一种以新型载体递送的抗变异毒株保守靶标nCOVsiRNA的筛选方法与流程

一种以新型载体递送的抗变异毒株保守靶标ncovsirna的筛选方法
技术领域
1.本发明涉及一种以新型载体递送的抗变异毒株保守靶标ncovsirna的筛选方法，属于传染病防治的生物制药领域。


背景技术：

2.新型冠状病毒的主要结构包括单股正链核酸(ssrna)、刺突蛋白(s)、膜蛋白(m)、包膜蛋白(e)和核壳蛋白(n)，其中s蛋白的n端由结构域(s1-ntd)和受体结合域 (s1-rbd)组成，新型冠状病毒通过其受体结合域s1-rbd与宿主细胞受体ace2结合引起感染。
3.ace2为i型跨膜糖蛋白，由805个氨基酸组成，包括跨膜区、胞内羧基端和胞外氨基端，冠状病毒通过其s1-rbd与ace2的细胞外催化结构域互动结合，导致细胞内吞、膜融合，使病毒进入表达ace2或含有ace2受体的细胞。
4.rna干扰(rnai)作为一种高效的序列特异性基因沉默技术，正在给疾病的治疗带来难以想象的应用前景，已有多种sirna药物被fda审批上市。小干扰rna(sirna)大约21～23bp，以参与rna干扰(rnai)的方式调节基因表达,特异性降解与之互补的靶信使rna(mrna)，但无论是细胞水平还是活体内，使用sirna进行基因干扰均要克服很多困难：1)膜通透性：sirna 带有大量的负电荷，分子量大(～13kd)，自身很难穿过细胞膜，运输sirna主要靠化学修饰和一些运输载体；2)抗核酸酶降解：sirna由大量的核糖核酸分子构成，很容易被外界的 rna酶降解，如果在设计sirna及选择运输载体时不对碱基进行特定的化学修饰或采取载体保护方法，则在sirna进入作用位点前即被rna酶降解；3)靶向递送及载体：sirna的作用位点主要在靶细胞浆内，所以需将sirna特异性递送给靶细胞浆，如果不能有效地选用合适的靶向递送载体并及时使sirna从内涵体释放到胞浆，通常可激活细胞免疫反应，导致干扰素等细胞因子的释放，所以，如何有效地将sirna运输并释放到靶细胞浆是影响rnai效果的瓶颈问题，有些sirna能导致序列或浓度依赖性非特异性基因沉默即脱靶，因此，在设计 sirna时，应同时考虑靶向递送、基因抑制效果以及尽可能选择低脱靶效应的序列。
5.文献报道，dxmv、v1、v2、nj1和nj1-17这5个犬冠状病毒流行株的m基因核苷酸同源性为96.6％，显示出很高的保守性(犬冠状病毒流行株膜蛋白基因序列分析及其表达研究，中国病毒学，2006年21卷5期)，说明m基因为保守基因，是在病毒进化中保持不变或几乎不变的基因序列，或各种病毒之间的相同基因序列，换句话说，保守序列就是指不管冠状病毒或其全基因组发生怎样的变异，但总有某些基因序列是保持相对稳定或不变的，所以，只要降解了病毒的保守序列，就会影响病毒其他基因的装配，从而抑制整体病毒的复制。
6.在covid-19的防治中，如果能以合适的靶向递送载体将ncovsirna稳定地、特异地递送给靶器官、靶组织、靶细胞、穿越靶细胞膜、释放到靶细胞浆，并以保守基因为靶标，就能对多种变异毒株产生广谱的rnai作用，从而更好地开展covid-19的靶向基因治疗。
7.所以，本发明要设计以新型载体递送的抗变异毒株保守靶标ncovsirna的筛选方
法。


技术实现要素：

8.本发明的目的是要提供一种以保守基因为靶标的ncovsirna筛选方法以及以rbd或 ace2靶向递送ncovsirna的rbdncovsirna或ace2ncovsirna的制备方法。
9.本发明的目的通过以下技术方案实施：
10.筛选共有基因：从数据库记载的各种致病性冠状病毒及其变异毒株中筛选不随病毒变异而改变的共有基因，包括保守基因、超保守基因和/或保守微卫星。
11.筛选sirna：从共有基因中预选多对以该共有基因为干扰靶标的sirna，使sirna包含有保守基因、超保守基因和/或保守微卫星。
12.合成sirna：合成2条互补的21-25nt的寡核苷酸sirna及起间隔作用的碱基序列。
13.合成shrna：将已合成的2条互补寡核苷酸多肽sirna和起间隔作用的碱基序列进一步合成由中间碱基序列间隔成loop环的小发夹shrna双链。
14.优选sirna：将合成的shrna构建干扰载体，检测其mrna表达、蛋白表达和干扰效果，经sirna设计、合成、筛选、迭代设计和验证，优选具有高沉默效率的sirna。
15.合成优选的sirna和shrna：采用优选的sirna序列合成sirna、shrna，包括为增加稳定性和避免脱靶进行的化学修饰。
