用于改善癌症T细胞免疫疗法的DNA构建体

背景技术：

1、当前用于修饰针对治疗用途的离体或活体基因编辑细胞的技术集中于纠正现有突变，将治疗适用性限制在由导致基因功能失调的单突变引起的病症，或者整合全新的合成基因，这些技术需要广泛的研究和开发才能创造出新的能够用于治疗的合成dna序列。因此，基因组修饰的选择有限。考虑到t细胞在过继性细胞疗法中的重要性，获得人t细胞并对其进行修饰以产生具有所需的一种或多种功能的经编辑的t细胞的能力可能有利于过继性t细胞疗法的开发和应用。

技术实现思路

1、本公开涉及用于修饰t细胞基因组的组合物和方法。发明人已发现，可以修饰人t细胞以改变t细胞特异性和功能。通过将编码多肽和异源性t细胞受体(tcr)或合成抗原受体(例如嵌合抗原受体(car))的核酸插入t细胞基因组中的特定内源位点(例如，tcr基因座)，可以制备具有所需tcr或car抗原特异性和多肽功能的人t细胞。此外，本文所述的组合物和方法可用于产生特异性和功能改变的人t细胞，同时限制与t细胞疗法相关的副作用。

2、本文提供异源表达一种或多种多肽的人t细胞，其中一种或多种多肽由插入细胞tcr基因座的核酸构建体编码。

3、在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人ox40胞内结构域(和任选地，fas胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人fas胞外结构域或其部分；(fas-ox40)。

4、在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人ox40胞内结构域(和任选地，tnfrsf12胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人tnfrsf12胞外结构域。

5、在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人ox40胞内结构域(和任选地，ltbr胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人ltbr胞外结构域。

6、在一些实施方式中，多肽是截短的人ltbr蛋白，其包含人ltbr胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸。

7、在一些实施方式中，多肽是截短的人tnfrsf12蛋白，其包含人tnfrsf12胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸。

8、在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人4-1bb胞内结构域(和任选地，lag3胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人lag-3胞外结构域。

9、在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人il-4r胞内结构域(和任选地，dr5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人dr5胞外结构域。

10、在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人il-4r胞内结构域(和任选地，dr4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人dr4胞外结构域。

11、在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人il-4r胞内结构域(和任选地，tnfrsf1a胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人tnfrsf1a胞外结构域。

12、在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人il-4r胞内结构域(和任选地，ltbr胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人ltbr胞外结构域。

13、在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人icos胞内结构域连接的人il-4ra胞外结构域。

14、在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人icos胞内结构域连接的人lag3胞外结构域或其部分(和任选地，icos胞外结构域的1-20个氨基酸)。

15、在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人cd28胞内结构域连接的人ctla4胞外结构域或其部分(和任选地，ctla4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)。

16、在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人icos胞内结构域连接的人cd200r胞外结构域或其部分(和任选地，icos胞外结构域或其部分)。

17、在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人cd28胞内结构域连接的人dr5胞外结构域或其部分(和任选地，dr5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)。

18、在一些实施方式中，多肽包括全长il21r蛋白、lat1蛋白、batf蛋白、batf3蛋白、batf2蛋白、id2蛋白、id3蛋白、irf8蛋白、myc蛋白、pou2f1蛋白、tfap4蛋白、smad4蛋白、nfatc1蛋白、ezh2蛋白、eomes蛋白、sox5蛋白、irf2bp2蛋白、sox3蛋白、prdm1蛋白、il2ra或relb蛋白。

19、一些实施方式中，t细胞异源表达包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽：seq id no:33-seq id no:64、seq id no:99、seq id no:101、seq idno:103和seq id no:105。

20、一些实施方式中，t细胞包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的异源性核酸序列：seq id no:1-32、seq id no:98、seq id no:100、seq id no:102和seq id no:104。

