一种细菌介导的纳米药物递送系统及其制备方法和应用

1.本发明属于药物生物化学技术领域，具体涉及一种细菌介导的纳米药物递送系统及其制备方法和应用。


背景技术：

2.作为各类实体肿瘤共有的特征之一，肿瘤的乏氧微环境在恶性实体肿瘤的多药耐药和癌细胞转移中扮演十分重要的角色。同时，肿瘤乏氧微环境还抑制免疫反应并募集肿瘤相关巨噬细胞，为肿瘤干细胞的生存提供保护。在传统的肿瘤放射治疗或化疗治疗期间，肿瘤微环境可以保护癌细胞存活，药物也难以进入坏死区或乏氧区域，导致抗肿瘤疗效有限。肿瘤部位的特殊结构决定了肿瘤微环境呈现乏氧的特点，而一些专性或兼性厌氧菌对肿瘤乏氧部位具有很高的选择性和深入定植能力，可用于靶向肿瘤组织。
3.细菌在治疗人类疾病方面已经有了很多实践性成果，而采用厌氧菌治疗肿瘤也是一项很有前景的治疗方案，不仅可以利用厌氧菌对缺氧区的靶向能力，厌氧菌本身也可通过各种方式抑制肿瘤细胞的生长，如提交细菌抗原，引发特异性t细胞聚集从而杀伤细菌聚集处的肿瘤细胞；诱导炎症反应和炎症因子的释放，可对肿瘤产生非特异性杀伤；在肿瘤部位与肿瘤细胞争夺营养，使得癌细胞不能吸收足够的养分从而限制其生长；细菌蛋白可被巨噬细胞吞噬，可导致肿瘤细胞程序性死亡等等。无论厌氧菌是作为一个运输药物的载体，还是其本身的肿瘤抑制能力，都会是肿瘤乏氧区治疗中的一个重要手段，具有很广阔的研究前景及发展前景。
4.普通的厌氧菌大多为致病菌，对人体都具有程度不等的危害，而对细菌进行减毒处理后可大大减少这种危害，但机体也会吞噬这类细菌，不能达到预期的疗效，因而选用生物兼容性强并且对人体友好的厌氧菌成为关键。基于天然的生物相容性和生物降解性，白蛋白纳米粒已经在药物靶向递送，肿瘤细胞调控等方面得到了广泛的探索。最近的研究表明，白蛋白纳米颗粒的设计非常有利于肿瘤治疗。例如，白蛋白可与肿瘤细胞特异性分泌的sparc蛋白结合，促进白蛋白纳米粒在肿瘤组织的积累，随后释放出所携带的治疗药物，从而更有利于肿瘤细胞对于药物的摄取，随后发挥肿瘤特异性杀伤以实现更好的肿瘤治疗。
5.到目前为止，关于白蛋白纳米粒与细菌偶联对恶性实体肿瘤进行治疗的研究十分匮乏。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术中的缺陷，本发明提供一种细菌介导的纳米药物递送系统及其制备方法和应用。
7.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种细菌介导的纳米药物递送系统，包括细菌以及搭载于所述细菌上的包裹有抗肿瘤药物的纳米颗粒；细菌为具有厌氧趋向性的厌氧菌；纳米颗粒对厌氧菌及机体正常细胞无特异性杀伤作用；抗肿瘤药物为抑制肿瘤细胞的化疗药物。
8.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
9.进一步，厌氧菌为双歧杆菌属、乳酸菌属、大肠杆菌属、减毒沙门氏菌和梭状芽孢杆菌中的至少一种。
10.进一步，厌氧菌为婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌和乳酸杆菌中的至少一种。
11.进一步，纳米颗粒为以血清白蛋白为原料制得的纳米药物载体。
12.进一步，血清白蛋白为人血清蛋白或其他动物源性血清蛋白。
