一种治疗结直肠癌的中药及其制备方法

1.本发明涉及中药制剂及制法，具体涉及一种以中草药为原料制成的治疗结直肠癌的中药制剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.2020年全球统计数据表明，结直肠癌已成为男性发病顺位第3、女性发病顺位第2、死亡率位居第3的高发恶性肿瘤；每年有超过180万例患者被诊断为结直肠癌，约90万例患者死于结直肠癌；预计到2030年，全球每年结直肠癌新发病例约220万例，死亡病例将达110万例，疾病负担增加约60％。中国癌症谱系处于从发展中国家向发达国家转变的转型期，结直肠癌属西化生活方式相关癌症，近年来，中国结直肠癌的发病率有所上升，居恶性肿瘤发病顺位第3，且发病呈逐年增长趋势,结直肠癌负担更在迅速增加。可见，结直肠癌已成为严重威胁全人类生命健康的高发恶性肿瘤，降低结直肠癌的发病率和死亡率，提高结直肠癌患者生存率及生存质量成为亟待解决的难题。
3.中医药治疗结直肠癌，历经数千年临床实践，其疗效毋庸置疑，是恶性肿瘤综合治疗的重要组成部分；中医药治疗结直肠癌，以中医理论为指导，采用辨证论治方法，通过中药复方，在全球抗结直肠癌中广泛研究和应用，具有成本低、多靶点、多成分、毒副作用少等特点，在增强机体免疫、控制肿瘤大小，延长肿瘤患者生存期、抗肿瘤转移等方面发挥重要作用；在全世界范围内，中医药在临床实践中已被证明是治疗结直肠癌的有效方法。


技术实现要素：

4.本发明提供一种疗效显著、副作用小的治疗结直肠癌，特别是针对结直肠癌手术、放疗和化疗后“阴阳俱损、癌毒内伏”证患者的中药及其制备方法，解决现有西药的毒副作用大、成本高昂、很难防治结直肠癌的复发和转移等技术问题。
5.本发明采用以下技术方案：一种治疗结直肠癌的中药，由以下重量份数的原料药制成：补骨脂6-10份、生地10-15份、炮姜3-9份、木瓜6-18份、砂仁3-6份、茯神10-25份、仙鹤草10-14份、薏仁10-30份、人参3-6份、三棱5-10份、莪术6-12份、黄连2-5份、苦参5-9份。
6.所述治疗结直肠癌的中药，由以下重量份数的原料药制成：补骨脂8份、生地12份、炮姜6份、木瓜9份、砂仁4份、茯神15份、仙鹤草12份、薏仁20份、人参5份、三棱7份、莪术9份、黄连4份、苦参7份。
7.所述治疗结直肠癌的中药，所述薏仁为炒薏仁、莪术为醋莪术。
8.所述治疗结直肠癌的中药，中药的制备方法为：以上十三味，炮姜、三棱、莪术用水蒸气蒸馏法提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣与其余补骨脂等十味，加水煎煮二次，加水煎煮二次，第一次加入全药材重量10倍量的水，第二次加入全药材重量8倍量的水，每次1.5-2小时，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，减压浓缩成生药量为2g/ml的浸膏，加辅料，混匀，制成颗粒，干燥，喷入上述挥发油，混匀，制备成固体制剂。
9.所述治疗结直肠癌的中药，固体制剂为片剂、胶囊剂或颗粒剂中的一种。
10.所述治疗结直肠癌的中药，辅料为糊精或蔗糖中的一种。
11.所述治疗结直肠癌的中药在治疗治疗结直肠癌药物中的应用。
12.所述治疗结直肠癌的中药在治疗治疗结直肠癌药物中的应用，结直肠癌的中医证型为结直肠癌手术、放疗和化疗后“阴阳俱损、癌毒内伏”证。
13.有益效果：中医正邪理论认为，恶性肿瘤与正虚密切相关，古人云：“壮人无积，虚人则有之”；《外证医案汇编》云：“正虚则为岩”；《医宗必读》曰：“积之成也，正气不足而后邪居之”；中医阴阳理论认为，恶性肿瘤是阴阳失和的产物，《诸病源候论》曰:“积聚者，由阴阳不和，脏腑虚弱，受于风邪，搏于脏腑之气所为也。”国医大师周仲瑛教授根据60余年临床经验提出癌毒病机理论，认为癌毒是在恶性肿瘤发病过程中体内产生的一种特殊的病理因素，由风、火(热)、痰、瘀、湿、寒等病理因素互相搏结，积渐生变，酿生癌毒，癌毒是恶性肿瘤发生、发展、转移和复发的关键。结直肠癌属中医“锁肛痔”、“脏毒”、“积聚”等范畴，是全身性疾病的局部表现。