21、在一些实施方式中，t细胞表达识别靶抗原的抗原特异性t细胞受体(tcr)或合成抗原受体。在一些实施方式中，t细胞是调节t细胞、效应t细胞、记忆t细胞或原初t细胞。在一些实施方式中，效应t细胞是cd8+t细胞或cd4+t细胞。在一些实施方式中，效应t细胞是cd8+cd4+t细胞。在一些实施方式中，t细胞是原代细胞。

22、在一些实施方式中，靶插入位点位于tcr-α亚基恒定基因(trac)的外显子1中。在一些实施方式中，靶插入位点位于tcr-β亚基恒定基因(trbc)的外显子1中。

23、在一些实施方式中，插入人t细胞的异源性核酸以下述顺序编码：(i)第一自切割肽序列；(ii)第一异源性tcr亚基链，其中tcr亚基链包含tcr亚基的可变区和恒定区；(iii)第二自切割肽序列；(iv)如本文所述的异源性多肽；(v)第三自切割肽序列；(vi)第二异源性tcr亚基链的可变区；和(vii)内源性tcr亚基的n末端的部分，其中，如果细胞的内源性tcr亚基是tcr-α(tcr-阿尔法)亚基，那么第一异源性tcr亚基链是异源性tcr-β(tcr-贝塔)亚基链且第二异源性tcr亚基链是异源性tcr-α亚基链，并且其中如果细胞的内源性tcr亚基为tcr-β亚基，那么第一异源性tcr亚基链是异源性tcr-α亚基链且第二异源性tcr亚基链是异源性tcr-β亚基链。

24、在一些实施方式中，插入人t细胞的异源性核酸以下述顺序编码，(i)第一自切割肽序列；(ii)如本文所述的异源性多肽；(iii)第二自切割肽序列；(iv)第一异源性tcr亚基链，其中tcr亚基链包含tcr亚基的可变区和恒定区；(v)第三自切割肽序列；(vi)第二异源性tcr亚基链的可变区；和(vii)内源性tcr亚基的n末端的部分，其中，如果细胞的内源性tcr亚基为tcr-α(tcr-阿尔法)亚基，那么第一异源性tcr亚基链是异源性tcr-β(tcr-贝塔)亚基链且第二异源性tcr亚基链是异源性tcr-α亚基链，并且其中如果细胞的内源性tcr亚基为tcr-β亚基，那么第一异源性tcr亚基链是异源性tcr-α亚基链且第二异源性tcr亚基链是异源性tcr-β亚基链。

25、在一些实施方式中，核酸构建体以下述顺序编码：(i)第一自切割肽序列；(ii)合成抗原受体；(iii)第二自切割肽序列；(iv)本文所述的异源性多肽；和(v)第三自切割肽序列或多聚a序列。

26、在一些实施方式中，核酸构建体以下述顺序编码：(i)第一自切割肽序列；(ii)异源性多肽；(iii)第二自切割肽序列；(iv)合成抗原受体；和(v)第三自切割肽序列或多聚a序列。

27、在一些实施方式中，核酸构建体包含与选自下组的核酸序列至少95％相同的核酸序列：seq id no:1-seq id no:32、seq id no:98、seq id no:100、seq id no:102和seqid no:104。

