可电离阳离子脂质和脂质纳米颗粒及其合成和使用方法与流程

本发明提供了用于将核酸递送至免疫细胞的可电离阳离子脂质和脂质纳米颗粒以及制备和使用此类脂质和靶向脂质纳米颗粒的方法。

背景技术：

1、近年来，已经开发了许多涉及将一种或多种核酸递送至受试者的治疗方式。治疗方式包括例如基因疗法，其中将呈脱氧核糖核酸(dna)形式的目的基因引入细胞中，然后表达所述目的基因以产生基因产物(例如，蛋白质)，以用于治疗由所述基因产物的缺陷或缺乏引起或与之相关的障碍。在此方法中，使基因转录成信使核糖核酸(mrna)，然后翻译mrna以产生基因产物。在另一种方法中，可以将mrna而非目的基因递送至细胞。所得的表达产物可以改善受试者中特定蛋白质的缺陷或缺乏(例如，在某些形式的囊性纤维化或溶酶体贮积症中发生的蛋白质缺陷)，或者可以用于调节细胞功能，例如对免疫细胞进行重编程以启动或以其他方式调节受试者的免疫反应(例如，作为用于治疗癌症的治疗剂或作为用于预防微生物或病毒感染或使其风险或严重程度最小化的预防性疫苗)。

2、然而，将mrna递送至细胞以在细胞内进行翻译因多种因素而具有挑战性，所述因素如mrna在进入细胞之前以及在引入细胞之后但在翻译之前的核酸酶降解。

3、可以使用不同的递送媒介物将rna递送至受试者，例如基于与rna一起形成纳米颗粒的阳离子聚合物或脂质。纳米颗粒旨在保护rna免于降解，使rna能够递送至靶位点，并且促进靶细胞的细胞摄取和加工。对于递送功效，除了分子组成外，像粒度、电荷或与分子部分(如聚乙二醇(peg)或配体)的接枝等参数也起作用。与peg接枝被认为可减少血清相互作用、增加血清稳定性和增加循环时间，这对于某些靶向方法可能是有帮助的。

4、与某些基因疗法中使用的dna递送技术相比，基于mrna的基因治疗具有许多优越的特点，例如易于操作、快速且短暂的表达以及无需诱变的自适应可转换性。

5、然而，鉴于rna的相对不稳定性和低细胞渗透性，将治疗性rna递送至细胞是困难的。因此，需要开发用于促进将诸如mrna等rna递送至细胞的方法和组合物。

技术实现思路

1、本发明提供了可电离阳离子脂质、脂质-免疫细胞靶向基团缀合物、和包含此类可电离阳离子脂质和/或脂质-免疫细胞(例如，t细胞)靶向基团缀合物的脂质纳米颗粒组合物、含有此类脂质和/或缀合物的医用试剂盒、以及制备和使用此类脂质和缀合物的方法。

2、本文提供的脂质纳米颗粒组合物可以进一步包含核酸，如rna，例如信使rna或mrna。所述脂质纳米颗粒组合物可以用于将mrna递送至受试者的细胞(例如，免疫细胞，如t细胞)。基于信使rna的基因疗法需要将mrna有效地递送至血浆中的循环细胞(例如，免疫细胞，如t细胞或nk细胞)或递送至给定组织中的细胞。与有效mrna递送以达到稳健的蛋白质表达水平相关的主要挑战包括：(a)在施用至受试者时保护mrna有效载荷免受普遍存在的血清核酸酶影响的能力；(b)将mrna递送特异性靶向至靶细胞(例如，t细胞)群，从而使其中的蛋白质表达最大化的能力；以及(c)将mrna有效载荷最大程度地递送至细胞(例如，t细胞)的胞质区室以在细胞质内翻译成蛋白质的能力。

3、本发明提供了用于产生脂质纳米颗粒组合物的可电离阳离子脂质，所述脂质纳米颗粒组合物促进将放置在其中的有效载荷(例如，核酸，如dna或rna，如mrna)递送至细胞，例如哺乳动物细胞，例如免疫细胞。所述脂质被设计成能够将核酸(例如，mrna)细胞内地递送至靶细胞类型的胞质区室并快速降解成无毒组分。这些复杂的功能是通过可电离脂质头基、疏水“酰基尾”基团和连接可电离阳离子脂质中的头基和酰基尾基团的接头的化学与几何形状之间的相互作用来实现的。

4、在一个方面，本发明提供了一种由式i表示的化合物：

5、或其盐，其中变量如本文所定义。

6、在另一个方面，本发明提供了一种由式ii表示的化合物：

7、或其盐，其中变量如本文所定义。

8、本文部分地提供了一种选自以下的化合物：

9、

10、

11、或其盐。

12、在某些实施方案中，所述化合物是式iii的化合物：

13、或其盐，其中变量如本文所定义。

14、本文还提供了一种下式的化合物：

15、

16、或其盐。

17、本文还提供了一种下式的化合物：

18、

19、或其盐。

20、本文还提供了一种下式的化合物：

21、

22、或其盐。

23、本文还提供了一种下式的化合物：

24、

25、或其盐。

26、本文还提供了一种下式的化合物：

27、

28、或其盐。

29、本文还提供了一种下式的化合物：

30、

31、或其盐。

32、本文还提供了一种下式的化合物：

33、

34、或其盐。

35、本文还提供了一种下式的化合物：

36、

37、或其盐。

38、本文还提供了一种包含脂质共混物的脂质纳米颗粒(lnp)，所述脂质共混物包含本文提供的可电离阳离子脂质和/或脂质-免疫细胞靶向基团缀合物(例如，脂质-t细胞靶向基团缀合物)。

39、在另一个方面，本文提供了一种将核酸递送至免疫细胞(例如，t细胞)的方法，所述方法包括在允许所述核酸进入所述免疫细胞的条件下使所述免疫细胞暴露于本文所述的含有所述核酸的lnp。

40、在另一个方面，本文提供了一种将核酸递送至有需要的受试者的免疫细胞(例如，t细胞)的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含本文所述的含有核酸的lnp的组合物，从而将所述核酸递送至所述免疫细胞。

41、在另一个方面，本文提供了一种将核酸(例如，mrna)的递送靶向至受试者的免疫细胞(例如，t细胞)的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的含有所述核酸的lnp，以促进将所述核酸靶向递送至所述免疫细胞。

