番泻苷A在制备抗铜绿假单胞菌感染的制剂中的用途

番泻苷a在制备抗铜绿假单胞菌感染的制剂中的用途
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及番泻苷a在制备抗铜绿假单胞菌感染的制剂中的用途。


背景技术：

2.铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)是一种革兰氏阴性机会致病菌，常见于呼吸和重症医学科，可引起免疫功能低下或烧伤患者的急性和慢性感染。铜绿假单胞菌在急性感染过程中，合成细胞外多糖等粘附物质进行粘附，分泌蛋白酶破坏宿主细胞结构进入体内，并产生绿脓素等毒力因子防御免疫系统。而在慢性感染过程中，铜绿假单胞菌通常会形成生物被膜，通常与细菌运动有关，并且生物被膜的形成会导致细菌耐药性的增加。
3.群体感应(quorum sensing，qs)是指细菌之间借助信号分子进行通讯的过程，使大量的细菌随着种群密度和物种组成的变化而改变生物学行为，包括与铜绿假单胞菌感染宿主相关的诸多毒性因子的表达，包括生物被膜形成、胞外水解酶和胞外多糖的产生、运动性等。传统的抗菌药物通常是通过破坏细菌蛋白质、核酸、细胞壁等细菌细胞组分的合成，干扰微生物重要生命过程而致使微生物死亡，达到治疗感染目的，与传统抗菌药物相比，qs抑制剂(qs inhibitors，qsis)是具有qs淬灭作用的一类物质。不同的qsis能在不影响细菌正常生长的前提下，通过抑制qs信号分子的生物合成、降解信号分子、与信号分子竞争结合受体位点、或结合受体蛋白使其失活等方式来干扰细菌qs过程，从而调节细菌众多基因表达，降低细菌致病性相关基因及其产物表达，从而降低或消除其对宿主的感染或毒性。同时，该类抑制剂由于不对细菌的生存产生压力，因此很少或不产生耐药性。因此，以细菌的qs系统为靶点筛选药物不失为一种可行的抗生素替代疗法。
4.番泻苷a(sennoside a)是一种蒽醌糖甙类物质，众多研究表明其具有清热行滞、通便利水、排毒养颜、促进肠胃蠕动致泻的作用，是临床上最常用的泻下药之一。但是目前尚未见其作为细菌qsis的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服世界范围内现有抗生素对病原微生物耐药性逐渐增强、耐药病原微生物感染治疗效果低下、死亡率逐渐升高的现状和抗生素筛选技术的缺陷和抗生素作用不足，提供番泻苷a在制备抗铜绿假单胞菌感染的制剂中的用途。
6.进一步的，所述制剂通过下调铜绿假单胞菌群体感应基因及其调控的毒性基因，抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成、毒力因子产生及抑制铜绿假单胞菌运动，从而达到抗感染的目的。
7.进一步的，所述群体感应调控基因为lasi、lasr、rhli、rhlr、pqsa和pqsr。
8.更进一步的，所述感染宿主相关毒性因素包括蛋白水解酶、弹性蛋白酶和绿脓菌素。
9.更进一步的，所述运动为丛动、泳动和蹭行。
lasr)，pao1(pkd-rhli)，pao1(pkd-rhlr)，pao1(pkd-pqsa)，pao1(pkd-pqsr)作为实验菌株，所述实验菌株的构建参见《duan，k.；dammel，c.；stein，j.；rabin，h.；mg，s.modulation of pseudomonas aeruginosa gene expression by host microflora through interspecies communication.mol.microbiol.2003，50，1477-1491.》；根据荧光素酶luxceabe的发光(cps)强弱可指示对应基因的表达。
28.实验方法：挑取上述融合发光报道子的菌株单克隆接种于液体lb培养基中，于37℃℃、200rpm条件下培养12h后以1％接种量转接到新的液体lb培养基中继续培养3h，然后转接到96孔板中，孔内含有不同质量浓度分别为0，50，100μg/ml的番泻苷a的液体lb培养基，用酶标仪连续24h检测荧光素酶的化学发光，反映为对应基因的表达情况。
29.实验结果：如图2所示，与对照组相比，质量浓度分别为50μg/ml和100μg/ml的番泻苷a以浓度依赖形式降低了发光报道子的发光强度，表明该浓度的番泻苷a下调了pao1中qs系统相关基因lasi、lasr、rhli、rhlr、pqsa、pqsr的表达。
30.实施例3：番泻苷a对pao1生物被膜形成的影响
31.实验方法：挑取pao1单克隆到5ml液体lb培养基中，37℃、200rpm培养12h，将菌液的od
600
值调为0.5后接种到含有3ml液体lb培养基的12孔板中，其中番泻苷a浓度分别为0，50，100μg/ml，37℃静置培养24h后，移除培养液，用pbs缓冲液轻轻冲洗孔内壁以去除贴壁细胞，加入0.1％的结晶紫溶液对生物被膜进行染色，室温放置10min，移除结晶紫溶液，并洗去残余染液，观察生物被膜形成情况，干燥后用1ml 95％乙醇洗下生物被膜，并检测其od
595
值。
32.实验结果：如图3所示，与对照组相比，质量浓度分别为50μg/ml和100μg/ml的番泻苷a以浓度依赖形式显著减少了pao1生物被膜的形成。与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
