用于将生物素递送至线粒体的方法和组合物与流程

用于将生物素递送至线粒体的方法和组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求未决的2020年9月9日提交的美国临时专利申请63/075,996(代理人案号1255-003)以及于2020年9月9日提交的美国临时专利申请63/076,022(代理人案号1255-004)的优先权并且通过引用以其整体并入本文。
3.附图简述
4.参考所附的示例性附图，通过本文提供的对某些示例性实施方案的非限制性、非穷举性描述，将更容易地理解各种各样潜在的、可行的和/或有用的实施方案，在附图中：
5.图1a、图1b和图1c是示出生物素可以如何与靶向线粒体的肽序列缀合的化学结构图。
6.图2是与某些示例性化合物的细胞摄取相关的荧光显微图像。
7.图3是示出示例性细胞摄取的图。
8.图4是与某些示例性化合物的细胞摄取相关的荧光显微图像。
9.图5是示出示例性细胞摄取的图。
10.图6是与某些示例性化合物的靶向线粒体相关的荧光显微图像。
11.图7是示出示例性细胞存活力的图。
12.图8是示出示例性细胞数量的显微图像。
13.图9是示出示例性细胞存活力的图。
14.图10是示出示例性细胞atp水平的图。
15.图11是示出示例性细胞atp水平的图。
16.图12是示出示例性细胞atp水平的图。
17.图13是示出线粒体电位的荧光显微图像。
18.图14是示出示例性线粒体电位的荧光显微图像。
19.图15是与某些示例性化合物相关的划痕区域的显微图像。
20.图16是示出示例性划痕面积的图。
21.图17是示出示例性划痕面积的图。
22.图18是与某些示例性化合物相关的划痕区域的显微图像。
23.图19是示出示例性划痕面积的图。
24.图20是与某些示例性化合物的细胞增殖相关的显微图像。
25.图21是示出示例性细胞增殖的图。
26.图22是与某些示例性化合物的细胞增殖相关的显微图像。
27.图23是示出示例性细胞增殖的图。
28.图24是与某些示例性化合物的线粒体电位相关的显微图像。
29.图25是示出示例性线粒体电位的图。
30.图26是与某些示例性化合物的视网膜摄取相关的荧光显微图像。
31.图27是与某些示例性化合物的视网膜摄取相关的荧光显微图像。
32.详述
33.本文描述的某些示例性实施方案可以涉及用于增强生物素的细胞和/或线粒体摄取的方法和组合物。生物素靶向递送至线粒体可以提高功效并且避免使用高剂量的生物素。
34.本文描述的某些示例性实施方案可以提供一种用于使用水溶性的、细胞渗透性的、靶向线粒体的肽序列将生物素递送至线粒体的方法。
35.本文描述的某些示例性实施方案涉及选自具有通用的芳香族-阳离子基序的多肽组的短水溶性的肽序列，这意味着多肽组的氨基酸可以布置为例如[芳香族-阳离子-芳香族-阳离子]或[阳离子-芳香族-阳离子-芳香族]。
[0036]
本文描述的某些示例性实施方案可以包括包含天然存在的氨基酸的多肽。
[0037]
本文描述的某些示例性实施方案可以包括d氨基酸，d氨基酸可以帮助使肽对肽酶的水解更耐受。本文描述的某些示例性实施方案可以包括包含一个或更多个非天然存在的氨基酸的多肽。非天然存在的氨基酸是那些通常不在活生物体中的正常代谢过程中合成的氨基酸，并且不天然存在于蛋白中。非天然存在的氨基酸可以包括天然存在的氨基酸的衍生物。
[0038]
可用于本发明的肽可以包含一个或更多个非天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸可以是l-氨基酸、右旋(d)氨基酸或其混合物。最佳地，肽不具有天然存在的氨基酸。
[0039]
非天然存在的氨基酸是那些不天然存在于蛋白中的氨基酸。此外，可用于本发明中的非天然存在的氨基酸优选地也不被普通蛋白酶识别。
[0040]
非天然存在的氨基酸可以存在于肽的任何位置处。例如，非天然存在的氨基酸可以在n-末端处、c-末端处或者n-末端与c-末端之间的任何位置处。
[0041]
非天然氨基酸可以例如包含烷基、芳基或烷基芳基基团。烷基氨基酸的一些实例包括α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、δ-氨基戊酸和ε-氨基己酸。芳基氨基酸的一些实例包括邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸和对氨基苯甲酸。烷基芳基氨基酸的一些实例包括邻氨基苯乙酸、间氨基苯乙酸和对氨基苯乙酸，以及γ-苯基-β-氨基丁酸。
[0042]
非天然存在的氨基酸也包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可以例如包括将一个或更多个化学基团添加至天然存在的氨基酸。
[0043]
例如，一个或更多个化学基团可以添加至苯丙氨酸或酪氨酸残基的芳香族环的2
′
、3
′
、4
′
、5
′
或6
′
位置，或者色氨酸残基的苯并环的4
′
、5
′
、6
′
或7
′
位置中的一个或更多个。基团可以是可以添加至芳香族环的任何化学基团。这样的基团的一些实例包括支化的或非支化的c
1-c4烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基，c
1-c4烷氧基(即烷氧基)，氨基，c
1-c4烷基氨基和c
1-c4二烷基氨基(例如，甲基氨基、二甲基氨基)，硝基，羟基，卤代(例如，氟代、氯代、溴代或碘代)。天然存在的氨基酸的非天然存在的衍生物的一些特定实例包括正缬氨酸(nva)、正亮氨酸(nle)和羟脯氨酸(hyp)。
[0044]
可用于本发明方法的肽中氨基酸修饰的另一实例是肽的天冬氨酸或谷氨酸残基的羧基基团的衍生化。衍生化的一种实例是用氨或用伯胺或仲胺(例如甲胺、乙胺、二甲胺或二乙胺)进行酰胺化。衍生化的另一实例包括与例如甲醇或乙醇酯化。
[0045]
另一种这样的修饰包括对赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基的氨基基团的衍生化。例如，这样的氨基基团可以被酰化。一些合适的酰基基团包括例如包含以上提及的c
1-c4烷基基团的苯甲酰基基团或烷酰基基团，诸如乙酰基或丙酰基基团。本文描述的某些示例性实
施方案包括肽序列的c-末端的酰胺化，这可以帮助使肽对羧肽酶的水解更耐受。
[0046]
羧基基团，特别是c-末端氨基酸的末端羧基基团，可以用例如氨进行酰胺化以形成c-末端酰胺。可选地，c-末端氨基酸的末端羧基基团可以用任何伯胺或仲胺进行酰胺化。伯胺或仲胺可以是例如烷基胺，特别是支化或未支化的c
1-c4烷基胺或芳基胺。因此，肽的c-末端处的氨基酸可以被转化为酰氨基、n-甲基酰氨基、n-乙基酰氨基、n,n-二甲基酰氨基、n,n-二乙基酰氨基、n-甲基-n-乙基酰氨基、n-苯基酰氨基或n-苯基-n-乙基酰氨基基团。
[0047]
不存在于本发明芳香族-阳离子肽的c-末端处的天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸残基的游离羧酸基团也可以酰胺化，无论它们存在于肽内何处。在这些内部位置处的酰胺化可以用氨或以上描述的任何伯胺或仲胺进行。
[0048]
本文描述的某些示例性实施方案可以包括包含最少四个氨基酸的多肽。
[0049]
本文描述的某些示例性实施方案可以包括包含不多于六个氨基酸的多肽。
[0050]
本文描述的某些示例性实施方案涉及水溶性的肽序列，其选自包含4-6个氨基酸(呈d或l构型)的具有交替的芳香族-阳离子基序的多肽。
[0051]
本文描述的某些示例性实施方案涉及水溶性的肽序列，包括但不限于：
[0052]
d-arg-l-(2
’6’‑
二甲基tyr)-l-lys-l-phe-nh2(ss-31)；
[0053]
d-arg-l-tyr-d-arg-l-phe-l-lys-nh2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(spn02)；
[0054]
d-trp-d-arg-d-trp-d-lys-oh
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(spn07)；
[0055]
l-trp-l-arg-l-trp-l-lys-nh2(spn10)；
[0056]
d-trp-d-arg-d-trp-d-lys-nh2(spn13)；以及
[0057]
l-trp-l-arg-l-trp-l-lys-oh(spn14)。
[0058]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供用于将d-生物素与短的(即4个至6个氨基酸)、水溶性的、细胞渗透性的、靶向线粒体的肽序列缀合，以将生物素靶向递送至线粒体的方法。
[0059]
本文描述的某些示例性肽序列由n-末端和c-末端限定，并且可以包含n-末端处的α-胺。本文描述的某些示例性实施方案可以提供用于将d-生物素与靶向线粒体的肽序列的n-末端α-胺缀合。
[0060]
本文描述的某些示例性肽序列可以包含在其c-末端处具有ε-胺的赖氨酸残基。本文描述的某些示例性实施方案可以提供用于将d-生物素与靶向线粒体的肽序列的c-末端处的赖氨酸残基的ε-胺缀合(ε-n-[d-生物素基]-l-赖氨酸)的方法。
[0061]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供用于将d-生物素与靶向线粒体的肽序列的n-末端α-胺和c-末端处的赖氨酸残基上的ε-胺缀合的方法。
[0062]
本文描述的某些示例性实施方案涉及至少一种治疗有效的物质组合物和/或用于制备和/或使用这样的组合物和/或其一种或更多种组分的方法，所述组合物包括：
[0063]
一种或更多种化合物，选自由以下组成的多肽组：
[0064]
d-生物素-d-arg-l-(2
’6’‑
二甲基tyr)-l-lys-l-phe-nh2(spn05)；
[0065]
d-生物素-d-trp-d-arg-d-trp-d-lys-oh
ꢀꢀꢀꢀ
(spn08)；
[0066]
d-trp-d-arg-d-trp-d-lys(生物素基)-oh
ꢀꢀꢀ
(spn09)；
[0067]
l-trp-l-arg-l-trp-l-lys(生物素基)-nh2ꢀꢀꢀ
(spn11)；
[0068]
d-生物素-l-trp-l-arg-l-trp-l-lys(生物素基)-nh2ꢀꢀꢀ
(spn12)；
[0069]
d-arg-l-tyr-d-arg-l-phe-l-lys(生物素基)-nh2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(spn15)；以及
[0070]
d-生物素-d-arg-l-tyr-d-arg-l-phe-l-lys(生物素基)-nh2(spn16)。
[0071]
本文描述的一种或更多种示例性组合物可以包含适于刺激细胞atp产生的一种或更多种肽缀合生物素分子。示例性组合物可以包括以有效浓度促进atp合成的维生素和/或氨基酸和/或代谢补充剂。
[0072]
本文描述的一种或更多种示例性组合物可以包含适于保持线粒体电位的一种或更多种肽缀合生物素分子。
[0073]
本文描述的某些示例性实施方案涉及适于在不存在血清的情况下离体培养细胞时促进细胞存活的新组合物和/或方法。本文描述的一种或更多种示例性组合物可以包含适于刺激线粒体功能(诸如促进细胞增殖)的一种或更多种肽缀合生物素分子。本文描述的一种或更多种示例性组合物可以包含以有效浓度在维持细胞生长方面表现出加性活性或协同活性的维生素和/或氨基酸和/或代谢补充剂。
[0074]
由于干细胞数量少，为了进行细胞疗法，需要大量离体扩增以获得用于治疗临床适应症的足够细胞数量。包含胎牛血清(fbs)的培养基提供用于间充质干细胞的分离和扩增的支持性环境。fbs提供附着因子、生长因子和许多其他营养物质。然而，除了fbs的固有可变性和有限的全球供应之外，血清产品也可能是病原体的来源和/或包含具有在人类受者中引发免疫应答潜力的血清蛋白。
[0075]
血清耗尽引起细胞周期停滞和凋亡，这严重限制了临床使用的干细胞或原代细胞的产量。必须向无血清培养基中添加多种生长因子以允许干细胞扩增，并且这通常涉及使用可能被人类病原体污染的人类来源的补充剂。本文描述的某些示例性培养基包含化学成分确定的但无血清且无异源性的成分，该成分支持人类原代细胞和传代培养物的生长和附着，以允许大规模产生用于临床用途的原代哺乳动物细胞。
[0076]
原代哺乳动物细胞的大规模产生对于实验室产生肉类作为传统家畜来源肉类的替代品可能是重要的。用fbs培养动物成肌细胞是不可持续的。本文描述的某些示例性培养基包含化学成分确定的无血清成分，该成分支持动物成肌细胞的增殖，用于实验室生长肉类的大规模产生。
[0077]
本文描述的某些示例性实施方案涉及适于促进细胞或组织存活以用于人类中移植的新组合物和/或方法。本文描述的一种或更多种示例性组合物可以包含适于刺激线粒体细胞atp产生以促进细胞存活的一种或更多种肽缀合生物素分子。本文描述的一种或更多种示例性组合物可以包含以有效浓度在维持器官存活方面表现出加性活性或协同活性的维生素和/或氨基酸和/或代谢补充剂。
[0078]
胰岛移植是用于1型糖尿病的β细胞替换疗法的方法。添加可以在整个收获和纯化程序中提高细胞存活力的一种或更多种肽缀合生物素分子可以极大提高胰岛产量，和/或增加受者中血糖控制的成功率。
[0079]
缺血和低氧是移植之前器官保存期间不可避免的事件。器官被剥夺了正常的血液供应后，线粒体atp合成的耗尽会导致细胞死亡。心脏和肺的储存持续时间从4小时-6小时不等，并且对于肾的储存持续时间至多36小时。在器官保存溶液中添加可以提高细胞活力的一种或更多种肽缀合生物素分子可以延长器官的存活时间，以允许向匹配受者的更广泛分配。移植器官质量的提高也可以减少移植物功能延迟和移植物衰竭。
[0080]
本文描述的某些示例性实施方案涉及适于促进组织健康和/或防止组织损伤的新组合物和/或方法。本文描述的某些示例性方法提供了示例性组合物向哺乳动物的全身施用。组合物可以包含种适于刺激线粒体细胞atp产生以促进细胞功能的一种或更多肽缀合生物素分子。组合物可以包含以有效浓度在维持组织健康方面表现出加性活性或协同活性的维生素和/或氨基酸和/或代谢补充剂。
[0081]
衰老与许多细胞类型(包括皮肤和上皮膜)的增殖能力降低相关。肠上皮在5天内完全自我更新，而肺上皮可能需要长达6个月才能更新。衰老降低了上皮再生的能力，并且导致进行性上皮损伤。
[0082]
随着年龄的增长，大多数组织表现出再生能力方面的进行性降低，这导致组织退化、功能障碍和病理。本文描述的某些方法可以在衰老期间促进组织健康，可以预防和/或减少许多这些与年龄相关的功能障碍。
[0083]
本文描述的示例性方法涉及适于促进组织健康的新组合物和/或方法，该新组合物和/或方法可以在衰老和/或受损的组织中促进驻留干细胞/祖细胞的体内增殖。
[0084]
