具有增强稳定性的抗rankl人源化单克隆抗体的药物组合物
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有增强稳定性的抗rankl人源化单克隆抗体的药物组合物。
背景技术：
2.细胞核因子-κb受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa-b ligand，“rankl”）是肿瘤坏死因子超家族的成员，其与破骨细胞表面表达的细胞核因子-κb受体活化因子（receptor activator of nuclear factor kappa-b，“rank”）结合，促进破骨细胞的分化及成熟。rankl是成骨细胞和活化的t细胞中典型的同源三聚体膜连接蛋白，可由活化的t细胞等通过溶蛋白裂解或选择剪接的方式分泌，在淋巴结、胸腺、乳腺和肺组织中高表达，在脾和骨髓等组织中低表达。大多数已知刺激破骨细胞形成和活化的因子诱导髓样基质细胞表达rankl。关节炎关节中的滑膜细胞和活化的t细胞表达rankl，并与白细胞介素（interleukin，il）-1和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，tnf）一起促进破骨细胞前体融合形成破骨细胞，引起一定程度的关节破坏。rankl还可刺激破骨细胞前体进入血液循环。在rankl诱导下，破骨细胞的活化把骨重建和造血作用的调节联系在一起。
3.阻断rankl/rank信号传导能够抑制破骨细胞形成和活性，阻断骨吸收，从而治疗骨质疏松症，已被证实是一条可行的路径。美国amgen公司出品的denosumab为通过免疫人igg（免疫球蛋白g）转基因小鼠xenomouse获得的全人源抗人rankl单克隆抗体，被fda批准用于治疗妇女绝经后骨质疏松，被emea批准用于治疗前列腺癌相关的骨丢失。denosumab抗体的临床有效性使得抗rankl单克隆抗体作为药物治疗一系列由于破骨细胞活动增强导致骨丢失的骨代谢疾病的靶点得到了最终确证。
4.与传统合成的小分子药物相比，单克隆抗体是一类大分子物质，具有复杂的结构。单克隆抗体的理化性质，不仅仅取决于其一级结构上的各氨基酸组成，同时也取决于其在溶剂（通常为水）中经以特殊方式折叠后所形成的高级结构，而这一结构也同时决定了药用蛋白质的药效性质。保持抗体的高级结构是发挥其生物学活性的基本要求。而蛋白质高级结构的稳定性，一方面取决于蛋白质自身，同时也取决于蛋白质与其溶剂及溶剂中的其它溶质之间的相互作用。对于单克隆抗体而言，找到有利于其蛋白质高级结构的稳定又便于给药的制剂，是生物药制剂的关键。此外，在保持高蛋白质浓度的情况下，提高生物药制剂的稳定性，尤其具有很大的挑战。
技术实现要素：
5.为了解决上述问题，本公开提供了一种新的具有增强稳定性的抗rankl人源化单克隆抗体（简称抗rankl单抗）的药物组合物，使抗体制剂更加稳定，保存时间更长。
6.在一个方面，本公开涉及一种药物组合物，其包含：(a) 抗rankl人源化单克隆抗体；
(b) 缓冲剂；(c) 保护剂和/或渗透压调节剂；(d) 表面活性剂；其中所述缓冲剂为柠檬酸/柠檬酸钠、谷氨酸/谷氨酸钠、乙酸/乙酸钠或组氨酸/组氨酸盐酸盐，优选为组氨酸/组氨酸盐酸盐；所述保护剂和/或渗透压调节剂为海藻糖、蔗糖、脯氨酸中的一种或多种，优选为蔗糖和脯氨酸组合使用；所述表面活性剂为聚山梨酯80（吐温80）或聚山梨酯20（吐温20），优选为聚山梨酯80。
7.在优选的实施方案中，所述抗rankl人源化单克隆抗体为全长igg2抗体，与rankl抗原结合，其中包含选自seq id. no. 1的轻链可变区序列和seq id. no. 2的重链可变区序列。
8.seq id. no. 1：nivltqspaslsvslgqratiscrasesvdsygrsfmhwyqqrpgqaprlliylasnlesgvparfsgsgsrtdftltissveaedeatyycqqdnedpytfgggtkleikseq id.no.2：qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytfttywlqwvrqapgqglewmgaiypgpgntkytqkfkdrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarrgsrrgiaywgqgtlvtvsa在优选的实施方案中，所述抗rankl人源化单克隆抗体的轻链全长如seq id.no.3所示，重链全长如seq id.no.4所示。
