一种绿原酸-黄芩苷共载纳米粒鼻腔原位凝胶及其制备方法和应用

1.本发明涉及医药制剂领域，尤其涉及一种绿原酸-黄芩苷共载纳米粒鼻腔原位凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.上呼吸道感染是常见的感染性疾病，全年均有发生，其中冬季最为好发。目前主要用的抗菌药物有一定的疗效，但容易耐药且不能有效控制反复发病。宿主抵御外邪入侵的第一道防线是上呼吸道黏膜，其中鼻黏膜可以介导全身性及黏膜免疫反应，可以防御各种抗原及病原体通过呼吸系统对机体的侵害。同时研究发现许多药物的鼻腔给药生物利用度高于口服给药。
3.目前，中药可以有效改善呼吸道黏膜免疫状态，对流感病毒感染有着广泛的应用和显著的疗效，其安全无副作用优势具备良好的前景。但是中药成分可以应用在鼻腔给药中的研究不多，而且疗效有限，导致中药在传统的鼻腔给药方式中存在着许多不足。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种绿原酸-黄芩苷共载纳米粒鼻腔原位凝胶及其制备方法和应用，以解决目前中药成分在鼻腔给药制剂中应用所存在的缺陷，从而提高对流感病毒的治疗效果。
5.为了解决上述技术问题，本发明目的之一提供了一种绿原酸-黄芩苷共载纳米粒鼻腔原位凝胶的制备方法，包括以下步骤：
6.(1)将壳聚糖与溶剂溶解配置成壳聚糖溶液；
7.(2)将黄芩苷和绿原酸滴入壳聚糖溶液中，搅拌后调节ph，随后滴加三磷酸钠溶液，搅拌制得纳米粒；
8.(3)将p-407和p-188加入纳米粒中，充分溶胀分散均匀后调节ph，得到绿原酸-黄芩苷共载纳米粒鼻腔原位凝胶。
9.作为优选方案，在步骤(2)中，所述壳聚糖与三磷酸钠的质量比为(3-7)：1。
10.作为优选方案，在步骤(2)中，所述纳米粒中黄芩苷和绿原酸的浓度均为0.05mg/ml-0.3mg/ml。
11.作为优选方案，在步骤(1)中，所述溶剂为2％乙酸水溶液。
12.作为优选方案，在步骤(2)中，调节ph为3-5。
13.作为优选方案，在步骤(2)中，所述壳聚糖与三磷酸钠的质量比为5：1，所述黄芩苷和绿原酸的浓度均为0.1mg/ml，调节ph为5。
14.作为优选方案，在步骤(3)中：当所述p-407添加的质量分数为18.5049％时，所述p-188添加的质量分数为0.9576％；当所述p-407添加的质量分数为17.9997％时，所述p-188添加的质量分数为0.99995％；当所述p-407添加的质量分数为19.4999％时，所述p-188
添加的质量分数为2.00015％。
15.通过采用上述方案，由于鼻腔的生理温度普遍在32℃-35℃之间，少部分人群超出该温度范围，上述两种原位凝胶的添加比例可以控制绿原酸-黄芩苷共载纳米粒鼻腔原位凝胶的凝胶温度不低于32℃时，低于32℃时无法在鼻腔中形成凝胶，无法发挥最大作用，而鼻腔温度高于35℃时候可以形成凝胶，仍可以使用，提高使用体验感，高效发挥绿原酸-黄芩苷共载纳米粒鼻腔原位凝胶的药效。
16.作为优选方案，在步骤(3)中，调节ph为5.5-7.5。
17.作为优选方案，在步骤(3)中，将p-407加入纳米粒中，待充分溶胀分散均匀后，加入p-188，充分溶胀分散均匀后，调节ph，得到绿原酸-黄芩苷共载纳米粒鼻腔原位凝胶。
18.为了解决上述技术问题，本发明目的之二提供了一种绿原酸-黄芩苷共载纳米粒鼻腔原位凝胶。
19.为了解决上述技术问题，本发明目的之三提供了一种绿原酸-黄芩苷共载纳米粒鼻腔原位凝胶在用于治疗呼吸道感染的鼻腔给药制剂中的应用。
20.相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：
21.本技术采用黄芩苷和绿原酸作为中药活性成分，具有良好的生物活性和抗菌抗病毒等功能，在呼吸道黏膜抗流感病毒免疫应答中疗效显著，相较中药提取液，中药有效成分有利于提高中药制剂的内在质量和临床治疗效果，使中药的效果得以最大限度的发挥。本技术以壳聚糖纳米粒作为绿原酸-黄芩苷载体，再负载于原位凝胶中，以期提高药物在鼻腔内的生物利用度及细胞膜的通透性，增强鼻腔内的滞留，具有缓释作用，可以增强黏膜免疫功能，预防和治疗上呼吸道感染。
附图说明
22.图1-为本发明效果验证1.4项中绿原酸-黄芩苷混合对照品的液相色谱图(注：a-绿原酸-黄芩苷混合对照品；b-绿原酸对照品；c-黄芩苷对照品)；
23.图2-为本发明效果验证2.1项中绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒的粒径结果；
24.图3-为本发明效果验证2.1项中绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒的电位结果；
25.图4-为本发明效果验证2.2项中绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒的电镜图；