42、在一个方面，本文提供了用于将核酸靶向递送至免疫细胞的脂质纳米颗粒(lnp)，其包含脂质共混物。在一些实施方案中，所述脂质共混物包含脂质-免疫细胞靶向基团缀合物，其包含式iv的化合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]。在一些实施方案中，所述脂质共混物包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质包含

43、

44、在一些实施方案中，所述lnp包含放置在其中的核酸。

45、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含结合t细胞抗原的抗体。在一些实施方案中，所述t细胞抗原是cd3、cd4、cd7或cd8或其组合(例如，cd3和cd8两者、cd4和cd8两者或cd7和cd8两者)。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含结合自然杀伤(nk)细胞抗原的抗体。在一些实施方案中，所述nk细胞抗原是cd7、cd8或cd56或其组合(例如，cd7和cd8两者)。在一些实施方案中，所述抗体是人或人源化抗体。

46、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团经由含有聚乙二醇(peg)的接头与所述脂质共混物中的脂质共价偶联。在一些实施方案中，经由含有peg的接头与所述免疫细胞靶向基团共价偶联的所述脂质是二硬脂酰甘油(dsg)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(dspe)、二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰-甘油-磷酸甘油(dspg)、二肉豆蔻酰-甘油(dmg)、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(dppe)、二棕榈酰-甘油(dpg)或神经酰胺。在一些实施方案中，所述peg是peg 2000。

47、在一些实施方案中，所述脂质-免疫细胞靶向基团缀合物以0.002-0.2摩尔百分比的范围存在于所述脂质共混物中。在一些实施方案中，所述脂质共混物包含结构脂质(例如，固醇)、中性磷脂和游离peg-脂质中的一种或多种。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质以40-60摩尔百分比的范围存在于所述脂质共混物中。在一些实施方案中，所述固醇以30-50摩尔百分比的范围存在于所述脂质共混物中。在一些实施方案中，所述固醇以20-70摩尔百分比的范围存在于所述脂质共混物中。在一些实施方案中，所述固醇是胆固醇。

48、在一些实施方案中，所述中性磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dspe)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、鞘磷脂(sm)。在一些实施方案中，所述中性磷脂以1-10摩尔百分比的范围存在于所述脂质共混物中。

49、在一些实施方案中，所述游离peg-脂质选自peg-二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(peg-dspe)或peg-二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(peg-dmpe)、n-(甲基聚氧乙烯氧基羰基)-1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dppe-peg)、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯(peg-dmg)、1,2-二棕榈酰-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯(peg-dpg)、1,2-二油酰-rac-甘油,甲氧基聚乙二醇(dog-peg)、1,2-二硬脂酰-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯(peg-dsg)、n-棕榈酰-鞘氨醇-1-{琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)](peg-神经酰胺)和dspe-peg-半胱氨酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述游离peg-脂质包含二酰基磷脂酰乙醇胺，其包含二棕榈酰(c16)链或二硬脂酰(c18)链。在一些实施方案中，所述游离peg-脂质是两种或更多种独特的游离peg-脂质的混合物。在一些实施方案中，所述游离peg-脂质以1-4摩尔百分比的范围(如约1-2摩尔百分比、或约2-4摩尔百分比、或约1.5摩尔百分比)存在于所述脂质共混物中。在一些实施方案中，所述游离peg-脂质包含与所述脂质-免疫细胞靶向基团缀合物中的脂质相同或不同的脂质。

50、在一些实施方案中，所述lnp具有在50-200nm范围内的平均直径。在一些实施方案中，所述lnp具有约100nm的平均直径。在一些实施方案中，所述lnp具有在从0.05至1范围内的多分散性指数。在一些实施方案中，所述lnp在ph 5下具有从约-10mv至约+30mv的ζ电位。

51、在一些实施方案中，所述核酸是dna或rna。在一些实施方案中，所述rna是mrna、trna、sirna或微rna。在一些实施方案中，所述mrna编码受体、生长因子、激素、细胞因子、抗体、抗原、酶或疫苗。在一些实施方案中，所述mrna编码能够调节所述免疫细胞中的免疫反应的多肽。在一些实施方案中，所述mrna编码能够对所述免疫细胞进行重编程的多肽。在一些实施方案中，所述mrna编码合成t细胞受体(syntcr)或嵌合抗原受体(car)。在一些实施方案中，所述car包含seq id no:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码所述car的mrna包含seq id no:25的多核苷酸序列。

52、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含抗体，并且所述抗体是fab或免疫球蛋白单可变结构域，如纳米抗体。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含fab、f(ab')2、fab'-sh、fv或scfv片段。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含被工程化以敲除一个或多个天然链间二硫键的fab。例如，在一些实施方案中，所述fab包含含有c233s取代的重链片段，根据kabat编号；和/或含有c214s取代的轻链片段，根据kabat编号。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含被工程化以引入一个或多个包埋的链间二硫键的fab。例如，在一些实施方案中，所述fab抗体包含含有f174c取代的重链片段，根据kabat编号；和/或含有s176c取代的轻链片段，根据kabat编号。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含被工程化以敲除一个或多个天然链间二硫键并引入一个或多个包埋的链间二硫键的fab。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含在所述重链或轻链片段的c末端含有半胱氨酸的fab。在一些实施方案中，所述fab进一步包含在所述fab的重链片段与所述c末端半胱氨酸之间的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，所述fab包含与抗体ch1结构域连接的重链可变结构域和与抗体轻链恒定结构域连接的轻链可变结构域，其中所述ch1结构域和所述轻链恒定结构域通过一个或多个链间二硫键连接，并且其中所述免疫细胞靶向基团进一步包含通过氨基酸接头与所述轻链恒定结构域的c末端连接的单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，所述fab抗体是ds fab(具有野生型(天然)链间二硫键的fab)、nods fab(敲除了天然二硫键的fab，如在重链上具有c233s取代和/或在轻链上具有c214s取代的fab，根据kabat编号)、bds fab(没有天然二硫键并引入了非天然链间包埋的二硫键的fab，如在重链上具有f174c和c233s和/或在轻链上具有s176c和c214s取代的fab，根据kabat编号)或bds fab-scfv(通过接头(如(g4s)x)与scfv连接到的bds fab)，如图47所展示。