14.申请者在中医阴阳理论、正邪理论和癌毒理论基础上，结合多年肿瘤临床实践，提出恶性肿瘤患者多表现为“阴阳俱损、癌毒内伏”证，提出“温滋解毒法”辨治恶性肿瘤，常获佳效，并在多年肿瘤临床积累过程中形成针对“阴阳俱损、癌毒内伏”证的结直肠癌患者的有效处方
‑‑‑
本发明温滋解毒方(以下简称wjr)。该方以补骨脂补肾温阳，合生地黄补肾滋阴为君药；以炮姜、砂仁、茯神、木瓜4味中药温中健中、健脾强胃、疏肝安神，合仙鹤草既补气血、又解热毒、还收敛止血，薏仁祛湿祛痰、加强健中之效，6味中药合用为臣；人参补气，三棱、莪术活血化瘀、软坚破结，共为佐药；苦参、黄连清热燥湿为使药。全方以补骨脂合中医经典名方琼玉膏(原方生地、人参、茯苓、白蜜4味)为基础方药，加少量人参守五脏精气，加解热毒、湿毒、痰毒和瘀毒的祛邪小方，由13味中药组成，针对结直肠癌尤其是手术、放疗和化疗后“阴阳俱损、癌毒内伏”的患者，发挥温滋同用、阴阳并调、扶正驱邪之作用。
15.该方不同于其他抗结直肠癌中药复方的主要特点在于，目前中药抗结直肠癌复方多以人参或党参、黄芪，白术等补气补血药为主要扶正抗癌药，用半枝莲、蛇舌草、红藤、败酱草等清热解毒药和丹参、丹皮、当归、水蛭等活血化瘀药为主要祛邪抗癌药。温滋解毒方在温滋解毒法指导下，以温补肾阳药合滋补肾阴药为主要扶正抗癌药，以健脾强胃、安神疏肝、淡渗利湿为辅助抗癌药，以少量补气药、活血化瘀药合清热解毒药为佐使抗癌药。使得结直肠癌患者在临床中医药治疗中除了常用清热解毒法、活血化瘀法、补气养血法、健脾补肾法等常用中医治法之外，又多了一种融以上诸法于一体的重要治法——温滋解毒法，并凝练成临床疗效好、毒副作用少、适合长期服用的温滋解毒方，增强了中药防治手段，提高了中药防治结直肠癌的疗效。
附图说明
16.图1为本发明中药体内抗肿瘤效应h&e染色示意图；a为阴性对照组(nc)，b为低剂量wjr组(ld)，c为中剂量wjr组(md)，d为高剂量wjr组(hd)，e为阳性对照组(pc)。
17.图2为本发明中药体外抗肿瘤效应hoechst 33258染色示意图；a为阴性对照组(nc)，b为低剂量wjr组(ld)，c为中剂量wjr组(md)，d为高剂量wjr组(hd)。
具体实施方式
18.实施例1：取补骨脂6g、生地15g、炮姜3g、木瓜18g、砂仁3g、茯神25g、仙鹤草10g、薏仁30g、人参3g、三棱10g、莪术6g、黄连5g、苦参5g，以上十三味，炮姜、三棱、莪术用水蒸气蒸馏法提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣与其余补骨脂等十味，加水煎煮二次，第一次加入全药材重量10倍量的水，第二次加入全药材重量8倍量的水，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，减压浓缩成生药量为2g/ml的浸膏，加淀粉，混匀，制成颗粒，干燥，喷入上述挥发油，混匀，压片，制备成片剂。
19.实施例2：取补骨脂10g、生地10g、炮姜9g、木瓜6g、砂仁6g、茯神10g、仙鹤草14g、薏仁10g、人参6g、三棱5g、莪术12g、黄连2g、苦参9g，以上十三味，炮姜、三棱、莪术用水蒸气蒸馏法提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣与其余补骨脂等十味，加水煎煮二次，第一次加入全药材重量10倍量的水，第二次加入全药材重量8倍量的水，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，减压浓缩成生药量为2g/ml的浸膏，加辅料，混匀，制成颗粒，干燥，喷入上述挥发油，混匀，灌胶囊，制备成胶囊剂。