26.图5-为本发明效果验证5.1项中绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶的体外释放曲线；
27.图6-为本发明效果验证5.2项中绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶的体外溶蚀和释药曲线；
28.图7-为本发明效果验证6.1项中显微镜下的牛蛙上颚纤毛(注：a-1％去氧胆酸钠溶液组；b-空白凝胶组；c-绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶组；d-空白对照组)。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.呼吸道黏膜抗流感病毒免疫应答中常用的中药有金银花和黄芩，其中金银花疏散风热，清热解毒，为君药，臣以黄芩清上焦热毒，与金银花相须为用，增加其清热解毒之力。两药相配，共奏清热解毒，透表祛邪之功。同时中药的有效成分黄芩苷、绿原酸具有良好的生物活性和抗菌抗病毒等功能，相较中药提取液，中药有效成分有利于提高中药制剂的内在质量和临床治疗效果，使中药的效果得以最大限度的发挥。
31.本技术以壳聚糖纳米粒为绿原酸-黄芩苷载体，再负载于原位凝胶中，以期提高药物在鼻腔内的生物利用度及细胞膜的通透性，增强鼻腔内的滞留，以期增强黏膜免疫功能，预防和治疗上呼吸道感染。
32.制备例一
33.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，采用以下步骤制备：
34.(1)采用离子交联法制备纳米粒，将壳聚糖溶解于2％乙酸水溶液(50ml)中，配成2mg
·
ml-1
的壳聚糖溶液；
35.(2)分别取黄芩苷、绿原酸10mg，加入10ml的peg 400使溶解，缓慢滴入壳聚糖溶液中，于1000r
·
min-1
搅拌，加完后继续搅拌10min，用1mol
·
l-1
naoh溶液调节ph5；以2滴/s加入1g
·
l-1
三聚磷酸钠溶液20ml，此时，壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为5：1，随后于1000r
·
min-1
搅拌，加完三聚磷酸钠溶液后继续搅拌20min，即得纳米粒。
36.制备例二
37.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，各步骤及各步骤使用的试剂及工艺参数均与制备例一相同，不同的地方在于，步骤(2)中黄芩苷和绿原酸的添加量均为2.5mg。
38.制备例三
39.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，各步骤及各步骤使用的试剂及工艺参数均与制备例一相同，不同的地方在于，步骤(2)中黄芩苷和绿原酸的添加量均为5mg。
40.制备例四
41.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，各步骤及各步骤使用的试剂及工艺参数均与制备例一相同，不同的地方在于，步骤(2)中黄芩苷和绿原酸的添加量均为15mg。
42.制备例五
43.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，各步骤及各步骤使用的试剂及工艺参数均与制备例一相同，不同的地方在于，步骤(1)中浓度2mg
·
ml-1
壳聚糖添加量为30ml，此时壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为3：1。
44.制备例六
45.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，各步骤及各步骤使用的试剂及工艺参数均与制备例一相同，不同的地方在于，步骤(1)中浓度2mg
·
ml-1
壳聚糖添加量为70ml，此时壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为7：1。
46.制备例七
47.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，各步骤及各步骤使用的试剂及工艺参数均与制备例一相同，不同的地方在于，步骤(1)中浓度2mg
·
ml-1
壳聚糖添加量为90ml，此时壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为9：1。
48.制备例八
49.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，各步骤及各步骤使用的试剂及工艺参数均与
制备例一相同，不同的地方在于，在步骤(2)中用1mol
·
l-1
naoh溶液调节ph3。