53、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含免疫球蛋白单可变结构域，如纳米抗体。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白单可变结构域在c末端包含半胱氨酸。在一些实施方案中，所述纳米抗体进一步包含间隔子，其包含在所述vhh结构域与所述c末端半胱氨酸之间的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含两个或更多个vhh结构域。在一些实施方案中，所述两个或更多个vhh结构域通过氨基酸接头连接。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含与抗体ch1结构域连接的第一vhh结构域和与抗体轻链恒定结构域连接的第二vhh结构域，并且其中所述抗体ch1结构域和所述抗体轻链恒定结构域通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含与抗体ch1结构域连接的vhh结构域，并且其中所述抗体ch1结构域通过一个或多个二硫键与抗体轻链恒定结构域连接。在一些实施方案中，所述ch1结构域包含f174c和c233s取代，和/或所述轻链恒定结构域包含s176c和c214s取代，根据kabat编号。在一些实施方案中，所述抗体是scfv、vhh(nb)、2xvhh、vhh-ch1/空vk或vhh1-ch1/vhh-2-nb bds，如图47所展示。

54、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含fab，其包含含有seq id no:1的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:2或3的氨基酸序列的轻链片段。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含fab，其包含含有seq id no:6的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:7的氨基酸序列的轻链片段。在一些实施方案中，所述抗体是在例子中所述的抗体。

55、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含fab，其包含：

56、(a)含有seq id no:1的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:2或3的氨基酸序列的轻链片段；

57、(b)含有seq id no:4的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:5的氨基酸序列的轻链片段；

58、(c)含有seq id no:6的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:7的氨基酸序列的轻链片段；

59、(d)含有seq id no:8的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:9的氨基酸序列的轻链片段；

60、(e)含有seq id no:10的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:11的氨基酸序列的轻链片段；

61、(f)含有seq id no:12的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:13的氨基酸序列的轻链片段；

62、(g)含有seq id no:14的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:15的氨基酸序列的轻链片段；

63、(h)含有seq id no:16的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:17的氨基酸序列的轻链片段；

64、(i)含有seq id no:18的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:19的氨基酸序列的轻链片段；

65、(j)含有seq id no:20的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:21的氨基酸序列的轻链片段；或者

66、(k)含有seq id no:22的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:23的氨基酸序列的轻链片段。

67、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含fab、f(ab')2、fab'-sh、fv或scfv片段。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含被工程化以敲除c末端的天然链间二硫键的fab。在一些实施方案中，所述fab包含含有c233s取代的重链片段和含有c214s取代的轻链片段，根据kabat编号。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含具有非天然链间二硫键(例如，工程化的包埋的链间二硫键)的fab。在一些实施方案中，所述fab在所述重链片段中包含f174c取代，并且在所述轻链片段中包含s176c取代，根据kabat编号。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含在所述重链或轻链片段的c末端含有半胱氨酸的fab。在一些实施方案中，所述fab进一步包含在所述fab的重链片段与所述c末端半胱氨酸之间的一个或多个氨基酸。

68、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含免疫球蛋白单可变结构域。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白单可变结构域在c末端包含半胱氨酸。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白单可变结构域包含vhh结构域，并且进一步包含间隔子，其包含在所述vhh结构域与所述c末端半胱氨酸之间的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含两个或更多个vhh结构域。在一些实施方案中，所述两个或更多个vhh结构域通过氨基酸接头连接。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含与抗体ch1结构域连接的第一vhh结构域和与抗体轻链恒定结构域连接的第二vhh结构域。在一些实施方案中，所述抗体ch1结构域和所述抗体轻链恒定结构域通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含与抗体ch1结构域连接的vhh结构域。在一些实施方案中，所述抗体ch1结构域通过一个或多个二硫键与抗体轻链恒定结构域连接。在一些实施方案中，所述ch1结构域包含f174c和c233s取代，并且所述轻链恒定结构域包含s176c和c214s取代，根据kabat编号。

69、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含fab，其包含：(a)含有seq id no:1的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:2或3的氨基酸序列的轻链片段；或(b)含有seq id no:6的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:7的氨基酸序列的轻链片段。

70、在另一个方面，本文提供了将核酸的递送靶向至受试者的免疫细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使所述免疫细胞与脂质纳米颗粒(lnp)接触。在一些实施方案中，所述lnp包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含含有下式的化合物的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]。在一些实施方案中，所述lnp包含固醇或其他结构脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含中性磷脂。在一些实施方案中，所述lnp包含游离聚乙二醇(peg)脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含所述核酸。

71、在一些实施方案中，本公开文本的一个方面涉及如本文所公开的lnp或含有其的药物组合物，用于在将核酸的递送靶向至受试者的免疫细胞的方法中使用。这种方法可以用于治疗如下文所公开的疾病或障碍。在一些实施方案中，如本文所公开的方法可以包括使受试者的所述免疫细胞在体外或离体地与脂质纳米颗粒(lnp)接触。在一些实施方案中，所述lnp是如在本公开文本中本文所述的lnp。

72、在一些实施方案中，所述lnp提供以下益处中的至少一种：

73、(i)与参考lnp相比，靶向递送至所述免疫细胞的特异性增加；

74、(ii)与参考lnp相比，所述核酸或由所述核酸编码的多肽在所述免疫细胞中的半衰期增加；

75、(iii)与参考lnp相比，转染率增加；以及

76、(iv)低水平的染料可及mrna(<15％)和高rna囊封效率，其中相对于在lnp批量制备中使用的总rna，在最终配制品中回收至少80％的mrna。

77、在一些方面，提供了在受试者的靶向免疫细胞中表达目的多肽的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使所述免疫细胞与脂质纳米颗粒(lnp)接触。在一些实施方案中，所述lnp包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]。在一些实施方案中，所述lnp包含固醇或其他结构脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含中性磷脂。在一些实施方案中，所述lnp包含游离聚乙二醇(peg)脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含编码所述多肽的核酸。在一些实施方案中，本公开文本的一个方面涉及如本文所公开的lnp或含有其的药物组合物，用于在受试者的靶向免疫细胞中表达目的多肽的方法中使用。这种方法可以用于治疗如下文所公开的疾病或障碍。在一些实施方案中，如本文所公开的方法可以包括使受试者的所述免疫细胞在体外或离体地与脂质纳米颗粒(lnp)接触。