9.seq id.no.3：nivltqspaslsvslgqratiscrasesvdsygrsfmhwyqqrpgqaprlliylasnlesgvparfsgsgsrtdftltissveaedeatyycqqdnedpytfgggtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecseq id.no.4：qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytfttywlqwvrqapgqglewmgaiypgpgntkytqkfkdrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarrgsrrgiaywgqgtlvtvsaastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg在优选的实施方案中，所述抗rankl人源化单克隆抗体的蛋白浓度为60~100 g/l，如60~80 g/l，更具体地，如70 g/l。
10.在优选的实施方案中，所述保护剂和/或渗透压调节剂的浓度为10~90 g/l，如50-70 g/l。
11.在优选的实施方案中，所述表面活性剂的浓度为0.01~0.15g/l，如0.05-0.1 g/l。
12.在优选的实施方案中，所述缓冲剂的浓度为1~5 g/l，如3-4 g/l。
13.在优选的实施方案中，所述药物组合物的ph为4.5~7.5，优选为5.0~6.0，更优选为约5.8。
14.在某些实施方案中，所述药物组合物包含：
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60~80 g/l 抗rankl人源化单克隆抗体；
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1.0~1.2 g/l l-组氨酸；
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2.5~3.0 g/l 一水合l-组氨酸盐酸盐
‑ꢀ
35.0~45.0 g/l蔗糖；
‑ꢀ
10.0~15.0 g/l 脯氨酸；
‑ꢀ
0.08~0.12 g/l 聚山梨酯80。
15.在优选的实施方案中，所述药物组合物为以下物质的ph为5.8的水溶液：在另一个方面，公开涉及一种药物组合物在制备用于治疗由于破骨细胞活动增强导致骨丢失的骨代谢疾病的药物中的用途。
16.在一个优选的实施方案中，所述骨代谢疾病为骨质疏松症。
17.本发明的优点本公开的药物组合物至少具有以下优点：本公开的药物组合物在常规保存、高温、振荡、冻融、运输等各种条件下，均具有增强的稳定性，有利于药物的贮存，可使药物的存储期延长；本公开的药物组合物含有高浓度的抗rankl单抗。
具体实施方式
18.定义为了便于理解本发明，对本发明的某些术语进行定义或说明。
19.除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。
20.sec-hplc：分子排阻高效液相色谱法hmw：高分子量峰组（聚体）lmw：低分子量峰组（片段）cex-hplc：阳离子交换高效液相色谱法acidic：酸性峰组basic：碱性峰组
main：主峰组rce-sds：还原毛细管凝胶电泳法hc：重链lc：轻链nghc：无糖重链xmw：杂质或降解片段flowcam：将流式细胞法组合到数字成像显微镜中，基于图像分析法的流式动态成像进行颗粒分析nt：未检测sd：标准差uv280：紫外分光光度计在波长为280nm处的吸光度值，用于定量蛋白质含量（紫外吸收系数法）术语“稳定性”意指药物制剂或药物组合物在保存时，其中的抗体基本上能保持它的物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物稳定性。
21.术语“缓冲剂”指能使溶液的ph值在一定范围内维持基本恒定的物质。如本文所用，所述缓冲剂包括但不限于柠檬酸、柠檬酸钠、谷氨酸、谷氨酸钠、乙酸、乙酸钠、组氨酸、组氨酸盐酸盐、磷酸盐、磷酸盐缓冲盐水、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(tris)等。
22.如本文所用，术语“保护剂和/或渗透压调节剂”包括但不限于甘露醇、海藻糖、蔗糖、脯氨酸等，优选为蔗糖和脯氨酸组合。
23.如本文所用，术语“表面活性剂”包括但不限于聚山梨酯80（吐温80）或聚山梨酯20（吐温20）等，优选为聚山梨酯80。
24.术语“骨疾病”包括骨质疏松症、类风湿性关节炎引起的骨关节骨质破坏、肿瘤骨转移造成的骨质破坏、巨骨细胞瘤生长导致的骨质破坏和其它由于rankl诱导的破骨亢进所形成的骨质丢失或破坏等病理改变。本文所述骨疾病主要指骨损失疾病或骨代谢疾病。示例性的骨代谢疾病包括但不限于，骨质疏松症、骨软化症等。