20.实施例3：取补骨脂8g、生地12g、炮姜6g、木瓜9g、砂仁4g、茯神15g、仙鹤草12g、薏仁20g、人参5g、三棱7g、莪术9g、黄连4g、苦参7g，以上十三味，炮姜、三棱、莪术用水蒸气蒸馏法提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣与其余补骨脂等十味，加水煎煮二次，第一次加入全药材重量10倍量的水，第二次加入全药材重量8倍量的水，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，减压浓缩成生药量为2g/ml的浸膏，加辅料，混匀，制成颗粒，干燥，喷入上述挥发油，混匀，制备成颗粒剂。
21.实施例4：体内抗肿瘤效应
22.实验器材：倒置荧光显微镜nikon eclipse ti-sr(日本nikon公司)；jb-p5型石蜡包埋机(武汉俊杰电子有限公司)；rm2016型石蜡切片机(上海徕卡仪器有限公司)；无毒环保苏木素-伊红(h-e)染液(南京建成科技有限公司，批号：20190404)
23.实验动物：balb/c雄性小鼠60只，4-6周龄，体质量(20
±
2)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
24.实验过程：
25.1.药物的制备
26.按上述实施例3方法制备温滋解毒方(以下简称wjr)，置于-20℃保存。参照人与小鼠等效剂量换算公式，分为低剂量、中剂量和高剂量组。
27.2.动物饲养及造模
28.饲养：这些动物实验是按照南京中医药大学实验动物伦理委员会批准的指南进行的。小鼠分笼饲养，每笼5只，在特定的无病原条件下饲养，自由饮水进食。控制室温20℃～25℃，相对湿度65～70％，光照/暗照循环周期为12小时，室内通风良好。
29.造模：将ct26细胞(5
×
106/只)皮下注射于小鼠腹侧，建立结直肠癌异种移植模型。每天评估小鼠的肿瘤形成情况，肿瘤直径》3mm视为肿瘤形成。
30.给药及分组：当肿瘤直径达到5-6mm时，将小鼠随机分为5组(每组10只)：对照组(nc，等体积生理盐水)、wjr低剂量组(wjrl)、wjr中剂量组(wjrm)、wjr高剂量组(wjrh)和奥沙利铂组(pc)。小鼠通过灌胃给予相应剂量的药物，每天一次，连续10d，对照组给予相当剂量的生理盐水。阳性对照组给予奥沙利铂腹腔注射8mg/kg,1次/3天。连续给药14d。最后一
次给药后24h内处死小鼠，采集肿瘤进一步分析。
31.3.wjr的体内抗肿瘤效应
32.给药的14d内，每2-3d对小鼠称重1次，用游标卡尺测量并记录移植瘤的长径(a)和短颈(b)，通过公式v＝(a
×
b2)/2来计算肿瘤体积。末次给药24h内，通过颈脱臼法处死小鼠，通过外科手术的方法分别取空白对照组、wjr低剂量组、wjr中剂量组、wjr高剂量组和阳性对照组肿瘤组织。通过he染色，来观察不同组别肿瘤组织的变化。
33.(1)用福尔马林固定将肿瘤组织固定。
34.(2)石蜡包埋及切片：按常规方法进行脱蜡，水合，将切片用二甲苯浸泡5min，更换二甲苯后再浸泡5min；分别用无水乙醇中浸泡5min；95％乙醇中浸泡5min；85％乙醇中浸泡5min；70％乙醇中浸泡5min，pbs浸洗3min
×
3次。
35.具体实验步骤：
36.①
浸入试剂盒中试剂一核染液染缸内染色3-5min，水洗约30-60s；
37.②
浸入试剂盒中试剂二分色液i中约20s，水洗约30-60s；
38.③
浸入试剂盒中试剂三分色液ii中约40s，水洗约30-60s；
39.④
置于试剂盒中试剂四染液中染色2min，再用试剂五增色液洗去多余染液，洗两次，滤纸吸干封片镜检；
40.(3)由专业人员，在光镜下观察肿瘤细胞病理形态的变化，根据病变程度，可将肿瘤组织半定量标记为，见表1：
41.表1不同肿瘤组织半定量标记
[0042][0043]
实验结果:
[0044]