78、在一些实施方案中，所述lnp提供以下益处中的至少一种：

79、(i)与参考lnp相比，在所述免疫细胞中的表达水平增加；

80、(ii)与参考lnp相比，在所述免疫细胞中表达的特异性增加；

81、(iii)与参考lnp相比，所述核酸或由所述核酸编码的多肽在所述免疫细胞中的半衰期增加；

82、(iv)与参考lnp相比，转染率增加；以及

83、(v)低水平的染料可及mrna(<15％)和高rna囊封效率，其中相对于在lnp批量制备中使用的总rna，在最终配制品中回收至少80％的mrna。

84、在一些方面，提供了调节受试者的靶免疫细胞的细胞功能的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用脂质纳米颗粒(lnp)。在一些实施方案中，所述lnp包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]。在一些实施方案中，所述lnp包含固醇或其他结构脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含中性磷脂。在一些实施方案中，所述lnp包含游离聚乙二醇(peg)脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含编码用于调节所述免疫细胞的细胞功能的多肽的核酸。在一些实施方案中，本公开文本的一个方面涉及如本文所公开的lnp或含有其的药物组合物，用于在调节受试者的靶向免疫细胞的细胞功能的方法中使用。这种方法可以用于治疗如下文所公开的疾病或障碍。在一些实施方案中，如本文所公开的方法可以包括使受试者的所述免疫细胞在体外或离体地与脂质纳米颗粒(lnp)接触。

85、在一些实施方案中，所述lnp提供以下益处中的至少一种：

86、(i)与参考lnp相比，在所述免疫细胞中的表达水平增加；

87、(ii)与参考lnp相比，在所述免疫细胞中表达的特异性增加；

88、(iii)与参考lnp相比，所述核酸或由所述核酸编码的多肽在所述免疫细胞中的半衰期增加；

89、(iv)与参考lnp相比，转染率增加；

90、(v)所述lnp可以以与参考lnp相比更低的剂量施用，以在所述免疫细胞中实现相同的生物学作用；以及

91、(vi)低水平的染料可及mrna(<15％)和高rna囊封效率，其中相对于在lnp批量制备中使用的总rna，在最终配制品中回收至少80％的mrna。

92、在一些实施方案中，细胞功能的所述调节包括对所述免疫细胞进行重编程以启动免疫反应。在一些实施方案中，细胞功能的所述调节包括调节所述免疫细胞的抗原特异性。

93、在一些方面，提供了治疗、改善或预防有需要的受试者的障碍或疾病的症状的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用脂质纳米颗粒(lnp)以将核酸递送至所述受试者的免疫细胞。在一些实施方案中，所述lnp包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]。在一些实施方案中，所述lnp包含固醇或其他结构脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含中性磷脂。在一些实施方案中，所述lnp包含游离聚乙二醇(peg)脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含所述核酸。

94、在一些实施方案中，所述核酸调节所述免疫细胞的免疫反应，从而治疗或改善所述症状。在一些实施方案中，本公开文本的一个方面涉及如本文所公开的lnp或含有其的药物组合物，用于在治疗、改善或预防有需要的受试者的障碍或疾病的症状的方法中使用。疾病或障碍可以如下文所公开。在一些实施方案中，如本文所公开的方法可以包括使受试者的所述免疫细胞在体外或离体地与脂质纳米颗粒(lnp)接触。

95、在一些实施方案中，所述lnp提供以下益处中的至少一种：

96、(i)与参考lnp相比，将所述核酸递送至所述免疫细胞的特异性增加；

97、(ii)与参考lnp相比，所述核酸或由所述核酸编码的多肽在所述免疫细胞中的半衰期增加；

98、(iii)与参考lnp相比，转染率增加；

99、(iv)所述lnp可以以与参考lnp相比更低的剂量施用，以达到相同的治疗功效；

100、(v)与参考lnp相比，免疫细胞的功能获得水平增加；以及

101、(vi)低水平的染料可及mrna(<15％)和高rna囊封效率，其中相对于在lnp批量制备中使用的总rna，在最终配制品中回收至少80％的mrna。

102、在一些实施方案中，所述障碍是免疫障碍、炎性障碍或癌症。在一些实施方案中，所述核酸编码用于在治疗或预防病原体感染的治疗性或预防性疫苗中使用的抗原。在一些实施方案中，所述fab抗体包含含有f174c取代的重链片段，根据kabat编号；和/或含有s176c取代的轻链片段，根据kabat编号。

103、在一些实施方案中，不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的非免疫细胞被所述lnp转染。在一些实施方案中，不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的不意在成为所述递送的目标的不希望的免疫细胞被所述lnp转染。在一些实施方案中，由所述lnp递送至所述免疫细胞的核酸或由所述lnp递送的所述核酸所编码的多肽的半衰期比由参考lnp递送至所述免疫细胞的核酸或由所述参考lnp递送的所述核酸所编码的多肽的半衰期长至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更长。

104、在一些实施方案中，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多的意在成为所述递送的目标的免疫细胞被所述lnp转染。

105、在一些实施方案中，由所述lnp递送的所述核酸的表达水平比由参考lnp递送的核酸在相同免疫细胞中的表达水平高至少5％、至少10％、至少10％、至少10％、至少10％、至少10％、至少10％、至少10％、至少10％、至少10％、至少10％、至少10％、至少10％、至少10％、至少10％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多。

106、在一个方面，提供了用于将核酸递送至受试者的nk细胞的脂质纳米颗粒(lnp)。所述lnp包含(a)可电离阳离子脂质；(b)含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]；(c)固醇或其他结构脂质；(d)中性磷脂；(e)游离聚乙二醇(peg)脂质；以及(f)所述核酸。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含结合cd56的抗体。

107、在一个方面，提供了用于将核酸递送至受试者的免疫细胞的脂质纳米颗粒(lnp)。所述lnp包含(a)可电离阳离子脂质；(b)含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]；(c)固醇或其他结构脂质；(d)中性磷脂；(e)游离聚乙二醇(peg)脂质；以及(f)所述核酸。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含结合cd7或cd8的抗体，并且所述游离peg脂质是dmg-peg。

