稳定性改善的重组肉毒毒素轻链蛋白组合物的制作方法

本技术主张基于2020年9月29日申请的韩国专利申请第10-2020-0127249号的优先权，该申请的说明书和附图中公开的所有内容均援用于本技术。本公开涉及改善重组肉毒毒素轻链蛋白的稳定性的组合物。

背景技术：

1、肉毒毒素(botulinum toxin)是厌氧菌肉毒杆菌(clostridium botulinum)的多肽产物，是神经毒素的一种。该毒素通过阻断神经递质乙酰胆碱在哺乳类神经肌肉接头部(neuro muscular junction)的突触前释放而引起肌肉麻痹。

2、利用将没有人体副作用的用量以下作为注射药使用时，只能使注射部位的肌肉部分麻痹的原理，肉毒毒素在治疗不随意肌运动障碍方面得到治疗学应用。不随意肌运动障碍包括斜视、特发性眼睑痉挛、半侧颜面、斜颈、口下颌骨肌张力异常、痉挛性发声障碍、以及多种类型的肌肉痉挛及发作。

3、肉毒毒素近年来被用于麻痹眼角、眉间、额头等处形成皱纹的肌肉，从而非外科地减少颜面上的皱纹，也被用于缩小毛孔、粉刺、赋予弹力、缓解方下巴等审美、美容学领域。

4、肉毒毒素分为8种神经毒素，其中7种(a、b、c、d、e、f、g)可诱发神经麻痹。

5、肉毒毒素的大小约为150kda，除肉毒毒素蛋白外，还由非毒素蛋白(non-toxin)的复合体构成。每个复合体的大小根据毒素型的种类而最大生成至900kda。据悉，作用形式和对象、活性时间等根据肉毒毒素型而改变，其中a型肉毒毒素是致命的生物学作用剂之一。

6、无论毒素型如何，肉毒毒素的分子机制似乎相似。肉毒毒素表达为一个多肽，表达后通过重组过程分为约100kda的重链(heavy chain，h链)和约50kda的轻链(light chain，l链)。再次，h链和l链通过二硫键连接。尽管根据肉毒毒素型具有不同的靶标，但共同的是h链与神经细胞的受体结合，通过内吞作用(endocytosis)形成包含毒素的内体(endosome)。通过这种内体允许肉毒毒素进入内部。l链进入细胞后逃出内体，切割细胞质内的snare蛋白，抑制乙酰胆碱分泌，从而表现出肌肉麻痹效果。

7、一般来说，蛋白质制剂容易因蛋白质的变性、凝集等而使稳定性降低。这些蛋白质制剂的不稳定性随着蛋白质制剂的储存时间的延长而增加。在蛋白质制剂的剂型化中，主要目的是保持蛋白质的溶解度、稳定性、生物活性度等。特别是，蛋白质制剂中酶根据它们的三维结构，生物活性度会大幅改变。将纯化的肉毒毒素结晶用生理盐水或水稀释时，生物学活性和药剂学特性丧失。另外，已知在40℃以上的温度下容易变性。即，公知如果没有合适的稳定剂，则肉毒毒素的毒性会被迅速清除。

8、以药剂学目的流通的肉毒毒素通常是包含非-毒素蛋白(non-toxin protein)和肉毒毒素蛋白分子的毒素复合体。非-毒素蛋白在毒素复合体中起到稳定肉毒毒素分子、保护其免于变性从而保护肉毒毒素活性的作用。为了以化妆料的目的使用肉毒毒素，必须具备弱毒化(toxicity attenuation)过程和皮肤渗透性。因此，需要开发一种组合物，其不是与非-毒素蛋白一起的毒素复合体形式而是仅通过l链来保持肉毒毒素的活性。

技术实现思路

1、技术课题

2、肉毒毒素的轻链是一种能够水解肽键的内肽酶(endopeptidase)。在a型肉毒毒素的情况下，切割snare蛋白中的snap-25。因此，可以说轻链单独也可以抑制神经细胞的乙酰胆碱分泌。着眼于此，试图开发具有肌肉麻痹效果的仅具有肉毒毒素轻链的组合物，优选地试图以能够经皮传递的形式开发。

3、因此，本公开要解决的课题是提供一种含有重组肉毒毒素轻链蛋白的稳定组合物。

4、特别是，本公开旨在进一步提供一种组合物，其不仅在冷藏条件下而且在室温下长时间储存时也保持肉毒毒素的内肽酶(endopeptidase)活性。更优选地，本公开旨在提供一种组合物，其作为消除使用上的不便的制剂形式，是液态形式而非冻干形式。

