FAP激活的血清延长半衰期治疗性缀合物的制作方法

背景技术：

1、多种治疗药物由于免疫相关毒性和其他剂量限制因素而缺乏实际效力，例如诱导固有免疫应答的药物；然而，这些药物对于全身性使用通常毒性太大。这是因为全身性固有免疫激活极大地限制了可施用的剂量。因此，最大耐受剂量在许多对象中未达到治疗水平。

技术实现思路

1、公开了治疗剂或显像剂的血清半衰期延长的药物缀合物，所述药物缀合物的接头包含可被成纤维细胞活化蛋白α(fapα)选择性切割以在切割位点释放治疗性部分的fapα底物。在通过fapα切割fap底物时，药物缀合物以其活性形式或以易于代谢(或以其他方式转化)为其活性形式的形式释放治疗性部分。还公开了包含所述药物缀合物的药物组合物，以及使用所述药物缀合物治疗以fapα上调为特征的病症的方法。

2、在一些方面中，治疗性缀合物被设计成在对象的肿瘤微环境中释放治疗有效量的药物(或其他治疗性部分)而不在所述对象中诱导急性毒性。出乎意料的是，即使在不存在细胞结合性(例如靶向)部分的情况下，本公开内容的缀合物能够局部递送治疗有效量的药物。代替靶向部分或其他细胞特异性归巢机制，本公开内容的缀合物包含半衰期延长部分和可切割接头，其使得药物(或其他治疗性部分)能够特异性地在肿瘤微环境中局部累积和释放。半衰期延长部分使得药物能够局部累积，而特异性是使用被fapα(在肿瘤微环境中高水平存在的酶)特异性切割的可切割接头实现的。因此，fapα对接头的特异性切割导致在肿瘤微环境中局部释放治疗有效量的药物，而没有通常与药物全身递送相关的毒性副作用。

3、本公开内容的一些方面提供了治疗性缀合物，其包含通过可被fapα切割的接头与半衰期延长部分连接的治疗性部分，其中所述治疗性缀合物在体内的循环血清半衰期为至少48小时，并且所述缀合物不包含以1×10-6m或更小的kd与细胞的细胞表面蛋白结合的细胞结合部分。

4、本公开内容的另一些方面提供了治疗性缀合物，其包含通过可被fapα切割的接头与半衰期延长部分连接的治疗性部分，其中所述治疗性缀合物在体内的循环血清半衰期为至少48小时，并且所述缀合物不包含与肿瘤微环境中的细胞的细胞表面蛋白结合的细胞结合部分。

5、本公开内容的另一些方面还提供了治疗性缀合物，其包含通过可被fapα切割的接头与半衰期延长部分连接的治疗性部分，其中所述治疗性缀合物的体内循环血清半衰期相对于未与半衰期延长部分连接的治疗性部分的循环血清半衰期延长至少2倍，并且所述缀合物不包含以1×10-6m或更小的kd与细胞的细胞表面蛋白结合的细胞结合部分。

6、本公开内容的另一些方面还提供了治疗性缀合物，其包含通过可被fapα切割的接头与半衰期延长部分连接的治疗性部分，其中所述治疗性缀合物的体内循环血清半衰期相对于未与半衰期延长部分连接的治疗性部分的循环血清半衰期延长至少2倍，并且所述缀合物不包含与肿瘤微环境中细胞的细胞表面蛋白结合的细胞结合部分。