16.合成rbd多肽或蛋白：合成位于但不限于冠状病毒s蛋白的第319-510位氨基酸序列、位于但不限于n439、v483和q493位点的保守氨基酸序列及经密码子优化的氨基酸序列。
17.合成ace2多肽或蛋白：合成的ace2包括但不限于全长ace2、第741-763位氨基酸的跨膜ace2、第764-805位氨基酸的胞内ace2、第1-740位氨基酸的胞外ace2以及经氨基酸序列密码子优化的ace2多肽或蛋白。
18.合成rbdncovsirna或ace2ncovsirna：以二硫键、磷酸二酯键、二硫代磷酸脂键、硫醚键、肟键、酰胺键或马来酰亚胺-巯基键等偶联方法将已合成的sirna和rbd或ace2连接、合成为化合物；或根据sirna的核苷酸序列、rbd或ace2的氨基酸序列进行合成。
19.化合物的提纯：以高效液相色谱、反向高效液相色谱或离子交换色谱提纯化合物。
20.化合物的脂质体修饰：通过带负电荷的sirna吸附带正电荷的脂质体制备脂质体修饰化合物；通过氨基的巯基化使巯基与脂质体的马来酰胺形成马来酰亚胺-巯基键制备peg内化的脂质体修饰化合物；通过氨基末端与脂质体形成氨甲酸酯键制备脂质体修饰化合物。
21.本发明的有益效果在于：
22.本发明从不随或几乎不随病毒变异而变异的冠状病毒保守基因、超保守基因和/或保守微卫星中筛选sirna，使这种sirna具有广谱抗变异毒株的靶向基因治疗作用。
23.首次发现新型靶向递送载体rbd和ace2，并将sirna分别和rbd或ace2合成以rbd或 ace2为靶向递送载体的广谱抗变异毒株基因治疗药物rbdncovsirna或ace2ncovsirna。
24.冠状病毒特异性感染表达ace2的靶细胞，目前还没有将抗冠状病毒的sirna/shrna特异性递送给病毒感染细胞而不递送给未感染细胞的靶向递送载体。本发明根据配体rbd与受体 ace2的特殊关系，将sirna分别与rbd或ace2合成为rbdncovsirna或ace2ncovsirna，使 rbdncovsirna被rbd靶向递送给ace2表达细胞；而ace2ncovsirna被
ace2靶向递送给冠状病毒rbd，进而被病毒递送给ace2表达细胞。从而可避免非特异性递送sirna的副作用。
25.寡核苷酸sirna或shrna带负电荷、脂溶性、不易通过细胞膜、极易被核酸酶降解，所以很难将寡核苷酸递送到靶细胞浆进行rnai，但本发明将寡核苷酸与rbd或ace2多肽合成为化合物后，能使寡核苷酸易通过细胞膜、不易被核酸酶降解、易被递送到靶细胞浆。
附图说明
26.图1是本发明筛选ncovsirna药物的技术线路图。
27.图2是本发明将sirna与rbd或ace2合成的以rbd或ace2靶向递送shrna的示意图。
28.图3是本发明以rbd或ace2靶向递送sirna的脂质体修饰示意图。
29.在图1中，经超保守基因、保守基因和/或保守微卫星的筛选、以保守基因为靶标的广谱抗变异毒株靶标sirna筛选、sirna合成、rbd或ace2的合成、sirna与rbd或ace2的连接，最终合成以rbd或ace2靶向递送的ncovsirna药物。
30.在图2中，1为loop环，2为由两条互补的正反义链(sirna)形成的shrna，3为两条rbd 或ace2多肽(蛋白)，两条rbd或ace2分别与shrna正反义链相连接。shrna被rbd或ace2 保护，能被rbd靶向递送至ace2受体；或被ace2靶向递送至病毒rbd，然后通过病毒递送至ace2受体；最后均通过ace2受体通道特异性进入靶细胞浆，降解病毒靶基因。
31.在图3中，1为被脂质体包裹的sirna，2为脂质体层，3为peg层，4为rbd或ace2。其中sirna起rnai作用，脂质体起保护sirna和引起细胞内吞作用，peg使sirna缓慢释放和长效循环，rbd或ace2起靶向递送sirna的作用。其中rbd将sirna靶向递送至ace2受体；而ace2则将sirna靶向递送至病毒rbd，然后通过病毒递送至ace2受体；最后均通过 ace2受体通道特异性进入靶细胞浆，降解病毒靶基因。
具体实施方式
32.下面结合图1，2和3，对本发明的具体实施方法作详细的举例描述，但这些范例性的描述并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
33.一、设计以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的sirna
34.1、超保守基因、保守基因及保守微卫星的设计