28、还提供了修饰人t细胞的方法，包括(a)向人t细胞引入(i)切割人t细胞tcr基因座中靶区域以在细胞基因组中产生靶插入位点的靶向核酸酶；和(ii)编码多肽的核酸构建体，多肽选自下组：包含通过跨膜结构域与人ox40胞内结构域(和任选地，fas胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人fas胞外结构域或其部分的多肽；(fas-ox40)；包含通过跨膜结构域与人ox40胞内结构域(和任选地，tnfrsf12胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人tnfrsf12胞外结构域的多肽；包含通过跨膜结构域与人ox40胞内结构域(和任选地，ltbr胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人ltbr胞外结构域的多肽；截短的人ltbr蛋白，其包含人ltbr胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸；截短的人tnfrsf12蛋白，其包含人tnfrsf12胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸；截短的人btla蛋白，其包含人btla胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸；包含通过跨膜结构域与人4-1bb胞内结构域(和任选地，lag3胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人lag-3胞外结构域的多肽；包含通过跨膜结构域与人il-4r胞内结构域(和任选地，dr5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人dr5胞外结构域的多肽；包含通过跨膜结构域与人il-4r胞内结构域(和任选地，dr4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人dr4胞外结构域的多肽；包含通过跨膜结构域与人il-4r胞内结构域(和任选地，tnfrsf1a胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人tnfrsf1a胞外结构域；包含通过跨膜结构域与人il-4r胞内结构域(和任选地，ltbr胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人ltbr胞外结构域；包含通过跨膜结构域与人icos胞内结构域连接的人il-4ra胞外结构域；包含通过跨膜结构域与人icos胞内结构域连接的人lag3胞外结构域或其部分(和任选地，icos胞外结构域的1-20个氨基酸)的多肽；包含通过跨膜结构域与人cd28胞内结构域连接的人ctla4胞外结构域(和任选地，ctla4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)的多肽，包含通过跨膜结构域与人icos胞内结构域连接的人cd200r胞外结构域(和任选地，cd200r胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)的多肽，包含与编码人icos的氨基酸129-199的多肽连接的人cd200r胞外结构域的多肽；包含通过跨膜结构域与人cd28胞内结构域连接的人dr5胞外结构域(和任选地，dr5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)的多肽；；和包含il21r蛋白、lat1蛋白、batf蛋白、batf3蛋白、batf2蛋白、id2蛋白和id3蛋白、irf8蛋白、myc蛋白、pou2f1蛋白、tfap4蛋白、smad4蛋白、nfatc1蛋白、exh2蛋白、eomes蛋白、sox5蛋白、irf2bp2蛋白、sox3蛋白、prdm1蛋白、il2ra或relb蛋白的多肽；和(b)允许重组发生，从而将核酸构建体插入靶插入位点以产生修饰的人t细胞。

29、在一些方法中，多肽包含与选自下组的蛋白质至少95％相同的氨基酸序列：seqid no:33-seq id no:64、seq id no:99、seq id no:101、seq id no:103和seq id no:105。

30、在一些方法中，靶插入位点位于tcr-α(tcr-阿尔法)亚基恒定基因(trac)的外显子1中或tcr-β亚基恒定基因(trbc)的外显子1中。

31、在一些方法中，通过将包含核酸构建体的病毒载体引入细胞中来插入核酸构建体。在一些实施方式中，靶向核酸酶选自rna向导的核酸酶结构域，转录激活因子样效应核酸酶(talen)，锌指核酸酶(zfn)和megatal。

32、在一些方法中，将靶向核酸酶、向导rna和dna模板作为核糖核蛋白复合物(rnp)-dna模板复合物引入细胞中，其中rnp-dna模板复合物包含：(i)rnp，其中rnp包含靶向核酸酶和向导rna；和(ii)核酸构建体。

33、在一些方法中，t细胞表达识别靶抗原的抗原特异性t细胞受体(tcr)或合成抗原受体。在一些实施方式中，t细胞是调节t细胞、效应t细胞、记忆t细胞或原初t细胞。在一些实施方式中，效应t细胞是cd8+t细胞或cd4+t细胞。在一些实施方式中，效应t细胞是cd8+cd4+t细胞。在一些实施方式中，t细胞是原代细胞。

34、还提供了通过本文所述的任何方法产生的经修饰的t细胞。

35、还提供了增强人对象免疫应答的方法，所述方法包括给予本文所述的任何t细胞。在一些实施方式中，t细胞表达识别对象中靶抗原的抗原特异性tcr。在一些实施方式中，人对象患有癌症并且靶抗原是癌症特异性抗原。在一些实施方式中，人对象患有自身免疫性疾病或过敏性疾病，并且抗原是与自身免疫性疾病或过敏性疾病相关的抗原。在一些实施方式中，对象患有感染并且靶抗原是与感染相关的抗原。在一些实施方式中，t细胞是自体同源的。在一些实施方式中，t细胞是同种异体的。在一些实施方式中，干细胞是诱导型多潜能干细胞(ipsc)衍生的t细胞。