7、不与半衰期延长部分连接的治疗性部分在本文中称为“游离”治疗性部分(即由fapα切割缀合物产生的治疗性部分的亲本分子)。

8、在一些实施方案中，半衰期延长部分包含血清蛋白。例如，血清蛋白可选自纤连蛋白、转铁蛋白和人血清白蛋白(human serum albumin，hsa)。

9、在一些实施方案中，半衰期延长部分包含与血清蛋白结合的分子。例如，与血清蛋白结合的分子可以是纤连蛋白、转铁蛋白或hsa。

10、在一些实施方案中，与血清蛋白结合的分子与血清蛋白结合的分子是抗体。例如，抗体可以是fab、f(ab)2、f(ab’)、f(ab’)2、f(ab’)3、fd、fv、二硫键连接的fv、dab或sdab(或)、cdr、scfv、(scfv)2、di-scfv、bi-scfv、tascfv(串联scfv)、(例如，双抗体、三抗体和四抗体)、t细胞接合物fc、scfv-fc、fcab、mab2、小模块化免疫药物(small modular immunopharmaceutical，smip)、genmab/unibody或duobody、v-nar结构域、ignar、minibody、iggach2、dvd-ig、probody、胞内抗体或多特异性抗体。

11、在一些实施方案中，与血清蛋白结合的分子是非抗体分子。例如，非抗体分子可以是亲和体(affibody)、多肽、affilin、抗运载蛋白、atrimer、avimer、darpin、fn3支架(例如，adnectin、centyrin)、fynomer、kunitz结构域、nanofitin、pronectin、三抗体、双环肽或cys-结。本公开内容涵盖了与血清蛋白结合的其他非抗体分子。

12、在一些实施方案中，半衰期延长部分包含stefin多肽(即，多肽)的hsa结合性重组改造变体。

13、在一些实施方案中，stefin多肽(即，多肽)的重组改造变体包含与seq id no：110至132中任一个的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列。

14、在一些实施方案中，半衰期延长部分包含抗体fc结构域，其任选地来自iga、igd、ige、igg或igm、或其亚类。

15、在一些实施方案中，半衰期延长部分包含生物相容性聚合物，其任选地选自聚(乙二醇)(poly(ethylene glycol)，peg)、羟乙基淀粉、xtentm聚合物和脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物。

16、在一些实施方案中，治疗性缀合物由下式之一表示：x-l1-srs-l2-tm，其中x是半衰期延长部分，l1是间隔基或键，srs是可被fapα切割的底物识别序列，l2是自牺牲接头(self-immolative linker)(例如，其在fapα切割之后被代谢或以其他方式清除以释放游离治疗性部分)或键，并且tm是治疗性部分。

17、在一些实施方案中，治疗性缀合物由下式之一表示：x-(l1-srs-l2-tm)n；x-l1-(srs-l2-tm)n；(x)m-(l1-srs-l2-tm)n；或(x)m-l1-(srs-l2-tm)n，其中x是半衰期延长部分，l1是间隔基或键，srs是可被fapα切割的底物识别序列，l2是自牺牲接头或键，tm是治疗性部分，m是1至6的整数，并且n是1至500，任选地1至100、1至10或1至5的整数。

18、在一些实施方案中，治疗性缀合物包含能够在体内与患者血清中循环的白蛋白或其他蛋白质化学缀合的部分。在一些实施方案中，治疗性缀合物由下式之一表示：y-l1-srs-l2-tm；y-(l1-srs-l2-tm)n；或y-l1-(srs-l2-tm)n，其中l1、srs、l2和tm如上所限定，并且y是能够与体内蛋白质发生化学交联的反应性基团。

19、在一些实施方案中，y是能够与蛋白质中存在的游离胺(例如赖氨酸的侧链)化学交联的反应性基团。非限制性实例包括包含nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)的接头，例如图6a中所示。

20、在一些实施方案中，y是能够与蛋白质中存在的游离巯基(例如半胱氨酸侧链)化学交联的反应性基团。非限制性实例包括包含马来酰亚胺的接头，例如图6b中所示。

21、在一些实施方案中，治疗性缀合物是：

22、

23、在一些实施方案中，可被fapα切割的接头是寡肽。在一些实施方案中，寡肽包含与治疗性部分共价连接(任选地通过键或自牺牲接头，和/或n端封闭基团进行)的c端脯氨酸。在一些实施方案中，该键是可被fap的蛋白水解活性切割的键，例如酰胺键。在一些实施方案中，可被fapα切割的接头有助于fap的p1’特异性(被fap识别为p1’残基)。