108、在一个方面，提供了用于将核酸递送至受试者的免疫细胞的脂质纳米颗粒(lnp)。所述lnp包含(a)可电离阳离子脂质；(b)含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]；(c)固醇或其他结构脂质；(d)中性磷脂；(e)游离聚乙二醇(peg)脂质；以及(f)所述核酸。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含抗体，并且所述抗体是fab或免疫球蛋白单可变结构域。在一些实施方案中，所述fab被工程化以敲除c末端的天然链间二硫键。在一些实施方案中，所述fab具有包埋的链间二硫键。在一些实施方案中，所述抗体是免疫球蛋白单可变(isv)结构域，并且所述isv结构域是isv。在一些实施方案中，所述游离peg脂质包含具有至少2000道尔顿的分子量的peg。在一些实施方案中，所述peg具有约3000至5000道尔顿的分子量。在一些实施方案中，所述fab是抗cd3抗体，并且所述lnp中的所述游离peg脂质包含具有约2000道尔顿的分子量的peg。在一些实施方案中，所述fab是抗cd4抗体，并且所述lnp中的所述游离peg脂质包含具有约3000至3500道尔顿的分子量的peg。

109、在一个方面，提供了用于将核酸递送至受试者的免疫细胞的脂质纳米颗粒(lnp)。所述lnp包含(a)可电离阳离子脂质；(b)含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]；(c)固醇或其他结构脂质；(d)中性磷脂；(e)游离聚乙二醇(peg)脂质；以及(f)所述核酸。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含结合cd3的抗体和结合cd11a或cd18的抗体。

110、在一个方面，提供了用于将核酸递送至受试者的免疫细胞的脂质纳米颗粒(lnp)。所述lnp包含(a)可电离阳离子脂质；(b)含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]；(c)固醇或其他结构脂质；(d)中性磷脂；(e)游离聚乙二醇(peg)脂质；以及(f)所述核酸。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含结合cd7的抗体和结合cd8的抗体。

111、在一个方面，提供了用于将核酸递送至受试者的两种不同类型的免疫细胞的脂质纳米颗粒(lnp)。所述lnp包含(a)可电离阳离子脂质；(b)含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]；(c)固醇或其他结构脂质；(d)中性磷脂；(e)游离聚乙二醇(peg)脂质；以及(f)所述核酸。

112、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含双特异性靶向部分。在一些实施方案中，所述双特异性靶向部分与所述两种不同类型的免疫细胞结合。在一些实施方案中，所述两种不同类型的免疫细胞是cd4+t细胞和cd8+t细胞。在一些实施方案中，所述双特异性靶向部分是双特异性抗体。在一些实施方案中，所述双特异性抗体是fab-scfv。

113、在一个方面，提供了用于将核酸递送至受试者的cd4+和cd8+t细胞两者的脂质纳米颗粒(lnp)。所述lnp包含(a)可电离阳离子脂质；(b)含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]；(c)固醇或其他结构脂质；(d)中性磷脂；(e)游离聚乙二醇(peg)脂质；以及(f)所述核酸。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含与cd3或cd7结合的单一抗体。

114、进一步提供了一种用于将核酸递送至受试者的免疫细胞的脂质纳米颗粒(lnp)，其中所述lnp包含：(a)可电离阳离子脂质；(b)含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]；(c)固醇或其他结构脂质；(d)中性磷脂；(e)游离聚乙二醇(peg)脂质；以及(f)所述核酸，其中所述免疫细胞靶向基团包含缺乏天然链间二硫键的fab。在一些实施方案中，所述fab被工程化以用非半胱氨酸氨基酸替换天然恒定轻链和天然恒定重链上的形成天然链间二硫键的一个或两个半胱氨酸，从而去除所述fab中的天然链间二硫键。

115、还提供了一种与人cd8结合的免疫球蛋白单可变结构域(isvd)。在一些实施方案中，所述isvd包含三个互补决定结构域cdr1、cdr2和cdr3，其中

116、(a)所述cdr1包含gstfsdyg(seq id no:100)，

117、(b)所述cdr2包含idwngeht(seq id no:101)，并且

118、(c)所述cdr3包含aadalpytvrkyny(seq id no:102)。

119、在一些实施方案中，所述isvd是人源化的。

120、在一些实施方案中，所述isvd包含seq id no:77，由其组成，或基本上由组成。

121、还提供了一种多肽，其包含gstfsdyg(seq id no:100)、idwngeht(seq id no:101)和aadalpytvrkyny(seq id no:102)。

122、在一些实施方案中，所述多肽包含如本文所述的isvd。

123、在一些实施方案中，所述多肽进一步包含第二结合部分，其中所述第二结合部分与cd8或另一种不同的靶标结合。在一些实施方案中，所述第二结合部分也是isvd。

124、在一些实施方案中，所述多肽进一步包含可检测标记或治疗剂。

125、还提供了一种组合物，其包含如本文所述的isvd或多肽。

126、进一步提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的isvd或多肽以及药学上可接受的载体。

127、进一步提供了一种治疗受试者的与cd8相关的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所述的药物组合物。

128、在一些实施方案中，所述疾病是癌症。在一些实施方案中，所述障碍是免疫障碍、炎性障碍或癌症。

129、在一些实施方案中，所述核酸编码用于在治疗或预防病原体感染的治疗性或预防性疫苗中使用的抗原。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质是

130、

131、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含结合t细胞抗原的抗体。在一些实施方案中，所述t细胞抗原是cd3、cd8或cd3和cd8两者。60.在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含结合自然杀伤(nk)细胞抗原的抗体。在一些实施方案中，所述nk细胞抗原是cd56。在一些实施方案中，所述抗体是人或人源化抗体。

132、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团经由含有聚乙二醇(peg)的接头与所述脂质共混物中的脂质共价偶联。在一些实施方案中，经由含有peg的接头与所述免疫细胞靶向基团共价偶联的所述脂质是二硬脂酰甘油(dsg)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(dspe)、二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰-甘油-磷酸甘油(dspg)、二肉豆蔻酰-甘油(dmg)、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(dppe)、二棕榈酰-甘油(dpg)或神经酰胺。在一些实施方案中，所述peg是peg 2000。

133、在一些实施方案中，所述脂质-免疫细胞靶向基团缀合物以0.002-0.2摩尔百分比的范围存在于所述脂质共混物中。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质以40-60摩尔百分比的范围存在于所述脂质共混物中。