25.术语“骨质疏松症”是一种复杂的骨代谢性疾病,其发生发展主要是由骨形成和骨吸收失衡造成的，其特征是骨密度低和骨组织微结构的缺陷，导致骨脆性和骨折易感性增加。骨质疏松症包括但不限于原发性骨质疏松症，内分泌骨质疏松症(包括但不限于甲状腺功能亢进，甲状旁腺功能亢进，库欣综合征，和肢端肥大症)，骨质疏松症的遗传和先天形式(包括但不限于成骨不全，高胱氨酸尿症，门克斯综合征，赖-戴综合征)，和由于肢端固定的骨质疏松症；成年人和少年骨佩吉特氏病(畸形性骨炎)；骨髓炎，即导致骨损失的骨感染性病变；高钙血症，包括但不限于实体肿瘤(包括但不限于乳房，肺和肾)和血液恶性病变(包括但不限于多发性骨髓瘤，淋巴瘤和白血病)导致的高钙血症，特发性高钙血症，和与甲状腺功能九进和肾功能失调相关的高钙血症；骨质稀少，包括但不限于手术之后的骨质稀少，施用药物诱导的骨质稀少，与小肠和大肠疾病相关的骨质稀少，和与慢性肝和肾病相关的骨质稀少；骨坏死，即骨细胞死亡，包括但不限于与创伤性损伤有关的骨坏死，与戈谢病有关的骨坏死，与镰状细胞贫血有关的骨坏死，与系统性红斑狼疮有关的骨坏死，与类风湿性关节炎有关的骨坏死，与牙周病有关的骨坏死，与溶骨性转移有关的骨坏死，与其它状况有关的骨坏死；和与类风湿性关节炎有关的软骨损失和关节侵蚀。
实施例
26.为更好地理解本发明，下文将结合实施例对本发明进行详细描述，但应理解的是，这些实施例仅为对本发明进行示例说明，而非意在限制本发明。
27.在本发明中，如无其他说明，则所有操作均在室温、常压下实施。
28.本公开实施例中使用的抗rankl人源化单克隆抗体为本技术人自主研制的抗rankl人源化单克隆抗体；其为全长igg2抗体，与rankl抗原结合，其中包含选自seq id. no. 1的轻链可变区序列和seq id. no. 2的重链可变区序列；其轻链全长如seq id no.3所示；其重链全长如seq id no.4所示。蔗糖购自美国j.t.baker公司和美国pfanstiehl公司，脯氨酸购自上海协和氨基酸有限公司，l-组氨酸、一水合l-组氨酸盐酸盐、聚山梨酯80购自美国j.t.baker公司。
29.本公开的示例性药物组合物（以下实施例中简称为“抗rankl单抗药物组合物”）组成如下：组分含量（g/l）抗rankl单抗70.0l-组氨酸1.13一水合l-组氨酸盐酸盐2.66蔗糖40.0脯氨酸13.9聚山梨酯800.1ph5.8实施例1. 常规稳定性测定将上述抗rankl单抗药物组合物分别进行室温振荡72小时实验、-20℃/室温冻融5周期实验、4℃长期稳定性实验以及40℃加速稳定性实验。其中振荡实验条件为：25℃、180 rpm放置72小时后取样；冻融实验条件为：-20℃/室温冻融5周期后取样。通过sec-hplc、cex-hplc、rce-sds、flowcaw进行初步分析测试，采用生物学活性作为最终判断稳定性的标准。实验结果见表1。
30.表1：常规稳定性各检测项结果
由表1可以看出，抗rankl单抗药物组合物无论是在4℃避光条件下储存到3个月，还是经过振荡或冻融，都未发现颗粒或分子大小异质体明显变化；在40℃避光下储存1个月或2个月的情况下，生物学活性结果未观察到变化；此外，-20 ℃/室温冻融5个周期和室温振荡72小时，分子大小异质体和不溶性微粒未观察到明显变化（数据未显示）。
31.以上结果表明，抗rankl单抗药物组合物有着优良的理化稳定性，适合作为临床用制剂。
32.实施例2. 运输稳定性考察本实施例通过考察抗rankl单抗药物组合物在运输条件影响下质量变化的规律，为药品的包装、贮存、运输条件等提供科学依据。
33.表2：运输稳定性检测结果
以上结果表明，经运输和分别正放或倒放储存6个月后，本公开的抗rankl单抗药物组合物的分子大小异质体和电荷异质体均无明显变化，具有优异的稳定性，未观察到生物学活性的显著性降低。
34.实施例3. 注射稳定性考察在药用蛋白注射液中，药液从注射器经过针头时，由于针头的直径急剧减小，导致针头管路中的水压大大增高，不利于蛋白质的胶体稳定性。对本公开的抗rankl单抗药物组合物用注射器进行反复抽吸，对比抽吸后药液的理化性质。
35.将抗rankl单抗药物组合物用1 ml注射器抽吸10次后，于4℃下分别储存3小时和24小时。实验结果见表3。
36.表3：注射稳定性实验结果
由表3可以看出，本公开的抗rankl单抗药物组合物样品经过注射器10次抽吸后，蛋白浓度和sec-hplc纯度无明显变化，不溶性微粒也处于较低水平，未观察到由剪切力引起的蛋白质的不稳定现象。
37.以上实施例表明，本公开的抗rankl单抗药物组合物取得了出人意料的效果，在常规保存、高温、振荡、冻融、运输等各种条件下，均具有增强的稳定性。此外，本公开的药物组合物含有高浓度（如70.0 g/l）的抗rankl单抗，具有活性成分浓度高的显著的优点。本公开的药物组合物在实现高浓度活性成分的同时，也具有优异的稳定性，具有重要的临床应用价值。
38.虽然上文已描述了本发明的各种实施方案，但是应理解的是，其仅以示例的方式提供，而并非限制。在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。