50.制备例九
51.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，各步骤及各步骤使用的试剂及工艺参数均与制备例一相同，不同的地方在于，在步骤(2)中用1mol
·
l-1
naoh溶液调节ph4。
52.制备例十
53.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，各步骤及各步骤使用的试剂及工艺参数均与制备例一相同，不同的地方在于，步骤(1)中浓度2mg
·
ml-1
壳聚糖的添加量为68ml；步骤(2)中黄芩苷和绿原酸的添加量均为11mg，用1mol
·
l-1
naoh溶液调节ph5。
54.制备例十一
55.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，各步骤及各步骤使用的试剂及工艺参数均与制备例一相同，不同的地方在于，步骤(2)中黄芩苷和绿原酸的添加量均为15mg，用1mol
·
l-1
naoh溶液调节ph3。
56.制备例十二
57.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，各步骤及各步骤使用的试剂及工艺参数均与制备例一相同，不同的地方在于，步骤(1)中浓度2mg
·
ml-1
壳聚糖的添加量为70ml；步骤(2)中黄芩苷和绿原酸的添加量均为5mg，用1mol
·
l-1
naoh溶液调节ph4。
58.实施例一
59.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶，可以制成滴鼻剂等鼻腔给药制剂，直接喷入鼻腔中给药，具体采用以下步骤制备而成：
60.(1)称取p-407，加入到制备例一获得的纳米粒中，于磁力搅拌下使其分散均匀，4℃冰箱静置过夜，至p-407充分溶胀分散均匀，p-407的质量占比为18.5049％；
61.(2)在体系中缓慢加入p-188，于磁力搅拌下分散均匀，继续静置于4℃冰箱中过夜，至p-188完全溶胀分散均匀，p-188的质量占比为0.9576％；
62.(3)最后在磁力搅拌下逐滴滴加2mol/l的naoh调节体系的ph至5.5左右，即得绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶。
63.实施例二
64.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶，可以制成滴鼻剂等鼻腔给药制剂，直接喷入鼻腔中给药，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，在步骤(1)中，p-407的质量占比为18.4391％；在步骤(2)中，p-188的质量占比为0.2927％。
65.实施例三
66.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶，可以制成滴鼻剂等鼻腔给药制剂，直接喷入鼻腔中给药，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，在步骤(1)中，p-407的质量占比为20.5608％；在步骤(2)中，p-188的质量占比为0.2927％。
67.实施例四
68.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶，可以制成滴鼻剂等鼻腔给药制剂，直接喷入鼻腔中给药，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，在步骤(1)中，p-407的质量占比为18.4391％；在步骤(2)中，p-188的质量占比
为1.7072％。
69.实施例五
70.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶，可以制成滴鼻剂等鼻腔给药制剂，直接喷入鼻腔中给药，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，在步骤(1)中，p-407的质量占比为20.5608％；在步骤(2)中，p-188的质量占比为1.7072％。
71.实施例六
72.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶，可以制成滴鼻剂等鼻腔给药制剂，直接喷入鼻腔中给药，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，在步骤(1)中，p-407的质量占比为17.9997％；在步骤(2)中，p-188的质量占比为0.99995％。
73.实施例七
