一种用于半月板替代的3D打印支架及其制备方法

一种用于半月板替代的3d打印支架及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物医用材料技术领域，更具体地说，涉及一种用于半月板替代的3d打印支架及其制备方法。


背景技术：

2.半月板切除术一直被认为是治疗发生在半月板的无血管和无细胞区的不可逆损伤的金标准，然而，实施半月板切除术之后膝关节的生物力学失稳会造成关节软骨的磨损，导致骨关节炎进程的加速，这仍然是临床上的一个难题。
3.为了恢复整个膝关节的生物力学，各种半月板替代物被开发以重现天然半月板的结构和功能，但这些植入物仍然不能模拟半月板的微结构和实现不同区域差异性的力学性能。其中，传统的水凝胶基支架力学性能不足和生理环境中较差的溶胀稳定性严重限制了其作为半月板替代物的应用。
4.3d打印技术能够精确重现各种生物组织的结构与功能，3d打印聚合物纤维具有优异的力学性能和生物相容性，而基于多重氢键的超分子聚合物水凝胶具有抗溶胀性能和优异的弹性。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术中的不足—大多数半月板替代物难以重现半月板微结构，也难以同时在生理条件下保持溶胀稳定性和优异的力学性能，提供一种用于半月板替代的3d打印支架及其制备方法，本发明配方简单，制备方法容易，通过设计径向和周向排列纤维的半月板模型实现半月板胶原纤维结构的模拟，并通过向3d打印得到的支架中浇注含n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)、光引发剂2-羟基-2-甲基苯基丙酮的水溶液，在紫外光下进行自由基聚合反应，以模拟蛋白聚糖实现能量耗散和缓冲功能，得到用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)，支架具有优异的力学性能和抗疲劳性能，初步证实其在构建半月板组织替代物方面的应用潜能。
6.本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现。
7.一种用于半月板替代的3d打印支架，包括聚(ε-己内酯)的3d打印半月板和聚n-丙烯酰甘氨酰胺，以聚(ε-己内酯)的3d打印半月板支架为模板，利用酯基水解以使其产生羟基和/或羧基；n-丙烯酰甘氨酰胺在聚(ε-己内酯)的3d打印半月板中进行聚合，形成聚n-丙烯酰甘氨酰胺；由于聚n-丙烯酰甘氨酰胺分子链之间的强氢键相互作用形成氢键超分子聚合物高强度水凝胶，同时聚n-丙烯酰甘氨酰胺分子链与聚(ε-己内酯)分子链之间存在氢键相互作用。
8.将聚(ε-己内酯)的3d打印半月板支架置入碱液液中进行表面处理，利用酯基水解以使其产生羟基和/或羧基；碱液为氢氧化钠或者氢氧化钾水溶液，浓度为2—5mol/l，处理时间为1—2h。
9.将聚(ε-己内酯)的3d打印半月板支架放到半月板形状的模具中，向模具中加入含
pnaga)的力学性能测试曲线图(1)。
26.图4是本发明中3d打印半月板支架(pcl)和用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)的力学性能测试曲线图(2)。
27.图5是本发明中3d打印半月板支架(pcl)和用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)的力学性能测试曲线图(3)。
28.图6是本发明中3d打印半月板支架(pcl)和用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)的力学性能测试曲线图(4)。
29.图7是本发明动物实验中用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)的拉伸应力-应变曲线图。
30.图8是本发明动物实验中用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)的拉伸强度和杨氏模量测试结果图。
31.图9是本发明动物实验中用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)的压缩应力-应变曲线图。
32.图10是本发明动物实验中用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)的1000次循环压缩加载-卸载曲线图(沿图中箭头方向，循环次数依次增加)。
33.图11是本发明动物实验中用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)的第1次和每100次循环压缩加载-卸载的最终应力和耗散能测试结果图(所有循环的最大应变固定为30％)。