5、技术方案

6、本发明人发现了通过特定的稳定剂充分确保重组肉毒毒素轻链蛋白的稳定性，同时将重组肉毒毒素轻链蛋白的生物学活性保持在可用水平的惊人效果，从而完成了本发明。

7、具体地，本发明人试图通过在含有重组肉毒毒素轻链蛋白的组合物中包含糖醇、多元醇、高分子化合物、表面活性剂、抗氧化剂等用于蛋白质稳定化的多种稳定剂中的任一种以上来制备在室温下蛋白质稳定性增强的组合物。然而，确认了重组肉毒毒素轻链蛋白稳定性根据稳定剂的种类而显著不同。

8、在各种蛋白质稳定剂中，只有糖醇(sugar alcohol)显著增强了a型肉毒毒素轻链蛋白或其片段(具有基本相同功效的片段)的稳定性，本发明人确认了这些意想不到的实验结果，从而完成了本发明。

9、本发明的糖醇是典型地衍生自糖的有机化合物，并且是每个碳原子上附着一个羟基(-oh)的物质。链的长度根据碳数而多种多样，并且根据羟基的方向存在多种异构体。当糖醇包含多个羟基时，可以归类为多元醇(polyol)，但在本说明书中，将多元醇和糖醇区分开来，并且将多元醇定义为除糖醇外的具有羟基的物质。

10、本公开的一个方面提供了一种包含a型肉毒毒素轻链蛋白或其片段和稳定剂的组合物，其中稳定剂是糖醇。

11、优选地，本公开的一个方面的a型肉毒毒素轻链蛋白是包含序列号:1的448个氨基酸序列的a型肉毒毒素轻链蛋白。在本公开的一个优选方面，本发明的a型肉毒毒素轻链蛋白由序列号:1组成。

12、在本公开的一个方面，a型肉毒毒素轻链蛋白除了轻链蛋白氨基酸序列之外，还可以包含额外的氨基酸序列，用于生产蛋白质、纯化蛋白质等目的。例如，本发明的a型肉毒毒素轻链蛋白可以在序列号:1的氨基酸序列中进一步包含额外的氨基酸序列，例如序列号:3的21个氨基酸序列。

13、另外，在本发明中，可以利用具有相同功效的片段代替本发明的a型肉毒毒素轻链蛋白。例如，作为这种片段，可以利用包含序列号:2的425个氨基酸序列的a型肉毒毒素轻链蛋白片段。在本公开的一个方面，本发明的a型肉毒毒素轻链蛋白片段由序列号:2的序列组成。

14、在本公开的一个方面，a型肉毒毒素轻链蛋白片段除了片段的氨基酸序列之外，还可以包含额外的氨基酸序列，用于生产蛋白质、纯化蛋白质等目的。例如，本公开的一个方面的a型肉毒毒素轻链蛋白片段可以在序列号:2的氨基酸序列中进一步包含额外的氨基酸序列，例如序列号:3的21个氨基酸序列。

15、然而，即使进一步包含额外的氨基酸序列，a型肉毒毒素轻链蛋白或其片段的功能也不会改变。

16、在本公开的一个方面，a型肉毒毒素轻链蛋白是利用a型肉毒毒素蛋白的氨基酸序列中具有酶活性的n-末端部分的氨基酸序列的重组蛋白。

17、本说明书中使用的术语“重组”蛋白是由引入宿主细胞例如细菌或真核生物细胞内的异源(例如，重组)核酸编码的蛋白质。即，指的是经过基因操作以使能够大量生产的蛋白质。

18、本发明的蛋白质或其片段可根据该技术领域公知的常规方法制备。例如，可利用美国注册专利第10,300,118号等中提及的方法。

19、在本公开的一个优选方面，组合物是液态组合物。与冻干形式相比，液态形式的组合物可以改善使用上的不便。不仅如此，液态形式在化妆品的制造过程中不需要充氮过程，因此在经济方面是有利的。如果在化妆品制造时利用冻干形式的蛋白质，则需要充氮过程以确保稳定性。通常，在液态形式下稳定性降低，但本公开的组合物具有即使在这种液态形式下也可以保持稳定性的很大优点。