本文描述的某些示例性实施方案涉及适于促进组织修复和再生的新组合物和/或方法。本文描述的某些示例性方法提供了示例性组合物在组织损伤之后向哺乳动物的全身施用。组合物可以包含适于刺激线粒体细胞atp产生以促进细胞增殖和/或组织再生的一种或更多种肽缀合生物素分子。组合物可以包含以有效浓度在维持组织健康方面表现出加性活性或协同活性的维生素和/或氨基酸和/或代谢补充剂。
[0085]
组织损伤可以包括对皮肤、和/或软组织(例如，肌肉、肌腱、韧带、神经、血管)、和/或硬组织(例如，骨、牙齿)和/或实体器官(例如，心脏、肾、肺、肝、脾、肠等)的损伤。组织损伤的原因可以包括，例如，外伤(trauma)、低氧(即，低的氧供应)、缺血(即，低的血流量)、感染原(infectious agents)、药物、化学物质和/或毒素等。
[0086]
本文描述的某些示例性实施方案涉及适于治疗创伤(wounds)和/或组织损伤和/或促进组织再生和更快速创伤修复的新组合物和/或方法。本文描述的某些示例性方法提供了组合物向创伤的直接应用，诸如刺激(即，促进)创伤外周的邻近细胞增殖(即，细胞数量增加)，以促进和/或实现创伤闭合。组合物可以包含适于刺激线粒体细胞atp产生以促进细胞增殖和/或迁移(即细胞运动)的一种或更多种肽缀合生物素分子。组合物可以包含以有效浓度在刺激创伤愈合方面(诸如用于患者的手术后创伤和/或不愈合的慢性创伤，例如压疮和/或糖尿病溃疡和/或静脉溃疡)表现出加性活性或协同活性的维生素和/或补充剂和/或代谢补充剂。
[0087]
本文描述的示例性方法涉及适于治疗组织损伤的新组合物和/或方法，该新组合物和/或方法可以在受损的组织中促进驻留干细胞/祖细胞的体内增殖。
[0088]
某些示例性实施方案可以提供可以可用于促进组织修复和/或再生的药物组合物，该药物组合物包含：
[0089]
(a)促进atp产生和细胞增殖的一种或更多种化合物；
[0090]
(b)至少一种维生素；和/或
[0091]
(c)至少一种氨基酸；和/或
[0092]
(d)至少一种代谢补充剂。
[0093]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供增强哺乳动物中线粒体atp产生的方
法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的具有下式的化合物：
[0094]
d-生物素-d-arg-l-(2
’6’‑
二甲基tyr)-l-lys-l-phe-nh2(spn05)；
[0095]
d-生物素-d-trp-d-arg-d-trp-d-lys-oh
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(spn08)；
[0096]
d-trp-d-arg-d-trp-d-lys(生物素基)-oh
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(spn09)；
[0097]
l-trp-l-arg-l-trp-l-lys(生物素基)-nh2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(spn11)；
[0098]
d-生物素-l-trp-l-arg-l-trp-l-lys(生物素基)-nh2ꢀꢀꢀ
(spn12)；
[0099]
d-arg-l-tyr-d-arg-l-phe-l-lys(生物素基)-nh2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(spn15)；
[0100]
和/或
[0101]
d-生物素-d-arg-l-tyr-d-arg-l-phe-l-lys(生物素基)-nh2(spn16)。
[0102]
其中化合物作为包含药学上可接受的载体的组合物向哺乳动物施用。
[0103]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供被配置为用于在没有血清的情况下增加离体培养的原代细胞的细胞增殖的组合物，该组合物包含活性成分和第二成分，该活性成分包含刺激线粒体atp产生和细胞增殖的一种或更多种肽缀合生物素分子，该第二成分包含增强atp产生和细胞增殖的至少一种维生素和/或氨基酸和/或代谢补充剂。
[0104]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供被配置为用于增加细胞和器官离体存活的组合物，该组合物包含活性成分和第二成分，该活性成分包含刺激线粒体atp产生和细胞增殖的一种或更多种肽缀合生物素分子，该第二成分包含增强atp产生和细胞增殖的至少一种维生素和/或氨基酸和/或代谢补充剂。
[0105]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供被配置为用于增加细胞增殖(诸如在创伤区域中)的组合物，该组合物包括包含一种或更多种肽缀合生物素分子的活性成分，和/或包含增强细胞增殖和迁移的至少一种维生素和/或一种氨基酸和/或一种代谢补充剂的混合物的第二成分。
[0106]
可以用于本文描述的某些示例性实施方案的氨基酸的实例包括所有天然氨基酸的l-异构体，所述天然氨基酸包括必需和非必需氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸)，以及天然来源于半胱氨酸的牛磺酸。
[0107]
可以用于本文描述的某些示例性实施方案的代谢补充剂的实例包括丙酮酸、肉碱、乙酰肉碱、肌酸、α-酮戊二酸、α-硫辛酸、辅酶q
10
、烟酰胺核糖苷、烟酰胺单核苷酸。
[0108]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供增强原代哺乳动物细胞在无血清、化学成分确定的培养基中的存活和增殖的方法，通过向培养基中添加包含有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子、和至少一种维生素和/或至少一种氨基酸和/或至少一种代谢补充剂的混合物的制剂。
[0109]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，原代细胞可以包括用于自体、同种异体或异种再生医学应用的骨髓干细胞或间充质干细胞。
[0110]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，原代细胞可以是从胎盘或脐带血获得的用于同种异体移植的干细胞。
[0111]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，原代细胞可以是用于嵌合抗原受体(car)t细胞疗法的造血细胞，诸如t细胞。
[0112]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，原代细胞可以是被培养为用于以下的哺乳动物细胞：产生治疗性蛋白(诸如单克隆抗体)和/或生物药物，和/或用于开发和/或产生病毒疫苗。
[0113]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，原代细胞可以是被培养为用于体外产生实验室生长的非屠宰肉类的动物细胞，诸如成肌细胞。
[0114]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，原代细胞可以是从供者胰腺收获并且在移植之前在实验室中纯化的胰岛细胞。
[0115]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供用于优化和/或提高干细胞移植和/或线粒体转移以用于组织再生的方法，通过在移植前用包含治疗有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子、和至少一种维生素和/或至少一种氨基酸和/或至少一种代谢补充剂的混合物的溶液处理干细胞和/或线粒体。
[0116]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，细胞可以是受损组织中的驻留干细胞/祖细胞，并且可以向受试者全身施用一种或更多种肽缀合生物素分子、和至少一种维生素和/或至少一种氨基酸和/或至少一种代谢补充剂的混合物。
[0117]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，可以在线粒体移植之后向受试者全身施用一种或更多种肽缀合生物素分子和至少一种维生素和/或至少一种氨基酸和/或至少一种代谢补充剂，以优化线粒体的存活和功能。
[0118]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，可以将一种或更多种肽缀合生物素分子、和至少一种维生素和/或至少一种氨基酸和/或至少一种代谢补充剂添加至无血清培养基中用于培养实验室生长的肉类，以替代家畜来源的肉类。
[0119]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供增强器官保存溶液的方法，通过向保存溶液中添加包含有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子和至少一种维生素和/或至少一种氨基酸和/或至少一种代谢补充剂的制剂。
[0120]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，器官可以包括肾、肝、心脏、肺、胰腺、皮肤、肠、角膜、气管和/或血管。
[0121]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，可以向移植受者全身施用有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子和至少一种维生素和/或至少一种氨基酸和/或至少一种代谢补充剂，以提高早期移植物功能并且提高移植物存活。
[0122]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供增强受试者中组织健康的方法，通过施用包含有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子、和至少一种维生素和/或至少一种氨基酸和/或至少一种代谢补充剂的混合物的微量营养制剂。
[0123]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供增强受试者中组织健康的方法，通过施用包含有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子、和乙酰肉碱和/或α-酮戊二酸的混合物的微量营养制剂。
[0124]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供增强受试者中组织健康的方法，通过给予包含有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子，和乙酰肉碱、α-酮戊二酸和/或牛磺酸的混合物的微量营养制剂。
[0125]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，组织健康可以包括角质组织(例如，皮肤、毛发和/或指/趾甲)、和/或肌肉、和/或关节、和/或骨、和/或心脏、和/
或肺、和/或肾、和/或脑、和/或视觉和/或听力的健康。
[0126]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，组织损伤可以由衰老引起。随着年龄的增长，所有的细胞都可以经历改变。许多细胞可以失去其发挥功能的能力，废弃产物可以在细胞中积累，结缔组织可以变得僵硬，并且许多组织可以失去质量。
[0127]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供降低、减轻和/或逆转受试者中年龄相关损伤的方法，通过施用包含有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子和至少一种维生素和/或至少一种氨基酸和/或至少一种代谢补充剂的组合物，施用通过口服、舌下和/或皮下等进行。用于口服施用的药物制品可以是溶液、悬浮液或固体形式，诸如片剂、胶囊和粉末等。用于舌下施用或用于皮下注射的药物制品可以通过将这样的组合物与通常用于舌下和/或皮下制剂的无毒性、治疗惰性和/或液体的载体混合来制备。
[0128]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供增强受试者中皮肤创伤愈合的方法，通过直接向创伤区域施用包含治疗有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子和至少一种维生素和/或至少一种氨基酸和/或至少一种代谢补充剂的表面溶液。
[0129]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供增强受试者中皮肤创伤愈合的方法，通过直接向创伤区域给予包含治疗有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子和牛磺酸的表面溶液。
[0130]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，创伤可以是压力创伤、手术创伤、烧伤创伤、外伤(trauma)和/或已经暴露于一种或更多种化学物质和/或治疗性辐射的创伤等。
[0131]
对于向皮肤的表面施用，本文描述的某些示例性组合物可以制备为喷雾剂、软膏、乳膏和/或凝胶。用于向皮肤的表面施用的药物制品可以通过将这样的组合物与通常用于表面施用的药物制品的无毒性、治疗惰性、固体和/或液体的载体混合来制备。
[0132]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供增强受试者中牙龈和/或牙周愈合的方法，通过直接向创伤区域施用包含治疗有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子和至少一种维生素和/或至少一种氨基酸和/或至少一种代谢补充剂的表面溶液。
[0133]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供增强受试者中牙龈和/或牙周愈合的方法，通过施用包含治疗有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子和牛磺酸的表面溶液。
[0134]
对于向口腔粘膜的表面施用，本文描述的某些示例性组合物可以制备为喷雾剂、软膏、凝胶、漱口水和/或牙膏等。用于向粘膜表面施用的药物制品可以通过将这样的组合物与通常用于表面施用的药物制品的无毒性、治疗惰性和/或液体的载体混合来制备。
[0135]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供增强受试者中眼睛损伤修复的方法，通过直接向眼睛施用包含治疗有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子和至少一种维生素和/或至少一种氨基酸和/或至少一种代谢补充剂的表面溶液。
