疾病状态、年龄、性别和体重)以及产品或药物组合物在个体中引起所需应答的能力而变化。可以调整剂量方案以提供最佳治疗应答。治疗有效量典型地也是其中治疗有益效果超过产品或药物组合物的任何毒性或有害效果的量。

138、如本文所用，术语“患者”或“个体”表示哺乳动物。优选地，根据本公开的患者或个体是人。

139、在本公开的上下文中，如本文所用的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指逆转、减轻或抑制该术语所适用的扩张型心肌病或病症的进展，或逆转、减轻或抑制该术语所适用的病症或病症的一种或多种症状的进展，特别是减少心脏纤维化和/或改进心脏功能。

140、本公开的药物组合物通常根据已知程序以在患者中有效诱导治疗效果的剂量和时间段施用。

141、施用可以是全身的或局部的。全身施用是优选的，如肠胃外施用如皮下(sc)、肌内(im)；血管内施用，如静脉内(iv)或动脉内；腹膜内(ip)；皮内(id)，间质或其他。施用可以是例如通过注射或灌注。在一些优选实施方案中，施用是肠胃外的，优选血管内，如静脉内(iv)或动脉内。除非另外指明，否则本公开的实践将采用本领域技术范围内的常规技术。这种技术在文献中有充分的解释。

142、现在将参考附图通过以下实施例举例说明本发明，这些实施例不是限制性的，其中：

技术实现思路