24、在一些实施方案中，该键可借助于fapα的蛋白水解活性而被切割，任选地其中该键是酰胺键。

25、在一些实施方案中，自牺牲接头包含杂环自牺牲部分，任选地为his-ala、对氨基苄氧基羰基(p-aminobenzyloxycarbonyl，pabc)或和2，4-双(羟基甲基)苯胺。

26、在一些实施方案中，可被fapα切割的接头包含选自以下的序列：d-ala-pro、ppgp(seq id no：136)、(d/e)-(r/k)-g-(e/d)-(t/s)-g-p(seq id no：137)、drgetgp(seq idno：138)和gpax(seq id no：139)，任选地d-ala-pro序列或d-ser序列。

27、在一些实施方案中，前述权利要求中任一项所述的治疗性缀合物，其中所述可被fapα切割的接头的底物识别序列(substrate recognition sequence，srs)由以下表示：

28、

29、

30、其中r2是氢或(c1-c6)烷基或氢，r3是氢或者支链或直链低级烷基，例如低级烷基(例如甲基)(如果(d)是氨基酸侧链，则r3不是氢)，r4是支链或直链低级烷氧基(例如羟基甲基)(例如，对于丝氨酸而言)或1-羟乙基(例如，对于苏氨酸而言)(在一个实施方案中，r4是羟基甲基)，x1是o或s，和/或者x2是o或s。

31、在一些实施方案中，可被fapα切割的接头的底物识别序列包含第三氨基酸位置，任选地位于(d)-ala的n端(或在该位置处且由r3形成的其他(d)-氨基酸)，并且任选地其中在第三氨基酸位置处的氨基酸是丝氨酸或苏氨酸。

32、在一些实施方案中，可被fapα切割的接头被fapα切割的kcat/km是被脯氨酰内肽酶(ec 3.4.21.26；prep)切割的kcat/km的至少10倍、至少100倍、1000倍、5000倍或10,000倍大。

33、在一些实施方案中，治疗性部分是细胞毒性剂，即当从治疗性缀合物中释放时，其引起靶细胞在治疗性缀合物之施用浓度下的细胞死亡。

34、在一些实施方案中，治疗性部分是细胞抑制剂，即当从治疗性缀合物中释放时，其引起靶细胞在治疗性缀合物之施用浓度下的有丝分裂阻滞或静止(quiescence)。

35、在一些实施方案中，治疗性部分是表观遗传剂，即当从治疗性缀合物中释放时，其引起靶细胞在治疗性缀合物之施用浓度下的表观遗传改变，这可以例如导致细胞分化(或去分化)为另一细胞表型。

36、在一些实施方案中，治疗性部分是化学治疗药物部分。例如，化学治疗药物部分可以是紫杉烷、基于铂的药剂或蛋白酶体抑制剂。本公开内容涵盖了另一些化学治疗药物部分。

37、在一些实施方案中，紫杉烷选自紫杉醇、多西他赛和卡巴他赛。在一些实施方案中，紫杉烷是紫杉醇。本公开内容涵盖了另一些紫杉烷。

38、在一些实施方案中，基于铂的药剂选自奥沙利铂(oxaliplatin)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奈达铂(nedaplatin)、吡铂(picoplatin)、菲铂(phenanthriplatin)、triplatin、螺铂(spiroplatin)、赛特铂(satraplatin)、异丙铂(iproplatin)和赛特铂(satraplatin)。在一些实施方案中，基于铂的药剂是奥沙利铂。本公开内容涵盖了另一些基于铂的药剂。