74.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶，可以制成滴鼻剂等鼻腔给药制剂，直接喷入鼻腔中给药，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，在步骤(1)中，p-407的质量占比为21.0002％；在步骤(2)中，p-188的质量占比为0.99995％。
75.实施例八
76.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶，可以制成滴鼻剂等鼻腔给药制剂，直接喷入鼻腔中给药，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，在步骤(1)中，p-407的质量占比为19.4999％；在步骤(2)中，p-188的质量占比为2.00015％。
77.实施例九
78.一种绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶，可以制成滴鼻剂等鼻腔给药制剂，直接喷入鼻腔中给药，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，在步骤(1)中，p-407的质量占比为19.4999％；在步骤(2)中，p-188的质量占比为0.99995％。
79.效果验证
80.1、绿原酸-黄芩苷液相色谱含量测定：
81.1.1、液相色谱条件：cosmosil packedc18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，流动相0.4％磷酸水(a)-乙腈(b)梯度洗脱，柱温30℃，流速1ml
·
min-1
，检测波长327nm，进样量20μl。
82.表1-色谱条件中流动相a和b随时间变化
[0083][0084]
1.2、溶液的制备：
[0085]
对照品溶液a：准确称取绿原酸对照品10mg，置50ml量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得绿原酸对照品储备液；精密量取对照品储备溶液1ml，至10ml量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.01g
·
l-1
的绿原酸对照品溶液。
[0086]
对照品溶液b：准确称取黄芩苷对照品10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得黄芩苷对照溶品储备液；精密量取对照品储备溶液1ml，至10ml的量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.01g
·
l-1
黄芩苷对照品溶液。
[0087]
1.3、绿原酸和黄芩苷线性关系考察：
[0088]
混合对照品：精密量取1.2项中绿原酸照品储备溶液(0.19206g
·
l-1
)0.125ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml和2.5ml，分别置10ml量瓶中，再精密量取1.2项中黄芩苷对照品储备溶液(0.196g
·
l-1
)0.125ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml和2.5ml，分别置上述对应的量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，得到混合对照品。
[0089]
照上述1.1项中液相色谱条件测定混合对照品，以峰面积(y)对进样量(x)进行线性回归，绘制回归曲线：y绿原酸＝0.869x+1.1876(r2＝0.9999)；y黄芩苷＝0.6416x+0.0932(r2＝0.9999)；结果表明绿原酸和黄芩苷分别在2.4255mg
·
l-1
～48.51mg
·
l-1
、2.45mg
·
l-1
～49mg
·
l-1
线性关系良好。
[0090]
1.4、系统适应性和专属性考察：
[0091]
按照1.3项中2.5ml对照品储备溶液制备混合对照品以及1.2项中黄芩苷对照品溶液和绿原酸对照品溶液各10μl,按1.1项的液相色谱条件进样分析，并分别记录各自的液相色谱图，得到的结果是拖尾因子在0.95～1.05之间，表明在该液相色谱条件下结果专属性良好，液相色谱图结果见图1。
[0092]
1.5、稳定性试验：
[0093]
供试品溶液的制备：取制备利一获得的绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒混悬液5ml置离心管，于10000r/min高速速离心30min后收集上清液，经0.22μm滤膜滤过，精密量取续滤液1ml，50％甲醇定容至10ml，混匀，制得供试品溶液。
[0094]
精密度试验：分别取绿原酸对照品溶液和黄芩苷对照品溶液，按1.1项的液相色谱条件连续进样6次，计算绿原酸-黄芩苷峰面积的rsd，绿原酸对照品溶液的rsd为0.21％，黄芩苷对照品溶液的rsd为0.23％，表明仪器精密度良好。