我们用结直肠癌荷瘤小鼠模型研究了温滋解毒方(wjr)体内抗肿瘤功效，见图1和表2，模型组(nc)肿瘤生长迅速。与nc组相比，wjr低剂量组(ld)和中剂量组(md)组在一定程度上抑制了肿瘤进展。高剂量组(hd)和奥沙利铂组(pc)治疗对肿瘤进展的抑制作用最强。hd组和pc组的肿瘤体积远小于nc组，hd组与pc组无显着差异。同时，我们还在治疗阶段进行了tgi评分。我们发现ld和md组的tgi显著。但hd组和pc组的tgi更显著，这与肿瘤体积的结果一致。病理观察显示，hd组和pc组肿瘤组织结构出现更明显的广泛性损伤，坏死严重，细胞间隙不规则增宽；然而，ld和md组中的肿瘤组织是中度损伤。总之，这些结果表明wjr在体内可以抑制结直肠癌的肿瘤进展，并且高剂量具有更强的抑制作用。
[0045]
表2.不同组小鼠肿瘤体积比较
[0046][0047]
注：nc代表空白对照组，ld为wjr低剂量组，md为wjr中剂量组，hd为wjr高剂量组，pc为阳性对照组，wjr为温滋解毒方。*代表与nc组相比，p＜0.05；#代表与ld组相比，p＜0.05；&代表与md组相比，p＜0.05。
[0048]
实施例5：体外抗肿瘤效应
[0049]
实验器材：spectrophotometer(德国implen公司)；移液器(德国eppendorf公司)；水平电泳槽dycp-31dn(美国bio rad公司)；酶标仪(美国perkinelmer公司)
[0050]
实验细胞：dld-1人结直肠癌细胞株购于中国科学院上海细胞库；sd大鼠(6～8周，220～250g)，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
[0051]
实验过程：
[0052]
1.含药血清的制备
[0053]
将24只成年sd大鼠(6～8周，220～250g)分为wjr组(n＝12)和对照组(n＝12)。大鼠禁食12小时。根据含药血清的制备方法，采取灌胃给药，2次/d，连续给药3d。最后一次给药后1～2h内视网膜静脉采集血液，以3000rpm的速度离心处理15min，离心分离血清。置于56℃30min，灭火血清内的补体，然后用0.22μm滤膜过滤，将处理好的含药血清置于-20℃下保存。对照组给予相同体积的生理盐水，按照上述方法制备不含药空白对照血清。
[0054]
2.细胞培养
[0055]
①
细胞复苏：取出冻存细胞，置于37℃水浴锅中轻轻晃动加热，完全融化细胞。1000rpm离心处理5min，弃上清液，加含有10％胎牛血清的完全培养吹打细胞，使细胞混匀，将重悬后的细胞接种于培养皿内，置于37℃、5％co2的培养箱内过夜，第2d更换新鲜培养液。
[0056]
②
细胞传代：细胞融合约80％时，吸出原培养基，加入适量pbs清洗3次，加入1ml胰酶，置于37℃培养箱内消化2min，加入完全培养液使消化终止。1000rpm离心处理5min，弃上清液，向其中加入5ml完全培养基，移液枪反复吹打为均匀的细胞悬液，分别接种于新鲜的培养瓶中，加入适量完全培养基。置于37℃、5％co2的培养箱内过夜，第2d更换新鲜培养液。
[0057]
3.mtt
[0058]
①
将对数生长期结直肠癌细胞dld-1以5
×
103/孔接种于96孔板中，并置于37℃、5％co2的培养箱内培养过夜，使细胞附着于96孔板。
[0059]
②
将细胞分为4组：对照组(空白血清)、wjr组(xjr含药血清)。细胞分别按上述分组加入相应的培养基。在37℃、5％co2的培养箱内分别培养12h、24h、36h及48h。
[0060]
③
处理后，每孔加入50μl mtt进一步孵育4h，充分还原mtt。
[0061]
④
然后，向每孔加入150μl dmso，置于平板床上摇匀。
[0062]
⑤
在570nm波长下用酶标仪测量各孔的吸光度(optical density，od)。细胞活性(％)＝(给药组的平均od值/对照组的平均od值)
×
100％。
[0063]