33.实施例4：番泻苷a对pao1运动(丛动、泳动和蹭行)的影响
34.实验方法：37℃、200rpm条件下培养pao1，以此为基础，分别配制含有0μg/ml，50μg/ml，100μg/ml番泻苷a的pao1培养液。分别取2μl上述含番泻苷a的培养液点在丛动(1％蛋白胨、3％nacl、0.5％琼脂和0.5％葡萄糖，ph7.2)和泳动(1％蛋白胨、3％nacl和0.3％琼脂，ph7.2)培养基上；蹭行运动的检测中，首先用无菌的200μl的枪头刺透平板中固体lb培养基，然后在刺透的地方底部点2μl菌液。所有运动检测平板均于37℃正置培养24h，观察pao1的运动情况。
35.实验结果：如图4所示，与对照相比，番泻苷a对pao1的丛动、泳动和蹭行均有一定程度的抑制，呈浓度依赖型抑制作用。与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
36.实施例5：番泻苷a对pao1毒力因子产生的影响
37.实验方法：
38.(1)蛋白水解酶
39.将活化的pao1菌株分别转接到分别含有0μg/ml，50μg/ml，100μg/ml番泻苷a的液体lb培养基中，于37℃、200rpm培养12h后，8000rpm离心5min获得培养物上清，分别取200μl上清液加入到含有800μl的新配制的2％牛奶中，37℃水浴30min后检测溶液的od
440
值。
40.(2)弹性蛋白酶
41.将活化的pao1菌株分别转接到含有0μg/ml，50μg/ml，100μg/ml番泻苷a的液体lb
培养基中，于37℃、200rpm培养12h后，8000rpm离心5min获得培养物上清，待用。
42.称取5mg弹性蛋白酶-刚果红加入到800μl缓冲液(100mm tris-hcl，1mm cacl2，ph7.2)中，加入400μl培养物上清，于37℃、200rpm培养6h后，检测培养物的od
495
值。
43.(3)绿脓菌素
44.将活化的pao1菌株分别转接到含有0μg/ml，50μg/ml，100μg/ml番泻苷a的液体pdp培养基中，于37℃、200rpm培养16h后，8000rpm离心5min获得培养物上清。取3ml上清液加入到新的离心管中，加入等体积氯仿，充分震荡混匀，静置分层后将上层有机相转移到新的离心管，加入1ml 0.2n hcl，充分震荡混匀，静置分层后检测上层无机相的od
520
值。
45.实验结果：如图5所示，番泻苷a对铜绿假单胞菌pao1致病相关的重要毒力因子蛋白水解酶、弹性蛋白酶以及绿脓菌素均有抑制作用。与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
46.实施例6：体内致病性测定
47.使用了白菜感染模型、果蝇感染模型和线虫感染模型来检测番泻苷a对pao1致病性的影响。
48.实验方法：
49.(1)白菜模型
50.将活化的pao1菌株转接到分别含有0μg/ml，50μg/ml，100μg/ml番泻苷a的液体lb培养基中，于37℃、200rpm培养12h后，8000rpm离心5min获得菌体细胞，用无菌的10mm mgso4溶液重悬菌体，将菌液的od
600
值调为2.0，待用。取新鲜大白菜的块状茎，使用0.1％双氧水擦拭灭菌，吸取上述制备好的菌体重悬液5μl注射到白菜茎部，放置于无菌的培养皿中，于30℃下培养6天，观察注射菌液部位的白菜腐烂情况。
51.(2)果蝇模型
52.过夜培养的pao1菌株转接到液体lb培养基中，于37℃、200rpm培养12h后，8000rpm离心5min获得菌体细胞，用无菌的5％蔗糖溶液重悬菌体，将菌液的od
600
值调为2.0，待用。配制5％蔗糖固体琼脂分装在100ml玻璃瓶中，灭菌凝固后使用超净工作台吹干，放置一张合适大小的无菌滤纸，吸取200μl重悬好的菌液混合0μg/ml，50μg/ml，100μg/ml的番泻苷a后分别均匀添加到5％蔗糖固体琼脂表面的无菌滤纸上。使用冷冲击法麻醉果蝇，挑选雄性果蝇饥饿处理3h后加入到玻璃瓶中，每瓶10只，25℃培养10d，每24小时记录一次存活果蝇数目。
53.(3)线虫模型
54.将活化的pao1菌株分别转接到液体lb培养基中，于37℃、200rpm培养12h后，转接到新的液体lb培养基中继续培养直至菌液od
600
到0.6左右，取100μl菌液分别涂布于含有番泻苷a浓度为0μg/ml，50μg/ml，100μg/ml的ngm(0.3％nacl，0.25％蛋白胨，1mm mgso4，1mm cacl2，5μg/ml胆固醇，100μg/ml 5-氟尿嘧啶和2％琼脂)平板上，挑取一定数量同期化处理好的l4期线虫，25℃培养4d，每隔12h记录一次存活线虫的数目。
55.实验结果：白菜、果蝇和线虫结果如图6a，6b，6c所示，与对照相比，番泻苷a减轻了pao1对于白菜的腐蚀作用，提高了被pao1感染的果蝇和线虫的生存率，表明番泻苷a可显著降低pao1体外、体内的致病性。
56.尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造
性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
57.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。