35.如技术线路图1所示，从genbank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中下载β冠状病毒属(特别是新型冠状病毒及其变异毒株)全基因组(cdna)序列，在全基因组序列中搜寻最长的公共子序列，获得超保守基因或保守基因；利用clustal w软件对 genbank数据库下载的全基因组进行序列比对，检测不同序列之间的相似度，筛选保守微卫星序列；利用mega6.0分子进化遗传分析软件，用邻接法(neighbour-jioning，n-j)对下载的冠状病毒氨基酸序列构建氨基酸种系分子进化树，对氨基酸序列的分子变异特征进行分析，推断保守基因序列。
36.共找到以下3段最长及次长的超级保守子序列(没有插入或删除的完全相同的子序列)，其长度为22～30bp,与小rna长度相当，但在高等生物特别是人类中不包含这3段子序列。
37.具体序列如下：
38.seq id no.1(subsequence 1)＝ttaatacgacctctctgttggattttgaca(30bp)；
39.seq id no.2(subsequence 2)＝ggttcgcaacttcacaca gagt(22bp)；
40.seq id no.1(subsequence 3)＝caggcgtttgttggttgattaa(22bp)。
41.共找到以下3段最长及次长的保守子序列，它们的长度为22～30bp,与小rna长度相当，但在高等生物特别是人类中不包含这3段保守子序列：
42.seq id no.4(subsequence 1)＝gttttacgacaacgatgttggtttaggaca(30bp)；
43.seq id no.5(subsequence 2)＝ggttcggttgttatatacgata(22bp)；
44.seq id no.6(subsequence 3)＝ggttcagagagtctcctattta(22bp)。
45.共找到以下5个由核苷酸重复多次的保守微卫星位点，微卫星分别为ctctct、agagag、 aaaaaaa、tatata、cacaca。
46.2、sirna的常规设计及其常见变异株间的比对
47.根据上述从genbank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)下载的β冠状病毒属(特别是新型冠状病毒及其变异毒株)的完整基因组(cdna)序列，利用ambion公司的 shrna在线设计软件(http://www.ambion.com/techlib/misc/sirnatools.html)获得长度约为19nt的多个sirna备选序列，根据rna结合的tm值及特异性比对结果，优选sirna。例如，据此本技术从nc_045512.2株、delta变异株、omicron变异株的e、m、n、orf1ab及s基因中分别优选到表1-5所示的候选sirna，表中“钭黑体”序列为三种毒株的共有sirna序列(如表1中的)，即尽管nc_045512.2 株变异为delta株和omicron株，但是各毒株中仍保持不变且理论上具有靶向干扰作用的保守序列(sirna)，如果靶向干扰这些sirna序列，即可广谱杀灭相应的变异毒株。
48.表1新型冠状病毒nc_045512.2株、delta株、omicron株e基因的sirna候选序列
[0049][0050]
表2新型冠状病毒nc_045512.2株、delta株、omicron株m基因的sirna候选序列
[0051][0052]
表3新型冠状病毒nc_045512.2株、delta株、omicron株n基因的sirna候选序列
[0053]
[0054]
表4新型冠状病毒nc_045512.2株、delta株、omicron株orf1ab基因的sirna候选序列
[0055][0056]
表5新型冠状病毒nc_045512.2株、delta株、omicron株s基因的sirna候选序列
[0057][0058]
3、筛选以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的sirna
[0059]
利用clustal w软件或其他软件，将上述设计的超保守基因、保守基因及保守微卫星与常规筛选的sirna进行基因序列比对，检测不同序列之间的相似度，设计既为超保守基
因、保守基因或保守微卫星，又为rnai靶位点的多对sirna(设计以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的sirna)。
[0060]
(1)以超保守基因和保守微卫星为靶标的sirna(s1/s2)：
[0061]
