靶向SARS-COV-2的单结构域抗体的制作方法

本发明提供了靶向sars-cov-2的改进的单结构域抗体、多价多肽和包含所述单结构域抗体的融合蛋白，所述单结构域抗体、多价多肽和融合蛋白在治疗和/或预防冠状病毒中的用途，以及使用各种方法、测定方法和试剂盒的所述单结构域抗体、多价多肽和融合蛋白在检测和诊断冠状病毒中的用途。本发明还提供了结合冠状病毒的刺突蛋白的受体结合结构域上的两个不同表位的冠状病毒结合分子，所述冠状病毒结合分子在治疗和/或预防冠状病毒中的用途，以及使用各种方法、测定方法和试剂盒的所述冠状病毒结合分子在检测和诊断冠状病毒中的用途。冠状病毒结合分子基于通过接头将两个抗原结合分子连接在一起。

背景技术：

1、迫切需要确定对抗最近出现的sars-cov-2病毒的方法，这导致了对能够中和该病毒的抗体的研究，并因此可以通过被动免疫疗法用作急性感染的治疗。大部分注意力都已经集中在从已从covid-19康复的患者中鉴定中和性单克隆抗体(例如，rogers,zhao etal.2020)。然而，来源于骆驼科免疫球蛋白的只有重链的子集的纳米抗体或vhh(重链抗体的可变重链结构域)提供了优于常规抗体的可替代物。相较于通常需要哺乳动物细胞来生产的包含两个二硫化物连接的多肽(重链和轻链)的常规抗体，单结构域抗体可以使用微生物系统以较低的成本被制备。它们的小分子尺寸和稳定性也意味着纳米抗体可以被配制用于直接局部递送至受感染患者的呼吸道。单结构域抗体作为sars-cov-2感染的抑制剂的潜力最近已经在基于细胞的测定中得到证实(huo,le bas et al.2020,wrapp,de vliegeret al.2020)。

2、由sars-cov-2引起的疾病covid-19是重大的全球性健康问题，因此迫切需要有效的治疗存在。此外，需要快速且有效检测sars-cov-2的合适工具，以能够准确诊断并监测该病毒。本发明描述了单结构域抗体的分离，所述单结构域抗体以高亲和力结合sars-cov-2的受体结合结构域上的不同表位，并且在野生型病毒中和测定中非常有效。此外，已经产生了各种多肽，它们显示出比单独组分增强的结合亲和力。

3、将结合至相同抗原上两个不同表位的两个纳米抗体连接成单个多肽可以提供从所谓的“螯合效应”中受益的潜力。在化学中，这描述了与单个位点结合相比，螯合配体对金属离子增强的亲和力，并且不同于从多价获得的亲合力效应。在最简单的实施例中，当双配位分子的两个结合基团都结合到相同靶点时，双配位分子就获得了螯合效应。获得螯合效应的增强的关键是，当组分连接时，每个相互作用的焓被保持。因此，用太短或太长或角度排列错误的间隔区(也称为接头)连接两个结合物将意味着，两个位点不能同时结合而不损失显著的焓。这将降低并潜在地消除螯合效应的任何益处。针对此的解决方案是引入更柔性的接头，并因此允许每个接头结合获得其全部焓。然而，柔性的引入导致了问题，这是因为结合造成了刚性，从而造成了熵罚(entropic penalty)。因此，需要在间隔区元件的柔性和刚性之间实现良好的平衡(von krbek,achazi et al.2017)。虽然存在许多方式用于设计在焓和熵之间进行权衡的接头，但是在不付出高熵成本的情况下获得焓的接头的范围通常非常有限。因此，获得螯合效果(其为热力学的)而非简单的亲合力则需要仔细的设计和洞察力。

4、本发明还提供了冠状病毒双配位分子，其以高亲和力结合至冠状病毒刺突蛋白的受体结合结构域上的两个不同表位。这些表明，与单独组分相比，结合亲和力惊人地增强。

技术实现思路

1、本发明提供了特异性结合至sars-cov-2的s蛋白质的受体结合结构域的单结构域抗体。

2、在第一方面，提供了包含互补决定区(互补决定区3(cdr3))的单结构域抗体。

3、在第二方面，提供了包含cdr2和cdr3的单结构域抗体。

4、在第三方面，提供了包含cdr1、cdr2和cdr3的单结构域抗体。

5、在另一个方面，提供了一种包含氨基酸序列的抗sars-cov-2单结构域抗体，所述氨基酸序列与选自由以下组成的组的序列具有至少70％同一性：seq id no:19、seq idno:213、seq id no:18、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:20、seq id no:209、seqid no:211、seq id no:215、seq id no:217、seq id no:219、seq id no:220和seq id no:239。