39、在一些实施方案中，蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米(bortezomib)、乳胞素、双硫仑(disulfiram)、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate)、马里佐米(marizomib)(盐孢酰胺a)、奥泼佐米(oprozomib)(onx-0912)、德兰佐米(delanzomib)(cep-18770)、环氧霉素和β-羟基β-甲基丁酸盐。本公开内容涵盖了另一些蛋白酶体抑制剂。

40、在一些实施方案中，治疗性部分在体内诱导固有免疫(v.适应性免疫)应答。在一些实施方案中，治疗性部分具有急性毒性。急性毒性描述了药物的不良作用，例如，由短时间(例如小于24小时)内的多次暴露或单次暴露引起的不良作用。急性毒性的不良作用通常发生在施用药物的14天内。在一些实施方案中，治疗性部分选自tlr激动剂、rig-i激动剂、idash抑制剂和sting激动剂。在一些实施方案中，治疗性部分是val-boropro(塔拉司他(talabostat))。

41、在一些实施方案中，治疗性部分包含针对受体的配体，例如当从治疗性缀合物释放时能够与细胞表面受体的胞外配体结合性结构域结合的配体。示例性受体配体包括生长抑素、胆囊收缩素-2(cholecystokinin-2，cck2)、叶酸、铃蟾肽、胃泌素释放肽、神经降压素、物质p、胰高血糖素样肽1、神经肽y以及这些配体的类似物。受体配体本身可具有药理学活性，或者可被用于递送缀合的药物部分、毒素或放射性同位素。

42、在一些实施方案中，治疗性部分由以下通式表示：

43、

44、其中rbm是受体结合部分，z是细胞毒性部分、细胞抑制部分或表观遗传部分或者包含放射性同位素的部分，并且p是0(z不存在)或1至8的整数。在一些实施方案中，p是1。

45、在一些实施方案中，治疗性部分由以下通式表示：

46、-rbm-l3-z

47、其中rbm是受体结合部分，z是细胞毒性部分、细胞抑制部分或表观遗传部分或者包含放射性同位素的部分，并且l3是键或者可切割或不可切割的接头。例如，l3可以是酸不稳定性接头或酶敏感性接头(例如包含组织蛋白酶切割位点)，使得z在部分-rbm-l3-z内化时通过依赖于受体结合部分rbm的细胞结合而在胞内释放。

48、在一些实施方案中，治疗性部分的循环血清半衰期是游离治疗性部分的循环血清半衰期的至少5、10、25、50、100或甚至1000倍长。治疗性部分的循环血清半衰期是药代动力学参数，其被定义为治疗性部分在血清中的浓度降低50％所花费的时间。

49、在一些实施方案中，治疗性部分的循环血清半衰期为至少10、25、50、100、200或300小时。

50、在一些实施方案中，在至少10、24、48、72、96或120小时的时期内，治疗性缀合物在靶标fapα表达组织中产生的游离治疗性部分的浓度是在同一时期内体循环中的游离治疗性部分的浓度的至少2、5、10、20、50、75或100倍。例如，这样的游离治疗性部分浓度差异在对象中可出现在的表达fapα的肿瘤与血清之间。

51、在一些实施方案中，当向患有fapα+肿瘤的对象施用时，该缀合物在至少10、24、48、72、96或120小时的时期内产生的游离治疗性部分的瘤内浓度处于或高于游离治疗性部分的抗肿瘤活性的ec50。

52、在一些实施方案中，当向患有fapα+肿瘤的对象施用时，治疗性缀合物的抗肿瘤活性治疗指数为至少2、5、10、25、50、100或500。治疗指数(therapeutic index，ti)是对药物相对安全性的定量量度。它是治疗剂的引起治疗效果的量与引起毒性的量的比较(ti也称为治疗比)。

53、在一些实施方案中，当向患有fapα+肿瘤的对象施用时，治疗性缀合物的抗肿瘤活性的治疗指数是游离治疗性部分的治疗指数的至少2、10、50、100、250、500、1000、5000或10,000倍大。