[0136]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供增强受试者中眼睛损伤修复的方法，通过施用包含治疗有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子和牛磺酸的表面溶液。
[0137]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，对眼睛的损伤可以是以下中的一种或更多种：例如急性角膜擦伤、结膜下出血、和/或视网膜脱离等、和/或慢性眼病，包括例如年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、青光眼和/或干眼症等。
[0138]
某些示例性实施方案可以提供增强受试者中骨和软组织愈合的方法，通过直接向
创伤区域施用包含治疗有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子和至少一种维生素和/或至少一种氨基酸和/或至少一种代谢补充剂的溶液。
[0139]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，损伤可以是急性和/或慢性的，诸如外伤、关节炎、肌腱炎、一种或更多种韧带撕裂和/或神经压迫等。
[0140]
对于向软组织的直接应用，本文描述的某些示例性组合物可以制备为用于注射到一个或更多个关节、肌腱、肌肉和/或神经等中的无菌溶液。用于注射的药物制品可以通过将这样的组合物与通常用于这样的制品的无毒性、治疗惰性和/或液体的载体(诸如聚乙二醇和透明质酸)混合来制备。
[0141]
本文描述的某些示例性实施方案可以提供增强受试者中器官修复的方法，通过施用(诸如静脉内、肌内、皮下和/或口服等)包含治疗有效量的一种或更多种肽缀合生物素分子和至少一种维生素和/或至少一种氨基酸和/或至少一种代谢补充剂的溶液。用于注射的药物制品可以通过将这样的组合物与通常用于可注射的药物制品的无毒性、治疗惰性和/或液体的载体混合来制备。用于口服施用的药物制品可以以例如溶液、悬浮液和/或固体形式(诸如一种或更多种片剂、胶囊和/或粉末)等施用。
[0142]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，组织损伤可以由急性疾病引起，例如外伤、降低的血流量、降低的氧气供应、感染原、药物和/或对一个或更多个器官、结构和/或系统(诸如心脏、脑、肾、肝、肠和/或四肢)的毒素等。
[0143]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，组织损伤可以由慢性疾病引起，例如心力衰竭、慢性肾病、炎性肠病、糖尿病并发症、中风、黄斑变性、和/或神经退行性疾病，包括帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、慢性外伤性脑病和/或阿尔茨海默氏病等。
[0144]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，可以向患有进行性多发性硬化、额颞叶痴呆、帕金森氏病和/或阿尔茨海默氏病的受试者施用一种或更多种肽缀合生物素分子的混合物。
[0145]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，可以向患有生物素-硫胺素反应性基底神经节疾病的受试者施用一种或更多种肽缀合生物素分子和硫胺素的混合物。
[0146]
在本文描述的一种或更多种方法的某些示例性实施方案中，可以向患有炎性肠病的受试者施用一种或更多种肽缀合生物素分子的混合物。
[0147]
实施例1-短芳香族-阳离子肽序列增加生物素细胞摄取
[0148]
本文描述的某些肽序列可以是包含4个至6个氨基酸的水溶性多肽，该水溶性多肽可以具有通用的芳香族-阳离子基序，这意味着肽序列可以是，例如，[芳香族-阳离子-芳香族-阳离子]或[阳离子-芳香族-阳离子-芳香族]。
[0149]
本文描述的某些“短”肽序列可以是包含最少四个氨基酸且最多六个氨基酸的多肽。
[0150]
氨基酸可以是天然存在的。天然存在的氨基酸包括通常可见于蛋白中的20种最常见的氨基酸，即丙氨酸(ala)、精氨酸(arg)、天冬酰胺(asn)、天冬氨酸(asp)、半胱氨酸(cys)、谷氨酰胺(gln)、谷氨酸(glu)、甘氨酸(gly)、组氨酸(his)、异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、赖氨酸(lys)、甲硫氨酸(met)、苯丙氨酸(phe)、脯氨酸(pro)、丝氨酸(ser)、苏氨酸
(thr)、色氨酸(trp)、酪氨酸(tyr)和缬氨酸(val)。芳香族氨基酸可以包括phe、tyr和trp。阳离子氨基酸可以包括lys、arg和his。氨基酸可以包括呈d-构型的天然氨基酸。在某些肽中，羧基末端可以是酰胺化的。
[0151]
氨基酸可以是非天然存在的。非天然存在的氨基酸是那些通常不在活生物体中的正常代谢过程中合成的氨基酸，并且不天然存在于蛋白中。非天然存在的氨基酸可以包括天然存在的氨基酸的呈l-构型或d-构型的衍生物。
[0152]
某些示例性实施方案可以提供向受试者施用用于治疗性目的的组合物。在某些示例性治疗性应用中，可以以足以治愈或至少部分阻止疾病和/或状况的症状(包括其并发症和疾病和/或状况发展中的中间病理表型)的量向怀疑罹患或已经罹患这样的疾病和/或状况的受试者施用组合物和/或药物。
[0153]
在某些示例性实施方案中，治疗性方法包括组合物与一种或更多种活性剂一起施用。在某些示例性实施方案中，肽施用是长期的。
[0154]
在某些示例性实施方案中，肽可以与一种或更多种溶栓剂一起施用。在某些示例性实施方案中，一种或更多种溶栓剂可以选自由以下组成的组：组织纤溶酶原激活剂、尿激酶、尿激酶原、链激酶、酰化形式的纤溶酶原、酰化形式的纤溶酶和酰化链激酶-纤溶酶原复合物。
[0155]
在某些示例性实施方案中，治疗性方法可以包括组合物与一种或更多种抗高血压剂一起施用。在某些示例性实施方案中，一种或更多种抗高血压剂可以包括利尿剂、肾上腺素能受体拮抗剂、钙通道阻断剂、肾素抑制剂、血管紧张素转换酶(ace)抑制剂、血管紧张素ii受体拮抗剂、醛固酮拮抗剂、血管扩张剂和/或α-2激动剂。
[0156]
在某些示例性实施方案中，利尿剂可以包括循环利尿剂、噻嗪类利尿剂、噻嗪样利尿剂和/或保钾利尿剂。在某些示例性实施方案中，利尿剂可以包括布美他尼、依他尼酸、呋塞米、托拉塞米、依匹噻嗪、氢氯噻嗪、氯噻嗪、苄氟噻嗪、吲达帕胺、氯噻酮、美托拉宗、阿米洛利、氨苯蝶啶和/或螺内酯。
[0157]
在某些示例性实施方案中，肾上腺素能受体拮抗剂可以包括β受体阻断剂、α受体阻断剂或混合的α和β受体阻断剂。在某些示例性实施方案中，肾上腺素能受体拮抗剂可以包括阿替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、氧烯洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔(propranolol)、噻吗洛尔、多沙唑嗪、酚妥拉明、吲哚拉明、苯氧苄胺、哌唑嗪、特拉唑嗪、妥拉唑啉、布新洛尔、卡维地洛和/或拉贝洛尔。
[0158]
在某些示例性实施方案中，钙通道阻断剂可以包括二氢吡啶和/或非二氢吡啶。在某些示例性实施方案中，钙通道阻断剂可以包括氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、乐卡地平、尼卡地平、硝苯地平、尼莫地平、尼群地平、地尔硫卓和/或维拉帕米。
[0159]
在某些示例性实施方案中，肾素抑制剂可以包括
[0160]
在某些示例性实施方案中，血管紧张素转换酶(ace)抑制剂可以包括卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、群多普利和/或贝那普利。
[0161]
在某些示例性实施方案中，血管紧张素ii受体拮抗剂可以包括
[0162]
在某些示例性实施方案中，醛固酮拮抗剂可以包括依普利酮和/或螺内酯。
[0163]
在某些示例性实施方案中，血管扩张剂可以包括硝普钠和/或肼屈嗪。
[0164]
在某些示例性实施方案中，α-2激动剂可以包括可乐定、胍那苄(guanabenz)、甲基
多巴、莫索尼定、胍乙啶和/或利血平。
[0165]
在某些示例性实施方案中，可以采用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官和/或组织与肽接触的任何方法。合适的方法可以包括体外、离体和/或体内方法。在体内用于治疗时，组合物可以以有效量(即，具有期望的治疗效果的量)向受试者施用。剂量和剂量方案可以取决于受试者中的损伤程度、使用的特定组合物的特性，例如其治疗指数、受试者和/或受试者的病史。
[0166]
有效量可以在临床前试验和/或临床试验期间通过医师和/或临床医师熟悉的方法确定。可用于该方法中的有效量的肽可以通过许多熟知的用于施用药物化合物的方法中的任何一种向有相应需要的哺乳动物施用。肽可以全身和/或局部施用。
[0167]
肽可以配制为药学上可接受的盐。药学上可接受的盐可以来源于药学上可接受的无机碱或有机碱和药学上可接受的无机酸或有机酸。在肽既包含碱性部分，诸如胺、吡啶或咪唑，又包含酸性部分，诸如羧酸或四唑时，可以形成两性离子并且该两性离子包含在如本文使用的术语“盐”中。来源于药学上可接受的无机碱的盐包括铵盐、钙盐、铜盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐、亚锰盐、钾盐、钠盐和锌盐等。来源于药学上可接受的有机碱的盐包括以下的盐：伯胺、仲胺和叔胺，包括取代的胺、环胺、天然存在的胺等，诸如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、n,n
′‑
二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、n-乙基吗啉、n-乙基哌啶、d-葡糖胺(glucamine)、葡糖胺(glucosamine)、组氨酸、海巴胺(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。来源于药学上可接受的无机酸的盐包括以下的盐：硼酸、碳酸、氢卤酸(氢溴酸、盐酸、氢氟酸或氢碘酸)、硝酸、磷酸、氨基磺酸和硫酸。来源于药学上可接受的有机酸的盐包括以下的盐：脂肪族羟基酸(例如，柠檬酸、葡萄糖酸、乙醇酸、乳酸、乳糖酸、苹果酸和酒石酸)、脂肪族单羧酸(例如，乙酸、丁酸、甲酸、丙酸和三氟乙酸)、氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、芳香族羧酸(例如，苯甲酸、对氯苯甲酸、二苯基乙酸、龙胆酸、马尿酸和三苯基乙酸)、芳香族羟基酸(例如，邻羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、1-羟基萘-2-羧酸和3-羟基萘-2-羧酸)、抗坏血酸、二羧酸(例如，富马酸、马来酸、草酸和琥珀酸)、葡萄糖醛酸、扁桃酸、粘液酸、烟酸、乳清酸、帕莫酸、泛酸、磺酸(例如，苯磺酸、樟脑磺酸、乙磺酸(edisylic)、乙基磺酸、羟乙磺酸、甲磺酸、萘磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2,6-二磺酸和对甲苯磺酸)、昔萘酸(xinafoic acid)等。在一些实施方案中，盐是乙酸盐或三氟乙酸盐。
[0168]
本文描述的组合物或其药学上可接受的盐，诸如乙酸盐或三氟乙酸盐，可以被掺入药物组合物中，用于单独或组合向受试者施用，以治疗和/或预防本文描述的紊乱。这样的组合物可以包括活性剂和药学上可接受的载体，该药学上可接受的载体可以包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等中的一种或更多种。补充活性化合物也可以被掺入某些示例性组合物中。
[0169]
药物组合物可以配制为与其预定的施用途径相容。示例性施用途径包括肠胃外(例如静脉内、皮内、腹膜内或皮下)、口服、舌下、鼻、吸入、透皮(表面)、眼内、离子透入和经粘膜施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用使用的溶液或悬浮液可以包括以下组分中的任何一种或更多种：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、不挥发性的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或
亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的剂诸如氯化钠或右旋糖。在某些示例性实施方案中，可以用酸或碱诸如盐酸或氢氧化钠来调节ph。肠胃外制品可以包封在安瓿、一次性注射器和/或由玻璃和/或塑料制成的多剂量小瓶中。为了方便患者和/或治疗医师，可以在包含任何或所有必要设备(例如，药物小瓶、稀释剂小瓶、注射器和/或针头等)的药盒中提供给药制剂，用于治疗过程(例如，7天的治疗)。
[0170]
适于可注射使用的药物组合物可以包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)和/或分散体和/或用于临时制备无菌的可注射溶液和/或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体可以包括生理盐水、抑菌水、cremophor el
tm
(basf,parsippany,n.j.)和/或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。用于肠胃外施用的组合物可以是无菌的和/或可以是易于注射的流体。某些示例性组合物在制备和/或储存条件下可以是稳定的和/或可以防止微生物诸如细菌和/或真菌的污染作用。
[0171]
组合物组分可以包括载体，载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和/或液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。合适的流动性可以如下维持，例如，通过使用包衣诸如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需要的粒度和/或通过使用表面活性剂。通过各种抗细菌剂和/或抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸等，可以实现防止微生物的作用。可以包括谷胱甘肽和/或其他抗氧化剂来防止氧化。某些示例性组合物可以包括等渗剂，例如糖和/或多元醇，诸如甘露醇、山梨醇和/或氯化钠。可注射的组合物的延长的吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的剂诸如单硬脂酸铝和/或明胶来实现。