6、在一个方面，本发明提供了冠状病毒结合分子，其结合冠状病毒的刺突蛋白(优选sars-cov-2刺突蛋白)的受体结合结构域上的两个不同表位。

7、在一个方面，提供了一种冠状病毒结合分子，包含：

8、(a)第一抗原结合分子，其结合至冠状病毒蛋白内包含的第一表位的全部或部分；

9、(b)第二抗原结合分子，其结合至冠状病毒蛋白内包含的第二表位的全部或部分；以及

10、(c)接头，

11、其中，所述接头包含：

12、(a)泛素或泛素样蛋白质；

13、(b)连接至所述泛素或泛素样蛋白质的n端的4-50个氨基酸的另一个任选的间隔区；以及

14、(c)连接至所述泛素或泛素样蛋白质的c端的4-50个氨基酸的另一个任选的间隔区；

15、并且其中，所述接头将所述第一抗原结合分子连接至所述第二抗原结合分子，

16、并且，任选地其中，所述第一表位和所述第二表位基本上不重叠。在一个实施方案中，所述冠状病毒蛋白质是刺突蛋白，任选地是刺突蛋白的受体结合结构域(receptorbinding domain，rbd)。所述冠状病毒可以是选自由以下组成的组的冠状病毒：sars-cov-1、sars-cov-2和mers，优选为sars-cov-2。

17、在一个方面，提供了一种冠状病毒结合分子，包含：

18、(a)第一抗原结合分子，其结合至seq id no:232内包含的第一表位的全部或部分；

19、(b)第二抗原结合分子，其结合至seq id no:233内包含的第二表位的全部或部分；以及

20、(c)接头，

21、其中，所述接头包含：

22、(i)泛素或泛素样蛋白质；

23、(ii)连接至所述泛素或泛素样蛋白质的n端的4-50个氨基酸的另一个任选的间隔区；以及

24、(iii)连接至所述泛素或泛素样蛋白质的c端的4-50个氨基酸的另一个任选的间隔区；

25、并且其中，所述接头将所述第一抗原结合分子连接至所述第二抗原结合分子，

26、并且，任选地其中，所述第一表位和所述第二表位基本上不重叠。

27、在一个方面，提供了一种冠状病毒结合分子，包含：

28、(a)第一抗原结合分子，其与c5、h3、h11-d4、h11-h4、h11-a10、h11-b5、h11-h6或vhh_h6竞争用于结合至sars-cov-2受体结合结构域；

29、(b)第二抗原结合分子，其与a8、cr3022、vhh72或ey6a、f2、c1或b12竞争用于结合至sars-cov-2受体结合结构域；以及

30、(c)接头，

31、其中，所述接头包含：

32、(a)泛素或泛素样蛋白质；

33、(b)连接至所述泛素或泛素样蛋白质的n端的4-50个氨基酸的另一个任选的间隔区；以及

34、(c)连接至所述泛素或泛素样蛋白质的c端的4-50个氨基酸的另一个任选的间隔区；

35、并且其中，所述接头将所述第一抗原结合分子连接至所述第二抗原结合分子，

36、并且，任选地其中，所述第一表位和所述第二表位基本上不重叠。

37、在另一个方面，提供了一种编码本发明的单结构域抗体、多价多肽或冠状病毒结合分子的多核苷酸序列。

38、在另一个方面，提供了一种多价多肽，其包含一种或任选的两种或更多种本发明的单结构域抗体。

39、在另一个方面，提供了一种本发明的单结构域抗体、多价多肽或冠状病毒结合分子的亲和力成熟的突变体。

40、在另一个方面，提供了一种生产本发明的单结构域抗体、多价多肽或冠状病毒结合分子的方法。

41、在另一个方面，提供了一种包含本发明的单结构域抗体、多价多肽或冠状病毒结合分子的药物组合物。

42、在另一个方面，提供了本发明的单结构域抗体、多价多肽或冠状病毒结合分子或者本发明的药物组合物用于医药。

43、在另一个方面，提供了一种用于治疗受试者的冠状病毒的方法，所述方法包括向受试者施用治疗活性量的本发明的单结构域抗体、多价多肽或冠状病毒结合分子。

44、在另一个方面，提供了本发明的单结构域抗体、多价多肽或冠状病毒结合分子在制备用于治疗和/或预防冠状病毒的药物中的用途。

45、在另一个方面，提供了用于检测冠状病毒蛋白质的方法。

46、在另一个方面，提供了用于诊断受试者的冠状病毒感染的方法。