一种具有美白功效的植物提取物组合物及其应用的制作方法

1.本技术涉及护肤品技术领域，尤其涉及一种具有美白功效的植物提取物组合物及其应用。


背景技术：

2.亚洲女性一直追求肌肤白若凝脂，爱美之心人皆有之。考古学家认为，大约自5万年前的旧石器时代，人类便已开始使用化妆品。随着人类生活水平不断提高，生存环境却日渐恶劣，复杂的外部因素容易导致肌肤产生过敏、红斑等各类问题。与此同时，现代人的饮食习惯的变化、精神压力的增加，都容易导致机体紊乱，进一步反映到皮肤上便容易产生红肿、肤色暗沉等肌肤状态问题。
3.人们通常所说的黑色素主要是指优黑素和褐黑素。现代美容医学表明，黑色素是通过一系列氧化反应形成的：在酪氨酸酶、多巴色素互变异构酶、5,6-二羟基吲哚羧酸氧化酶这三种酶不同阶段的参与下，黑色素细胞中的酪氨酸经过一系列反应生成5,6-二羟基吲哚或5,6-二羟基吲哚羧酸，形成优黑素；同时，在半胱氨酸或谷胱甘肽的催化下，上述反应过程中的中间产物多巴醌被转换为半胱氨酰多巴或谷氨酰胺多巴，最后生成褐黑素。进而，黑色素细胞组织将黑色素转移到表皮基底层细胞中，随着细胞的新陈代谢而被带到角质层中，最后随角质化细胞脱落。
4.皮肤美白的机制有许多种，例如：防御紫外线辐射，抑制黑素细胞中酪氨酸酶、多巴互变酶、5,6-二羟基吲哚羧酸氧化酶活性，提高机体超氧化歧化酶活性并清除多余超氧自由基，抑制黑素转移，促进角质细胞更新等。但是，目前在产品中采用的美白化妆品添加剂较为单一，且美白机制以抑制酪氨酸酶活性为主，例如，曲酸曾以其优异的酪氨酸酶合成抑制能力用于美白产品中，从而有效抑制黑色素的生成，然而，曲酸属于3类致癌物，长期使用对人体具有较强的致癌风险。
5.随着生活水平的提高，人们对美白化妆品的要求也越来越高。除了美白肌肤外，还有许多方面有待加强，如延缓皮肤衰老、减少皱纹、光滑肌肤，这些可通过提高机体超氧化歧化酶活性和清除多余超氧自由基来实现；促黑素细胞激素(α-msh)是由黑色素细胞产生的，其与黑皮素-1(mcr-1)受体相结合，会通过一系列反应最终激活酪氨酸酶的合成表达，从而促进黑色素合成增加，若能抑制α-msh产生可从酪氨酸酶合成的源头阻止黑素生成，最终达到美白效果。而机制单一的美白产品总体效果较差，因此，为了研发出功效更突出的美白化妆品，需要多种机制的综合运用来更好的达到美白肌肤的目的。
6.近年来，人们尝试采用来源天然、成分安全性好的植物提取物代替现有的化学美白剂，但其存在单一植物提取物美白效果差、多种植物提取物组合时易出现拮抗作用和难以采用多种去黑机制共同作用的问题。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题是提供一种具有美白功效的植物提取物组合物，该组合
物能够通过多种机制抑制黑色素的生成，达到美白肌肤的效果。
8.一方面，本技术提供了一种具有美白功效的植物提取物组合物，所述组合物包括质量比为(0.5～2):(0.5～2)的艾叶提取物和玫瑰花提取物，或，
9.所述组合物包括艾叶提取物、玫瑰花提取物和牡丹皮提取物，所述艾叶提取物、玫瑰花提取物和牡丹皮提取物的质量比为(0.5～2):(0.5～2)：(0.5～2)；或，
10.所述组合物包括艾叶提取物、玫瑰花提取物和猫须草提取物，所述艾叶提取物、玫瑰花提取物和猫须草提取物的质量比为(0.5～2):(0.5～2)：(0.5～2)；或，
11.所述组合物包括艾叶提取物、玫瑰花提取物、牡丹皮提取物和猫须草提取物，所述艾叶提取物、玫瑰花提取物、牡丹皮提取物和猫须草提取物的质量比为(0.5～2):(0.5～2)：(0.5～2)：(0.5～2)。
12.进一步地，所述组合物由质量比为1:1的艾叶提取物和玫瑰花提取物，或，
13.所述组合物由质量比为1:1:1的艾叶提取物、玫瑰花提取物和牡丹皮提取物组成；或，
14.所述组合物由质量比为1:1:1的艾叶提取物、玫瑰花提取物和猫须草提取物组成；或，
15.所述组合物由质量比为1:1:1:1的艾叶提取物、玫瑰花提取物、牡丹皮提取物和猫须草提取物组成。
