用于治疗1型强直性肌营养不良的靶向RNA的组合物和方法与流程

本公开文本涉及分子生物学、基因疗法、以及用于修饰rna分子的表达和活性的组合物和方法。相关申请的交叉引用本技术要求2020年12月1日提交的u.s.s.n.63/119,977、2020年12月23日提交的u.s.s.n.63/130,092和2021年11月12日提交的u.s.s.n.63/278,746的权益和优先权，将其各自的内容通过引用以其整体特此并入。通过引用序列表并入将2021年12月1日创建的大小为1.81mb的名为“locn_007_001wo_seqlist_st25”的文本文件的内容通过引用以其整体特此并入。

背景技术：

1、对于提供有效的靶向rna的系统(其提供有效的基因疗法)，本领域存在长期但未满足的需求。特别地，本公开文本提供了在被称为1型强直性肌营养不良(dm1)的微卫星重复扩增(mre)疾病中用于特异性靶向和破坏从重复性段表达的毒性rna的组合物和方法。dm1是由dmpk基因的3’非翻译区中的ctg mre引起的多系统、常染色体显性遗传性障碍。对于所有mre疾病，可用的治疗方法解决了dm1的症状，但是不能针对其潜在病因。通过基因组编辑消除dna中的mre可以消除引起dm1的致病性mre，但是在重复附近产生的dna断裂激活修复机制，所述修复机制的活性与扩增生长相关，并且可能导致重复的进一步突变和/或可能无法区分致病性重复与在转录中具有调节作用的正常重复。已经评价了其他潜在的dm1治疗剂，如反义寡核苷酸、shrna和小分子，但是这些治疗剂具有与频繁的重复给药相关的问题、对受影响组织的渗透性差、缺乏与重复的直接接合、毒性和脱靶效应。在克服这些问题的努力中，基于cas9的靶向rna的系统(rcas9)已经被证明在小鼠的成年发作的强直性肌营养不良中能够特异性靶向毒性cug重复rna并且提供与dm1相关的疾病表型的长期修复。然而，需要描述和开发其他非cas9 rna结合系统，以提供用于治疗dm1的有效、持续和可扩展的基因疗法。这种靶向cug mre的非cas9 rna结合系统对于制造规模是重要的，因为系统组分足够小以依赖于单一载体。这些非rcas9系统对于避免由免疫原性cas9组分引发的任何有害的免疫应答也是重要的。因此，本文提供了能够消除毒性cug重复的新的和改进的靶向rna的非rcas9基因疗法组合物和系统，以及使用所述组合物和系统治疗dm1的方法。

技术实现思路

1、本公开文本提供了用于治疗1型强直性肌营养不良(dm1)的组合物和方法。本文公开的组合物和方法经由破坏或阻断降低的dmpk以及随后在选择性剪接和肌强直中的校正导致cugexp(cug重复扩增)rna的剂量依赖性降低。

2、本文公开了一种组合物，所述组合物包含编码非指导的rna结合蛋白的核酸，所述非指导的rna结合蛋白包含能够结合毒性靶cug重复rna序列的puf或pumby蛋白，其中所述rna结合蛋白不能切割所述毒性靶cug重复rna序列。

3、本文公开了一种组合物，所述组合物包含编码非指导的rna结合融合蛋白的核酸序列，所述非指导的rna结合融合蛋白包含a)能够结合毒性靶cug重复rna序列的puf或pumby蛋白和b)能够切割所述毒性靶rna序列的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶是zc3h12a锌指核酸内切酶的核酸酶结构域。

4、本公开文本提供了一种组合物，所述组合物包含编码rna结合多肽的核酸序列，所述rna结合多肽包含能够结合毒性靶cug重复rna序列的非指导的rna结合多肽或指导的rna结合多肽。

5、在一些实施方案中，所述rna结合多肽是融合蛋白。

6、在一些实施方案中，所述融合蛋白包含所述rna结合多肽，所述rna结合多肽与能够切割所述毒性cug重复rna序列的核酸内切酶融合。

7、在一些实施方案中，所述非指导的rna结合多肽是puf或pumby蛋白。

8、在一些实施方案中，所述指导的rna结合多肽是cas13d蛋白。在一些实施方案中，所述cas13d蛋白是无催化活性的。在一些实施方案中，所述cas13d蛋白包含seq id no:583或586-589中任一个所示的氨基酸序列。

