重组非洲猪瘟病毒抗原“鸡尾酒”疫苗及应用

1.本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种重组非洲猪瘟病毒抗原“鸡尾酒”疫苗及应用。


背景技术：

2.非洲猪瘟（african swine fever, asf）是由非洲猪瘟病毒（african swine fever virus, asfv）引起猪发病的急性烈性传染病，死亡率可达100%，目前无商品化疫苗可供使用。世界动物卫生组织（world organization for animal health, oie）将其列为将其列为必须通报的动物疫病，我国将其列为重点防控的一类动物传染病。自从asfv被发现以来，对疫苗的研究从来没有停止，但由于病毒基因组庞大，编码的蛋白众多且结构复杂，免疫与感染机理不清，至今没有安全有效的疫苗可供使用。asf疫苗的研究表明：（1）asf灭活疫苗不能提供免疫保护；（2）asf减毒活疫苗能保护同源或异源毒株感染，但会引起不良反应，而且存在毒力回复的风险。（3）asf亚单位疫苗能诱导产生中和抗体，但免疫保护效果并不理想，需设计多种保护抗原参与的全新多组分亚单位疫苗，以提高亚单位疫苗的免疫保护水平。
3.asfv基因组大小为170-194 kb，含有150-167个开放阅读框，编码50多种结构蛋白和100多种非结构蛋白。研究已证实病毒蛋白p30、p54、p72和cd2v能诱导产生中和抗体，其中抗p54和p30抗体可抑制病毒的吸附和内化，p72抗体也能抑制asfv的吸附pam细胞，重组cd2v能诱导免疫保护，pep153r作为一种多功能蛋白诱导特异性血清学反应、提供部分免疫保护。总之，针对asfv复杂的免疫保护机理，设计多组分抗原组成的亚单位疫苗，拓宽抗原谱和中和抗体水平显得尤为重要，是解决目前亚单位疫苗免疫保护效果不理想的重要手段之一。


技术实现要素：

4.为了开发安全有效的asf疫苗，本发明通过基因融合和串联表达的方式得到3种重组asfv抗原融合蛋白，即p30-modified p54、p72的epitope-pe248r的n段和cd2v的n段-pep153r的c段。将这3种重组蛋白按一定比例与佐剂配伍成“鸡尾酒”疫苗，免疫猪后诱导产生asfv中和抗体和细胞免疫应答，提示该疫苗是一种有开发应用前景的asf亚单位疫苗。
5.本发明采用的具体方案为：本发明的目的一是提供一种重组非洲猪瘟病毒抗原“鸡尾酒”疫苗，所述“鸡尾酒”疫苗以三种重组asfv抗原融合蛋白pm、ppe和cpe中的两种或两种以上作为活性成分；所述pm由asfv p30和修饰的p54通过linker融合而成，通式为 p30-(linker)
3-mp54；所述ppe由asfv p72的4个已验证抗原表位和pe248r的n段氨基酸序列通过linker融合而成，通式为p72抗原表位1-(linker)
3-p72抗原表位2-(linker)
3-p72抗原表位3-(linker)
3-p72抗原表位4-(linker)
3-pe248r的n段氨基酸序列；
所述cpe由cd2v n段氨基酸序列和pep153r c段氨基酸序列通过linker融合而成，通式为：cd2v的n 段氨基酸序列-(linker)
2-pep153r的c段氨基酸序列；其中，所述连接肽linker序列为ggggs。
6.作为对上述方案的进一步优化，所述pm的氨基酸序列如seq id no：4所示；所述ppe的氨基酸序列如seq id no：5所示；所述cpe的氨基酸序列如seq id no：6所示。
7.作为对上述方案的进一步优化，编码所述pm的核苷酸序列如seq id no：1所示；编码所述ppe的核苷酸序列如seq id no：2所示；编码所述cpe的核苷酸序列如seq id no：3所示。