54、在一些实施方案中，当在等效剂量基础上进行比较时，相对于游离治疗性部分，更大百分比的游离治疗性部分位于表达fapα的靶组织中，任选地其中等效剂量的治疗性缀合物与游离治疗性部分相比，位于靶组织中的游离治疗性部分相对于其他组织(例如血液、肝或心脏)的比率是至少2、5、10、100或1000倍大。

55、在一些实施方案中，治疗性缀合物的最大耐受剂量是游离治疗性部分的最大耐受剂量的至少2、5、10、100或1000倍大。最大耐受剂量是指在特定时间段内不会引起不可接受的副作用或明显毒性的治疗性部分(例如药物)的最高剂量。可在临床试验中通过测试针对不同人群的增加剂量，直至发现具有可接受副作用的最高剂量来确定最大耐受剂量。

56、在一些实施方案中，治疗性缀合物的细胞渗透性比游离治疗性部分的细胞渗透性小至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.9％。

57、在一些实施方案中，治疗性缀合物的循环半衰期比游离治疗性部分的循环半衰期长至少25％、50％、75％、100％、150％、200％、500％、750％或1000％。

58、在一些实施方案中，治疗性缀合物相对于游离治疗性部分具有小于50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.9％或99.99％的针对肿瘤细胞的细胞毒性或细胞溶解活性。

59、在一些方面中，本文中还提供了组合物，其包含前述段落中任一段落的治疗性缀合物以及可药用赋形剂。

60、在一些方面中，本文中还提供了方法，其包括向对象施用前述段落中任一段落的治疗性缀合物或组合物，其中所述对象具有病变组织，任选地为癌。

61、在一些实施方案中，治疗性缀合物或组合物以相对于未经治疗的对照对象将该对象的肿瘤微环境中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，ldh)释放有效提高至少0.5倍或至少1倍的量施用。在一些实施方案中，治疗性缀合物或组合物以使对象肿瘤微环境中的ldh释放有效提高约0.5倍、约0.6倍、约0.7倍、约0.8倍、约0.9倍、约1倍、约1.5倍或约2倍的量施用。在一些实施方案中，治疗性缀合物或组合物以使对象肿瘤微环境中的ldh释放有效提高约0.5倍至约1.5倍、约0.5倍至约2倍或约1倍至约2倍的量施用。

62、在一些实施方案中，在施用治疗性缀合物或组合物后约2至3周时，病变组织(任选地为肿瘤)的体积降低至少50％、至少60％或至少70％。在一些实施方案中，病变组织(任选地为肿瘤)的体积降低约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％或约80％。在一些实施方案中，病变组织(任选地为肿瘤)的体积降低约50％至约60％，或约50％至约70％，或约50％至约80％。

63、一些方面提供了前述段落中任一段落所述的治疗性缀合物或组合物，其用于治疗病变组织(任选地为癌)的方法中。

64、另一些方面提供了前述段落中任一段落所述的治疗性缀合物在制备用于治疗病变组织(任选地为癌)的药物中的用途。

65、本公开内容的一些方面提供了治疗性缀合物，其包含通过可被fapα切割的接头与半衰期延长部分连接的化学治疗性治疗部分，其中所述化学治疗部分在体内诱导固有免疫应答和/或具有急性毒性，所述治疗性缀合物在体内的循环血清半衰期为至少48小时，并且所述治疗性缀合物不包含以1×10-8m或更小的kd与细胞的细胞表面蛋白结合的细胞结合部分。在一些实施方案中，化学治疗部分选自tlr激动剂、rig-i激动剂、idash抑制剂和sting激动剂。在一些实施方案中，化学治疗部分是val-boropro(塔拉司他)。在一些实施方案中，半衰期延长部分是抗体fc结构域。在一些实施方案中，半衰期延长部分是hsa。在一些实施方案中，半衰期延长部分是stefin多肽(即，多肽)的hsa结合性重组改造变体，其任选地包含与seq id no：110至132中任一个的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列。