16.进一步地，所述艾叶提取物、玫瑰花提取物、牡丹皮提取物和/或猫须草提取物采用如下方法制备：
17.步骤一、向植物的干物质中加入质量浓度10％～90％的乙醇水溶液，用量比例为植物干物质重量(g)：乙醇水溶液体积(ml)＝1：(8～15)，于温度70～100℃下回流提取2-8h，提取1～3次；
18.步骤二、向提取液中加入基于提取液质量10％～50％的活性炭脱色，过滤获得滤液；
19.步骤三、浓缩滤液，加1,3-丁二醇稀释储存。
20.进一步地，所述步骤一中，采用质量浓度75％的乙醇水溶液，用量比例为植物干物质重量(g)：乙醇水溶液体积(ml)＝1：10，于温度90℃下回流提取4h，提取1次。
21.进一步地，所述步骤二中，于温度75～90℃下脱色。
22.进一步地，所述步骤三中，滤液浓缩10～50倍，1,3-丁二醇的用量为滤液浓缩后质量的0.5～3倍。
23.进一步地，还包括将制备获得的艾叶提取物、玫瑰花提取物、牡丹皮提取物和/或猫须草提取物按质量比进行混合的步骤。
24.另一方面，本技术还提供了上述植物提取物组合物在制备黑色素细胞抑制剂和/或黑色素小体抑制剂中的应用。
25.进一步地，所述植物提取物组合物的质量浓度为0.0190％～0.1570％。
26.优选的，由艾叶提取物和玫瑰花提取物组成的组合物，在0.1563％浓度下黑素含量显著下降，在0.1563％、0.0781％和0.0391％三个浓度下，黑素小体含量显著下降；
27.由艾叶提取物、玫瑰花提取物和牡丹皮提取物组成的组合物，在0.1563％、0.0781％和0.0391％三个浓度下，黑素小体含量显著下降；
28.由艾叶提取物、玫瑰花提取物和猫须草提取物组成的组合物，在0.0391％浓度下，黑素含量显著下降，在0.0781％和0.0391％两个浓度下，黑素小体含量显著下降；
29.由艾叶提取物、玫瑰花提取物、牡丹皮提取物和猫须草提取物组成的组合物，在0.1563％浓度下，黑素含量显著下降，在0.1563％、0.0781％和0.0391％三个浓度下，黑素小体含量显著下降。
30.另一方面，本技术还提供了上述植物提取物组合物在制备美白去黑化妆品中的应用。
31.优选的，所述美白去黑化妆品的剂型包括但不限于霜剂、乳液、化妆水、凝胶剂、面膜、涂擦剂和洗剂。
32.其中，艾叶是温性，辛、苦，归脾、肝、肾经。艾可全草入药，艾文化由来已久，早在《诗经》时代，艾草就已经是很重要的民生植物。艾叶晒干捣碎得“艾绒”，制艾条供艾灸用，又可作“印泥”的原料。此外全草作杀虫的农药或薰烟作房间消毒、杀虫药。嫩芽及幼苗作菜蔬。艾晒干粉碎成艾蒿粉，是畜禽优质饲料添加剂，还可以做天然植物染料使用。
33.玫瑰花提取物在化妆品里起到滋润养颜，护肤美容的作用，可去除皮肤上的黑斑，令皮肤嫩白自然，防皱纹也有帮助。玫瑰中的糖具有强大的保湿和锁水功能，对于干燥的肌肤，能够起到现状的保湿和锁水效果；玫瑰中含有的硒、锌、铜等微量元素更能够清除自由基，让肌肤恢复水嫩与光泽。玫瑰中富含多种维生素、葡萄糖、果糖、柠檬酸、苹果酸等有益于人体健康的营养物质，还富含三萜类化合物，具有延缓皮肤衰老的作用，可有效去除皱纹。
34.牡丹皮提取物对皮肤具有抗衰老、紧致皮肤和帮助祛痘的功效作用。牡丹根提取物含有抗氧化成分，可以有效延缓肌肤老化。此外，牡丹根提取物含有的胶原纤维凝胶具有收缩和抗菌作用，可以帮助紧致皮肤，去除皮肤的细纹皱纹，还能帮助皮肤祛痘。
35.猫须草，清凉消炎，可入药，主要用于治疗急慢性肾炎、膀胱炎、尿路结石和风湿性关节炎。硫酸钙、未知有机酸的钙盐和钾盐，挥发油、皂甙、戊糖，己糖、葡萄糖醛酸等。叶含内消旋肌醇。有较强抗菌、消炎作用，同时有助于皮肤身体排毒排汗。可清洁，清凉皮肤等，用作综合调理成分。保护生殖系统、提高视力、提高呼吸道抗病能力、美容养颜和滋润肌肤。