9、在一些实施方案中，所述核酸内切酶是zc3h12a锌指核酸内切酶的核酸酶结构域。

10、在一些实施方案中，所述puf rna结合蛋白包含seq id no:444-451、461、570或638-649中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述puf rna结合蛋白包含seqid no:444中所示的氨基酸序列。

11、在一些实施方案中，所述毒性靶cug rna重复序列包含seq id no:453-456中所示的核酸序列中的任一种。

12、在一些实施方案中，所述毒性靶cug rna重复序列包含seq id no:454中所示的核酸序列。

13、在一些实施方案中，所述靶向cug的puf蛋白由seq id no:452中所示的核酸序列编码。在一些实施方案中，所述puf或pumby蛋白是人puf或pumby蛋白。

14、在一些实施方案中，所述puf或pumby蛋白通过接头序列与所述zc3h12a核酸内切酶连接。

15、在一些实施方案中，所述接头包含seq id no:411中所示的氨基酸序列。

16、在一些实施方案中，所述融合蛋白包含选自核定位序列(nls)和核输出序列(nes)的一个或多个信号序列。

17、在一些实施方案中，所述zc3h12a锌指核酸酶包含seq id no:358或seq id no:359中所示的氨基酸序列。

18、在一些实施方案中，所述融合蛋白包含seq id no:559-567中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述融合蛋白由包含seq id no:460、seq id no:516或seq idno:517的核酸序列编码。

19、在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸分子包含启动子。在一些实施方案中，所述启动子是tcag启动子、efs/ubb启动子、结蛋白启动子、ck8e启动子或efs启动子。

20、本公开文本提供了一种包含本公开文本的任何实施方案的组合物的载体。

21、在一些实施方案中，所述载体选自：腺相关病毒(aav)、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、纳米颗粒、胶束、脂质体、阳离子脂质体/dna复合物(lipoplex)、聚合物囊泡、多聚复合物(polyplex)和树状聚合物。在一些实施方案中，是aav载体。本公开文本提供了本公开文本的任何实施方案的aav载体，其中所述aav载体包含：第一aav itr序列；第一启动子序列；编码至少一个cug重复rna结合多肽的多核苷酸序列；和第二aav itr序列。

22、在一些实施方案中，所述cug重复rna结合多肽包含puf或pumby蛋白。在一些实施方案中，编码所述puf或pumby序列的所述多核苷酸序列包含seq id no:452中所示的核酸序列。

23、在一些实施方案中，所述cug重复rna结合多肽包含cas13d蛋白。在一些实施方案中，编码所述cas13d序列的所述多核苷酸序列包含seq id no:601、612或615-618中所示的核酸序列。

24、在一些实施方案中，所述第一启动子序列包含seq id no:568、569、608、609、634-637中所示的核酸序列。

25、在一些实施方案中，所述第一aav itr序列包含seq id no:599或600中所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二aav itr序列包含seq id no:599或600中所示的核酸序列。

26、在一些实施方案中，所述载体进一步包含第二启动子序列。在一些实施方案中，所述第二启动子控制指导rna(grna)的表达，其中所述grna包含(i)dr序列和(ii)间隔子序列。在一些实施方案中，所述第二启动子包含seq id no:519中所示的核酸序列。

27、在一些实施方案中，所述载体进一步包含聚a序列。在一些实施方案中，所述载体包含至少一个接头序列。在一些实施方案中，所述载体包含至少一个核定位序列。

28、在一些实施方案中，所述载体由seq id no:574-582、584-585、590-597中任一个所示的核酸编码。

29、本公开文本提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：a)本公开文本的任何实施方案的aav病毒载体；和b)至少一种药学上可接受的赋形剂和/或添加剂。

30、本公开文本提供了一种aav病毒载体，所述aav病毒载体包含：a)本公开文本的任何实施方案的aav载体；和b)aav衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述aav衣壳蛋白是aav1衣壳蛋白、aav2衣壳蛋白、aav4衣壳蛋白、aav5衣壳蛋白、aav6衣壳蛋白、aav7衣壳蛋白、aav8衣壳蛋白、aav9衣壳蛋白、aav10衣壳蛋白、aav11衣壳蛋白、aav12衣壳蛋白、aav13衣壳蛋白、aavphp.b衣壳蛋白、aavrh74衣壳蛋白或aavrh.10衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述aav衣壳蛋白是aav9衣壳蛋白。