[0095]
重复性试验：称取同批绿原酸对照品溶液a和黄芩苷对照品溶液样品6份，每份400μl，取上述供试品溶液，按1.1项的液相色谱条件测定，计算质量分数的rsd，绿原酸和黄芩苷峰面积的rsd分别为1.24％、1.22％，均低于2.0％，提示该液相色谱条件测试方法的重复性良好。
[0096]
稳定性试验：取上述供试品溶液在放置0h、3h、6h、9h、12h和24h后，分别进样，记录绿原酸和黄芩苷的峰面积，如表2所示，结果显示绿原酸、黄芩苷对照品峰面积的rsd分别为0.26％、0.60％，结果表明供试品溶液24h内稳定性良好。
[0097]
表2-稳定性测试中供试品溶液各组分浓度随时间变化
[0098][0099]
1.6、回收率试验：
[0100]
空白壳聚糖混悬液的制备：采用离子交联法制备纳米粒，将壳聚糖溶解于2％乙酸水溶液(50ml)中，配成2mg
·
ml-1
的壳聚糖溶液；用1mol
·
l-1
naoh溶液调节ph5；以2滴/s加入1g
·
l-1
三聚磷酸钠溶液20ml，此时，壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为5：1，随后于1000r
·
min-1
搅拌，加完三聚磷酸钠溶液后继续搅拌20min，即得空白壳聚糖纳米粒。
[0101]
取空白壳聚糖纳米粒混悬液，平行6份，每3份为1组，依次精密加入1.2项中对照品储备液，漩涡混匀5s，离心，上清液经0.22μm微孔滤膜滤过，按1.1项的液相色谱条件测定，计算平均回收率和rsd。结果表明绿原酸平均回收率为98.78％，rsd＝0.73％，黄芩苷平均回收率为99.05％，rsd＝0.67％，表面回收率较高且壳聚糖的包封能力稳定。
[0102]
1.7、载药量和包封率的测定：
[0103]
取制备例一的绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒混悬液5ml置离心管，于12000r/min高速速离心30min后收集上清液，经0.22μm滤膜滤过，精密量取续滤液1ml，50％甲醇定容至10ml，混匀，按1.1项液相色谱条件进行测定。包封率＝(c-c1)/c；c为混悬液中总的药物的质量浓度；c1为混悬液中未包封的药物的质量浓度。
[0104]
2、制备例中绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒溶液的表征测定：
[0105]
2.1、粒径及zeta电位测定：取适量制备例一获得的绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒乳液，加水稀释10倍，运用纳米粒度分析仪测定粒径及zeta电位。如图2所示，通过粒度仪测得(n＝3)纳米粒的平均粒径(536.1
±
16.24)nm，多分散系数(polydispersity，pdi)＝0.310
±
0.053；如图3所示，zeta电位(24.39
±
0.27)mv，电位大于20mv表明纳米粒状态比较稳定。
[0106]
2.2、电镜形态：取少量制备例一获得的绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒溶液滴至铺有碳膜铜网上，静置2min，用滤纸吸干混悬液，滴加2％磷钨酸溶液(ph6.2)负染2min，自然干燥后用电子显微镜观察纳米粒形态。如图4所示，结果表面纳米粒形态为均一的类球形实体粒子，形状规则，形态饱满。
[0107]
3、制备例中绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒溶液的药物包封率测试：
[0108]
3.1、药物投料质量的影响：按制备例1-4的方法制得绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，固定其他辅料用量，按照1.7项考察不同药物总投料质量分别为2.5mg、5mg、10mg、15mg对纳米粒包封率的影响，结果表3所示，当药物剂量为10mg时，绿原酸-黄芩苷的包封效率最高，说明投药量对壳聚糖纳米粒包封率影响较大。
[0109]
表3-不同药物投料质量对包封率的影响
[0110][0111]
3.2、壳聚糖与三聚磷酸钠质量浓度比的影响：按制备例1、5-7的方法获得绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，固定其他辅料用量，按1.7项考察壳聚糖与三聚磷酸钠(tpp)质量浓度比分别为3∶1、5∶1、7∶1和9∶1对绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒包封率的影响。结果表4所示，壳聚糖与tpp质量浓度比为5:1时，药物包封率比较高，而当9:1时纳米粒不稳定，容易沉降。