8.作为对上述方案的进一步优化，所述“鸡尾酒”疫苗是以三种重组asfv抗原融合蛋白pm、ppe和cpe作为活性成分。更进一步地，所述“鸡尾酒”疫苗还包括佐剂，是将pm、ppe和cpe混合后与佐剂配伍后制得。优选地，三种所述重组asfv抗原融合蛋白pm、ppe和cpe按照1：1：2的质量比混合，得抗原混合物，然后将所述抗原混合物与等质量的isa 206佐剂乳化成“鸡尾酒”疫苗。
9.本发明的目的二是提供所述“鸡尾酒”疫苗在制备治疗/预防非洲猪瘟病毒感染的药物方面的应用。
10.由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：1、本发明所述的3种重组asfv抗原融合蛋白均可以在原核表达系统（大肠杆菌）中诱导表达，表达量高、易于纯化；2、由3种重组asfv抗原融合蛋白制成的“鸡尾酒”疫苗共含有６种asfv蛋白，抗原谱更为全面；3、利用本发明制备的asf“鸡尾酒”疫苗在接种猪体内诱导产生高水平的特异性抗体和细胞免疫。并经中和试验证实，所述“鸡尾酒”疫苗诱导产生的抗体在体外对asfv感染宿主细胞具有显著的抑制作用，提示具有良好的免疫保护功效。
附图说明
11.图1为本发明实施列中3种重组asfv抗原融合蛋白纯化后的sds-page结果。泳道1：蛋白分子量标准（marker）；泳道2：纯化的pm；泳道3：纯化的ppe；泳道4：纯化的cpe；图2为本发明实施列中利用鼠抗6
×
his单克隆抗体(a)和asfv阳性血清(b)对3种重组蛋白的western blotting鉴定结果。泳道1：纯化的pm；泳道2：纯化的ppe；泳道3：纯化的cpe；图3本发明实施列中首次免疫猪后不同时间点血清中p30 (a)、p54 (b)、p72 (c)、pe248r (d)、cd2v (e)和pep153r (f)特异性igg消长动态；图4为本发明实施列中首次免疫猪后35天，外周血单核淋巴细胞经灭活asfv刺激的淋巴细胞增殖水平；图5为本发明实施列中首次免疫猪后35天，外周血单核淋巴细胞经灭活asfv刺激后，分泌ifn-γ、il-2和tnf-α的cd8
+ t细胞占t淋巴细胞总数的百分比；图6为本发明实施列中首次免疫猪后42天，免疫猪血清与asfv孵育后接种猪肺泡巨噬细胞并利用p30单克隆抗体检测asfv的间接免疫荧光图；图7为本发明实施列中asfv与首次免疫后42天的猪血清孵育后培养的asfv基因组
拷贝数（a）及病毒中和率（b）。
具体实施方式
12.本发明的发明人在研究中发现，通过基因融合和串联表达的方式得到3种重组asfv抗原融合蛋白，即p30-modified p54、p72 epitope-pe248r的n段氨基酸序列和cd2v的n段氨基酸序列-pep153r的c段氨基酸序列。将这3种重组蛋白按一定比例混合后，与佐剂配伍成“鸡尾酒”疫苗，免疫猪后诱导产生中和抗体和细胞免疫应答，提示该疫苗形式是一种有应用前景的asf亚单位疫苗。3种重组asfv抗原融合蛋白如下：(1) 重组asfv抗原融合蛋白pm，所述重组蛋白由asfv p30和修饰的p54（mp54）通过连接肽(linker)融合而成，所述重组蛋白的通式为 p30-(linker)
3-mp54；(2) 重组asfv抗原融合蛋白ppe，所述重组蛋白由asfv p72的4个抗原表位和pe248r的n段氨基酸序列通过连接肽(linker)融合而成，所述重组蛋白的通式为p72抗原表位1-(linker)
3-p72抗原表位2-(linker)
3-p72抗原表位3-(linker)
3-p72抗原表位4-(linker)
3-pe248r的n段氨基酸序列；(3) 重组asfv抗原融合蛋白cpe，所述重组蛋白由cd2v n段氨基酸序列和pep153r的c段氨基酸序列通过连接肽(linker)融合而成，所述重组蛋白的通式为：cd2v的n段氨基酸序列-(linker)
2-pep153r的c段氨基酸序列；其中，所述连接肽序列为ggggs。