seq id no.1(subsequence 1)＝ttaatacgacctctctgttggattttgaca(30bp)；
[0062]
seq id no.2(subsequence 2)＝ggttcgcaacttcacaca gagt(22bp)；
[0063]
(2)以保守基因和保守微卫星为靶标的sirna(s3/s4)：
[0064]
seq id no.5(subsequence 3)＝ggttcggttgttatatacgata(22bp)；
[0065]
seq id no.6(subsequence 4)＝ggttcagagagtctcctattta(22bp)。
[0066]
通过上述设计，获得以超保守基因、保守基因或保守微卫星为干扰靶标的在理论上抗冠状病毒变异毒株的sirna，命名为sirna1/2/3/4。
[0067]
二、验证以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的sirna功能
[0068]
1、合成sirna/shrna
[0069]
根据psilencer4.1.cmv.neo干扰载体的多克隆酶切位点设计能表达发夹结构的shrna 模板，每个模板由两条大部分互补的55bp的单链dna构成，退火互补后能形成带有bamh i 和hind iii酶切位点粘性末端的dna双链，用于与线性化的psilencer4.1.cmv.neo的连接。然后按设计的sirna及其shrna模板，委托公司合成，所合成的sirna/shrna序列如下：
[0070]
seq id no.1(subsequence 1)＝ttaatacgacctctctgttggattttgaca(30bp)；
[0071]
seq id no.2(subsequence 2)＝ggttcgcaacttcacaca gagt(22bp)；
[0072]
seq id no.5(subsequence 3)＝ggttcggttgttatatacgata(22bp)；
[0073]
seq id no.6(subsequence 4)＝ggttcagagagtctcctattta(22bp)。
[0074]
2、shrna表达载体的构建
[0075]
将上述合成的shrna分别与线性化的干扰载体psilencer4.1.cmv.neo进行连接和鉴定，构建shrna表达质粒，转化dh5a，获得shrna表达载体。
[0076]
3、shrna表达(干扰)载体的效果鉴定
[0077]
根据合成的sirna/shrna序列，构建荧光标签载体，并分别与shrna表达质粒共转染 293t细胞，进行鉴定，或以pcr扩增shrna。常规方法如下：
[0078]
shrna引物设计：参照网上在线引物设计软件，设计上、下游引物，在上游引物5'端添加起始密码，为将扩增产物克隆到pegfp-n1中，引物的5'端添加用于与载体发生同源重组的同源臂。
[0079]
shrna基因扩增：按上海生工试剂盒所提供的基因扩增反应体系及反应条件进行基因扩增、产物回收和纯化，获得扩增产物。
[0080]
pegfp-n1的线性化：复苏含有pegfp-n1质粒的dh5a菌种，按试剂盒提取质粒，测定浓度后进行酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收线性化的载体。
[0081]
将扩增的shrna与荧光标签载体(pegfp-n1)进行连接：使用金斯瑞公司的同源重组试剂盒进行连接，连接结束后可保存在-20℃备用或马上进行转化。
[0082]
shrna干扰载体的效果鉴定：分别将干扰载体(psilencer-shrna1/2/3/4)和荧光标签载体(pegfp-shrna1/2/3/4)共转染293t细胞，干扰载体与标签载体的质量比为1：2，同时设立对照，转染后48h观察细胞内gfp蛋白的融合表达，根据荧光强度评价干扰效果：
[0083]
流式细胞检测：为定量分析不同干扰载体的干扰效果，用流式细胞术检测，分析荧光蛋白表达细胞在总细胞数中的比例。
[0084]
westernbolt分析：
①
细胞收集与裂解：以ripa裂解细胞。
②
sds-page蛋白电泳：制备 sds-page胶，将样品加入等体积的2xsds缓冲液，沸水煮5min，冰浴2min，12000xg，10min。
③
western blot检测：经转膜、封闭、一抗结合、洗涤、二抗结合和显色，观察结果。
[0085]