[0172]
无菌可注射溶液可通过以下来制备：将所需量的活性化合物根据需要与上述成分中的一种或组合一起掺入合适的溶剂中，然后过滤灭菌。分散体可以通过将活性化合物掺入包含碱性分散介质和其他期望成分(诸如以上列举那些中的一种或更多种)的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，示例性制备方法包括真空干燥和/或冷冻干燥，其可以产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外的所需成分的粉末。
[0173]
口服组合物可以包括惰性稀释剂和/或可食用载体。为了口服治疗性施用的目的，活性化合物可以掺入赋形剂和/或以片剂、锭剂或胶囊(例如明胶胶囊)和/或可溶于稀释剂诸如水的粉末的形式使用。口服组合物可以使用用作漱口水的流体载体来制备。可以包括药学上相容的粘合剂和/或辅助材料(adjuvant materials)作为组合物的一部分。示例性片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以包含以下任何成分或类似性质的化合物：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶和/或明胶；赋形剂，诸如淀粉和/或乳糖，崩解剂，诸如海藻酸、primogel和/或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁和/或sterotes；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖和/或糖精；或调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯和/或柑橘调味剂；等等。
[0174]
对于通过吸入施用，化合物可以以气溶胶喷雾的形式从包含合适推进剂(例如，气体诸如二氧化碳)加压容器和/或分配器和/或雾化器递送。
[0175]
如本文描述的治疗性化合物的全身施用可以通过经粘膜和/或透皮的方式。对于经粘膜或透皮施用，可以在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂可以包括，例如，用于经粘膜施用的去污剂、胆盐和/或夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用
鼻喷雾来实现。对于透皮施用，活性化合物可以配制为软膏、药膏、凝胶和/或乳膏。在某些示例性实施方案中，透皮施用可以通过离子透入、微针和/或电穿孔来进行。
[0176]
治疗性蛋白和/或肽可以在载体系统中配制。载体可以是胶体系统。胶体系统可以是脂质体和/或磷脂双层媒介物。在某些示例性实施方案中，治疗性肽可以包封在脂质体中，同时保持肽完整性。活性剂可以装载到由药学上可接受的成分制备的颗粒中，这些成分包括但不限于可溶性的、不溶性的、渗透性的、不渗透性的、生物可降解性和/或胃滞留性聚合物和/或脂质体。这样的颗粒可以包括纳米颗粒、生物可降解的纳米颗粒、微米颗粒、生物可降解的微米颗粒、纳米球、生物可降解的纳米球、微米球、生物可降解的微米球、胶囊、乳液、脂质体、胶束和/或病毒载体系统。
[0177]
载体可以是聚合物，例如，生物可降解和/或生物相容的聚合物基质。在某些示例性实施方案中，治疗性肽可以包埋在聚合物基质中，同时维持蛋白完整性。聚合物可以是天然的，诸如多肽、蛋白或多糖，或者是合成的，诸如聚α-羟基酸。实例包括由例如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、乙酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶及其组合制成的载体。在某些示例性实施方案中，聚合物可以是聚乳酸(pla)和/或共聚乳酸/乙醇酸(pgla)。聚合物基质可以以各种形式和/或尺寸制备和/或分离，包括微米球和纳米球。聚合物制剂可以导致延长治疗效果的持续时间。
[0178]
在某些示例性实施方案中，治疗性化合物可以与将防止治疗性化合物从体内快速消除的载体一起制备，诸如控释制剂，包括植入物和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的和/或生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和/或聚乳酸等。这样的制剂可以使用已知的技术制备。材料也可从例如alza corporation和nova pharmaceuticals,inc.商业获得。脂质体悬浮液(包括具有针对细胞特定抗原的单克隆抗体的靶向特定细胞的脂质体)可以用作药学上可接受的载体。
[0179]
治疗性化合物可以被配制成增强细胞内递送。例如，脂质体递送系统和/或融合脂质体可以用于将蛋白递送至体内和/或体外的细胞。
[0180]
治疗剂的剂量、毒性和治疗功效可以在细胞培养物和/或实验动物中通过标准药学程序来确定，例如，用于确定ld50(对群体的50％致死的剂量)和/或ed50(对群体的50％治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比，称为“治疗指数”，可以表示为ld50/ed50比。表现出高治疗指数的化合物可能是优选的。尽管可以使用表现出毒副作用的化合物，但可以小心地设计将这样的化合物靶向至受影响组织部位的递送系统，以便使对未感染细胞的潜在损伤最小化，从而降低副作用。
[0181]
从细胞培养测定和/或动物研究获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。这样的化合物的剂量可以在包括ed50而几乎无毒性或无毒性的循环浓度的范围内。剂量可以取决于所使用的剂型和/或利用的施用途径而在该范围内变动。对于某些示例性化合物，最初可以从细胞培养测定中估计治疗有效剂量。在动物模型中可以将剂量配制成达到包括在细胞培养中确定的ic50(即，达到症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可以被用于更精确地确定在人类中有用的剂量。血浆中的水平可以通过例如高效液相层析来测量。
[0182]
足以达到治疗性或预防性效果的组合物的有效量范围可以是每天每千克体重约0.000001mg至每天每千克体重约10,000mg。剂量范围可以是每天每千克体重约0.0001mg至
每天每千克体重约100mg。例如，剂量可以是每天、每两天或每三天约1mg/kg体重或约10mg/kg体重，或者在每周、每两周或每三周约1mg/kg至约10mg/kg的范围内。在某些示例性实施方案中，肽的单剂量范围可以为每千克体重约0.1微克至约10,000微克。在某些示例性实施方案中，可以施用载体中的组合物浓度范围为每递送毫升约0.2微克至约2000微克。示例性治疗方案可能需要每天一次或每周一次施用。在某些治疗性应用中，可能需要以相对短间隔的相对高的剂量，直到疾病的进展降低和/或终止，和/或直到受试者显示出疾病症状的部分或完全改善。此后，患者可以被施用预防性方案。
[0183]
在某些示例性实施方案中，组合物的治疗有效量可以限定为靶组织处约10-12
m至约10-6
m，例如，大约10-7
m的肽浓度。该浓度可以以约0.01mg/kg至约100mg/kg的全身剂量或按体表面积计算的同等剂量施用。可以优化剂量的时间表以维持靶组织处的治疗浓度，诸如通过每天或每周单次施用，但也包括连续施用(例如，肠胃外输注和/或透皮应用)。
[0184]
在某些示例性实施方案中，组合物的剂量可以“低”、“中”或“高”剂量水平提供。在某些示例性实施方案中，可以提供约0.01mg/kg/h至约0.5mg/kg/h，诸如约0.0001mg/kg/h至约0.1mg/kg/h的低剂量。在某些示例性实施方案中，可以提供约0.001mg/kg/h至约1.0mg/kg/h，诸如约0.01mg/kg/h至约0.5mg/kg/h的中剂量。在某些示例性实施方案中，可以提供约0.005mg/kg/h至约10mg/kg/h，诸如约0.01mg/kg/h至约2mg/kg/h的高剂量。
[0185]
在某些示例性实施方案中，某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和/或时间，包括但不限于疾病或紊乱的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄和/或存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的本文描述的治疗性组合物对受试者的治疗可以包括单一治疗或一系列治疗。
[0186]
根据某些示例性方法治疗的哺乳动物可以是任何哺乳动物，包括例如农场动物，诸如绵羊、猪、牛和马；宠物动物，诸如犬和猫；和/或实验室动物，诸如大鼠、小鼠和兔。在某些示例性实施方案中，哺乳动物可以是人类。
[0187]
某些示例性实施方案提供了一种生物活性物质组合物，所述生物活性物质组合物包含与位于水溶性的、细胞渗透性的、靶向线粒体的肽序列的c-末端处的赖氨酸缀合的第一d-生物素，其中：
[0188]
靶向线粒体的肽序列包含最少四个氨基酸且最多六个氨基酸；
[0189]
靶向线粒体的肽序列具有通用的交替的芳香族-阳离子基序；
[0190]
靶向线粒体的肽序列选自：
[0191]
d-arg-l-(2
’6’‑
二甲基tyr)-l-lys-l-phe-nh2；
[0192]
d-arg-l-tyr-d-arg-l-phe-l-lys-nh2；
[0193]
d-trp-d-arg-d-trp-d-lys-oh；
[0194]
l-trp-l-arg-l-trp-l-lys-nh2；
[0195]
d-trp-d-arg-d-trp-d-lys-nh2；和/或
[0196]
l-trp-l-arg-l-trp-l-lys-oh；
[0197]
第二d-生物素，该第二d-生物素与靶向线粒体的肽序列的n-末端α-胺缀合；
[0198]
该组合物包含以下的一种或更多种：
[0199]
d-生物素-d-arg-l-(2
’6’‑
二甲基tyr)-l-lys-l-phe-nh2；和
[0200]
d-生物素-d-trp-d-arg-d-trp-d-lys-oh；
[0201]
第一d-生物素与靶向线粒体的肽序列的c-末端处的赖氨酸的ε-胺缀合；
[0202]
该组合物包含以下的一种或更多种：
[0203]
d-trp-d-arg-d-trp-d-lys(生物素基)-oh；
[0204]
l-trp-l-arg-l-trp-l-lys(生物素基)-nh2；以及
[0205]
d-arg-l-tyr-d-arg-l-phe-l-lys(生物素基)-nh2；
[0206]
第一d-生物素与靶向线粒体的肽序列的c-末端处的赖氨酸的ε-胺缀合，并且第二d-生物素与n-末端α-胺缀合；和/或
[0207]
该组合物包含以下的一种或更多种：
[0208]
d-生物素-l-trp-l-arg-l-trp-l-lys(生物素基)-nh2；以及
[0209]
d-生物素-d-arg-l-tyr-d-arg-l-phe-l-lys(生物素基)-nh2。
[0210]
某些示例性实施方案提供了一种生物活性物质组合物，所述生物活性物质组合物包含与位于水溶性的、细胞渗透性的、靶向线粒体的肽序列的n-末端处的赖氨酸缀合的第一d-生物素，其中靶向线粒体的肽序列：
[0211]
包含最少四个氨基酸且最多六个氨基酸；以及
[0212]
具有通用的交替的芳香族-阳离子基序。
[0213]
某些示例性实施方案提供了一种物质组合物，包含：
[0214]
治疗有效的制剂，包含：
[0215]
选自生物素化多肽组的一种或更多种有生物活性的、水溶性的、细胞渗透性的、靶向线粒体的化合物；
[0216]
用于一种或更多种有生物活性的、水溶性的、细胞渗透性的、靶向线粒体的化合物中的每一种的药学上可接受的载体；
[0217]
选自以下的一种或更多种维生素：
[0218]
维生素b1(硫胺素)；
[0219]
维生素b2(核黄素)；
[0220]
维生素b3(烟酸、烟酰胺)；
[0221]
维生素b5(泛酸)；
[0222]
维生素b6(吡哆醇)；
[0223]
维生素b7(生物素)；
[0224]
维生素b9(叶酸)；
[0225]
维生素b12(氰钴胺)；以及
[0226]
维生素c(抗坏血酸)；
[0227]
选自以下的一种或更多种代谢补充剂：
[0228]
丙酮酸；
[0229]
肉碱；
[0230]
乙酰肉碱；
[0231]
肌酸；
[0232]
α-酮戊二酸；
[0233]
α-硫辛酸；
[0234]
辅酶q；
[0235]
烟酰胺核糖苷；以及
[0236]
烟酰胺单核苷酸；和/或
[0237]
选自以下的一种或更多种氨基酸：
[0238]
亮氨酸；
[0239]
异亮氨酸；
[0240]
缬氨酸；
[0241]
谷氨酰胺；
[0242]
丝氨酸；
[0243]
精氨酸；
[0244]
甲硫氨酸；
[0245]
色氨酸；
[0246]
甘氨酸；
[0247]
三甲基甘氨酸；
[0248]
β-羟基-β-甲基丁酸酯；以及
[0249]
牛磺酸；
[0250]
其中：
[0251]
生物素化多肽组中的每一种有生物活性的、水溶性的、细胞渗透性的、靶向线粒体的化合物限定为：
[0252]
布置有通用的交替的芳香族-阳离子基序的多于一个氨基酸；
[0253]
最少四个氨基酸且最多六个氨基酸；
[0254]
与位于该生物素化多肽的c-末端或n-末端处的赖氨酸缀合的第一d-生物素；
[0255]
所述生物素化多肽组由以下组成：
[0256]
d-生物素-d-arg-l-(2
’6’‑
二甲基tyr)-l-lys-l-phe-nh2；
[0257]
d-生物素-d-trp-d-arg-d-trp-d-lys-oh；
[0258]
d-trp-d-arg-d-trp-d-lys(生物素基)-oh；
[0259]
l-trp-l-arg-l-trp-l-lys(生物素基)-nh2；
[0260]
d-arg-l-tyr-d-arg-l-phe-l-lys(生物素基)-nh2；
[0261]
d-生物素-l-trp-l-arg-l-trp-l-lys(生物素基)-nh2；以及
[0262]
d-生物素-d-arg-l-tyr-d-arg-l-phe-l-lys(生物素基)-nh2。
[0263]
表1鉴定某些示例性短的、水溶性的、交替的芳香族-阳离子肽序列。
[0264]
表1
[0265][0266]
可用于本文描述的某些示例性方法中的交替的芳香族-阳离子肽序列可以通过以下美国专利文献中描述的任何方法化学合成，该专利文献的每一个通过引用以其整体和/或对于其描述或涉及合成肽和/或使用合成肽的部分并入本文：
[0267]
美国专利4749742；
[0268]
美国专利5026773；
[0269]
美国专利7576061；
[0270]
美国专利9388212；
[0271]
美国专利9695214；
[0272]