13.进一步，化疗药物为紫杉烷类、蒽环类、铂类、表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂类中的一种或几种。
14.伴随着肿瘤的快速增殖，乏氧微环境以及sparc蛋白对肿瘤生长和转移具有深远的临床意义，它们不仅显著增加了肿瘤部位内药物扩散的难度，而且还保护了肿瘤干细胞，并在传统的肿瘤放疗或化疗期间显著提高肿瘤细胞存活能力。利用肿瘤的乏氧微环境，本发明中以厌氧菌作为药物传递工具，并以此开发了靶向肿瘤乏氧区的细菌介导的主动靶向递送系统，成功地在将包裹治疗药物的纳米颗粒运输到肿瘤部位，可以实现肿瘤区域药物浓度最大化。此外，肿瘤细胞分泌的sparc蛋白与纳米颗粒特异性结合，从而得以增进肿瘤细胞对于药物的摄取。
15.本发明中的药物递送系统为靶向肿瘤乏氧区的、细菌介导的纳米药物杂化递送系统，其具有肿瘤靶向性，在增加肿瘤部位药物聚集的同时降低了机体其他脏器对药物的摄取，从而降低了系统性的毒副反应，整体上大大提高了化疗药物的疗效。
16.本发明还提供了一种细菌介导的纳米药物递送系统的制备方法，制备方法包括以下步骤：
17.(1)培养厌氧菌，收集对数生长期菌落；
18.(2)通过去溶剂法制备包裹有化疗药物的纳米颗粒；
19.(3)将步骤(1)所收集的细菌与步骤(2)所制得的纳米颗粒混合，再加入edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺酯)，然后在37℃的厌氧环境中震荡孵育4小时；所加入的edc和nhs与纳米颗粒的摩尔比为1～1.5:1～1.5:1；
20.(4)用ph为7.4的pbs溶液洗涤离心三次，收集下层沉淀，即得。
21.本发明还公开了纳米药物递送系统的应用，其主要用于制备治疗恶性实体肿瘤的药物。具体的，恶性肿瘤为乳腺癌、食管癌、胃癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌或脑肿瘤等实体肿瘤。
22.本发明的有益效果是：
23.1.本发明利用厌氧菌搭载纳米颗粒可以制得一种新型的厌氧菌介导的主动靶向给药系统，该给药系统生物安全性高，制备工序简单，可以推动现有化疗手段的临床应用发展，并为癌症乏氧区治疗提供了一个全新的方向。
24.2.本发明中的细菌介导的药物递送系统能主动靶向肿瘤乏氧区，从而实现对乏氧肿瘤细胞的特异性杀伤，这种主动靶向肿瘤乏氧区的细菌载药系统显著增强了传统化疗药物的抗肿瘤功效并降低其毒副反应。
附图说明
25.图1为实施例1制得的纳米药物递送系统bif@dox-nps的形貌；
26.图2为经本发明纳米药物递送系统治疗后的小鼠行pet-ct扫描评估早期疗效；
27.图3为各组小鼠肿瘤部位fdg摄取定量统计图；
28.图4为小鼠体内药物浓度分布；
29.图5为经体内治疗后各组小鼠瘤体积变化情况；
30.图6为经体内治疗各组小鼠体重变化情况；
31.图7为经治疗后各组小鼠生存时间；
32.图8为经实施例1制得的纳米药物递送系统治疗后的小鼠心肝脾肺肾的毒性评价；
33.图9为各组红细胞的显微镜观察图；
34.图10为各组经处理后溶血情况的肉眼直观图；
35.图11为各组溶血实验紫外吸收光谱；
36.图12为各组溶血率。
具体实施方式
37.下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
38.实施例1
39.一种细菌介导的纳米药物递送系统，经过以下步骤制得：