rt-pcr检测mrna：采用相对荧光定量rt-pcr法检测转染细胞中基因的相对表达量，根据标准曲线，由ct值换算目的基因以及b-actin内参基因拷贝数，以b-actin内参基因校正病毒基因mrna相对表达量(目的基因拷贝数/b-actin拷贝数)，定量评价干扰效果。
[0086]
4、获得高沉默效率的sirna/shrna
[0087]
经上述设计、合成、筛选、迭代设计、合成和验证，获得以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的sirna/shrna：
[0088]
seq id no.1(subsequence 1(shrna1))＝ttaatacgacctctctgttggattttgaca；
[0089]
seq id no.2(subsequence 2(shrna2))＝ggttcgcaacttcacaca gagt；
[0090]
seq id no.5(subsequence 3(shrna3))＝ggttcggttgttatatacgata。
[0091]
三、合成以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的sirna/shrna
[0092]
根据上述筛选的以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的sirna1/2/3，委托生物公司，合成19-25nt的寡核苷酸多肽sirna,用于进一步连接rbd或ace2多肽(蛋白)。或合成2条互补的19-25nt的寡核苷酸多肽sirna，以及合成起间隔作用的9nt的碱基序列，然后将所合成的sirna和碱基序列进一步连接成由中间碱基序列间隔成loop环的小发夹 shrna双链，使所合成的shrna双链的每条单链均可以分别连接rbd或ace2多肽(蛋白)。
[0093]
例如，分别将seq id no.1(shrna1)、seq id no.2(shrna2)和seq id no.5 (shrna3)合成 5'-ttaatacgacctctctgttggattttgacattcaagagatgtcaaatccaacagagaggtcgtattaa-3'(seqid no.42)、5'-ggttcgcaacttcacacagagtttcaagagaactctgtgtgaagttgcgaacc-3'(seq idno.43)和5'-ggtt cggt tgtta tatac gata ttcaagaga tatc gtata taaca accg aacc-3'(seqid no.44)，其中“ttcaagaga”为loop环，其左、右侧分别为互补的正反义链，seq idno.42～44可分别合成shrna1、shrna2和shrna3。同理可从表1-5中进一步优选高沉默效率的sirna，合成shrna，在其3'和/或5'分别连接rbd或ace2多肽。
[0094]
四、靶向递送载体rbd或ace2的设计和合成
[0095]
1、rbd的氨基酸序列及合成设计：根据全球共享禽流感数据库(gisaid)和genbank数据库收集sars-cov、mers、sars-cov-2的s蛋白基因序列，进行氨基酸系统进化树分析，或经序列同源性分析，确定rbd中能与人ace2受体结合并且不易发生变异的保守氨基酸序列位点n439、v483和q493。另外根据sars cov s蛋白由1255个氨基酸组成、可被酶解为s1受体结合区(rbd)和s2膜融合区、rbd定位于s蛋白的第319到510位氨基酸(aa319-510)、 rbd通过其c端与ace2的细胞膜外n端结合、rbd能单独通过ace2进入靶细胞、rbd s蛋白 n连接的糖基化的去除不会影响rbd s蛋白的功能、sars-cov-2rbd(aa.331-550)中有3个 n-糖基化残基(n331,n343,n360)、组成肽链的色氨酸、组氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸都有多个n等特点，可设计rbd的合成，以及将rbd与脂质体或shrna进行连接。
[0096]
2、rbd的合成：以氨基酸合成多肽通常是由两个氨基酸脱水缩合形成肽键，由多个氨基酸残基以肽键相连接形成多肽。可委托公司，参照rbd序列(seq id no.45)采用多肽合
成仪自动化合成位于s蛋白的第319-510位氨基酸序列、位于能与ace2结合但不易发生变异的n439、v483和q493位点的保守氨基酸序列以及经密码子优化的氨基酸序列。其基本方法是，按被合成多肽的氨基酸序列逐个加入氨基酸，使肽链从c端到n端残基逐步延长，要求每一个氨基酸残基以一端保护和另一端活化的形式缩合，并且在每一轮肽链延长循环后除去氨基上的临时性保护基团，直至目标多肽的全部氨基酸序列缩合完毕。目前常用的固相合成多肽的反应原理是在密闭的防爆玻璃反应器中使氨基酸按照已知的序列从c端-羧基端向n端-氨基端的顺序不断添加所需氨基酸，进行合成反应，最终得到多肽。其主要步骤包括：