美国专利10125163；
[0273]
美国专利申请公布2019/0202861；
[0274]
美国专利申请公布2019/0015521；以及
[0275]
美国专利申请公布2012/0149868。
[0276]
表1中列出的某些示例性交替的芳香族-阳离子肽序列是水溶性的。
[0277]
表1中列出的某些示例性交替的芳香族-阳离子肽序列是水溶性的，但可以渗透细胞膜。
[0278]
表1中列出的某些示例性交替的芳香族-阳离子肽序列是水溶性的，但可以渗透线粒体外膜。
[0279]
生物素(图1a)可以与交替的芳香族-阳离子肽序列在n-末端α-胺处(图1b)或c-末端的赖氨酸的ε-氨基基团处(图1c)缀合。
[0280]
对于某些示例性实施方案，经由化学合成，生物素可以使用以下美国专利公布中的任一个中描述的一种或更多种方法与多肽缀合，该美国专利公布的每一个通过引用以其整体和其对于这些方法的教导并入本文：
[0281]
美国专利5,391,711；
[0282]
美国专利5,416,016；以及
[0283]
美国专利申请公布：2006/0149035。
[0284]
某些示例性实施方案可以优选地用生物素标记肽中的n-末端α-氨基。在某些示例性实施方案中，生物素化可以通过活化生物素的羧基基团使得其与肽的游离氨基基团反应来容易地实现。某些示例性实施方案可以使用生物素化试剂，诸如d-生物素-n-羟基-琥珀酰亚胺酯或生物素基-对硝基苯酯。活化的酯可以在温和的条件下与氨基基团反应，将生物素残基掺入所期望的分子中。某些示例性实施方案可以使用d-生物素-n-羟基-琥珀酰亚胺酯将大分子生物素化和/或可以使用生物素基-ε-硝基苯酯作为生物素化试剂将外源分子生物素化。某些示例性实施方案也可以使用其他试剂诸如d-生物素基-ε-氨基己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯，其中ε-氨基己酸用作间隔物连接以降低空间位阻。
[0285]
对于某些示例性实施方案，生物素化可以在赖氨酸ε-氨基基团处进行，以形成生物细胞素(biocytin)。在某些示例性实施方案中，含生物细胞素的肽可以使用c-末端位置处的fmoc-lys(ε-生物素基)经由固相合成来实现，这可以在经历树脂的酸裂解之后产生lys(生物素基)或生物细胞素。例如，为了产生生物细胞素，某些示例性实施方案可以利用美国专利2,720,527中描述的一种或更多种方法，该专利通过引用以其整体和其对于这样的方法的教导并入本文。
[0286]
某些示例性肽缀合生物素分子和对应的靶向线粒体的肽序列在表2中列出。
[0287]
表2
[0288][0289]
在hk-2人类肾上皮细胞和arpe-19人类视网膜色素上皮细胞(atcc,manassas,va)中确定肽缀合生物素分子的细胞摄取和定位。将hk-2细胞在包含1g/l葡萄糖和10％胎牛血清(fbs)、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dulbecco改良eagle培养基(dmem)中培养。将arpe-19细胞在包含1g/l葡萄糖和10％胎牛血清(fbs)、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem/f12培养基中培养。将细胞在含有5％co2的加湿培养箱中在37℃孵育。将hk-2细胞和arpe-19细胞以5
×
104个细胞的初始密度接种在35mm培养皿中。将fbs从培养基中去除，持续3天，以耗尽细胞中的内源生物素。然后将细胞在包含生物素或肽缀合生物素分子的无血清培养基中孵育12小时(hk-2细胞)或1小时(arpe-19细胞)。所有化合物以1μm使用。
[0290]
使用链霉抗生物素蛋白结合确定生物素摄取。链霉抗生物素蛋白对生物素具有高的亲和力。通过使用alexa fluor 594缀合链霉抗生物素蛋白，能够使用荧光显微术使生物素摄取可视化。将细胞用4％pfa在rt固定10分钟，在0.1％triton x-100/pbs中在rt透化10分钟，并且与3.2μg/ml链霉抗生物素蛋白-alexa fluor 594(jackson immunoresearch,west grove,pa)和5μg/ml hoechst 33342(novus biologicals,centennial,co)在rt孵育30分钟。hoechst 33342是用于标记dna的荧光染色剂，并且其用于细胞核染色。添加活细胞成像缓冲液，并且使用nikon eclipse ti2荧光显微镜(100
×
油浸物镜)观察alexa-594荧光(ex/em＝591/614nm)和hoechst荧光(ex/em＝490/461nm)。通过nis-elements成像软件(nikon)对来自每个样品的10个随机视野进行链霉抗生物素蛋白荧光定量，并且针对hoechst荧光归一化，以考虑每个视野的细胞数量。
[0291]
图2示出了hk-2人类肾上皮细胞在与1μm游离生物素或从表2选择的肽缀合生物素分子孵育12小时之后的代表性显微图像。用链霉抗生物素蛋白-alexafluor 594(红色荧光)使细胞内生物素可视化。用hoechst 33342染料(蓝色荧光)使细胞核可视化(1000
×
放大率)。在hk-2细胞与1μm单独的生物素孵育时，观察到最小的细胞内链霉抗生物素蛋白荧光。相比之下，所有肽缀合生物素化合物(spn05、spn08、spn09、spn11和spn12)显示出强烈的红色荧光，表明生物素的显著细胞摄取。
[0292]
图3是对hk-2人类肾上皮细胞在与1μm生物素或从表2选择的肽缀合生物素分子孵育12小时之后的生物素摄取进行定量的图。在hk-2细胞中，与游离生物素相比，肽缀合生物素分子递送显著更高的细胞内生物素含量。从10个随机视野计算针对细胞数量(hoechst荧光)归一化的总链霉抗生物素蛋白荧光，并且对每一种处理取平均值。然后将所有数据针对游离生物素处理归一化，其中游离生物素任意设置为1.0。与游离生物素相比，所有肽缀合生物素分子导致细胞内生物素显著更高(*p《0.05，***p《0.001)。肽缀合生物素分子的摄取
为游离生物素的2至2.5倍高。
[0293]
图4示出了arpe-19人类视网膜色素上皮细胞在与1μm生物素或从表2选择的肽缀合生物素分子孵育1小时之后的代表性显微图像。用链霉抗生物素蛋白-alexafluor 594(红色荧光)使细胞内生物素可视化。用hoechst 33342染料(蓝色荧光)使细胞核可视化(1000
×
放大率)。所有肽缀合生物素化合物(spn08、spn09、spn11、spn12、spn15和spn16)显示出具有核周分布的强烈红色染色。
[0294]
图5是示出arpe-19人类视网膜色素上皮细胞在与1μm生物素或从表2选择的肽缀合生物素分子孵育1小时之后的生物素摄取的图。在arpe-19细胞中，与游离生物素相比，肽缀合生物素分子递送显著更高的细胞内生物素含量。从10个随机视野计算链霉抗生物素蛋白荧光与hoechst荧光的比率，并且对每一种处理取平均值。然后将所有数据针对游离生物素处理归一化，其中游离生物素任意设置为1.0。与游离生物素相比，所有肽缀合生物素分子导致显著更高的细胞内生物素染色(***p《0.001)。肽缀合生物素分子的摄取为游离生物素的1.5至2倍高。
[0295]
这些肽通过简单扩散进入细胞，并且在进入细胞后，这些肽仅在线粒体中被观察到。如对于鉴定的spn肽通过图2以及图4证实的。对于线粒体，这些肽显示出的分布模式(从细胞核周围开始的丝状网络)非常明显。注意细胞核没有被染色，并且染色也不是在细胞内的每个地方。这极大降低了化合物作用于其他细胞器的副作用的机会。
[0296]
这些结果表明生物素与示例性短的水溶性的芳香族-阳离子肽序列的缀合可以显著增加生物素的细胞摄取。图2以及图4中的显微图像显示出生物素与ss-31、spn02、spn07和spn10的缀合可以极大增强两种不同细胞系(肾和视网膜上皮细胞)对生物素的摄取。这四种短肽都遵循交替的芳香族-阳离子基序，其中ss-31和spn02具有“阳离子-芳香族-阳离子-芳香族”序列顺序，而spn07和spn10具有“芳香族-阳离子-芳香族-阳离子”序列顺序。所有示例性肽都是水溶性的。spn02显示五肽可以像四肽一样起作用，并且是水溶性的。ss-31表明非天然存在的氨基酸(2
’6’‑
二甲基tyr)可以取代天然存在的氨基酸。这些肽还支持使用tyr、phe或trp作为芳香族氨基酸，以及使用arg或lys作为阳离子氨基酸。示例性实例显示氨基酸可以呈d-构型或l-构型，并且c-末端的酰胺化对线粒体递送没有影响，但是可以提高肽针对体内羧肽酶降解的稳定性。
[0297]
4-6个氨基酸的通用肽，具有由呈d-构型或l-构型、具有或没有c-末端酰胺化的天然存在的或非天然存在的氨基酸构成的交替的芳香族-阳离子基序，可以用作水溶性递送载体以增强哺乳动物细胞对生物素的细胞摄取。
[0298]
实施例2-短芳香族-阳离子肽序列将生物素选择性地递送至线粒体内膜
[0299]
表1中列出的某些示例性交替的芳香族-阳离子肽序列可以选择性地靶向并且定位于线粒体内膜。
[0300]
所有肽缀合生物素分子的核周分布模式(图2以及图4)表明它们定位于丝状线粒体网络。
[0301]
为了显示肽缀合生物素分子的线粒体定位，将arpe-19人类视网膜色素上皮细胞与1μm spn05、spn12或spn15在无血清dmem/f12培养基中孵育2小时。将细胞用4％pfa在rt固定10分钟，并且然后用0.1％triton x-100在rt透化10分钟。将细胞用2％bsa(牛血清白蛋白)在rt封闭30分钟，并且然后与针对细胞色素c氧化酶亚基4(cox4)(在线粒体内膜上表
达的主要蛋白质复合物)的一抗孵育。使用兔多克隆cox4抗体(invitrogen pa5-29992,waltham,ma)，在2％bsa中以1:500稀释度在4℃过夜。然后将细胞与二抗(山羊抗兔alexa fluor 488，1:500稀释度，invitrogen a-11008)和链霉抗生物素蛋白-alexa fluor 594(jackson immunoresearch,west grove,pa)和5μg/ml hoechst 33342(novus biologicals,centennial,co)在rt孵育30min。添加活细胞成像缓冲液，并且使用nikon eclipse ti2荧光显微镜(100
×
油浸物镜)观察alexa fluor-594荧光、alexa fluor-488荧光和hoechst荧光。
[0302]
图6示出了肽缀合生物素分子与细胞色素c氧化酶的共定位。上图是spn15(染色为红色)、细胞色素c氧化酶(cox)(染色为绿色)和合并图像(黄色/橙色)的代表性显微图像。下图示出了与cox染色合并的spn05和spn12的图像(黄色/橙色)。所有图像都以600
×
放大率示出。
[0303]
这些结果显示，短芳香族-阳离子肽序列可以用作将生物素靶向至线粒体的递送载体。cox4是细胞色素c氧化酶的亚基，细胞色素c氧化酶是电子传递链的末端复合物(复合物iv)。cox复合物是线粒体内膜氧化磷酸化的主要调节位点。来自spn05、spn12和spn15的生物素染色与cox4染色的共定位显示，这些短芳香族-阳离子肽序列可以用作靶向线粒体的序列以将生物素递送至线粒体内膜。
[0304]
实施例3-肽缀合生物素分子可以在延长的血清饥饿下促进细胞生长
[0305]
血清去除可以引起细胞atp降低、细胞周期停滞和/或凋亡。血清剥夺可以抑制培养的细胞增殖的能力。与某些示例性肽缀合生物素分子孵育可以在无血清条件下促进细胞存活力。
[0306]
在第一个模型中，hk-2细胞在96孔板中在单独的无血清dmem或在包含10nm spn11或spn12的无血清dmem中培养11天。每3天更换一次培养基。
[0307]
根据制造商的方案，使用alamar blue细胞增殖测定(bio-rad)测量细胞存活力。alamar blue使用刃天青来测量活细胞的还原能力。在被细胞代谢还原时，弱荧光刃天青被还原为高荧光刃天青。简言之，向培养基中添加alamar blue试剂(10μl)并且在37℃孵育1h。使用微板读取器(spectramax id3,molecular devices)检测来自刃天青的荧光(ex/em 530/590nm)。
[0308]
图7是示出hk-2细胞在血清饥饿11天之后的细胞存活力的图。在不存在血清的情况下，用仅10nm的spn11或spn12处理使细胞存活力显著提高35％(**p《0.005)。
[0309]
在第二个模型中，arpe-19细胞在不存在或存在肽缀合生物素分子的情况下在无血清dmem中生长30天。补充有10nm的spn12、spn15或spn16化合物(都以10nm)的无血清培养基每3天更换一次。每3天更换一次培养基。图8是代表性显微图像，显示在延长的血清剥夺之后，所有三种spn化合物都使细胞数量增加。
[0310]
图9示出了与对照相比，用spn12、spn15和spn16处理在血清剥夺30天之后细胞存活力显著加倍。数据代表来自每一种处理的6个样品的平均值
±
sem(与对照相比，**p《005；***p《0.001)。
[0311]
这些结果表明，添加仅10nm的肽缀合生物素分子可以使在无血清条件下的细胞存活显著加倍。这些结果显示示例性靶向线粒体的生物素分子是有生物活性的(即，它们改变细胞生物学)，保护至少两种不同哺乳动物细胞系统的细胞存活。
[0312]
实施例4-肽缀合生物素分子使无血清且营养物质剥夺的培养物中的细胞atp含量增加
[0313]
血清去除可以引起细胞atp降低。某些示例性肽缀合生物素分子可以使在血清剥夺和/或营养物质剥夺条件下的细胞atp水平增加。
[0314]
将人类肾上皮细胞(hk-2)在包含1g/l葡萄糖和10％胎牛血清(fbs)、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem中培养。将细胞在含有5％co2的加湿培养箱中在37℃孵育。将hk-2细胞以5
×
103个细胞的初始密度接种在96孔培养板中。将fbs从培养基中去除，并且将细胞在单独的无血清dmem(对照组)或包含10nm生物素或肽缀合生物素分子的无血清dmem中孵育7天。在每一个实验中，所有处理都以n＝6进行。每3天更换一次培养基。
[0315]
将人类视网膜色素上皮细胞(arpe-19)在包含1g/l葡萄糖和10％胎牛血清(fbs)、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem/f12中培养。将细胞在含有5％co2的加湿培养箱中在37℃孵育。将arpe-19细胞以5
×
103个细胞的初始密度接种在96孔培养板中。将fbs从培养基中去除，并且将细胞在单独的无血清dmem/f12(对照组)或包含10nm生物素或不同肽缀合生物素分子的dmem/f12中孵育7天。在每一个实验中，所有处理都以n＝5-6进行。每3天更换一次培养基。
[0316]