4.hoechst 33258染色
[0064]
将直径18mm细胞爬片置于6孔板中，取处于对数生长期的dld-1细胞，调整浓度后以每孔4
×
105个接种于细胞爬片上，培养24h后按照按4个浓度(0、40、80、160μg
·
ml-1)给药；继续培养48h，吸净上清后加入4％多聚甲醛1.0ml/孔，放置于摇床上低速振荡10min固定，后加入hoechst 33258染色液1ml/孔，置于摇床上低速振荡10min后吸净，用pbs冲洗2次后，滴入抗荧光淬灭液，去取出细胞爬片置于在薄片上，使用荧光显微镜观察细胞凋亡情况。
[0065]
5.细胞凋亡实验
[0066]
取处于对数生长期的dld-1细胞，调整浓度后以每孔4
×
105个接种于六孔板中，培养24h后加入含药血清；继续培养48h，用pbs两次洗涤、离心机2000rpm离心5min后收集细胞于1.5ml离心管中。使用binding buffer 500μl/管轻轻悬浮细胞，予5μlannexin v-fitc混匀后，再加入5μl propidiumiodide(pi)轻轻混匀，室温下避光反应5-15min，分组置入流式细胞仪进行检测。
[0067]
6.western blot检测各组bcl-2、bax蛋白表达
[0068]
取对数生长期的dld-1细胞接种于六孔板，培养24h后按照给予含药血清培养48h，刮取细胞，加入ripa裂解液提取总蛋白，bca测试盒测定蛋白浓度，确定蛋白上样量为20μg。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳后湿转法转膜至pvdf膜上，5％脱脂牛奶封闭1h，tbst洗膜后加入一抗bax(1:1000)、bcl-2(1:1000)和β-actin(1:1000)，于4℃冰箱中置于摇床上孵育过夜，tbst洗膜3次后加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的二抗，4℃摇床上孵育1h，tbst洗膜后，避光加入增强化学发光液(ecl)，使用凝胶成像仪曝光成像，imagej软件进行条带光密度值分析。目的蛋白与内参光密度的比值即为目的蛋白的相对表达量。
[0069]
实验结果:
[0070]
mtt检测显示，与nc组相比，wjr以剂量依赖性方式明显抑制细胞的增殖能力(表3)。hoechst 33258染色显示，在wjr治疗后，发现凋亡细胞比例呈剂量依赖性增加(见图2)。采用流式细胞术测定细胞凋亡率，与nc组相比，wjr治疗后凋亡细胞的百分比显著增加，并且大剂量wjr的抑制效果最好(表4)。此外，在xjr处理后，促凋亡bax蛋白的表达以浓度依赖性方式增加，伴随着抗凋亡bcl-2蛋白的表达降低(表5)。总之，这些结果表明wjr在体外具有显着的抗肿瘤作用。
[0071]
表3.不同处理组mtt结果
[0072][0073]
注：nc代表空白对照组，ld为wjr低剂量组，md为wjr中剂量组，hd为wjr高剂量组，
wjr为温滋解毒方。*代表与nc组相比，p＜0.05；#代表与ld组相比，p＜0.05；&代表与md组相比，p＜0.05。
[0074]
表4.不同处理组凋亡结果
[0075][0076]
注：nc代表空白对照组，ld为wjr低剂量组，md为wjr中剂量组，hd为wjr高剂量组，wjr为温滋解毒方。*代表与nc组相比，p＜0.05；#代表与ld组相比，p＜0.05；&代表与md组相比，p＜0.05。
[0077]
表5.不同处理组wb结果
[0078][0079]
nc代表空白对照组，ld为wjr低剂量组，md为wjr中剂量组，hd为wjr高剂量组，wjr为温滋解毒方。*代表与nc组相比，p＜0.05；#代表与ld组相比，p＜0.05；&代表与md组相比，p＜0.05。
[0080]
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。