34.图12是本发明动物实验中用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)的撕裂能测试结果图。
35.图13是本发明中动物实验中用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)在兔模型中的植入过程和大体观察图，其中(a)为动物实验中用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)在兔模型中的植入过程，(i)为切开皮肤组织和筋膜组织，(ii)为切断内侧副韧带并打开膝关节囊，(iii)为半月板切除术，(iv)支架植入，(v)为缝合内侧副韧带并关闭膝关节囊，(vi)为缝合皮肤组织和筋膜组织，(b)为术后4,8和12周股骨髁(fc)，胫骨平台(tp)和半月板支架的大体观察图(标尺：1厘米)。
36.图14是本发明中动物实验中用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)在兔模型中植入后4、8和12周股骨髁(fc)和胫骨平台(tp)组织学评价图(苏木精-伊红h&e染色图和番红o-固绿sofg染色图)。
具体实施方式
37.下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
38.如图1所示，总的实施思路是使用捷诺飞3d bio-architect
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sparrow打印机自带软件设计半月板模型，将3d打印半月板支架(pcl)置入氢氧化钠溶液中进行表面处理，利用酯基的水解以产生羟基和羧基，向放有pcl支架的模具中浇注含引发剂的naga单体溶液，在紫外光下辐照下进行naga的自由基聚合反应，由于pnaga分子链之间的强氢键相互作用形成氢键超分子聚合物高强度水凝胶，同时pnaga分子链与表面处理后的pcl分子链之间也存在氢键相互作用，用去离子水对支架进行透析以除去未反应的杂质后，最终得到用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)。
39.模型设计：采用熔融沉积成型3d打印系统对热塑性pcl颗粒进行打印，3d打印模型设计如图1所示，为了构建pcl网络作为支架的框架。受半月板微结构的启发，逐层3d打印径向和环向取向的pcl纤维，模拟天然半月板中胶原纤维的排列。在天然半月板中，由于环向纤维和径向纤维的存在，来自股骨和胫骨的轴向压缩载荷在半月板中转换为环向拉应力。因此，模型的每一层都是由一系列径向纤维和一系列环向纤维取向组成。为了构建半月板楔形的外观，每一层的纤维数量都随着模型高度的增加而减少。值得注意的是，考虑到半月板的外区具有更高的胶原纤维密度以抵抗环向拉伸应力，而内区具有较低的胶原纤维密度以抵抗压缩载荷。为了模拟这种特征，模型中也将支架环向纤维的纤维间距(两个相邻环形纤维之间的中心距离)调为梯度模式，即外密内疏。同时，为了实现轴向压缩模量以得到轴向更软的支架，对相邻层纤维(径向和环向纤维)调为彼此对齐或交错的排列方式。因此，通过以上设计得到具有精细微结构的pcl支架模型。为了分析对齐模式和交错模式以及不同纤维间距对支架力学性能的影响，我们将模型简化为对齐和交错排列的非梯度的均匀模型，打印了对齐pcl-x支架和交错pcl-y支架，其中x和y分别代表对齐支架和交错支架中的纤维间距(单位：mm)。值得注意的是，在打印软件中，当交错模式的纤维间距为对齐模式的纤维间距的两倍时，两种模式的纤维数量相等。
40.实施例1
41.步骤1，使用捷诺飞3d bio-architect
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sparrow打印机自带软件设计径向和环向排列纤维的半月板模型，打印模式为对齐模式，纤维间距为1mm，数均分子量为8w的聚(ε-己内酯)(pcl)粒料装入3d打印机的料筒中，将打印平台加热至45℃，料筒加热至80℃后进行熔融沉积成型3d打印，得到3d打印半月板支架(对齐pcl-1)。
42.步骤2，将步骤1制备得到的3d打印半月板支架(对齐pcl-1)置入5mol/l氢氧化钠溶液中，在37℃下振荡条件下对其进行表面处理1h。
43.步骤3，用去离子水将步骤2得到的处理后的3d打印支架的表面充分冲洗和干燥，将其放到半月板形状的模具中。
44.步骤4，用分析天平称取0.03g n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)放入离心管中，加100μl去离子水，涡旋使其完全溶解后，向其中加入0.3μl光引发剂2-羟基-2-甲基苯基丙酮，通氮气10min，除氧后得到均匀混合溶液。