根据制造商的方案，使用aposensor atp生物发光测定试剂盒(biovision)测量atp。该试剂盒利用萤光素酶催化从atp和萤光素形成光。简言之，将细胞用100μl细胞核释放缓冲液伴随轻轻摇动在rt处理5min。将10μl atp监测酶添加至细胞裂解物中，并且使用微板读取器(spectramax id3,molecular devices)测量发光。将atp水平针对无血清dmem对照组(任意设置为1.0)归一化。
[0317]
与游离生物素相比，所有肽缀合生物素分子导致在无血清条件下7天之后的hk-2细胞中更高的atp浓度(图10)。所示数据为来自每种处理的6个样品的平均值
±
sem。与游离生物素相比，spn08、spn09、spn11、spn12、spn15和spn16使在无血清条件下的atp水平升高35％-100％(**p《0.005；***p《0.001)。
[0318]
肽缀合生物素分子也使血清饥饿7天之后的arpe-19细胞中的atp浓度显著增加。所示数据为来自每种处理的6个样品的平均值
±
sem。与游离生物素相比，肽缀合生物素分子使atp水平升高60％-75％(***p《0.001)(图11)。
[0319]
第二个模型使用极端饥饿模型，其中将hk-2细胞在96孔板中在pbs(磷酸盐缓冲盐水)中的无血清5％dmem中培养3天。将细胞用10nm游离生物素或肽缀合生物素分子处理。在每一个实验中，所有处理都以n＝6进行。
[0320]
与游离生物素相比，所有肽缀合生物素分子都导致极度饥饿的情况下显著更高的atp浓度。所示数据为来自每种处理的6个样品的平均值
±
sem。(*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001)，其中spn11和spn12使atp含量加倍(图12)。
[0321]
这些结果显示示例性靶向线粒体的生物素分子是有生物活性的，促进至少两种不同哺乳动物细胞系统在血清和营养物质剥夺条件下的线粒体atp合成。
[0322]
实施例5-肽缀合生物素分子可以使线粒体电位恢复并且防止由血清饥饿引起的线粒体片段化
[0323]
血清剥夺可以诱导线粒体去极化，随后为atp合成降低。某些示例性肽缀合生物素分子可以使在无血清培养基中培养的细胞中的线粒体电位恢复。
[0324]
沿着线粒体内膜上的电子传递链的电子转移导致质子从线粒体基质泵送至膜间空间。这产生了跨线粒体内膜电位，并且质子梯度用于驱动atp合酶(复合物v)从adp产生atp。血清或营养物质的撤去导致线粒体电位下降和atp产生降低。
[0325]
将人类视网膜色素上皮细胞(arpe-19)在包含1g/l葡萄糖和10％fbs、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem/f12培养基中培养。将细胞在含有5％co2的加湿培养箱中在37℃孵育。将arpe-19细胞以5
×
104个细胞的初始密度接种在35mm玻底皿(glass plate)中。将fbs从培养基中去除，持续3天，以耗尽内源生物素。然后将细胞在单独的无血清dmem/f12(对照组)或包含1μm的spn12或spn15的dmem/f12中孵育2小时。
[0326]
为了确定线粒体电位，将活细胞与在不含酚红的dmem中的5nm四甲基罗丹明甲酯(tmrm,#70017,biotium,fremont,ca)孵育。tmrm是电位依赖性荧光染料(ex/em＝548/573)。tmrm在带负电荷的极化线粒体中积累，并且可以检测为红色荧光。总线粒体用线粒体电位非依赖性荧光染料(100nm mitoview green；ex/em＝490/523；#70054,biotium,fremont ca)成像。添加hoechst 33342(10μg/ml,novus biologicals,centennial,co)以对细胞核染色。将活细胞用磷酸盐缓冲液覆盖，并且使用nikon eclipse ti荧光显微镜使用60
×
水浸物镜成像。
[0327]
图13(上图)是在含有10％fbs的dmem/f12中培养3天的arpe-19细胞的代表性荧光显微图像。图13(下图)是在无血清dmem/f12中培养3天的arpe-19细胞的代表性图像。与血清对照相比，在无血清条件下，tmrm(红色)显示线粒体电位显著损失。mitogreen(绿色)染色还显示出无血清条件引起线粒体片段化并且以核周模式聚集，没有清晰的丝状网络。在图像合并时，可以观察到无血清条件下的所有细胞的线粒体去极化。
[0328]
图14是在10％fbs培养基(血清对照)或在单独的无血清培养基(无血清)中培养3天或在与1μm的spn12或spn15孵育2小时之后的arpe-19细胞的代表性荧光显微图像。所示图像是tmrm(红色)和mitogreen(绿色)的合并图像。与spn化合物孵育2小时足以使所有细胞的线粒体电位恢复，并且使在血清饥饿3天之后的arpe-19细胞恢复丝状线粒体网络。
[0329]
这些结果表明，在血清饥饿3天之后，线粒体完全去极化，并且细胞中的线粒体网络片段化。在血清饥饿中，肽缀合生物素分子(spn12和spn15)可以在大约2小时内挽救线粒体电位。这些结果证实了与芳香族-阳离子肽序列缀合的生物素靶向线粒体内膜并且在保护跨线粒体内膜电位方面是有生物活性的。
[0330]
实施例6-肽缀合生物素分子在创伤修复方面比游离生物素更有效
[0331]
某些示例性肽缀合生物素分子可以加速细胞培养物中的创伤愈合。体外划痕测定是用于测量体外“创伤区域”中的细胞增殖和迁移的简单且完善的方法。该测定包括用移液器吸头在细胞单层中产生“划痕”，并且然后检查细胞增殖和迁移以使划痕闭合的速率。
[0332]
将hk-2细胞在含有10％fbs、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem(1g/l葡萄糖)中培养。在实验前一天，将每孔3
×
105个细胞铺在6孔板中的dmem中，在37℃在含有5％co2的加湿培养箱中。为了在体外模拟创伤的微环境，在划痕测定中使用无血清培养基。在划痕测定当天，将培养基更换为无血清dmem，并且使用p1000移液器吸头穿过细胞单层划线。洗涤细胞以去除细胞残渣，并且更换为单独的dmem(对照)或包含10nm生物素或肽缀合生物素分子的dmem。
[0333]
立即(第0天)使用nikon eclipse ti2荧光显微镜检查划痕区域。对于每一个样
品，使用4
×
物镜捕获六个不同的视野。划痕面积(无细胞区域)使用imagej软件(受nih image(美国国立卫生研究院)启发的开源java图像处理程序)计算。24小时(第1天)之后再次检查划痕区域，并且将面积针对同一样品在第0天确定的面积归一化。所有结果都计算为与未处理对照的改变，并且对六个视野取平均值。
[0334]
图15是示出在机械划痕之后24小时，用10nm spn11或spn12处理极大加速hk-2细胞的划痕闭合的代表性显微图像。对于每一个处理组，将在24小时之后确定的划痕面积针对在施加划痕之后立即(第0天)确定的面积归一化。生物素对降低划痕面积具有小影响，而spn11和spn12在24小时内使划痕区域几乎完全闭合。
[0335]
图16总结了对hk-2细胞施加机械划痕之后24小时，生物素、spn11和spn12对划痕面积降低的影响。所有处理都显著加速划痕区的闭合(与对照相比，***p《0.001)。与生物素相比，生物素缀合肽(spn11和spn12)在降低划痕面积方面的效率是两倍(p《0.001)。
[0336]
图17示出了在hk-2细胞的另一个实验中，其他肽缀合生物素分子spn15和spn16在24小时之后也显著加速划痕区域的闭合(***p《0.001)，并且比游离生物素更有效(三倍)(p《0.001)。
[0337]
肽缀合生物素分子(spn12、spn15和spn16)也加速arpe-19细胞的创伤愈合(图18)。图19是总结肽缀合生物素分子对划痕面积的影响的图(**p《0.01；***p《0.001)。与游离生物素相比，肽缀合生物素分子显著更有效(1.5倍至2倍)(p《0.001)。
[0338]
这些结果显示，肽缀合生物素分子不仅是有生物活性的，它们还在促进体外创伤愈合方面优于游离生物素。
[0339]
实施例7-肽缀合生物素分子可以促进创伤区域中的细胞增殖
[0340]
创伤区域的重新上皮化需要创伤边缘处的细胞增殖，这在大多数创伤中可能受损，因为缺乏血流来递送对细胞增殖可能必需的营养物质和/或一种或更多种生长因子。创伤边缘中的细胞增殖可以通过增殖细胞核抗原(pcna)染色来监测。为了在体外模拟创伤的微环境，使用无血清培养基用于细胞培养物的划痕测定。
[0341]
根据ihc world提出的标准程序，通过用针对增殖细胞核抗原(pcna)的抗体进行免疫染色来鉴定增殖细胞。在确定划痕面积之后，使用同一细胞板进行pcna染色。将hk-2细胞用乙醇:甲醇(1:1)在-20℃固定30min，用0.1％riton x-100/pbs在rt透化10min，用2％山羊血清在rt封闭30min，并且与小鼠抗pcna一抗(dako agilent,santa clara,ca)和山羊抗小鼠igg-bi二抗在rt孵育30min。然后将细胞与链霉抗生物素蛋白-alexa fluor 594(jackson immunoresearch,west grove,pa)和hoechst(novus biologicals,centennial,co)孵育，并且用nikon eclipse ti2荧光显微镜(20
×
物镜)成像。所有细胞的细胞核用hoechst染色为蓝色，但增殖细胞的细胞核染色为红色。每个视野的增殖细胞数量通过红色细胞核染色的强度来定量，并且针对蓝色细胞核染色的强度(由nikon nis-elements成像软件确定)归一化。
[0342]
图20示出了机械划痕之后在仅无血清培养基(对照)或包含示例性spn化合物(10nm)的无血清培养基中24小时的hk-2人类肾上皮细胞单层的代表性显微图像(
×
40放大率)。增殖细胞核抗原阳性的细胞以红色示出。所有其他细胞核以蓝色示出。与游离生物素相比，spn11和spn12使划痕边缘处的增殖细胞数量增加。
[0343]
图21是总结机械划痕之后在仅无血清培养基(对照)中或在补充有10nm生物素或
肽缀合生物素分子的无血清培养基中24小时的hk-2人类肾上皮细胞单层中增殖细胞数量的图。将增殖细胞的数量针对所有细胞核归一化。生物素的影响较小，并且没有达到统计学显著性。与对照或生物素相比，与spn11和spn12孵育使划痕边缘处的增殖细胞数量加倍(***p《0.001)。
[0344]
图22示出了机械划痕之后在仅无血清培养基(对照)中或在补充有10nm游离生物素或肽缀合生物素分子的无血清培养基中24小时的arpe-19人类视网膜色素上皮细胞单层的代表性显微图像(40
×
放大率)。增殖细胞核抗原阳性的细胞以红色示出。所有其他细胞核以蓝色示出。与spn08、spn09、spn11或spn12孵育使划痕边缘处的增殖细胞数量增加，而10nm生物素对细胞增殖没有影响。
[0345]
图23是总结机械划痕之后在仅无血清培养基(对照)中或在包含10nm生物素或肽缀合生物素分子的无血清培养基中24小时的arpe-19人类视网膜色素上皮细胞单层中增殖细胞数量的图。将增殖细胞的数量针对所有细胞核归一化。与spn09、spn11、spn12、spn15和spn16中的每一种孵育使划痕边缘处的增殖细胞百分比显著增加，但生物素本身没有影响(与对照相比，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001)。
[0346]
这些结果表明，肽缀合生物素分子在促进创伤环境中的细胞增殖方面比单独的生物素更有效，并且这可能是由于生物素向线粒体的递送增加引起的。
[0347]
实施例8-肽缀合生物素分子保护创伤边缘处细胞的线粒体电位
[0348]
快速分裂的细胞可能需要atp来支持重要构建模块的合成。组织损伤可以引起线粒体快速去极化，从而损害atp的产生和/或导致细胞死亡。atp的失去可能进一步使细胞增殖和/或组织修复受损。可以使用细胞渗透性的电位依赖性染料tmrm(四甲基罗丹明甲酯)监测划痕区域边缘处的细胞的线粒体电位。tmrm可以在带负电荷的极化线粒体中积累，并且可以被检测为红色荧光。
[0349]
为了在体外模拟创伤的微环境，在划痕测定中使用无血清培养基。在划痕测定当天，将培养基更换为无血清dmem，并且使用p1000移液器吸头穿过hk-2细胞单层划线。洗涤细胞以去除残渣，并且更换为单独的dmem(对照)或补充有10nm游离生物素或肽缀合生物素分子的dmem，持续24小时。然后将hk-2细胞与没有酚红的dmem中的5nm tmrm孵育，并且孵育30min。然后将细胞用活细胞成像缓冲液覆盖，并且使用nikon eclipse ti2荧光显微镜(20
×
物镜)成像。
[0350]
图24示出了机械划痕之后在仅无血清培养基(对照)或包含10nm生物素、spn11或spn12的无血清培养基中24小时的hk-2细胞的线粒体电位的代表性显微图像(200
×
放大率)。线粒体电位用tmrm检测，其染色为红色，而细胞核用hoechst染色为蓝色。在对照条件下，划痕边缘处的少数细胞显示tmrm染色，表明许多细胞经历了线粒体去极化。添加10nm的spn11或spn12使具有良好线粒体电位的细胞数量增加，而生物素没有影响。
[0351]
图25是总结机械划痕之后在仅无血清培养基(对照)中或在包含10nm生物素或肽缀合生物素分子的无血清培养基中24小时的hk-2细胞的针对细胞核数量(蓝色荧光)归一化的线粒体电位(红色荧光)比率的图。与spn11或spn12孵育使划痕边缘处细胞的线粒体电位显著增加(与对照相比，***p《0.001)。游离生物素的影响没有达到统计学显著性。
[0352]
这些结果显示，生物素缀合肽(spn11和spn12)因其被靶向递送至线粒体内膜而在在创伤环境中保持线粒体电位方面优于游离生物素。这可以转化为更好的atp产生和细胞
增殖的增加。
[0353]
实施例9-腹膜内施用之后spn15在小鼠视网膜的摄取和分布
[0354]
为了显示肽缀合生物素分子可以体内施用，我们确定了腹膜内(ip)施用后小鼠中spn15的摄取和分布。
[0355]
向13个月龄的雄性小鼠(c57bl/6j品系)ip施用spn15(30mg/kg)。在施用之后2小时时，将小鼠用过量的氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，并且摘除眼睛。摘除角膜和晶状体之后，将眼杯在0.1m tris缓冲液中的4％多聚甲醛中固定1.25小时。然后将眼杯在tris缓冲液中冲洗3次，每次10分钟，并且然后在10％、20％和30％蔗糖中冷冻保护，然后用leica 3050冷冻切片机以30μm切片。切片储存在-20℃直到使用。
[0356]