①
去保护：用碱性溶剂去除氨基的保护基团；
②
激活和交联：活化下一个氨基酸的羧基，使活化的单体羧基与游离的氨基交联，形成肽键，反复循环这两步反应，直到多肽合成完成。
[0097]
3、ace2的合成设计
[0098]
从ace2的氨基酸序列及ace2的受体作用可知，ace2表达细胞的细胞壁和细胞膜均存在 ace2受体通道，全长ace2(seq id no.46)、胞外ace2(seq id no.47)、跨膜区ace2(seqid no.48)及胞内ace2(seq id no.49)均属于穿膜多肽，具有靶向递送sirna的功能，胞外ace2的n端具有结合冠状病毒rbd的中和病毒功能。可设计并合成全长ace2、第741-763 位氨基酸的跨膜ace2、第764-805位氨基酸的胞内ace2、第1-740位氨基酸的胞外ace2，以及优化氨基酸序列的ace2多肽作为sirna的靶向递送载体。
[0099]
4、ace2的合成
[0100]
两个氨基酸脱水缩合形成肽键，多个氨基酸残基以肽键相连接形成多肽。可委托公司采用多肽合成仪自动化合成多肽，基本方法同rbd的合成，按合成多肽的序列逐个加入氨基酸，使肽链从c端到n端残基逐步延长，要求每一个氨基酸残基以一端保护和另一端活化的形式缩合，并且在每一轮肽链延长循环后除去氨基上的临时性保护基团，直至目标多肽的全部氨基酸序列缩合完毕。目前常用的固相合成多肽的反应原理是在密闭的防爆玻璃反应器中使氨基酸按照已知的序列从c端-羧基端向n端-氨基端的顺序不断添加所需氨基酸，进行合成反应，最终得到多肽。其步骤包括：
①
去保护：用碱性溶剂去除氨基的保护基团；
②
激活和交联：活化下一个氨基酸的羧基，使活化的单体羧基与游离的氨基交联，形成肽键，反复循环这两步反应，直到多肽合成完成。
[0101]
五、rbdncovsirna或ace2ncovsirna的合成
[0102]
1、合成
[0103]
如图2所示，根据上述设计及seq id no.42～44、rbd序列(seq id no.45)和ace2序列(seq id no.46～49)，可委托公司，采用多肽与寡核苷酸的常规合成方法，以肟键、酰胺键、硫醚键、二硫键、磷酰键、腙键、酰脲键、磷酸二酯键、二硫代磷酸脂键、马来酰亚胺
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巯基键等形式将上述合成的sirna、rbd或ace2偶联成缀合物，包括多肽和寡核苷酸的正义链(5'末端、3'末端)或反义链(3'末端)以较牢固的共价键、较松散的离子键、疏水键或以带间隔臂的羧腙键进行非共价或共价交联，合成多肽-寡核苷酸偶联物(pocs)。目前最常用的合成pocs法是共价交联-液相片段合成法，已广泛应用于合成各种pocs，其主要步骤是：分别在固相基质上分别合成多肽和寡核苷酸，然后同时将两个合成物从固相基质上剥离，所剥离的多肽和寡核苷酸在溶液中通过反应活性基团进行偶联。合成pocs主要包括：
①
马来酰亚胺-巯基偶联：在多肽或寡核苷酸上修饰马来酰亚胺，在另一单体上修饰巯基，然后将
mol/l hcl 4ml中，加入内壁涂布脂膜的烧瓶中，于室温孵育30min，轻摇使脂膜充分分散。于混悬液中加10mum/l(ph 9.0)tris缓冲液20ml，混匀，氮气保护，于4℃孵育过夜。将样品置于分子质量为5kd的透析袋中，在10mmol/l(ph 7.4)tris缓冲液中透析约4h，再用去离子水于4℃透析24h，取出袋内溶液，冷冻干燥，置-20℃冰箱内保存。
[0116]
(4)rbd-sirna/lip的合成：如图3所示，将epc(蛋黄磷脂)、ch(胆固醇)、peg
2000-dspe (二硬脂酰乙醇胺聚乙二醇2000)和dotap(二油酰三甲胺丙烷)的氯仿溶液按摩尔比 (60:34:3.0:3.0)混合，如需标记脂膜，于上述混合液中加入占总脂质量摩尔比为0.1％ rho-pe，减压除尽氯仿，形成脂膜。将一定量的sirna(seq id no.5)溶于经depc处理的超纯水中，sirna用量应完全中和dotap所带的正电荷。于50℃水浴中用含sirna的水溶液将上述磷脂膜水化30min，形成包裹sirna的脂质体。用手动挤出装置(avanti polar lipids)，将初步形成的脂质体分别过0.4μm和0.1μm的聚碳酸酯核孔膜(whatman)10次，制备粒径均一的脂质体。取适量rbd-peg-dppe溶于甲醇中，置烧瓶，氮气吹干成膜，加入制备的脂质体悬液，于37℃水浴温浴2h，使rbd-peg-dppe定向地插入到脂质体的外层膜上。其中rbd在脂质体中占总脂质的摩尔比一般为0.5％～1.o％(可适当调整)。用动态激光散射、冰冻蚀刻电子显微镜、核酸电泳检验rbd修饰的包载sirna的聚乙二醇修饰的脂质体的特性。