31、一种细胞，所述细胞包含本公开文本的实施方案中任一项所述的载体。

32、本公开文本提供了一种治疗哺乳动物的1型强直性肌营养不良(dm1)的方法，所述方法包括将根据本公开文本的任何实施方案的组合物或aav载体施用至所述哺乳动物的组织中的毒性靶cug微卫星重复扩增(mre)rna序列，从而降低所述毒性靶rna的表达水平。

33、在一些实施方案中，将所述组合物或aav载体以如下方式施用于所述受试者：静脉内、鞘内、大脑内、心室内、鼻内、气管内、耳内、眼内或眼周、口服、直肠、透粘膜、吸入、经皮、肠胃外、皮下、皮内、肌内、脑池内、神经内、胸膜内、外用、淋巴内、脑池内或神经内。

34、在一些实施方案中，将所述组合物或aav载体静脉内施用于所述受试者。

35、在一些实施方案中，所述毒性靶rna的降低的表达水平因此改善了所述哺乳动物中dm1的症状。在一些实施方案中，与未经处理的毒性靶cug rna的表达水平的降低相比，所述毒性靶rna的表达水平降低。在一些实施方案中，降低的水平在1倍与20倍之间。

36、在一些实施方案中，所述puf rna结合蛋白包含seq id no:444-451、461、570或638-649中任一个所示的氨基酸序列。

37、在一些实施方案中，所述puf rna结合蛋白包含seq id no:444中所示的氨基酸序列。

38、在一些实施方案中，所述毒性靶cug rna重复序列包含seq id no:453-456中的任一个。

39、在一些实施方案中，所述毒性靶cug rna重复序列包含seq id no:454。

40、在一些实施方案中，所述靶向cug的puf蛋白由seq id no:452中所示的核酸序列编码。

41、在一些实施方案中，所述puf或pumby蛋白是人puf或pumby蛋白。

42、在一些实施方案中，所述puf或pumby蛋白通过接头序列与所述zc3h12a连接。

43、在一些实施方案中，所述接头包含seq id no:411中所示的氨基酸序列。

44、在一些实施方案中，所述融合蛋白包含选自核定位序列(nls)和核输出序列(nes)的一个或多个信号序列。

45、在一些实施方案中，所述zc3h12a锌指核酸酶包含seq id no:358或seq id no:359中所示的氨基酸序列。

46、在一些实施方案中，所述融合蛋白包含seq id no:559-567中任一个所示的氨基酸序列。

47、在一些实施方案中，所述融合蛋白由包含seq id no:460、seq id no:516或seqid no:517的核酸序列编码。

48、在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸分子包含启动子。

49、在一些实施方案中，所述启动子是tcag启动子。

50、本公开文本提供了一种载体，所述载体包含前述组合物中的任一种。

51、在一些实施方案中，所述载体选自：腺相关病毒(aav)、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、纳米颗粒、胶束、脂质体、阳离子脂质体/dna复合物、聚合物囊泡、多聚复合物和树状聚合物。在一些实施方案中，所述载体是aav载体。在一些实施方案中，所述aav载体是aav9或aavrh74。

52、本公开文本提供了一种包含本公开文本的载体的细胞。

53、本文公开了一种治疗哺乳动物的1型强直性肌营养不良(dm1)的方法，所述方法包括将组合物施用至所述哺乳动物的组织中的毒性靶cug微卫星重复扩增(mre)rna序列，其中所述组合物包含编码非指导的rna结合融合蛋白的核酸序列，所述非指导的rna结合融合蛋白包含a)能够结合毒性靶cug rna重复序列的puf rna结合蛋白，和b)能够切割所述毒性靶cug rna重复序列的核酸内切酶，从而降低所述毒性靶rna的表达水平。