36.其中，艾叶中的总黄酮类成分能抑制黑素细胞中酪氨酸酶的活性，能够抑制黑色素从黑素细胞中向角质层转移，同时可以清除晚期糖基化产物从而有抗氧化效果，因此对于皮肤美白有促进的作用。牡丹中的总皂苷能够有效抑制α-msh引起的酪氨酸酶活性增加和黑素合成增多，且能抑制α-msh引起的酪氨酸酶蛋白表达，同时具有清除糖基化产物从而达到抗氧化效果，因此能够有效促进皮肤美白。玫瑰中含有总黄酮、总皂苷成分可以抑制酪氨酸酶活性，促进表皮角质细胞更新，加速黑素代谢，而且可以提高角质细胞含水量。猫须草中内含黄酮类化合物，具有抗氧化、消炎作用，通过调控络氨酸酶代谢通路基因而抑制黑色素的产生。
37.通过上述植物提取物的复配而成的组合物，能从多种途径出发减少皮肤黑色素，且对皮肤具有多种作用，从而直接或间接的达到美白肌肤的目的。然而，不同植物来源的黄酮类物质和皂苷类物质之间也存在较大差异，在活性表现上也不尽相同，在混合后具体如何表现也难以得知，而本技术在以艾叶提取物和玫瑰花提取物作为固定美白组合物的基础上，继续添加牡丹皮提取物和/或猫须草提取物，并获得了能够在抑制黑素细胞和抑制黑素
小体活性上显示出协同作用的植物提取物组合物及其浓度。
38.本技术提供的植物提取物组合物具有如下有益效果：
39.1、本技术提供的植物提取物具有多途径抑制黑色素合成的作用，可以通过调控络氨酸酶代谢通路的多个步骤，达到优异的美白效果；
40.2、本技术植物提取物的复配而成的组合物，各成分间发生协同作用，能从多种途径出发减少皮肤黑色素，且对皮肤具有多种作用，因此，该组合物相比某一单独成分能更有效的发挥美白的功效。
附图说明
41.此处所说明的附图用来提供对本技术的进一步理解，构成本技术的一部分，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。在附图中：
42.图1是美白组合物1细胞毒性测试结果图；
43.图2是美白组合物2细胞毒性测试结果图；
44.图3是美白组合物3细胞毒性测试结果图；
45.图4是美白组合物4细胞毒性测试结果图；
46.图5是美白组合物处理后细胞内黑素含量图；
47.图6是美白组合物处理后细胞内黑素小体含量图。
具体实施方式
48.为了更清楚的阐释本技术的整体构思，下面结合说明书附图以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
49.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
50.如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
51.其中：升降油浴锅zkyy-5l由郑州科华仪器设备有限公司提供；co2培养箱150i由赛默飞世尔公司提供；超净工作台sw-cj-1f由苏州安泰空气技术有限公司提供；倒置显微镜ckx41由奥林巴斯株式会社提供；酶标仪epoch由美国伯腾仪器有限公司提供；荧光定量pcr仪cfx-96由伯乐生命医学产品(上海)有限公司提供；旋转蒸发仪b-300base由优莱博技术(北京)有限公司提供。
52.实施例1
53.本实施例提供了一种植物提取物组合物，该植物提取物组合物采用质量比为1:1:1:1的艾叶提取液、玫瑰花提取液、牡丹根皮提取液和猫须草提取液进行混合复配而成，记为美白组合物1。
54.其中，艾叶提取液、玫瑰花提取液、牡丹根皮提取液和猫须草提取液均采用以下方法制备获得：
55.量取植物干物质100g，向植物的干物质中加入质量浓度为75％的乙醇水溶液，用
量比例为植物干物质重量(g)：乙醇水溶液体积(ml)＝1：10，于温度90℃下回流提取4h，提取1次，向提取液中加入基于提取液质量20％的活性炭于80℃下加热脱色，过滤获得滤液，将滤液浓缩10倍，加滤液浓缩后质量的2倍的1,3-丁二醇稀释储存，获得植物提取液。
56.实施例2
57.采用与实施例1相同的制备方法制备艾叶提取液、玫瑰花提取液和牡丹根皮提取液，并将上述三个提取液按质量比为1:1:1的比例进行混合复配，记为美白组合物2。
58.实施例3
59.采用与实施例1相同的制备方法制备艾叶提取液、玫瑰花提取液和猫须草提取液，并将上述三个提取液按质量比为1:1:1的比例进行混合复配，记为美白组合物3。
