组合物及其使用方法与流程

该领域涉及用作防腐剂和/或抗微生物剂的活性交联酶及其配制剂。

背景技术：

1、用于保护和保存配制剂免受细菌或真菌攻击的防腐组合物是本领域已知的并且在诸如个人护理产品、家庭和工业产品、健康和卫生产品以及药品等领域具有广泛的应用。常规的防腐剂混合物包括传统的活性成分，诸如甲醛、甲醛释放剂、酚类化合物、季铵化合物、卤代化合物和/或对羟基苯甲酸酯，因为这些类型的化合物取得良好的杀细菌和杀真菌特性(美国专利号9,661,847b2)。除了化学品和小分子，杀生物酶和蛋白质已被用作食品(malhotra等人(2015)frontiers in microbiology 6:611)、医疗保健(kaplan等人(2010)journal of dental research 89:205-218)和海洋(olsen等人(2007)biofouling 23:369-383)工业中的生物相容性防腐剂。这些酶的实例包括：氧化酶和过氧化物酶(例如，葡萄糖氧化酶、漆酶)，其生成用于杀生物活性的氧化种类；裂解性酶，包括蛋白酶、水解酶和裂解酶(例如，溶菌酶、溶葡萄球菌素、枯草杆菌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、几丁质酶、脂肪酶)，它们降解微生物(例如，真菌、病毒、细菌)的表面；核酸酶(例如，乳铁蛋白、dna酶、rna酶)，它们水解核酸诸如rna或dna；和抗微生物肽(例如，乳酸链球菌素、片球菌素)，它们通过在细胞壁上形成孔，导致细胞破裂和细胞内容物渗漏来杀伤微生物。防腐剂混合物中的抗微生物剂之间的累加效应不仅允许降低单个成分的浓度，而且还阻碍抗微生物剂抗性，因为生物体受到多种作用模式的攻击，从而提供广谱抗微生物作用。

2、其他人已经鉴定出基于酶的抗微生物组合物。例如，美国专利号5,326,561公开了使用裂解性酶，诸如几丁质分解酶、葡聚糖分解酶和纤维素酶的抗真菌组合物。然而，裂解性酶的使用可能存在问题，因为此类酶可能破坏含有以下的消费品配制剂：(a)酯类，其用作调理剂和增亮剂，(b)蛋白质(例如，角蛋白和肽毛发/皮肤状况)，和/或(c)碳水化合物(例如，树胶和其他增稠剂)。因此，仍然需要具有抗微生物(例如，杀细菌和杀真菌)活性且没有有害副作用的药剂。

3、烷基化剂和交联化学剂已成功用于广谱微生物控制。其中最主要的是基于醛的杀生物剂，诸如甲醛和戊二醛，多年来已知它们具有广谱抗微生物活性。众所周知，这些醛交联至关重要的细胞成分，诸如细胞功能所需要的蛋白质、酶和核酸。该作用导致抑制微生物生长或细胞死亡。然而，醛类的反应性性质意味着它们可能通过非期望的化学反应在配制剂内迅速分解。此外，甲醛被归类为3类cmr(致癌、致突变和生殖毒性)。

4、少许缓慢释放甲醛的抗微生物剂仍在使用和商业制备。由于缺乏有效且广为接受的抗微生物剂，工业中被迫继续使用甲醛供体，如dmdm乙内酰脲、咪唑烷基脲和重氮烷基脲(diazolidinyl urea)。这些物质释放的甲醛能够经由其反应性醛式功能与若干化妆品成分反应。例如，唯一可用且全球认可的uv-a吸收剂阿伏苯宗与甲醛衍生物释放的甲醛发生反应。这是防晒剂配制剂的缺点。

5、国际公开日期为2020年9月10日的pct公开号wo 2020/181099公开了抗微生物组合物，其可以具有为活性形式或酶原形式的交联酶，其中此类组合物可以用于延长产品的保质期。