40.(1)制备包裹阿霉素的白蛋白纳米粒
41.s1：将盐酸阿霉素和牛血清白蛋白按1:1的摩尔比溶解在双蒸水中，在室温下搅拌2小时，然后调整ph值至9，得到药物-白蛋白混合物；
42.s2：在搅拌条件下以0.5毫升/分钟的速度向孵化的药物-白蛋白混合物中滴加乙醇，至沉淀量不再增加，得到纳米粒子溶液；
43.s3：按1:1的体积比向纳米粒子溶液中加入8wt％的戊二醛溶液，在室温下通过磁力搅拌使纳米粒子交联和固化16小时，得固化的纳米粒子溶液；
44.s4：用旋转蒸发器将固化的纳米粒子溶液中的有机溶剂除去，即得。
45.(2)制备双歧杆菌负载阿霉素纳米粒的杂化体系
46.s1：婴儿双歧杆菌在37℃的琼脂培养基中进行厌氧培养，48小时后，通过洗涤离心法收集细菌，得细菌悬浮液；
47.s2：将包裹阿霉素的白蛋白纳米粒分散于去离子水中，得阿霉素白蛋白纳米颗粒溶液；
48.s3：将细菌悬浮液与阿霉素白蛋白纳米颗粒溶液按1:2的体积比混合，再加入白蛋白纳米颗粒摩尔量1.0倍的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和白蛋白纳米颗粒摩尔量1.0倍的n-羟基琥珀酰亚胺酯，然后在37℃下厌氧培养4小时；随后将混合物在2000rpm下离心5分钟，取出上清液并用pbs(ph＝7.4)洗涤两次，得到细菌负载阿霉素白蛋白纳米粒的生物杂化体系。
49.实施例2
50.一种细菌介导的纳米药物递送系统，经过以下步骤制得：
51.(1)制备包裹紫杉醇的白蛋白纳米粒
52.s1：将紫杉醇和人血清白蛋白按1:1的摩尔比溶解在双蒸水中，在室温下搅拌2小时，然后调整ph值至7，得药物-白蛋白混合物；
53.s2：在搅拌条件下以0.5毫升/分钟的速度向孵化的药物-白蛋白混合物中滴加乙醇，至沉淀量不再增加，得到纳米粒子溶液；
54.s3：按1:1的体积比向纳米粒子溶液中加入8wt％的戊二醛溶液，在室温下通过磁力搅拌使纳米粒子交联和固化24小时，得固化的纳米粒子溶液；
55.s4：用旋转蒸发器将固化的纳米粒子溶液中的有机溶剂除去，即得。
56.(2)制备双歧杆菌负载紫杉醇纳米粒的杂化体系
57.s1：长双歧杆菌在37℃的琼脂培养基中进行厌氧培养，48小时后，通过洗涤离心法收集细菌，得细菌悬浮液；
58.s2：将包裹紫杉醇的白蛋白纳米粒分散于去离子水中，得紫杉醇白蛋白纳米颗粒溶液；
59.s3：将细菌悬浮液与紫杉醇白蛋白纳米颗粒溶液按1:1的体积比混合，再加入白蛋白纳米颗粒摩尔量1.5倍的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和白蛋白纳米颗粒摩尔量1.5倍的n-羟基琥珀酰亚胺酯，然后在37℃下厌氧培养4小时；随后将混合物在2000rpm下离心5分钟，取出上清液并用pbs(ph＝7.4)洗涤两次，得到细菌负载紫杉醇白蛋白纳米粒的生物杂化体系。
60.实施例3
61.一种细菌介导的纳米药物递送系统，经过以下步骤制得：
62.(1)制备包裹顺铂的白蛋白纳米粒
63.s1：将顺铂和牛血清白蛋白按1:1的摩尔比溶解在双蒸水中，在室温下搅拌2小时，然后调整ph值至10，得药物-白蛋白混合物；
64.s2：在搅拌条件下以0.5毫升/分钟的速度向孵化的药物-白蛋白混合物中滴加乙醇，至沉淀量不再增加，得到纳米粒子溶液；