[0112]
表4-壳聚糖和三聚磷酸钠质量浓度比对包封率的影响
[0113][0114]
3.3、ph的影响：用制备例1、8-9的方法制备绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，在步骤(2)中用1mol
·
l-1
naoh调节ph分别为3、4、5，其余条件不变，按1.7项计算绿原酸-黄芩苷包封率。结果表5所示，当ph为5时，绿原酸-黄芩苷包封率较为理想，说明ph对包封率影响较大。
[0115]
表5-ph对包封率的影响
[0116][0117]
3.4、多因素的影响：用制备例1、10-12的方法制备绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒，按照1.7项计算绿原酸-黄芩苷包封率。结果表6所示，制备例十获得的绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒包封率较高。
[0118]
表6-药物、ph和壳聚糖对包封率的影响
[0119][0120][0121]
4、实施例中绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶的各项性能测试：
[0122]
4.1、胶凝温度测试：采用实施例一方法分别制备不同浓度p-407和p-188凝胶的样品，观察浓度与胶凝温度(tgel)的关系。采用试管法测定胶凝温度，将2ml样品加入试管(10ml)中，并置于15℃的数字化循环水浴中，以1.0℃
·
min-1
的速度缓慢加热水浴，每升高0.1℃，将试管倾斜90
°
，观察液面，直至液面不再流动，记录此时的温度，即为胶凝温度。依据鼻腔的生理温度为32～35℃，为避免个体差异确定tgel为32℃为目标温度，由表7的测试结果可知，当p407和p188用量之比为18.5049％：0.9576％时，胶凝温度为32℃。
[0123]
表7-p407和p188不同凝胶浓度对胶凝温度的影响
[0124][0125]
4.2、均一性考察：取25℃及34℃下放置两周的实施例一获得绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶适量，分别离心，观察是否出现分层现象。结果表明，经离心后鼻用温敏原位凝胶稳定，凝胶无分层，性质均匀。
[0126]
4.3、性状及ph值考察：凝胶为淡绿色略带黏稠的液体，取32℃下绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶适量于烧杯中，用实验室ph计进行测定，ph为5.5，符合鼻用制剂在5.5-7.5之间的ph。
[0127]
4.4、胶凝时间的测定：采用试管倒置法记录凝胶时间，将2ml实施例一获得的绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶加入试管(10ml)中，并置于32℃的恒温水浴锅中。不时倾斜45
°
并观察液面，直至液面不再流动，平行6次，记录此时的时间，即为胶凝时间。试验平均结果为5s
±
1s，表明温敏凝胶在32℃凝胶速度较快，凝胶时间短，凝胶效果良好。
[0128]
5、实施例样品的体外鼻黏膜渗透性和体外释放度的试验：
[0129]
5.1扩散池法试验：
[0130]
对实施例一获得的绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶进行体外释放度试验考察，精密取样品2g，放入处理好的透析袋中，将袋两端扎紧。以200ml人工鼻液(精密称取磷酸二氢钾13.6g，加去离子水1l溶解，用0.1mol
·
l-1
溶液调节ph至6.8)为释放介质，转速为150r
·
min-1
，温度为34
±
1℃，依法操作。于0.5h、1h、1.5h、2h、3h、6h、10h、12h、24h分别移取2ml释放液经0.45μm滤膜过滤备用，并及时补充同温度的释放介质2ml。
[0131]
采用hplc法测定溶出液中的药物浓度，按公式1计算累积释放百分数(q)，以体外累积释放百分率(q)为纵坐标，取样时间(t)为横纵标，绘制如图5所示的释放曲线。由此可知，采用透析袋法时，样品在前6h药物释放较快，绿原酸累积释放率能达到57％，黄芩苷也达到41％，随后可持续稳定释药，释放时间可持续24h，具有良好的缓释作用，由表8所示，绿原酸释放曲线与一级方程拟合度最好，由表9所示，黄芩苷与higuchi方程的拟合度最好。
[0132]
[0133]
表8-绿原酸释药方程拟合结果
[0134][0135][0136]
表9-黄芩苷释药方程拟合结果
[0137][0138]
5.2无膜溶出法试验：
[0139]