54、在一些实施方案中，所述puf rna结合蛋白包含seq id no:444-451、461、570或638-649中的任一个。

55、在一些实施方案中，所述puf rna结合蛋白包含seq id no:444。

56、在一些实施方案中，所述毒性靶cug rna重复序列包含seq id no:453-456中的任一个。

57、在一些实施方案中，所述毒性靶cug rna重复序列包含seq id no:453。

58、在一些实施方案中，通过静脉内施用将所述组合物施用至所述哺乳动物的组织。

59、在一些实施方案中，所述毒性靶rna的降低的表达水平因此改善了所述哺乳动物中dm1的症状。

60、在一些实施方案中，与未经处理的毒性靶cug rna的表达水平的降低相比，所述毒性靶rna的表达水平降低。

61、在一些实施方案中，降低的水平在1倍与20倍之间。

62、在一些实施方案中，所述核酸内切酶是zc3h12a锌指核酸内切酶。

63、在一些实施方案中，所述zc3h12a锌指核酸酶包含seq id no:358或seq id no:359中所示的氨基酸序列。

64、在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列包含启动子。

65、在一些实施方案中，所述启动子是tcag启动子。

66、在一些实施方案中，所述启动子是肌肉特异性启动子。

67、在一些实施方案中，所述肌肉特异性启动子是结蛋白启动子(全长或截短的)。

68、在一些实施方案中，所述融合蛋白包含seq id no:559-567中任一个所示的氨基酸序列。

69、在一些实施方案中，所述融合蛋白由包含seq id no:460、seq id no:516或seqid no:517的核酸序列编码。

70、一种组合物，所述组合物包含编码非天然存在的或工程化的规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)相关(cas)系统的核酸序列，所述系统包含：(a)至少一种rna指导的rna酶cas蛋白；和b)能够与所述至少一种cas蛋白中的一种形成复合物的至少一种同源crispr-cas系统指导rna(grna)，其中所述grna包含(i)dr序列和(ii)间隔子序列，其中所述间隔子序列与所述靶cug mre分子杂交，并且其中所述间隔子序列包含选自以下的间隔子序列：agcagcagcagcagcagcagcagcag(seq id no:457)、gcagcagcagcagcagcagcagcagc(seq id no:458)和cagcagcagcagcagcagcagcagca(seq id no:459)或其部分，其中所述crispr-cas系统能够结合并切割所述靶cug mre。

71、一种组合物，所述组合物包含编码非天然存在的或工程化的规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)相关(cas)系统的核酸序列，所述系统包含：(a)至少一种rna指导的rna酶cas蛋白；和b)能够与所述至少一种cas蛋白中的一种形成复合物的至少一种同源crispr-cas系统指导rna(grna)，其中所述grna包含(i)dr序列和(ii)间隔子序列，其中所述间隔子序列与所述靶cug mre分子杂交，并且其中所述间隔子序列包含选自以下的间隔子序列：agcagcagcagcagcagcagcagcag(seq id no:457)、gcagcagcagcagcagcagcagcagc(seq id no:458)和cagcagcagcagcagcagcagcagca(seq id no:459)或其部分，其中所述crispr-cas系统能够结合并切割所述靶cug mre，其中所述crispr-cas系统是无催化活性的，并且其中所述crispr-cas能够结合但不切割所述靶cug mre。

72、在一些实施方案中，所述cas蛋白是cas13a、cas13b、cas13c或cas13d。在一些实施方案中，所述cas蛋白是cas13d。

73、在一些实施方案中，所述rna指导的rna酶cas蛋白或所述非指导的rna结合多肽是第一rna结合多肽，所述第一rna结合多肽与第二rna结合多肽融合。在一个实施方案中，所述第二rna结合多肽能够以其与rna缔合的方式结合rna。在一些实施方案中，所述第二rna结合多肽能够以其切割rna的方式与rna缔合。在一个实施方案中，所述第二rna结合多肽是zc3h12a锌指核酸内切酶的核酸酶结构域。

74、在一些实施方案中，编码所述cas或dcas系统的核酸包含启动子。在一些实施方案中，所述启动子是efs启动子。在一些实施方案中，所述启动子是肌肉特异性启动子。在一些实施方案中，所述肌肉特异性启动子是结蛋白启动子(全长或截短的)。

75、本文公开了一种载体，所述载体包含前述组合物中的任一种。

76、在另一个实施方案中，所述载体选自：腺相关病毒(aav)、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、纳米颗粒、胶束、脂质体、阳离子脂质体/dna复合物、聚合物囊泡、多聚复合物和树状聚合物。

77、在另一个实施方案中，所述载体是aav载体。

78、在另一个实施方案中，所述aav载体是aav9或aavrh74。

79、本文公开了包含所述载体的细胞。