为了标记spn15上的生物素，将切片与来自jackson immunoresearch,west grove,pa的链霉抗生物素蛋白缀合的alexafluor 594(1:500)孵育。使用topro 3(细胞核染色剂，1:1000，molecular probes)对细胞的细胞核染色。使用针对cox iv(细胞色素c氧化酶亚基4)的抗体(pa 529992，1:300，invitrogen)和mitotracker red(在tris中1:1500，invitrogen)确定线粒体定位。所有孵育均在微波(150w)中进行，除了cox iv和mitotracker标记之外，其通过以下实现：一抗在4℃过夜，随后是二抗(af488缀合的驴抗兔，jackson immunoresearch)。使用olympus fluoview 300与氦、氩和氖激光器，使用40
×
油浸透镜，以1024
×
1024的分辨率对切片成像。
[0357]
图26(左图)是来自未施用肽的对照小鼠的冷冻切片，显示在视网膜的不同层中标记了topro(蓝色)的细胞核，其中os＝外节；is＝内节；onl＝外核层；opl＝外丛状层；inl＝内核层；ipl＝内丛状层；rgc＝视网膜神经节细胞。
[0358]
图26(右图)是来自对照小鼠的冷冻切片，进行以下染色：cox4(cox4是表达在线粒体内膜上的蛋白)(绿色)、mitotracker red(其是标记线粒体的荧光染料)(红色)和topro(其标记细胞核)(蓝色)。对于线粒体的cox4染色在具有其丰富线粒体的光感受器is、和inl、ipl和rgc中清楚地可见。光感受器os中mitotracker red的染色令人惊讶，因为os中不存在线粒体。
[0359]
图26(中图)是来自spn15施用之后2小时的小鼠的冷冻切片。通过链霉抗生物素蛋白alexa fluor 594(红色)染色可视化，清楚的是spn15在视网膜的不同层中被摄取。spn15染色集中在内丛状层和外丛状层(ipl和opl)，即神经节、内核层(inl)中的双极细胞和无长突细胞和光感受器之间的突触处。链霉抗生物素蛋白染色与cox4染色共定位于rgc、ipl、inl和光感受器is。例外是在不存在cox4染色的光感受器os中强烈的链霉抗生物素蛋白染色。尚不清楚spn15为何如此大量地分布至包含负责光转导的密集堆叠盘(densely-packed disks)的os中。
[0360]
图27是光感受器is和os的放大图。视网膜色素上皮(rpe)是os上方的单层细胞。在rpe细胞中可以清楚地观察到spn15染色。
[0361]
这些结果表明spn15在ip施用到活体小鼠中之后被快速吸收，并且广泛分布遍及视网膜。哺乳动物视网膜存在两个供血来源：视网膜中央动脉和脉络膜血管。视网膜中央动脉始于视神经处，以供应视网膜内层。脉络膜血流对于维持视网膜外层(光感受器和视网膜色素上皮(rpe))至关重要。链霉抗生物素蛋白染色表明spn15通过两个血管系统进行分布。
[0362]
spn15染色集中在内丛状层和外丛状层(ipl和opl)。外核层(onl)包含视杆细胞和
异构体和d-异构体。
[0377]
和
–
与...一起。
[0378]
和/或
–
与...一起或可选的。
[0379]
抗生素
–
由某些微生物(包括真菌和细菌)产生和/或来源于其的一种物质，诸如青霉素或红霉素，可以破坏或抑制其他微生物(特别是细菌)的生长。抗生素广泛用于预防和治疗感染性疾病。
[0380]
抗惊厥药
–
一类用于预防或消除惊厥的药物中的任一种。
[0381]
抗氧化剂
–
减少活性氧产生的物质，抑制其他物质氧化的物质，延缓其他物质被氧化变质的物质，和/或自由基、活性氧、羟基自由基、氧化脂质和/或脂质过氧化产物的清除剂。
[0382]
任何
–
一个、一些、每个、和/或全部，非具体指定。
[0383]
仪器
–
用于特定目的的器具或装置。
[0384]
大约
–
约和/或与...几乎相同，包括两个或更多个数值的系列中的每一个值；在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差内，该误差取决于如何测量或确定该特定值；在一个标准差之内；在没有叙述特定的误差边际(例如，数据图或表中给出的平均值的标准差)时，包含所叙述的值的范围，和考虑到有效数字也将通过对所叙述的值向上或向下舍入而将包括的范围；和/或在指定值的
±
20％、15％、10％或5％之内的范围。
[0385]
芳香族
–
具有包含交替的双键和单键的不饱和环的有机化合物，包括那些具有苯环的化合物。
[0386]
布置
–
按特定顺序设置。
[0387]
缔合/相关
–
连接、连接在一起和/或关联。
[0388]
在...处
–
在...中、在...上和/或在附近。
[0389]
至少
–
不少于，并且可能多于，这适用于措辞“至少”之后的任何一系列值中的每一个值。
[0390]
是
–
实际存在。
[0391]
有生物活性的
–
被配置为改变细胞生物学。
[0392]
生物素
–
维生素b复合物的结晶性水溶性维生素，c10h16o3n2s，有时称为维生素b7和/或维生素h。
[0393]
生物素酶
–
一种酶，其在人类中由btd基因编码，容易地裂解和/或分解生物素酰胺，释放游离生物素和胺，并且其主要底物是生物细胞素或与赖氨酸连接的生物素；生物素酶也能够分解生物素酯。
[0394]
生物素化
–
具有位于其一个或更多个末端处的生物素分子的多肽。
[0395]
c-末端
–
(也称为羧基(carboxyl)-末端、羧基(carboxy)-末端、c-末端尾部、c-末端或cooh-末端)氨基酸链(蛋白或多肽)的以游离羧基基团(-cooh)终止的末端。
[0396]
可以
–
在至少一些实施方案中能够。
[0397]
载体
–
向其添加活性成分和/或剂作为应用和/或转移该活性成分和/或剂的方式的物质。
[0398]
阳离子
–
具有正电荷并且在电解中特征性地朝向阴极移动的离子或离子组。
[0399]
引起
–
带来、激发、促成、产生、引发、成为原因、导致和/或影响。
[0400]
由...引起
–
起因于。
[0401]
细胞
–
生物体能够独立起作用的最小结构单元，由全部被半透性细胞膜包围的细胞质、通常一个细胞核和各种其他细胞器组成。
[0402]
细胞渗透性的
–
能够被动地自由移动进出细胞。
[0403]
细胞的
–
细胞的、与细胞相关的或由细胞组成的。
[0404]
化学成分确定的培养基(chemically-defined medium)
–
培养基中的所有成分都以准确的浓度鉴定，并且培养基不含添加的动物或人类血清、生长因子、激素等的那些培养基。
[0405]
物质组合物
–
由人类和/或自动化从两种或更多种物质和/或元素形成的组合物、反应产物、化合物、混合物、制剂、材料和/或复合物。
[0406]
化合物
–
由两种或更不同元素的原子或离子按明确比例组成的、不能用物理方法分离的纯的、宏观上均匀的物质。化合物通常具有不同于其组成元素的特性。
[0407]
包含/包括(comprising)
–
包括/包含(including)但不限于。
[0408]
构思
–
在头脑中想象、概念化、形成和/或发展。
[0409]
配置
–
设计、布置、设置、塑造和/或使合适和/或适合于特定目的、功能、用途和/或情况。
[0410]
缀合
–
经由共价键将两种化合物连接在一起。
[0411]
保守取代
–
用功能、结构和/或化学相似的天然或非天然氨基酸取代多肽中的氨基酸，诸如以下各组各自包含彼此为保守取代的天然氨基酸：
[0412]
1)甘氨酸(gly/g)、丙氨酸(ala/a)；
[0413]
2)异亮氨酸(ile/i)、亮氨酸(leu/l)、甲硫氨酸(met/m)、缬氨酸(val/v)；
[0414]
3)苯丙氨酸(phe/f)、酪氨酸(tyr/y)、色氨酸(trp/w)；
[0415]
4)丝氨酸(ser/s)、苏氨酸(thr/t)、半胱氨酸(cys/c)；
[0416]
5)天冬酰胺(asn/n)、谷氨酰胺(gln/q)；
[0417]
6)天冬氨酸(asp/d)、谷氨酸(glu/e)；和/或
[0418]
7)精氨酸(arg/r)、赖氨酸(lys/k)、组氨酸(his/h)。
[0419]
和/或以下各组，其各自包含彼此为保守取代的天然氨基酸：
[0420]
1)非极性：ala、val、leu、ile、met、pro(脯氨酸/p)、phe、trp；
[0421]
2)疏水性：val、leu、ile、phe、trp；
[0422]
3)脂肪族：ala、val、leu、ile；
[0423]
4)芳香族：phe、tyr、trp、his；
[0424]
5)不带电荷的极性或亲水性：gly、ala、ser、thr、cys、asn、gln、tyr；
[0425]
6)含脂肪族羟基或巯基：ser、thr、cys；
[0426]
7)含酰胺：asn、gln；
[0427]
8)酸性：asp、glu；
[0428]
9)碱性：lys、arg、his；和/或
[0429]
10)小：gly、ala、ser、cys。
[0430]
和/或以下分组：
[0431]
1)疏水性：val、leu、ile、met、phe、trp；
[0432]
2)芳香族：phe、tyr、trp、his；
[0433]
3)中性亲水性：gly、ala、ser、thr、cys、asn、gln；
[0434]
4)酸性：asp、glu；
[0435]
5)碱性：lys、arg、his；和/或
[0436]
6)影响骨架取向的残基：pro、gly。
[0437]
由...组成
–
涉及不包括未列出的任何内容的封闭组(及其法律等同物)。
[0438]
服用
–
吃和/或喝；通过口摄入体内以供消化和/或吸收。
[0439]
包含/含有(containing)
–
包括/包含(including)但不限于。
[0440]
转化
–
转变、适应和/或改变。
[0441]
对应的
–
相关的、关联的、伴随的、目的和/或位置相似的、在每一个方面一致的、和/或在量、数量、数量级、质量和/或程度上等同和/或一致的。
[0442]
产生
–
使成为现实。
[0443]
培养基
–
一种营养物质，诸如琼脂凝胶或液体培养基，细菌、真菌、动物细胞或植物细胞的培养物在其中生长和/或培养用于科学目的。
[0444]
缺乏
–
偏离期望状态和/或状况的状态和/或状况。
[0445]
定义
–
确立含义、关系、轮廓、形式和/或结构；和/或精确和/或清楚地描述和/或指定。
[0446]
递送
–
传送和/或转移的行为。
[0447]
来源
–
从来源和/或起源接收、获得和/或产生。
[0448]
确定
–
通常通过研究、推理和/或计算来发现、获得、计算、决定、推断、确定和/或得出结论。
[0449]
装置
–
机器、制造品和/或其集合。
[0450]
每一个
–
组中被单独考虑的每一个。
[0451]
有效的
–
足以引起、激发、引发和/或引起。
[0452]
实施方案
–
实施方式、表现和/或具体表示。
[0453]
估计值/估计(estimate)
–
(名词)接近实际值的计算值；(动词)近似和/或暂定地计算和/或确定。
[0454]
过度的
–
超过正常、通常、合理和/或适当的限度。
[0455]
示例性
–
用作示例、实例和/或说明，但不一定比其他实施方案或特征更优选或更有利。
[0456]
第一
–
集合中最初引用的元素。
[0457]
制剂
–
以特定形式(诸如片剂、药糖剂、软膏或注射)施用的药物制品。
[0458]
来自
–
用于指示其来源、起源和/或位置。
[0459]
通用的交替
–
具有标识的序列或其逆序列，例如芳香族-阳离子或阳离子-芳香族，诸如具有a-c-a-c-a-c或c-a-c-a-c-a残基的肽序列(其中a代表芳香族，并且c代表阳离子)。
[0460]
产生(generate)
–
产生(create)、产生(produce)、产生(give rise to)和/或使之存在。
[0461]
大于
–
至少。
[0462]
组/分组(group)
–
(名词)由于一个或更多个相似之处而被一起考虑的一定数量的个体和/或事物；(动词)将一定数量的个体或事物关联在一起，使得它们被一起考虑，和/或由于具有相似的特性而将一定数量的个体或事物关联在一起。
[0463]
具有
–
包括但不限于。
[0464]
健康
–
在给定时间时生物体的总体状况；健全，特别是身体和/或精神的健全；没有疾病、损伤、紊乱和/或异常。
[0465]
提高
–
改变至更好的状态和/或状况。
[0466]
不足(inadequate)
–
不足(insufficient)。
[0467]
包括
–
具有但不限于以下内容。
[0468]
初始化
–
为使用和/或一些将来的事件准备某事物。
[0469]
损伤
–
对人和/或事物进行的损害和/或伤害、和/或人和/或事物遭受的损害和/或伤害。
[0470]
安装
–
连接或设置到位并准备使用。
[0471]
摄入
–
吸收、摄取和/或接收的行为和/或实例。
[0472]
肠吸收不良
–
从肠道吸收营养物质的缺陷和/或不足。
[0473]
肌内
–
在肌肉内。
[0474]
鼻内
–
在鼻内。
[0475]
静脉内
–
在静脉内。
[0476]
是
–
实际存在。
[0477]
赖氨酸
–
一种主要由许多蛋白通过水解产生的结晶性碱性必需氨基酸，h2n(ch2)4ch(nh2)cooh。
[0478]
维持
–
涉及恢复和/或保持项目和/或系统性能的活动。
[0479]
哺乳动物(mammal)
–
哺乳动物纲的各种温血脊椎动物中的任一种，包括人类，其特征是皮肤上覆盖有毛发，并且在雌性中，乳腺分泌乳汁以滋养幼体。
[0480]
哺乳动物的(mammalian)
–
哺乳动物的和/或与哺乳动物相关的。
[0481]
最大(maximum)
–
具有最大值。
[0482]
可以/可能(may)
–
在至少一些实施方案中，被允许(allow)和/或允许(permit)。
[0483]
医学状况
–
身体和/或精神的疾病、损伤、紊乱和/或异常。
[0484]
药物
–
适于减轻医学状况的至少一种症状和/或治愈医学状况的物质。
[0485]
代谢的
–
代谢的和/或与代谢相关的。
[0486]
代谢补充剂
–
增强能量产生的天然存在的化合物。
[0487]
代谢
–
在活细胞或生物体内存在的维持生命所必需的化学过程。在代谢中，一些物质被分解以产生生命过程所需的能量，同时合成生命所需的其他物质。
[0488]
方法
–
对待转变为不同状态或事物的主题进行的一个或更多个行为和/或与特定仪器相关联的一个或更多个行为，所述一个或更多个行为不是基本原则，并且不优先于基本原则的所有使用。
[0489]
最小(minimum)
–
具有最低值。
[0490]
减轻
–
使严重(severe)、严重(serious)或痛苦减少。
[0491]
线粒体
–
几乎所有真核细胞细胞质中的一种球形或细长的细胞器，包含遗传物质
和许多对细胞代谢重要的酶，包括那些负责将食物转化为可用能量的酶。
[0492]
靶向线粒体的
–
表示所指示的物质(例如，生物素)被转运至线粒体，使得进入细胞之后，该物质将优先定位于线粒体，而实质上不分布至其他细胞器或膜。
[0493]
更(more)
–
量词，意思是在尺寸、量、范围和/或程度上更大。
[0494]
基序
–
分子序列(通常是蛋白的核苷酸或氨基酸)或分子结构(通常对应于特定生物活性)的复现模式。
[0495]
n-末端
–