20、在本公开的一个方面，本发明的组合物优选为化妆料组合物，更优选为用于改善皮肤皱纹的化妆料组合物。

21、在本发明中，术语“改善皱纹”是指抑制或延缓皮肤上产生皱纹，或缓解已经产生的皱纹。

22、在本公开的一个方面，化妆料组合物可以剂型化为本领域通常制备的剂型即溶液、混悬液、乳浊液、露(lotion)、油、化妆水、软化水等，但不限于此。更具体地，可以制备成柔肤水、营养化妆水、爽肤水(skin)、皮肤柔软剂(skin softner)、皮肤调色剂(skintoner)、收敛水(astringent)、乳露(milk lotion)、保湿露(moisture lotion)、营养露、乳液、乳状液(emulsion)、精华液、营养精华液等的化妆品剂型，但不限于此。

23、在本公开的一个方面，本发明的化妆料组合物可以进一步包含一种以上的化妆品学上可接受的载体。在本公开的一个方面，可以包含在化妆料组合物中的化妆品学上可接受的载体根据剂型而多种多样。

24、在本公开的一个方面，当组合物的剂型为溶液或乳浊液时，作为载体成分，利用溶剂、增溶剂或乳浊剂，例如可以单独或组合利用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇、脱水山梨糖醇的脂肪酸酯等。

25、在本公开的一个方面，当组合物的剂型为混悬液时，可以单独或组合利用作为载体成分的水、乙醇或丙二醇等液体稀释剂；乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯等悬浮剂；微晶纤维素；偏氢氧化铝；膨润土；琼脂；黄芪胶等。

26、在本公开的一个方面，化妆料组合物可利用常规化妆料制备方法制备，并且本发明的化妆料组合物可以以化妆品的形式制备。这种化妆品可以通过任意选择附加的成分来适当地配制。例如，可以包括常规成分，例如增稠剂、表面活性剂、保湿剂、研磨剂、甜味剂、ph调节剂、防腐剂、结合剂、润湿剂、起泡剂、增溶剂、颜料或香料。

27、本发明的稳定剂是糖醇。在包括糖醇、多元醇、高分子化合物等的多种物质中，糖醇对本发明的a型肉毒毒素轻链蛋白或其片段的稳定性非常有效。

28、在本公开的一个方面，本发明的稳定剂是优选碳数为6以下、更优选碳数为2至6的糖醇。

29、在本公开的另一个方面，本发明的稳定剂是优选在20℃下在水中的溶解度为150mg/ml以上、更优选在20℃下在水中的溶解度为150mg/ml至10,000mg/ml的糖醇。

30、在本公开的另一个方面，本发明的稳定剂是碳数为6以下的糖醇中在20℃下在水中的溶解度为150mg/ml以上的糖醇。优选地，上述稳定剂是碳数为2至6且在20℃水中的溶解度为150mg/ml至10,000mg/ml的糖醇。

31、在本公开的另一个方面，本发明的稳定剂是乙二醇(ethylene glycol)、甘油(glycerol)、赤藓糖醇(erythritol)、苏糖醇(threitol)、阿拉伯糖醇(arabitol)、木糖醇(xylitol)、核糖醇(ribitol)、山梨糖醇(sorbitol)、艾杜糖醇(iditol)或它们的混合物。优选地，本发明的稳定剂是甘油(glycerol)、木糖醇(xylitol)、山梨糖醇(sorbitol)或它们的混合物，更优选是甘油。甘油表现出明显优于其他稳定剂的效果。

32、在本公开的一个方面，本发明提供了一种组合物，其中相对于组合物的总重量，稳定剂为50重量％以下、优选20至50％。为了使本发明的稳定剂具有有效的蛋白质稳定化效果，相对于组合物的总重量，必须占20重量％以上。

33、本说明书中使用的术语“稳定的”、“稳定化的”、“稳定”或“稳定化”是指将重组肉毒毒素轻链蛋白在25℃以下储存并用特定组合物重组时的酶活性保持在原始酶活性的1/3水平以上。在本说明书中，“酶活性为1/3水平以上”与美国注册专利第8,617,568号中的定义相同。在美国注册专利第8,617,568号中，在评价现有的肉毒毒素蛋白时，如果经3单位(unit)处理并显示1单位以上的活性，则评价其活性显著，并且本说明书中的稳定化也是指表现出这种水平的活性。

34、本发明中记载的所有成分优选地不超过韩国、中国、美国、欧洲、日本等的相关法规、规范(例如，化妆品安全标准等相关规定(韩国)、化妆品安全技术规范(中国)、卫生规范(中国))等中规定的最大使用值。即，优选地，本发明的化妆料或个人护理用组合物以各国相关法规、规范中允许的含量限度包含本发明的成分。

35、发明效果

36、本公开提供了一种包含稳定性得到改善、即其效果能够长时间保持的a型肉毒毒素轻链蛋白或其片段的组合物。特别是，本发明的组合物即使在液态剂型中也可以确保稳定性。