13.在本发明的实施方案中，所述的重组asfv抗原融合蛋白pm、ppe和cpe的氨基酸序列分别为seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6。
14.在本发明的实施方案中，所述重组asfv抗原融合蛋白pm、ppe和cpe编码的核苷酸序列分别为seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3。
15.上述重组蛋白的表达、纯化及鉴定方法，所述方法包括：(1) 载体构建：构建重组表达载体，所述表达载体由骨架质粒可修饰地连接编码上述重组蛋白的核苷酸序列形成；优选地，所述骨架质粒为pet-30a(+)；(2) 转化及阳性克隆的筛选：将步骤(1)中的重组表达载体转化至宿主菌感受态细胞，经诱导和sds-page鉴定得到能够表达目的蛋白的重组菌；(3) 诱导表达：将步骤(2)中的阳性重组菌转接生长到一定浓度时加入iptg诱导表达重组蛋白；(4) 蛋白纯化：收集(3)中的菌体，经超声破碎、包涵体溶解、ni-nta亲和层析纯化和透析复性得到目的蛋白；(5)重组蛋白的鉴定：采用sds-page和western blotting 对(4)中获得的重组蛋白鉴定。
16.本发明还提供上述重组蛋白用于制备重组asfv抗原“鸡尾酒”疫苗的方法，所述方法包括：蛋白浓度测定：采用bradford法测定纯化的重组蛋白的浓度；抗原的配制：将重组蛋白稀释到相同浓度并按一定比例进行混合；疫苗的乳化：将(2)中的抗原混合物与isa 206佐剂（50g:50g）乳化成疫苗。
17.为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但发明的保护内容不局限于以下实施例。
page（80 v 30 min，120 v 1 h 10 min），然后电转印于硝酸纤维素膜（pvdf）上，并用含5%脱脂奶粉的1
×
pbst溶液在室温条件下封闭2 h。一抗孵育：将封闭好的pvdf膜分别与鼠抗6
×
his单克隆抗体（1：5000倍稀释）和asfv阳性血清（1:300倍稀释）在4度条件下孵育过夜，并用1
×
pbst洗涤6次。二抗孵育：将过氧化物酶标记的羊抗鼠igg（1:5000倍稀释）和羊抗猪igg（1:5000倍稀释）分别加入对应的pvdf膜中，室温孵育1 h，并用1
×
pbst洗涤6次。显色：配制ecl发光液并均匀铺至pvdf膜上，采用多功能成像仪进行图像采集。
23.结果及分析：利用western blotting鉴定重组蛋白结果如图2所示，3种重组蛋白均能被his单克隆抗体识别，且与asfv阳性血清反应性良好，具有潜在的应用价值。
24.2.4疫苗制备及免疫方案采用bradford法对3种重组蛋白进行浓度测定，分别量取600
µ
g pm、600
µ
g ppe和1200
ꢀµ
g cpe，混合后将总体积稀释到4ml，然后与isa 206佐剂混合（50g:50g）乳化，制成水/油/水剂型疫苗。将7头6周龄雌性小猪随机分为2组（实验组4头，对照组3头），将制备好的疫苗以肌肉注射的方式，按照下列表中的免疫分组以及免疫剂量，初次免疫1次，21天后加强免疫1次。
25.结果及分析：根据不同浓度的蛋白标准品与bradford溶液反应在592 nm处的od值所建立的标准曲线为y=0.00049964x+0.28323，r2=0.993，线性良好，重组蛋白pm、ppe和cpe与等量bradford反应的吸光度分别为0.622、0.731和0.53，3种重组蛋白的浓度分别为677.1 μg/ml、896.2 μg/ml和494.1 μg/ml。
26.2.5免疫效果评价2.5.1 抗原特异性igg检测所有实验猪免疫前及免疫后14、21、35和42天采血，4000 rpm离心10 min分离血清。用实验室建立的p30、p54、p72、pe248r、cd2v和pep153r间接elisa检测免疫血清特异性抗体。检测程序：分别用纯化重组p30（0.125