(也称为氨基末端，nh2-末端，n-末端端部或胺末端)是蛋白或多肽的起点，指位于多肽末端的游离胺基基团(-nh2)。在肽中，胺基团与蛋白中的另一个羧基基团键合使其形成链，但由于蛋白的末端氨基酸仅在羧基末端连接，因此剩余的游离胺基团称为n-末端。
[0496]
无(no)
–
不存在和/或缺乏任何。
[0497]
一(one)
–
是和/或相当于单个单元、个体和/或整个事物、项目和/或物体。
[0498]
可操作的
–
可行的和/或适合、准备好和/或适于投入其预期用途和/或作用。
[0499]
或
–
用于表示可选项的连词，通常仅出现在一组可选项目的最后一个项目之前。
[0500]
口服
–
口的和/或与口相关的。
[0501]
器官
–
生物体的进行特定功能的分化部分，诸如眼睛、翅膀或叶片。
[0502]
患者
–
哺乳动物受试者，诸如人类受试者。
[0503]
肽
–
包含通过至少一个将一个氨基酸的羧基基团与另一个氨基酸的氨基基团连接的肽键和/或酰胺键共价连接的两个或更多个氨基酸的各种天然或合成化合物中的任一种(包括氨基酸盐，诸如药学上可接受的盐)。
[0504]
每/按照(per)
–
每一个/种，和/或通过...方式。
[0505]
药学上可接受的
–
这样的物质(例如，活性成分或赋形剂)，该物质适于与受试者的组织和器官接触使用而没有过度刺激、过敏反应、免疫原性和/或毒性、与合理的益处/风险比相称、对其预期使用有效、和/或与包含该物质的任何组合物的其他成分相容；可用于制备药物组合物且通常安全、无毒性、且既非生物学不合意也非其他方面不合意的，并且包括对于兽医使用以及人类药物使用是可接受的；和/或由联邦和/或州政府的管理机构和/或除了美国之外的国家的对应机构批准和/或可批准，和/或在美国药典和/或其他公认的药典中列出的用于在动物且更特别在人类中使用。
[0506]
复数
–
为复数和/或多于一个的状态。
[0507]
多肽(polypeptide)
–
通过肽键连接在一起并且具有多达约10,000的分子量的氨基酸链。
[0508]
多肽(polypeptides)
–
通常是肽和蛋白，其中多肽序列的左手末端称为“氨基(n)-末端”，而序列的右手末端称为“羧基(c)-末端”。
[0509]
部分
–
小于较大整体的部分、组成部分、部分(section)、百分比、比例和/或数量。
[0510]
前-(pre-)
–
在事先和/或预先发生的活动之前的前缀。
[0511]
预定
–
预先确定、决定和/或确立。
[0512]
保存
–
安全储存以备后用。
[0513]
防止
–
阻止、避免、抵抗、阻碍、停止和/或防止发生。
[0514]
概率
–
事件发生可能性的定量表示。
[0515]
产品
–
由人类和/或机械工作产生的某事物。
[0516]
预计(project)
–
计算、估计或预测。
[0517]
促进
–
促进...的进展和/或生长；进一步、推进、促进和/或推销(market)。
[0518]
蛋白
–
包含50个或更多氨基酸残基的连接的氨基酸残基序列。
[0519]
提供
–
供应、供给、给予和/或使可获得。
[0520]
范围
–
一组值的程度、和/或变化的量和/或程度的量度。
[0521]
比率
–
两个量之间的关系，表示为一个量除以另一个量的商。
[0522]
接收
–
作为信号得到、采集、获取和/或获得。
[0523]
推荐
–
建议、表扬、赞成和/或认可。
[0524]
降低
–
使更少和/或更小，和/或变得更少和/或更小。
[0525]
再生
–
失去和/或破坏的部分和/或器官的重新生长。
[0526]
去除
–
消除、去除和/或缺失，和/或从占据的地方或位置移走。
[0527]
修复
–
恢复至期望状况。
[0528]
重复
–
再次进行和/或再次执行。
[0529]
反复地
–
一次又一次地；重复地。
[0530]
请求
–
表达对
…
的期望和/或要求。
[0531]
结果/导致(result)
–
(名词)特定作用、操作和/或过程的结果和/或后果；(动词)引起特定作用、操作和/或过程的结果和/或后果。
[0532]
所述
–
在系统或装置权利要求中使用时，指示先前已引入的随后权利要求术语的冠词。
[0533]
第二
–
集合中在最初要素之后的引用要素。
[0534]
选择
–
从可选项中作出选出或选择。
[0535]
选择的
–
从多于一个可选项中选出的。
[0536]
序列(sequence)
–
有序集合。
[0537]
无血清的
–
缺乏在使全血凝结之后将其分离为固体和液体组分时获得的澄清的淡黄色流体。
[0538]
集合
–
相关的多于一个。
[0539]
溶液
–
两种或更多种物质(可以是固体、液体、气体或这些的组合)的均匀混合物。
[0540]
物种
–
根据其共同的属性分组并且指定共同的名称的一类个体和/或对象；属之下的划分。
[0541]
储存(storage)
–
储存的行为或被储存的状态。
[0542]
储存(store)
–
留出、保存、保藏、确保和/或存放以备将来使用。
[0543]
皮下
–
在皮肤略下方。
[0544]
受试者
–
动物，包括但不限于哺乳动物，诸如灵长类动物(例如，人类、黑猩猩或猴)、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、沙鼠或仓鼠)、兔形动物(例如，兔)、牛科动物(例如，牛)、猪科动物(例如，猪)、绵羊类(例如，绵羊)、马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，犬)和/或猫科动物(例如，猫)。
[0545]
舌下
–
位于舌头之下和/或舌头的下表面上。
[0546]
实质上
–
在很大范围和/或程度上。
[0547]
遭受
–
感到疼痛或痛苦；持续损伤和/或伤害；忍受、罹患和/或生病；被准确地诊断为。
[0548]
补充剂
–
(名词)包含一种或更多种维生素、草药、酶、氨基酸和/或其他成分、被服用以通过提供缺失的营养物质来补充个体的饮食的产品。
[0549]
系统
–
机制、装置、机器、制品、方法、物质组合物、数据和/或指令的集合，该集合被设计为进行一项或更多项特定功能。
[0550]
靶向
–
与...相互作用。
[0551]
治疗
–
疾病、损伤、紊乱和/或异常的医学治疗的或与之相关。
[0552]
治疗有效量
–
这样的物质的量，在向受试者施用时，至少在服用该物质的受试者的一部分中，足以预防、降低正在治疗的医学状况的发展风险、延迟正在治疗的医学状况的发作、减缓正在治疗的医学状况的进展和/或引起正在治疗的医学状况的消退，和/或减轻医学状况的一些程度和/或该状况的一种或更多种症状和/或并发症，和/或引发研究人员、兽医、医学博士和/或临床医师所寻求的细胞、组织、器官、系统、动物和/或人类的生物学和/或医学响应。
[0553]
组织
–
一起发挥作用以在体内进行一种或更多种特定功能的形态相似的细胞和相关的细胞间物质的聚集。
[0554]
组织再生
–
通过细胞增殖使组织重新生长，使受损组织的部分完全恢复至其正常状态。
[0555]
组织修复
–
损伤之后组织结构和功能的恢复，所述恢复包括组织再生和组织置换。
[0556]
组织置换
–
那些通过构建结缔组织或疤痕组织来修复受损组织的愈合类型。
[0557]
表面(topical)
–
身体的表面区域，并且通常是皮肤。
[0558]
透皮
–
穿过或通过皮肤。
[0559]
转变
–
可测量的改变：形式、外观、性质和/或特征。
[0560]
传输
–
作为信号发送、提供、供应和/或供给。
[0561]
转运
–
从一个地方传送和/或移动至另一个地方。
[0562]
治疗
–
减轻、改善、抑制医学状况和/或与该状况相关的一个或更多个原因、症状和/或并发症的进展，逆转、预防和/或消除医学状况和/或与该状况相关的一个或更多个原因、症状和/或并发症；操作(handle)和/或处理(deal with)某个体和/或某事物。
[0563]
摄取
–
摄入、服用和/或使用。
[0564]
使用
–
使起作用。
[0565]
使用的
–
采用以实现某事物。
[0566]
经由(via)
–
通过和/或利用。
[0567]
维生素
–
对活生物体的正常生长和活动是微量必需的各种脂溶性或水溶性的有机物质中的任一种，这样的物质由细菌和/或植物合成，和/或主要由动物从其饮食中获得；和/或被施用维生素的动物的食物中除了蛋白、碳水化合物或脂肪之外的必需成分的有机物质，例如，b族维生素，包括b1(硫胺素)、b2(核黄素)、b3(烟酸、烟酰胺)、b5(泛酸)、b6(吡哆醇)、b7(生物素)、b9(叶酸)、和b12(氰钴胺)、维生素c(抗坏血酸)、维生素d和维生素k。
[0568]
水溶性的
–
能够溶解于水。
[0569]
重量/权重
–
实体被地球或其他天体吸引的力，等于物体质量和重力加速度的乘
积；和/或在计算(诸如确定平均值)中分配至数字的因子和/或值，以使该数字对计算的影响反映其重要性、显著性、偏好、影响等。
[0570]
其中
–
在这方面；和；和/或除此之外。
[0571]
与(with)
–
伴随着。
[0572]
区域
–
具有至少一个预定边界的区域和/或体积。
[0573]
注意
[0574]
本文以文本和/或图示方式描述了所要求保护的主题的各种实质上和特定的实用和有用的示例性实施方案，包括本发明人已知的最佳模式(如果有的话)，以供本领域普通技术人员实现所要求保护的主题。本文对“在一种实施方案中”、“在实施方案中”等的提及不一定是指同一实施方案。
[0575]
在阅读本文件时，对于本领域普通技术人员来说，依赖于他/她的专业知识和/或对整个领域的了解并且无需进行过度实验，本文描述的一种或更多种实施方案的许多可能的变化(例如，修改、扩充、修饰、细化和/或增强等)、细节(例如，种类、方面、细微差别和/或精细加工等)和/或等同物(例如，取代、置换、组合和/或替代等)中的任一种都可以变得明显。本发明人预期本领域的任何普通技术人员在获得本发明人的授权后，适当地实现这样的变化、细节和/或等同物，并且本发明人因此预期了不同于本文特别描述地实施所要求保护的主题。因此，在法律允许的情况下，所要求保护的主题包括并覆盖所要求保护的主题的所有变化、细节和等同物。此外，在法律允许的情况下，本文描述的特征、功能、活性、物质和/或结构要素的每一种组合，以及它们的所有可能的变化、细节和等同物，都包含在所要求保护的主题中，除非本文另外明确指示、明确且具体地否认、或者另外明显不合适、无法操作或与上下文相矛盾。
[0576]
除非另外说明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意图更好地阐明一种或更多种实施方案，并且不对任何要求保护的主题的范围构成限制。本文任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的主题对于要求保护的主题的实践是必要的。
[0577]
因此，无论本文件的任何部分(例如，标题、领域、背景、概述、描述、摘要、附图等)的内容如何，除非明确指定相反的内容(诸如经由明确的定义、主张或论证等)，或与上下文明显矛盾，否则对于任何权利要求，无论是本文件的权利要求和/或要求其优先权的任何文件的任何权利要求，并且无论是最初提出的还是其他方式：
[0578]
不要求包括任何特定描述的特征、功能、活动、物质或结构要素，不要求包括任何特定的活动顺序，不要求包括任何特定的物质组合，也不要求包括任何特定的要素相互关系；
[0579]
所描述的任何特征、功能、活动、物质或结构要素都不是“必需的”；以及
[0580]
在所描述的任何实施方案内、其中和之间：
[0581]
所描述的任何两种或更多种物质可以混合、组合、反应、分开和/或分离；
[0582]
所描述的任何特征、功能、活性、物质、组成部分、和/或结构要素或其任何组合可以被特别地包括、复制、不包括、组合、重新排序、重新配置、整合和/或分离；
[0583]
所描述的任何特征、功能、活性、物质、组成部分和/或结构要素之间描述的任何相互关系、顺序和/或依赖性可以被省略、改变、变更和/或重新排序；
[0584]
所描述的任何活动都可以手动、半自动和/或自动进行；
[0585]
所描述的任何活动都可以重复，由多于一个实体进行，和/或在多于一个管辖区进行。
[0586]
除非本文另外指示或与上下文明显矛盾，否则在描述各种实施方案的上下文中(尤其是在所附权利要求书的上下文中)使用的术语“一(a)”、“一(an)”、“所述(said)”、“该/(the)”和/或类似的指示物，应被解释为覆盖单数和复数两者。
[0587]
除非另外说明，否则术语“包含/包括(comprising)”、“具有(having)”、“包括/包含(including)”和“包含/含有(containing)”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。
[0588]
在本文描述任何数量或范围时，除非另外明确说明，否则该数量或范围是近似的。除非本文另外指示，否则本文中对值的范围的叙述仅意图用作单独提及落入该范围内的每一个单独值的简写方法，并且由这样的单独值限定的每一个单独值和每一个单独子范围被并入本说明书中，如同其在本文中被单独叙述一样。例如，如果描述了1至10的范围，则该范围包括其间的所有值，诸如例如1.1、2.5、3.335、5、6.179、8.9999等，并且包括其间的所有子范围，诸如例如1至3.65、2.8至8.14、1.93至9等，即使这些特定值或特定子范围没有明确说明。
[0589]
当出现在权利要求中的任何措辞(即，一个或更多个词语)之后是附图要素编号时，该附图要素编号是示例性的而非限制权利要求范围。
[0590]
除非确切的措辞“意指(means for)”之后是动名词，否则本文件中的任何权利要求或权利要求要素都不意图援引35usc 112(f)。
[0591]
通过引用以其整体并入本文的任何材料(例如，美国专利、美国专利申请、书籍、文章、网页等)中的任何信息在其法律允许的最大允许范围内，但仅在这样的信息与本文阐述的其他定义、陈述和/或附图之间不存在冲突的情况下，通过引用以其整体并入本文。如果发生这样的冲突，包括会使本文的任何权利要求无效或寻求优先权无效的冲突，则这样的材料中的任何这样的冲突信息明确不通过引用并入本文。通过引用并入本文的任何材料的任何部分中的鉴定、批评或比较任何现有技术的任何特定信息不通过引用并入本文。
[0592]
本技术人意图本文中提出的每一项权利要求以及在本技术的审查期间的任何时间点，以及在要求其优先权的任何申请中，限定独特的可获得专利的发明，并且如果以及随着该权利要求的范围在其审查期间改变，则该发明的范围必须相应地改变。因此，在本文件中，以及在与本文件相关的任何专利申请的审查期间，对任何要求保护的主题的任何引用意图仅在该特定时间点引用当时待决的要求保护的主题的确切语言。
[0593]
因此，除了权利要求书本身和其中使用的措辞提供的任何限定之外，本文件的每个部分(例如，标题、领域、背景、概述、描述、摘要、附图等)本质上应被视为说明性的，而不是限制性的。由基于本文件发布的任何专利的任何权利要求所保护的主题的范围仅由该权利要求(及其所有法律等同物)的确切语言和该权利要求中使用的任何措辞提供的任何限定来限定和限制，如在由相关领域普通技术人员合理解释时由本文件的上下文所告知的。