[0117]
七、化合物(ncovsirna)的验证
[0118]
1、体外验证以保守基因为靶标的广谱抗病毒效果
[0119]
(1)病毒液的准备
[0120]
在vero e6细胞生长至30％汇合度的dmem培养液(10％fbs)中加入病毒株，36℃、5％co2培养箱培养5～7d，至出现细胞病变效应(cpe)时，分离病毒，用培养液配成103～10
5 tcid
50
/ml病毒液备用。据此分别准备新冠病毒的两种变异毒株b.1.617.1和b.1.617.2的病毒液，用于验证化合物是否对2种或以上含有相同保守基因的变异病毒同时有效，以证明本发明的sirna是否具有以保守基因为靶标的广谱抗病毒效果。
[0121]
(2)化合物(ncovsirna)和病毒共培养
[0122]
分别设立实验组和对照组，试验化合物对抗b.1.617.1和b.1.617.2的效果。每组接种8 孔板，每孔2
×
105个vero-e6细胞、2ml dmem培养液(10％fbs)，置36℃、5％co2培养箱中培养至30％汇合度时(24h后)，更换培养液，同时加入试验化合物、b.1.617.1和b.1.617.2 株病毒液。
[0123]
其中实验组包括:rbdncovsirna组(0.1nmol rbdncovsirna+0.6ml病毒液)、 ace2ncovsirna组(0.1nmol ace2ncovsirna+0.6ml病毒液)、rbd-sirna/lip组(0.1nmolrbd-sirna/lip+0.6ml病毒液)、对照组包括：naked sirna组(0.1nmol naked sirna+0.6 ml病毒液)、阳性对照组(0.6ml病毒液)、阴性对照组(0.6ml dmem培养液)(表1-6)。
[0124]
继续培养，然后于培养1小时、24小时和72小时后每组各取上清液，以1:4、1:12、 1:36、1:108、1:324、1:972、1:2916、1:8748倍稀释，进行rt-pcr检测。
[0125]
(3)实时荧光rt-pcr检测各组病毒rna
[0126]
病毒核酸提取和核酸(orf1ab/n)检测按试剂盒说明书操作。
[0127]
(4)病毒rna检测结果
[0128]
①
b.1.617.1株检测结果：如表1所示，各组细胞培养1h后，阴性对照组病毒rna检测结果为阴性，阳性对照组rna检测结果的滴度为1:36，其他各组rna检测结果滴度均为1:
12。如表2所示，各组细胞培养24h后，阴性对照组病毒rna检测结果仍为阴性，阳性对照组和naked sirna组rna检测结果滴度均为1:324，实验组的rna检测结果滴度均为1:36，明显低于对照组(p＜0.01)。如表3所示，各组细胞培养72h后，阴性对照组病毒rna检测结果仍为阴性，naked sirna组和阳性对照组rna检测结果滴度为均1:2916，实验组的rna检测结果滴度为1:108～1:324，明显低于对照组(p＜0.05)。表1-3说明，实验组具有明显的抗 b.1.617.1株作用，说明与rbd或ace2连接的sirna能被递送至靶细胞内进行rna干扰，而未与rbd或ace2连接的sirna不能进入靶细胞内，不能发挥rna干扰的作用。
[0129]
表1化合物与b.1.617.1株共培养1小时培养液中病毒rna rt-pcr检测结果(+/-)
[0130][0131][0132]
表2化合物与b.1.617.1株共培养24小时培养液中病毒rna rt-pcr检测结果(+/-)
[0133][0134]
表3化合物与b.1.617.1株共培养72小时培养液中病毒rna rt-pcr检测结果(+/-)
[0135][0136]
②