65.s3：按1:1的体积比向纳米粒子溶液中加入8wt％的戊二醛溶液，在室温下通过磁力搅拌使纳米粒子交联和固化12小时，得固化的纳米粒子溶液；
66.s4：用旋转蒸发器将固化的纳米粒子溶液中的有机溶剂除去，即得。
67.(2)制备乳酸杆菌负载顺铂纳米粒的杂化体系
68.s1：乳酸杆菌在37℃的琼脂培养基中进行厌氧培养，48小时后，通过洗涤离心法收集细菌，得细菌悬浮液；
69.s2：将包裹顺铂的白蛋白纳米粒分散于去0.9wt％的生理盐水中，得顺铂白蛋白纳米颗粒溶液；
70.s3：将细菌悬浮液与顺铂白蛋白纳米颗粒溶液按1:2的体积比混合，再加入白蛋白纳米颗粒摩尔量1.5倍的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和白蛋白纳米颗粒摩尔量1.5倍的n-羟基琥珀酰亚胺酯，然后在37℃下厌氧培养4小时；随后将混合物在2000rpm下离心5分钟，取出上清液并用pbs(ph＝7.4)洗涤两次，得到细菌负载顺铂白蛋白纳米粒的生物杂化体系。
71.结果分析
72.上述三个实施例所制得的纳米药物递送系统性能类似，以实施例1中制得的药物
递送系统为例进行具体说明。
73.实施例1中所得纳米药物递送系统的形貌结构如图1所示。其中图1a为空白的白蛋白纳米粒子的透射电镜图像；图1b为负载阿霉素的白蛋白纳米粒子的透射电镜图像；图1c为裸婴儿双歧杆菌的扫描电镜图像；图1d为本发明实施例1中的细菌/纳米药物杂化系统bif@dox-nps的扫描电镜图像。
74.根据动物实验的伦理要求建立和分析动物模型。建立模型所用小鼠为4～6周龄的雌性balb/c小鼠，在小鼠皮下注射107个4t1细胞，首先让小鼠生长形成平均体积达90mm3的肿瘤，确保在肿瘤组织内形成足够的乏氧区域，然后将小鼠随机分成6组，每3天通过静脉注射给予治疗(a:control组，注射生理盐水；b:bif组，注射裸婴儿双歧杆菌；c:bif@bsa-nps组，注射裸婴儿双歧杆菌@牛血清蛋白纳米粒；d:bif+dox组，注射裸婴儿双歧杆菌和阿霉素，e:dox-nps组，注射阿霉素白蛋白纳米粒；f:bif@dox-nps组，注射实施例1中的细菌介导的纳米药物递送系统)。
75.在给药治疗三次后，将各组小鼠随机抽取三只小鼠进行了micro-pet/ct扫描，结果如图2～4所示。从图中可以看出，注射本发明中的纳米药物递送系统后显示最弱的fdg摄取，代表肿瘤细胞增殖所需的糖代谢被显著抑制，说明本发明中的纳米药物递送系统对肿瘤具有较好的治疗效果，与对照组具有统计学差异。
76.对观察期内的小鼠瘤体积、体重以及生存时间进行了记录，结果如图5～7所示，同时，对采用本发明中细菌介导的纳米药物递送系统治疗后的小鼠心肝脾肺肾的毒性进行了评价，结果如图8所示，另外，对采用本发明中细菌介导的纳米药物递送系统治疗后的小鼠进行了溶血实验，结果如图9～12所示。从图中可以看出，注射本发明中的纳米药物递送系统后的瘤体积的生长率是最低的，并且体重也没有明显的变化，各类脏器机构均未出现异常，同时没有小鼠死亡，溶血实验也反映该体系的血液安全性，表明发明中的细菌介导的纳米药物递送系统毒性反应在安全范围内，由此也说明本发明的细菌介导的纳米药物递送系统在保证疗效的同时也具有很好的安全性的优点。
77.虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。