给药后凝胶与鼻腔中的鼻黏液接触，由于鼻纤毛的摆动使鼻黏液不断冲刷凝胶，凝胶在溶蚀作用下会释放出药物，但这种方式是否是凝胶的主要释药方式尚不明确，故用无膜溶出法对绿原酸-黄芩苷壳聚糖鼻腔原位凝胶进行体外释药考察。
[0140]
取实施例一样品1g置于5ml离心管中，先于恒温振荡器中使其形成凝胶后，精密称定凝胶与离心管的总重后加生理盐水1ml。将离心管置于35
±
1℃恒温振荡仪中，以100r/min的频率往复振荡，分别于15、30、45、60、90、120、180min的时候将离心管中的溶液全部倒出，并用滤纸将离心管表面擦拭干，随后精密称定重量，前后2次离心管质量之差即为两个时间点之间的溶蚀量。每次操作要迅速，避免离心管中的凝胶因室温较低而转变为液态。向离心管中重新加入1ml生理盐水继续恒温振荡，测定每个时间点倒出的生理盐水中药物的含量，采用式(2)计算药物累积释放率qn与累积溶蚀率x。得到溶蚀回归方程为y＝0.0045x+0.0978(r2＝0.96462)，绿原酸、黄芩苷的累积释药的回归方程分别为y＝0.0036x+0.0846(r2＝0.9378)、y＝0.0032x+0.0791(r2＝0.9351)。从图6结果表明，药物释放与凝胶溶蚀是同时进行的，药物释放速率主要受到凝胶溶蚀的控制。
[0141]
x＝(w0－wn)/(w0－w1)*100％式(2)
[0142]
式中：w0为加入生理盐水前凝胶与离心管的总重量(g)；
[0143]
wn为第n次称重时凝胶与离心管的总重量(g)；
[0144]
w1为空离心管的重量(g)。
[0145]
6、实施例中绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶安全性评价：
[0146]
6.1蟾蜍上颚黏膜观察：
[0147]
实验方法：中华大蟾蜍24只，随机分为4组，每组6只。将蟾蜍仰卧固定于蛙板上，以止血钳牵拉使口腔张开以防止蟾蜍吞咽药物，于蟾蜍两眼间的上颚黏膜处滴加样品药液0.5ml，使黏膜完全浸没，药物和上颚充分接触30min后用25℃生理盐水洗净药物，用眼科剪和眼科镊小心分离上颚黏膜约2mm
×
2mm，黏膜分离后立即洗净血污和杂物，纤毛面朝上平铺于载玻片上，于黏膜表面滴加生理盐水，盖上盖玻片，于光学显微镜下观察黏膜形态。本
试验采用有严重纤毛毒性的1％去氧胆酸钠作为阳性对照品，以生理盐水作为空白对照，并设立空白凝胶组(绿原酸和黄芩苷药物未含有)和实施例一绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶实验组，分别评价空白原位凝胶和绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶的鼻纤毛毒性。
[0148]
由图7中a图可知，给予1％去氧胆酸钠后30min后观察到黏膜表面杂乱，纤毛完全脱落，纤毛运动完全停止，说明其对黏膜组织纤毛运动有严重影响；图7中b图可知，给予生理盐水的蟾蜍上颚黏膜面完整，无纤毛脱落现象，纤毛运动非常活跃；图7中c图和d图可知，给予空白凝胶组、绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶组黏膜面较完整，纤毛数量多，运动活跃，但部分纤毛运动略减弱，表明绿原酸-黄芩苷-壳聚糖纳米粒温敏凝胶凝胶会在一定程度上减弱纤毛运动，但影响不大，说明空白凝胶基质和含药凝胶都具有良好的安全性。
[0149]
6.2纤毛持续运动时间和持续运动百分率测定：
[0150]
实验方法：取牛蛙24只，随机分为1％去氧胆酸钠溶液组、空白凝胶组、实施例一绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶组和空白对照组(生理盐水)，每组6只。将黏膜置于预先用少量蒸馏水饱和的层析缸中，密闭，环境温度25℃，样品给药处理，此后每隔适当时间取出上颚标本于图象分析系统下观察，如纤毛继续运动则放回层析缸中，直至纤毛运动停止。记录从给药开始至纤毛运动停止所持续的时间，即纤毛持续运动时间(persistent vibration duration，pvd)。以各给药组的pvd除以生理盐水对照组的pvd即得到纤毛持续运动百分率(percentage of persistent vibration，ppv)。百分率越高则表示药物对纤毛的毒性越小。
[0151]
结果如表10所示，生理盐水对纤毛运动无明显影响，持续运动时间为552.5
±
31.6min，1％脱氧胆酸钠处理的纤毛已经完全掉落，持续运动时间与生理盐水组相比有显著差别，表明其对蟾蜍上颚纤毛有较强的毒性；给予空白凝胶的纤毛运动时间相对生理盐水的百分率为89％，表明空白凝胶对纤毛运动存在轻微影响，这可能与p407、p188等辅料的黏度较大有关；给予绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶与空白凝胶的变化相似，说明绿原酸-黄芩苷-壳聚糖纳米粒温敏凝胶无明显的纤毛毒性，可以用于鼻腔给药。