134、在一些实施方案中，所述固醇是胆固醇。在一些实施方案中，所述固醇以30-50摩尔百分比的范围存在于所述脂质共混物中。在一些实施方案中，所述中性磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dspe)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、鞘磷脂(sm)。

135、在一些实施方案中，所述中性磷脂以1-10摩尔百分比的范围存在于所述脂质共混物中。

136、在一些实施方案中，所述游离peg-脂质选自peg-修饰的磷脂酰乙醇胺、peg-修饰的磷脂酸、peg-修饰的神经酰胺、peg-修饰的二烷基胺、peg-修饰的二酰基甘油和peg-修饰的二烷基甘油。例如，peg脂质可以是peg-二油酰甘油(peg-dog)、peg-二肉豆蔻酰-甘油(peg-dmg)、peg-二棕榈酰-甘油(peg-dpg)、peg-二亚油酰-甘油-磷脂酰乙醇胺(peg-dlpe)、peg-二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(peg-dmpe)、peg-二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(peg-dppe)、peg-二硬脂酰甘油(peg-dsg)、peg-二酰基甘油(peg-dag，例如peg-dmg、peg-dpg和peg-dsg)、peg-神经酰胺、peg-二硬脂酰-甘油-磷酸甘油(peg-dspg)、peg-二油酰-甘油-磷酸乙醇胺(peg-dope)、2-[(聚乙二醇)-2000]-n,n-双十四烷基乙酰胺或peg-二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(peg-dspe)脂质。

137、在一些实施方案中，所述游离peg-脂质包含二酰基磷脂酰乙醇胺，其包含二棕榈酰(c16)链或二硬脂酰(c18)链。在一些实施方案中，所述游离peg-脂质以2-4摩尔百分比的范围存在于所述脂质共混物中。在一些实施方案中，所述游离peg-脂质包含与所述脂质-免疫细胞靶向基团缀合物中的脂质相同或不同的脂质。

138、在一些实施方案中，所述lnp具有在50-200nm范围内的平均直径。在一些实施方案中，所述lnp具有约100nm的平均直径。在一些实施方案中，所述lnp具有在从0.05至1范围内的多分散性指数。在一些实施方案中，所述lnp在ph 5下具有从约-10mv至约+30mv的ζ电位。

139、在一些实施方案中，所述核酸是dna或rna。在一些实施方案中，所述rna是mrna、trna、sirna或微rna。在一些实施方案中，所述mrna编码受体、生长因子、激素、细胞因子、抗体、抗原、酶或疫苗。在一些实施方案中，所述mrna编码能够调节所述免疫细胞中的免疫反应的多肽。在一些实施方案中，所述mrna编码能够对所述免疫细胞进行重编程的多肽。在一些实施方案中，所述mrna编码合成t细胞受体(syntcr)或嵌合抗原受体(car)。

140、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含抗体，并且所述抗体是fab或免疫球蛋白单可变结构域。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含选自以下的抗体片段：fab、f(ab')2、fab'-sh、fv和scfv片段。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含含有一个或多个链间二硫键的fab。在一些实施方案中，所述fab包含含有f174c和c233s取代的重链片段和含有s176c和c214s取代的轻链片段，根据kabat编号。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含在所述重链或轻链片段的c末端含有半胱氨酸的fab。

141、在一些实施方案中，所述fab进一步包含在所述fab的重链片段与所述c末端半胱氨酸之间的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，所述fab包含与抗体ch1结构域连接的重链可变结构域和与抗体轻链恒定结构域连接的轻链可变结构域。在一些实施方案中，所述ch1结构域和所述轻链恒定结构域通过一个或多个链间二硫键连接。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团进一步包含通过氨基酸接头与所述轻链恒定结构域的c末端连接的单链可变片段(scfv)。

142、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含免疫球蛋白单可变结构域。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白单可变结构域在c末端包含半胱氨酸。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白单可变结构域包含vhh结构域，并且进一步包含间隔子，其包含在所述vhh结构域与所述c末端半胱氨酸之间的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含两个或更多个vhh结构域。在一些实施方案中，所述两个或更多个vhh结构域通过氨基酸接头连接。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含与抗体ch1结构域连接的第一vhh结构域和与抗体轻链恒定结构域连接的第二vhh结构域。在一些实施方案中，所述抗体ch1结构域和所述抗体轻链恒定结构域通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含与抗体ch1结构域连接的vhh结构域。在一些实施方案中，所述抗体ch1结构域通过一个或多个二硫键与抗体轻链恒定结构域连接。在一些实施方案中，所述ch1结构域包含f174c和c233s取代，并且所述轻链恒定结构域包含s176c和c214s取代，根据kabat编号。

143、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含fab，其包含：

144、(a)含有seq id no:1的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:2或3的氨基酸序列的轻链片段；

145、(b)含有seq id no:6的氨基酸序列的重链片段和含有seq id no:7的氨基酸序列的轻链片段。

146、在一些实施方案中，不超过5％的非免疫细胞被所述lnp转染。在一些实施方案中，由所述lnp递送的所述核酸或由所述lnp递送的所述核酸所编码的多肽的半衰期比由参考lnp递送的核酸或由所述参考lnp递送的所述核酸所编码的多肽的半衰期长至少10％。在一些实施方案中，至少10％的免疫细胞被所述lnp转染。在一些实施方案中，由所述lnp递送的所述核酸的表达水平比由参考lnp递送的核酸的表达水平高至少10％。

147、在一些方面，提供了用于将核酸递送至受试者的免疫细胞的脂质纳米颗粒(lnp)。在一些实施方案中，所述lnp包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]。在一些实施方案中，所述lnp包含固醇或其他结构脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含中性磷脂。在一些实施方案中，所述lnp包含游离聚乙二醇(peg)脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含所述核酸。在一些实施方案中，所述免疫细胞是nk细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含结合cd56的抗体。

148、在一些方面，本文提供了用于将核酸递送至受试者的免疫细胞的脂质纳米颗粒(lnp)。在一些实施方案中，所述lnp包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]。在一些实施方案中，所述lnp包含固醇或其他结构脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含中性磷脂。在一些实施方案中，所述lnp包含游离聚乙二醇(peg)脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含所述核酸。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含结合cd7或cd8的抗体。在一些实施方案中，所述游离peg脂质是dmg-peg。