60.实施例4
61.采用与实施例1相同的制备方法制备艾叶提取液和玫瑰花提取液，并将上述两个提取液按质量比为1:1的比例进行混合复配，记为美白组合物4。
62.应用实施例1细胞毒性测试
63.按实施例1～实施例4配制美白组合物1～4作为样品，进行细胞毒性测试，具体测试方法如下：
64.1)细胞接种：按9e3个/孔(黑素细胞接种密度为：1e4个/孔)的接种密度接种细胞至96孔板，培养箱(37℃、5％co2)中孵育过夜。
65.2)试验分组：试验设置调零组、溶剂对照组、阳性对照组与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个重复孔。
66.4)给药：待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％(黑素细胞铺板率为：30％～40％)时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μl培养液；阳性对照组每孔加入200μl含10％dmso的培养液；样品组每孔加入200μl含有相应浓度美白组合物的培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μl细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃、5％co2)中培养24h(黑素细胞培养72h)。
67.5)检测：细胞孵育培养24h(72h)后，弃掉上清，加入mtt工作液(0.5mg/ml)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μl dmso，在490nm处读取od值。
68.6)细胞相对活力计算，获得细胞相对活力。
69.细胞相对活力测试结果如图1～4所示，其中由图1结果可得，美白组合物1基于黑色素细胞，在小于0.0781％的浓度范围内未表现出细胞毒性，由图2可得，美白组合组2基于黑色素细胞，在小于0.1563％的浓度范围内未表现出细胞毒性，由图3可得，美白组合物3基于黑色素细胞，在小于0.0781％的浓度范围内未表现出细胞毒性，由图4可得，美白组合物4基于黑色素细胞，在小于0.1563％的浓度范围内未表现出细胞毒性。
70.应用实施例2黑色素含量检测
71.黑色素含量检测方法如下：
72.1)接种：按3
×
105个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，在37℃、5％co2条件下培养箱中孵育过夜；
73.2)配液：按照具体测试方案(如实施例1～实施例4)配置受试物工作液，美白组合物浓度梯度设置为工作液总质量的0.1563％、0.0781％、0.0391％和0.0195％；
74.3)给药：待6孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每孔给药量为
2ml，每组设3个复孔，在37℃、5％co2条件下培养箱中孵育72h，72h后弃去培养液，pbs洗涤1次；
75.4)细胞消化：用0.25％胰酶消化黑素细胞(700μl/孔)，37℃，1～2min，显微镜下观察，细胞80％回缩为球状且未脱离贴附面时，立即加入700μl/孔含10％fbs的dmem终止反应，吹打均匀后收集细胞到1.5ml ep管中，10000r/min离心10min，弃上清液；
76.5)在通风橱中按照2:5:5比例配置蒸馏水、无水乙醇和乙醚的混合液，混合均匀后按照1.2ml/管加入ep管中，摇晃，室温放置30min后10000r/min离心10min；
77.6)弃上清液，加入1ml含10％(体积分数)dmso的1mol/l naoh水溶液，采用封口膜封口；
78.7)分别将样品与不同浓度的黑色素标准品溶液放置于80℃水浴中加热30min；