[0152]
表10-牛蛙上颚黏膜纤毛摆动的影响(n＝6)
[0153][0154]
6.3测定纤毛输送速率：
[0155]
实验方法：取牛蛙24只，随机分为1％去氧胆酸钠溶液组、空白凝胶组、实施例一中绿原酸-黄芩苷-壳聚糖纳米粒温敏凝胶组和空白对照组(生理盐水)，每组3只。给药5min后在上腭靠前方部位用毛细管放置甲基红颗粒，此时颗粒将沿黏膜表面缓慢向咽部移动留下红色轨迹，用秒表记录颗粒移动1cm所需时间，每只蟾蜍平行测定3次，取均值后计算纤毛输
送速率。
[0156]
如表11所示，空白凝胶、药物凝胶组的相对百分率都大于95％，说明对蛙黏膜纤毛运动无明显的影响，给药前后纤毛运动的差异无显著性。阳性对照组1％去氧胆酸钠相对百分率为0，表明能够极显著抑制蛙黏膜纤毛运动，有较强的纤毛毒性。
[0157]
表11-牛蛙上颚黏膜纤毛输送速率(n＝3)
[0158][0159]
7.绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶对鼻黏膜免疫的影响：
[0160]
试剂和设备：实施例一中绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶；银翘散按《方剂学》的组成(连翘30g、金银花30g、桔梗18g、薄荷18g、牛蒡子18g、淡竹叶12g、甘草15g、荆芥穗12g和淡豆豉15g)，饮片均购自正康大药房；硝酸毛果芸香碱滴眼液(山东博士伦福瑞达制药有限公司)；小鼠分泌型免疫球蛋白a elisa试剂盒(江苏酶免实业有限公司)；溶菌酶测试盒(江苏酶免实业有限公司)；rt-6100自动酶标仪(雷杜生命科学股份有限公司)。
[0161]
动物模型的制备与分组：昆明种6w龄健康小鼠40只，雌雄各半，清洁级，体重18～22g[由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号:scxk(粤)2016-0041]。随机分为对照组、模型组、银翘组(按人和动物的体表面积计算法，根据临床药量换算出小鼠银翘散用量为21.84g/kg，给药体积均为0.2ml/10g)、绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶高剂量滴鼻组(50μl/10g)、绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶低剂量滴鼻组(25μl/10g)，共5组，每组10只。造模方法:除对照组外，其余各组小鼠置于-20℃寒冷环境中刺激60min，1次/d，连续3d；每天寒冷刺激前1h，绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶组和银翘组均滴鼻给予相应剂量药物，对照组和模型组滴鼻给予同体积的生理盐水。于第3d寒冷刺激后，在室温下适应60min，每只小鼠腹腔注射0.1％硝酸毛果芸香碱滴眼液0.5ml；2min后用移液枪取小鼠唾液，-40℃保存，采用elisa试剂盒分别测定小鼠唾液中siga含量和溶菌酶含量。
[0162]
统计学方法：使用spss 10.0统计软件进行处理。所有数据用表示，两组均数比较用t检验，各组数据之间比较采用方差分析，p＜0.05为差异有统计学意。
[0163]
如表12中结果表明，与对照组比较，模型组小鼠唾液中siga含量显著地降低(p＜0.05)、溶菌酶含量非常显著地降低(p＜0.01)；绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒温敏凝胶高剂量组siga含量、溶菌酶含量均较模型组显著地升高(p＜0.05)，低剂量组siga含量、溶菌酶含量有升高趋势，但与模型组比较无显著差异(p＞0.05)；银翘组中siga含量、溶菌酶含量均较模型组显著地升高(p＜0.05)。模型组的动物唾液中的siga明显减少，溶菌酶含量非常显著降低，说明寒冷刺激可以降低上呼吸道的黏膜免疫功能，表明此次寒冷刺激小鼠造模成功。绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶可提高因寒冷刺激减少的siga，同时提高其溶菌酶含量，表明绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶能够增强上呼吸道黏膜免
疫功能，为绿原酸-黄芩苷壳聚糖纳米粒鼻腔原位凝胶临床上用于预防和治疗反复上呼吸道感染提供了理论基础。
[0164]
表12-各组溶菌酶活性的比较(n＝8)
[0165][0166]
注：与模型组相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
[0167]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。