b.1.617.2株检测结果：如表4所示，各组细胞培养1h后，阴性对照组病毒rna检测结果为阴性，阳性对照组rna检测结果的滴度为1:36，其他各组rna检测结果滴度均为1:12。如表5所示，各组细胞培养24h后，阴性对照组病毒rna检测结果仍为阴性，naked sirna 组和阳性对照组rna检测结果滴度均为1:972，实验组的rna检测结果滴度为1:108～1:324，明显低于对照组(p＜0.05)。如表6所示，各组细胞培养72h后，阴性对照组病毒rna检测结果仍为阴性，naked sirna组和阳性对照组rna检测结果滴度均为1:8748或以上，实验组的 rna检测结果滴度为1:324～1:972，与对照组相比仍有明显的差异(p＜0.05)。表4-6说明，实验组具有明显的抗b.1.617.2株作用，说明与rbd或ace2连接的sirna能被递送至靶细胞内进行rna干扰，而未与rbd或ace2连接的sirna不能进入靶细胞内，从而不能发挥rna干扰的作用。表1-6表明，实验组同时具有抗b.1.617.1和b.1.617.2的作用，说明实验组以保守基因为靶标的sirna具有广谱抗变异毒株的效果。
[0137]
表4化合物与b.1.617.2株共培养1小时培养液中病毒rna rt-pcr检测结果(+/-)
[0138][0139]
表5化合物与b.1.617.2株共培养24小时培养液中病毒rna rt-pcr检测结果(+/-)
[0140][0141]
表6化合物与b.1.617.2株共培养72小时培养液中病毒rna rt-pcr检测结果(+/-)
[0142][0143]
2、动物体内验证rbd和ace2的靶向递送功能
[0144]
(1)动物分组和接种
[0145]
动物分组：选择6-8周龄、40克左右的spf级雌性balb/c小鼠，随机分为rbdncovsirna 组(接种rbdncovsirna+b.1.617.2)、ace2ncovsirna组(接种ace2ncovsirna+b.1.617.2 株)、naked sirna组(接种naked sirna+b.1.617.2株)，阳性对照组(接种b.1.617.2株+ 生理盐水)和阴性对照组(仅接种生理盐水)。
[0146]
动物接种：经鼻腔喷雾接种40μl滴度为105/mltcid
50
的b.1.617.2株病毒液，阴性对照组经鼻腔喷雾接种40μl生理盐水。以腹腔注射5％水合氯醛溶液麻醉，分别将0.1nmol 的rbdncovsirna、ace2ncovsirna、naked sirna缓慢注入小鼠气管，复位组织，在感染后第 7天每组处死10只小鼠，进行病毒检测。
[0147]
(2)以细胞半数感染量(tcid
50
)的百分率检测病毒
[0148]
将处死小鼠肺组织制备10％匀浆，取100pl离心后上清，以10倍递次稀释，接种于veroe6 单层生长的96孔板，每孔30μl，每个稀释度接种4个孔，轻摇匀浆，放37℃吸附lh，以hank 氏液清洗，加培养液，放37℃c02培养箱培养，观察细胞病变效应(cpe)，分别计算各组veroe6 细胞半数感染量(tcid
50
)的百分率，百分率越大病毒含量越多，见表7-11。
[0149]
表7 rbdncovsirna组小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0150][0151]
表8 ace2ncovsirna组小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0152][0153]
表9 naked sirna组小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0154][0155][0156]
表10阳性对照组小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0157][0158]
表11阴性对照组小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0159][0160]
(3)rbd或ace2靶向递送的效果
[0161]
从表7-11可知，各组小鼠肺匀浆(稀释度为101)致veroe6半数感染量的百分率分别为 rbdncovsirna组25.0％、ace2ncovsirna组30.0％、naked sirna组92.5％、阳性对照组95.0％、阴性对照组5.0％。因为rnai主要发生在细胞浆内，naked sirna极易被核酸酶降解、不易通过细胞膜，所以几乎不起rnai作用，与阳性对照组相比无显著性差异(p＞0.05)； rbdncovsirna组和ace2ncovsirna组中的sirna被蛋白多肽保护、不易被核酸酶降解并被 rbd或ace2靶向递送至靶细胞浆，所以其rnai效果较好，其中rbdncovsirna组和 ace2ncovsirna组与naked sirna组及阳性对照组相比，均有显著性差异(p＜0.05)。