149、在一些方面，提供了用于将核酸递送至受试者的免疫细胞的脂质纳米颗粒(lnp)。在一些实施方案中，所述lnp包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]。在一些实施方案中，所述lnp包含固醇或其他结构脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含中性磷脂。在一些实施方案中，所述lnp包含游离聚乙二醇(peg)脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含所述核酸。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含抗体。在一些实施方案中，所述抗体是fab或免疫球蛋白单可变结构域。

150、在一些实施方案中，所述fab被工程化以敲除c末端的天然链间二硫键。在一些实施方案中，所述fab包含含有c233s取代的重链片段和含有c214s取代的轻链片段。在一些实施方案中，所述fab包含非天然链间二硫键。在一些实施方案中，所述fab在所述重链片段中包含f174c取代，并且在所述轻链片段中包含s176c取代。在一些实施方案中，所述抗体是免疫球蛋白单可变(isv)结构域，并且所述isv结构域是isv。在一些实施方案中，所述游离peg脂质包含具有至少2000道尔顿的分子量的peg。在一些实施方案中，所述peg具有约3000至5000道尔顿的分子量。在一些实施方案中，所述抗体是fab。在一些实施方案中，所述fab结合cd3，并且所述lnp中的所述游离peg脂质包含具有约2000道尔顿的分子量的peg。在一些实施方案中，所述fab是抗cd4抗体，并且所述lnp中的所述游离peg脂质包含具有约3000至3500道尔顿的分子量的peg。

151、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含两个或更多个vhh结构域。在一些实施方案中，所述两个或更多个vhh结构域通过氨基酸接头连接。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含与抗体ch1结构域连接的第一vhh结构域和与抗体轻链恒定结构域连接的第二vhh结构域。

152、在一些方面，提供了用于将核酸递送至受试者的免疫细胞的脂质纳米颗粒(lnp)。在一些实施方案中，所述lnp包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]。在一些实施方案中，所述lnp包含固醇或其他结构脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含中性磷脂。在一些实施方案中，所述lnp包含游离聚乙二醇(peg)脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含所述核酸。

153、在一些实施方案中，所述lnp结合cd3，并且还结合cd11a或cd18。在一些实施方案中，所述lnp包含两种缀合物。在一些实施方案中，第一缀合物包含结合cd3的抗体。在一些实施方案中，第二缀合物包含结合cd11a或cd18的抗体。在一些实施方案中，所述lnp包含一种缀合物。在一些实施方案中，所述缀合物包含结合cd3和cd11a两者的双特异性抗体。在一些实施方案中，所述缀合物包含结合cd3和cd18两者的双特异性抗体。在一些实施方案中，所述双特异性抗体是免疫球蛋白单可变结构域或fab-scfv。

154、在一些方面，提供了用于将核酸递送至受试者的免疫细胞的脂质纳米颗粒(lnp)。在一些实施方案中，所述lnp包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]。在一些实施方案中，所述lnp包含固醇或其他结构脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含中性磷脂。在一些实施方案中，所述lnp包含游离聚乙二醇(peg)脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含所述核酸。在一些实施方案中，所述lnp结合所述免疫细胞的cd7和cd8。

155、在一些实施方案中，所述lnp包含两种缀合物。在一些实施方案中，第一缀合物包含结合cd7的抗体，并且第二缀合物包含结合cd8的抗体。在一些实施方案中，所述lnp包含一种缀合物。在一些实施方案中，所述缀合物包含结合cd7和cd8的双特异性抗体。在一些实施方案中，所述双特异性抗体是免疫球蛋白单可变结构域或fab-scfv。

156、在一些方面，提供了用于将核酸递送至受试者的两种不同类型的免疫细胞的脂质纳米颗粒(lnp)。在一些实施方案中，所述lnp包含：可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]。在一些实施方案中，所述lnp包含固醇或其他结构脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含中性磷脂。在一些实施方案中，所述lnp包含游离聚乙二醇(peg)脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含所述核酸。在一些实施方案中，所述lnp与第一类型的免疫细胞的表面上的第一抗原结合，并且还与第二类型的免疫细胞的表面上的第二抗原结合。在一些实施方案中，所述两种不同类型的免疫细胞是cd4+t细胞和cd8+t细胞。在一些实施方案中，所述lnp包含两种缀合物。在一些实施方案中，第一缀合物包含与所述第一类型的免疫细胞的所述第一抗原结合的第一抗体，并且第二缀合物包含与所述第二类型的免疫细胞的所述第二抗原结合的第二抗体。在一些实施方案中，所述lnp包含一种缀合物。在一些实施方案中，所述缀合物包含双特异性抗体。在一些实施方案中，所述双特异性抗体与所述第一类型的免疫细胞上的所述第一抗原和所述第二类型的免疫细胞上的所述第二抗原两者结合。在一些实施方案中，所述双特异性抗体是免疫球蛋白单可变结构域或fab-scfv。

157、在一些方面，提供了用于将核酸递送至受试者的cd4+和cd8+t细胞两者的脂质纳米颗粒(lnp)。在一些实施方案中，所述lnp包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]。在一些实施方案中，所述lnp包含固醇或其他结构脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含中性磷脂。在一些实施方案中，所述lnp包含游离聚乙二醇(peg)脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含所述核酸。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含与cd3或cd7结合的单一抗体。

158、在一些方面，提供了用于将核酸递送至受试者的t细胞和nk细胞两者的脂质纳米颗粒(lnp)。在一些实施方案中，所述lnp包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]。在一些实施方案中，所述lnp包含固醇或其他结构脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含中性磷脂。在一些实施方案中，所述lnp包含游离聚乙二醇(peg)脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含所述核酸。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团与cd7、cd8或cd7和cd8两者结合。

159、在一些方面，提供了用于将核酸递送至受试者的t细胞和nk细胞两者的脂质纳米颗粒(lnp)。在一些实施方案中，所述lnp包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]。在一些实施方案中，所述lnp包含固醇或其他结构脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含中性磷脂。在一些实施方案中，所述lnp包含游离聚乙二醇(peg)脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含所述核酸。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团与(i)cd3和cd56两者；(ii)cd8和cd56两者；或(iii)cd7和cd56两者结合。