79.8)加热结束后，待温度平衡至室温后，向96孔板依次加入上述溶液200μl/孔，每支ep管设置2个复孔，选择405nm波长在酶标仪上测吸光度值；
80.9)将不同浓度的标准品溶液测定的od值为横坐标，黑素含量为纵坐标，制作标准曲线，获取回归方程，将样品od值代入公式中，计算样品组黑色素含量。
81.试验结果如表1所示，并根据表1数据制图得图5。
82.表1美白组合物处理后细胞内黑素含量表
[0083][0084]
注：由应用实施例1细胞毒性实验结果，不再对美白组合物含有毒性的浓度进行测试，在表中以
“‑”
代替；“*”表示在0.01水平下的显著性，表示差异性显著；标注“**”表示在0.05水平下的显著性，表示差异性极显著；阳性对照与空白对照取平均浓度进行测量。
[0085]
安全浓度内取三个浓度进一步进行梯度测试，试验结果如图5所示，与空白对照组相比，以曲酸为阳性对照，对照组黑素含量显著降低，说明本次实验有效。与空白对照组相比，美白组合物1相比美白组合物2～3整体黑素含量下降显著，且下降程度与浓度不成正比关系，其中样品美白组合物1在0.0391％和0.0195％两个浓度下，黑素含量显著下降；样品美白组合物3在0.0391％浓度下，黑素含量显著下降，样品美白组合物4在0.1563％浓度下，黑素含量显著下降。
[0086]
应用实施例3黑素小体合成抑制检测
[0087]
1)按照具体测试方案(如实施例1～实施例4)配置受试物工作液，美白组合物浓度梯度设置为工作液总质量的0.1563％、0.0781％和0.0391％；
[0088]
2)接种：按照7*104/孔接种密度接种细胞于6孔板中，添加3ml黑素培养基，37℃，5％co2培养箱继续培养24h；
[0089]
3)药物处理：配制更换含待测活性物工作浓度的3ml表皮培养基，37℃，5％co2培养箱继续培养24h；
[0090]
4)黑素小体处理：清洗细胞孔板，加入新鲜角质形成细胞培养液。重悬前期收集的黑素小体于100μl角质形成培养基中，加入15μl重悬液于2ml培养孔中。37℃，5％co2培养箱继续培养72h；
[0091]
5)收样，免疫荧光：对黑素小体进行免疫组化检测，并用激光共聚焦进行拍照观察，采集图片；使用image-pro plus图像处理软件进行数据分析，采用graph pad prism program软件作图，各组间采用t-test统计分析，*p＜0.05表示差异显著，**p＜0.01表示差异极显。
[0092]
试验结果如表2所示，并根据表2数据制图得图6。
[0093]
表2美白组合物处理后细胞内黑素小体含量表
[0094][0095]
注：由应用实施例1细胞毒性实验结果，不再对美白组合物含有毒性的浓度进行测试，在表中以
“‑”
代替；“*”表示在0.01水平下的显著性，表示差异性显著；标注“**”表示在0.05水平下的显著性，表示差异性极显著；空白对照取平均浓度进行测量。
[0096]
安全浓度内取三个浓度进一步进行梯度测试，试验结果如图6所示，与空白对照组相比，样品美白组合物1在0.0781％和0.0391％两个浓度下，黑素小体含量显著下降；样品美白组合物2在0.1563％、0.0781％和0.0391％三个浓度下，黑素小体含量显著下降；样品美白组合物3在0.0781％和0.0391％两个浓度下，黑素小体含量显著下降；样品美白组合物4在0.1563％、0.0781％和0.0391％三个浓度下，黑素小体含量显著下降。
[0097]
结合应用实施例1可得，样品美白组合物1在0.0391％浓度下，黑素小体与黑素含量均显著降低，可预测其能够起到优异的美白作用。
[0098]
本发明的具有美白功效的植物提取物组合物，各成分之间发生协同作用，能从多种途径出发减少皮肤黑色素，且对皮肤具有多种作用，能更有效的发挥美白的功效。
[0099]
以上所述仅为本技术的实施例而已，并不用于限制本技术。对于本领域技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的权利要求范围之内。