6、本公开说明了基于醛的交联化学防腐剂的替代物。具体而言，本公开提供了通过使用交联酶用于微生物控制的基于酶的机制。交联酶对某些官能团或肽序列高度精确，允许与化学防腐剂或生物基抗微生物剂(例如，肽、蛋白质和酶)的相容性。本文提供的酶的分子量大于10kda，意味着皮肤渗透的风险较低。此外，本文提供的酶对交联氨基酸残基具有高度特异性，而不与核酸反应，从而减轻了安全性以及与化学交联剂(如甲醛)相关联的致突变和致癌特性的关键问题。交联酶提供了对化学交联剂的绿色、可持续替代物，用于广谱微生物控制。

技术实现思路

0、发明概述

1、在第一实施方案中，公开了组合物，其包含(a)至少一种交联酶，任选地为酶原的形式，组合(b)选自酶、肽和/或蛋白质的至少一种组分，任选地具有抗微生物活性，并且任选地进一步组合(c)至少一种化学防腐剂，其中包含(a)组合(b)，并且任选地进一步组合(c)的组合物具有选自防腐剂和抗微生物剂的至少一种活性。

2、在第二实施方案中，至少一种交联酶选自转谷氨酰胺酶、赖氨酰氧化酶、酪氨酸酶、漆酶、分选酶、甲酰甘氨酸生成酶和巯基氧化酶。优选地，至少一种交联酶是转谷氨酰胺酶。最优选地，至少一种交联酶与seq id no：2中所列的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。

3、在第三实施方案中，公开了本文所述实施方案中的任一者的具有抗微生物活性的至少一种组分选自溶菌酶、几丁质酶、脂酶、溶素、溶葡萄球菌素、葡聚糖酶、dna酶、rna酶、乳铁蛋白、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、乳过氧化物酶、内酯酶、酰化酶、分散素b(dispersinb)、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、乳酸链球菌素、细菌素、铁载体(siderophore)、多粘菌素和防御素。

4、在第四实施方案中，公开了本文所述实施方案中的任一者的至少一种化学防腐剂选自季铵化合物、洗涤剂、离液剂、有机酸、醇、二醇、醛、氧化剂、对羟基苯甲酸酯、异噻唑啉酮和阳离子聚合物。

5、在第五实施方案中，公开了(a)至少一种交联酶为酶原的形式并且(b)至少一种组分包含酶，进一步地其中酶原和酶相互作用以产生具有选自防腐剂和抗微生物剂的至少一种活性的活性酶。

6、在第六实施方案中，公开了表达载体，其包含编码至少一种交联酶的至少一种异源核酸序列，该至少一种交联酶任选地为酶原的形式，其中所述异源核酸序列任选地与至少一种调控序列可操作地连接，并且其中表达载体能够转化宿主细胞以在细胞内或细胞外表达至少一种交联酶，使得转化的宿主细胞被灭活、抑制或杀伤。此外，至少一种交联酶选自转谷氨酰胺酶、赖氨酰氧化酶、酪氨酸酶、漆酶、分选酶、甲酰甘氨酸生成酶和巯基氧化酶。优选地，至少一种交联酶是转谷氨酰胺酶。最优选地，至少一种交联酶与seq id no：2中所列的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。

7、序列概述

8、seq id no：1对应于茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)成熟形式的转谷氨酰胺酶(tgase)序列。

9、seq id no：2对应于seq id no：1成熟形式序列的变体。

10、seq id no：3对应于茂原链霉菌tgase酶原形式(pro-tgase)的变体的序列。

11、seq id no：4对应于茂原链霉菌酶原形式的野生型pro-tamep序列(pro-tamep；uniprot p83543)，其含有c端六组氨酸标签。

12、seq id no：5对应于茂原链霉菌酶原形式的野生型pro-sm-tap序列(pro-sm-tap；uniprot p83615)，其含有c端六组氨酸标签。

13、seq id no：6对应于seq id no：2中茂原链霉菌的变体转谷氨酰胺酶序列，成熟形式，包括n端甲硫氨酸和c端肽接头和六组氨酸标签。