160、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团经由含有聚乙二醇(peg)的接头与所述脂质共混物中的脂质共价偶联。在一些实施方案中，经由含有peg的接头与所述免疫细胞靶向基团共价偶联的所述脂质是二硬脂酰甘油(dsg)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(dspe)、二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰-甘油-磷酸甘油(dspg)、二肉豆蔻酰-甘油(dmg)、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(dppe)、二棕榈酰-甘油(dpg)或神经酰胺。在一些实施方案中，所述脂质-免疫细胞靶向基团缀合物以0.002-0.2摩尔百分比的范围存在于所述脂质共混物中。在一些实施方案中，所述脂质共混物进一步包含结构脂质(例如，固醇)、中性磷脂和游离peg-脂质中的一种或多种。

161、在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质以40-60摩尔百分比的范围存在于所述脂质共混物中。

162、在一些实施方案中，所述固醇以30-50摩尔百分比的范围存在于所述脂质共混物中。在一些实施方案中，所述固醇是胆固醇。

163、在一些实施方案中，所述中性磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dspe)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)。在一些实施方案中，所述中性磷脂以1-10摩尔百分比的范围存在于所述脂质共混物中。

164、在一些实施方案中，所述游离peg-脂质选自peg-二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(peg-dspe)或peg-二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(peg-dmpe)、n-(甲基聚氧乙烯氧基羰基)-1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dppe-peg)、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯(peg-dmg)、1,2-二棕榈酰-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯(peg-dpg)、1,2-二油酰-rac-甘油,甲氧基聚乙二醇(dog-peg)、1,2-二硬脂酰-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯(peg-dsg)、n-棕榈酰-鞘氨醇-1-{琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)](peg-神经酰胺)和dspe-peg-半胱氨酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述游离peg-脂质包含二酰基磷脂酰乙醇胺，其包含二棕榈酰(c16)链或二硬脂酰(c18)链。在一些实施方案中，所述游离peg-脂质以1-2摩尔百分比的范围存在于所述脂质共混物中。在一些实施方案中，所述游离peg-脂质包含与所述脂质-免疫细胞靶向基团缀合物中的脂质相同或不同的脂质。

165、在一些实施方案中，所述lnp具有在50-200nm范围内的平均直径。在一些实施方案中，所述lnp具有约100nm的平均直径。在一些实施方案中，所述lnp具有在从0.05至1范围内的多分散性指数。在一些实施方案中，所述lnp在ph 5下具有从约-10mv至约+30mv的ζ电位。

166、在一些实施方案中，所述核酸是dna或rna。在一些实施方案中，所述rna是mrna。在一些实施方案中，所述mrna编码受体、生长因子、激素、细胞因子、抗体、抗原、酶或疫苗。在一些实施方案中，所述mrna编码能够调节所述免疫细胞中的免疫反应的多肽。在一些实施方案中，所述mrna编码能够对所述免疫细胞进行重编程的多肽。在一些实施方案中，所述mrna编码合成t细胞受体(syntcr)或嵌合抗原受体(car)。

167、在一些方面，提供了用于将核酸递送至受试者的免疫细胞的脂质纳米颗粒(lnp)。在一些实施方案中，所述lnp包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含含有以下结构的缀合物：[脂质]-[任选的接头]-[免疫细胞靶向基团]。在一些实施方案中，所述lnp包含固醇或其他结构脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含中性磷脂。在一些实施方案中，所述lnp包含游离聚乙二醇(peg)脂质。在一些实施方案中，所述lnp包含所述核酸。

168、在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含缺乏天然链间二硫键的fab。在一些实施方案中，所述fab被工程化以用非半胱氨酸氨基酸替换天然恒定轻链和天然恒定重链上的形成天然链间二硫键的一个或两个半胱氨酸，从而去除所述fab中的天然链间二硫键。

169、在一些方面，提供了将核酸的递送靶向至受试者的免疫细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使所述免疫细胞与本文提供的脂质纳米颗粒(lnp)接触。在一些实施方案中，所述方法用于靶向nk细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团与cd56结合。在一些实施方案中，所述方法用于同时靶向t细胞和nk细胞两者。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团与cd7、cd8或cd7和cd8两者结合。在一些实施方案中，所述方法用于同时靶向cd4+和cd8+t细胞两者。在一些实施方案中，所述免疫细胞靶向基团包含与cd3或cd7结合的多肽。

170、在一些方面，提供了在受试者的靶向免疫细胞中表达目的多肽的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使所述免疫细胞与本文提供的脂质纳米颗粒(lnp)接触。

171、在一些方面，提供了调节受试者的靶免疫细胞的细胞功能的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用本文提供的脂质纳米颗粒(lnp)。

172、在一些方面，提供了治疗、改善或预防有需要的受试者的障碍或疾病的症状的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用本文提供的脂质纳米颗粒(lnp)。

173、在一些方面，提供了与人cd8结合的免疫球蛋白单可变结构域(isvd)。在一些实施方案中，所述isvd包含三个互补决定结构域cdr1、cdr2和cdr3。在一些实施方案中，所述cdr1包含gstfsdyg(seq id no:100)。在一些实施方案中，所述cdr2包含idwngeht(seq idno:101)。在一些实施方案中，所述cdr3包含aadalpytvrkyny(seq id no:102)。在一些实施方案中，所述isvd是人源化的。在一些实施方案中，所述isvd包含seq id no:77。

174、在一些方面，提供了多肽，其包含gstfsdyg(seq id no:100)、idwngeht(seq idno:101)和aadalpytvrkyny(seq id no:102)。在另一个方面，提供了多肽，其包含本文提供的isvd。在一些实施方案中，所述多肽包含第二结合部分。在一些实施方案中，所述第二结合部分与cd8或另一种不同的靶标结合。在一些实施方案中，所述第二结合部分也是isvd。在一些实施方案中，所述多肽包含可检测标记。在一些实施方案中，所述多肽包含治疗剂。

175、在一些方面，提供了组合物，其包含本文提供的isvd或本文提供的多肽。

176、在一些方面，提供了药物组合物，其包含本文提供的isvd或本文提供的多肽以及药学上可接受的载体。

177、在一些方面，提供了治疗受试者的与cd8相关的疾病或障碍的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或障碍是癌症。

178、下面进一步详细地描述本发明的各个方面和实施方案。