ꢀµ
g/ml）、p54（0.5
ꢀµ
g/ml）、p72（1
ꢀµ
g/ml）、pe248r（1
ꢀµ
g/ml）、cd2v（2
ꢀµ
g/ml）和pep153r（2
ꢀµ
g/ml）包被96孔酶标板，每孔100 μl，4 ℃过夜；将包被液弃掉，加入封闭液（5%脱脂奶粉，200 μl/孔），37 ℃孵育2 h；弃掉封闭液，加入1∶100稀释血清样本，100
ꢀµ
l/孔，37 ℃孵育1小时；弃掉液体，用1
×
pbst洗板5次；加入1∶10000 稀释的hrp标记的羊抗猪igg，100
ꢀµ
l/孔，37 ℃孵育1小时；弃掉液体，用1
×
pbst洗板5次；然后加入tmb底物，100 μl/孔，室温避光反应10 min；加入终止液(2 m h2so4)，每孔100 μl，测定450 nm处的od值。
27.如图3所示，与pbs组相比，3种重组蛋白混合物制成的“鸡尾酒”疫苗免疫后7天，开始产生针对p30、p54、p72、pe248r、cd2v和pep153r的特异性igg抗体，抗体滴度在加强免疫后明显升高。在所有被检抗体中，抗p30和抗p54特异性igg抗体水平最高，抗p72和抗pe248r特异性igg水平次之，抗cd2v和抗pep153r特异性igg最低，但均显著高于pbs对照（p 《 0.001）。结果说明,该“鸡尾酒”疫苗具有良好的免疫原性，免疫猪后能诱导较高水平的特异性igg。
28.2.5.2 淋巴细胞增殖实验
min，并在微量振荡器上混匀；每孔加入1 ml 5 % bsa封闭60 min；弃掉封闭液，向每孔加入0.5 ml 1:2000稀释的鼠抗p30单克隆抗体，37 ℃孵育60 min；弃掉孔中的液体并用pbs洗3遍，在避光条件下每孔加入0.5 ml 1:500稀释的tritc标记的羊抗鼠igg，37 ℃孵育60 min；弃掉孔中的液体并用pbs洗3遍，每孔加入两滴dapi并补加0.5 ml pbs，室温静置5 min, 每孔用1 ml pbs清洗3次；最后每孔加入0.5 ml的pbs，用leica dm16000b倒置荧光显微镜观察并拍照。
33.如图6所示，与阴性对照相比，“鸡尾酒”疫苗免疫血清与asfv孵育后明显降低tritc荧光强度和阳性细胞的数量，而pbs免疫组的tritc荧光强度和阳性细胞数量均无明显改变，结果提示，“鸡尾酒”疫苗诱导产生的抗体能够抑制asfv感染肺泡巨噬细胞细胞。
34.2.5.5 病毒中和实验将免疫前和首次免疫42天后的血清按1:5稀释并用0.22μm的针头滤器过滤除菌，置于56 ℃灭活30 min，将血清与等体积asfv混合（按moi=0.01计)，37 ℃孵育过夜。取血清/病毒混合物接种单层猪肺泡巨噬细胞（pam）（24孔板），每孔200
ꢀµ
l，37 ℃ 5 % co2吸附1 h。弃掉血清/病毒混合液，pbs清洗3次，每孔加入500
ꢀµ
l含5 % fbs的rpmi-1640，37 ℃ 5 % co2培养48 h，收集细胞，采用dna基因组提取试剂盒分别提取各实验组asfv基因组，qpcr试剂盒扩增asfv基因，计算样品中asfv基因组拷贝数，间接计算病毒中和率：病毒中和率（%）=100-100*免疫血清孵育后asfv拷贝数/免疫前血清孵育后asfv拷贝数。
35.如图7a所示，与免疫前血清(对照组)和pbs组相比，“鸡尾酒”疫苗免疫组血清显著降低pam细胞内asfv的拷贝数（p 《 0.001），对asfv具有显著的抑制作用(p 《 0.001)。以免疫前血清为对照，计算出疫苗组免疫血清对asfv感染的抑制率为81.6%（图7b）。说明本发明制备的“鸡尾酒”疫苗免疫猪后，诱导产生保护性中和抗体，其在体外阻断asfv感染pam细胞，是一种非常有应用前景的疫苗。
36.需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。