45.步骤5，将步骤4中得到的均匀混合溶液加入到步骤3的模具中，将其置于紫外光下辐照60min进行自由基聚合反应，用去离子水对支架进行透析以除去未反应的杂质后，得到用于半月板替代的3d打印支架(对齐pcl-1-pnaga)，用于半月板替代的3d打印支架低温无菌保存。
46.实施例2
47.步骤1，使用捷诺飞3d bio-architect
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sparrow打印机自带软件设计径向和环向排列纤维的半月板模型，打印模式为对齐模式，纤维间距为2mm，数均分子量为8w的聚(ε-己内酯)(pcl)粒料装入3d打印机的料筒中，将打印平台加热至45℃，料筒加热至80℃后进行熔融沉积成型3d打印，得到3d打印半月板支架(对齐pcl-2)。
48.步骤2，将步骤1制备得到的3d打印半月板支架(对齐pcl-2)置入5mol/l氢氧化钠溶液中，在37℃下振荡条件下对其进行表面处理1h。
49.步骤3，用去离子水将步骤2得到的处理后的3d打印支架的表面充分冲洗和干燥，
将其放到半月板形状的模具中。
50.步骤4，用分析天平称取0.03g n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)放入离心管中，加100μl去离子水，涡旋使其完全溶解后，向其中加入0.3μl光引发剂2-羟基-2-甲基苯基丙酮，通氮气10min，除氧后得到均匀混合溶液。
51.步骤5，将步骤4中得到的均匀混合溶液加入到步骤3的模具中，将其置于紫外光下辐照60min进行自由基聚合反应，用去离子水对支架进行透析以除去未反应的杂质后，得到用于半月板替代的3d打印支架(对齐pcl-2-pnaga)，用于半月板替代的3d打印支架低温无菌保存。
52.实施例3
53.步骤1，使用捷诺飞3d bio-architect
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sparrow打印机自带软件设计径向和环向排列纤维的半月板模型，打印模式为对齐模式，纤维间距为3mm，数均分子量为8w的聚(ε-己内酯)(pcl)粒料装入3d打印机的料筒中，将打印平台加热至45℃，料筒加热至80℃后进行熔融沉积成型3d打印，得到3d打印半月板支架(对齐pcl-3)。
54.步骤2，将步骤1制备得到的3d打印半月板支架(对齐pcl-3)置入5mol/l氢氧化钠溶液中，在37℃下振荡条件下对其进行表面处理1h。
55.步骤3，用去离子水将步骤2得到的处理后的3d打印支架的表面充分冲洗和干燥，将其放到半月板形状的模具中。
56.步骤4，用分析天平称取0.03g n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)放入离心管中，加100μl去离子水，涡旋使其完全溶解后，向其中加入0.3μl光引发剂2-羟基-2-甲基苯基丙酮，通氮气10min，除氧后得到均匀混合溶液。
57.步骤5，将步骤4中得到的均匀混合溶液加入到步骤3的模具中，将其置于紫外光下辐照60min进行自由基聚合反应，用去离子水对支架进行透析以除去未反应的杂质后，得到用于半月板替代的3d打印支架(对齐pcl-3-pnaga)，用于半月板替代的3d打印支架低温无菌保存。
58.实施例4
59.步骤1，使用捷诺飞3d bio-architect
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sparrow打印机自带软件设计径向和环向排列纤维的半月板模型，打印模式为交错模式，纤维间距为2mm，数均分子量为8w的聚(ε-己内酯)(pcl)粒料装入3d打印机的料筒中，将打印平台加热至45℃，料筒加热至80℃后进行熔融沉积成型3d打印，得到3d打印半月板支架(交错pcl-2)。
60.步骤2，将步骤1制备得到的3d打印半月板支架(交错pcl-2)置入5mol/l氢氧化钠溶液中，在37℃下振荡条件下对其进行表面处理1h。
61.步骤3，用去离子水将步骤2得到的处理后的3d打印支架的表面充分冲洗和干燥，将其放到半月板形状的模具中。
62.步骤4，用分析天平称取0.03g n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)放入离心管中，加100μl去离子水，涡旋使其完全溶解后，向其中加入0.3μl光引发剂2-羟基-2-甲基苯基丙酮，通氮气10min，除氧后得到均匀混合溶液。
63.步骤5，将步骤4中得到的均匀混合溶液加入到步骤3的模具中，将其置于紫外光下辐照60min进行自由基聚合反应，用去离子水对支架进行透析以除去未反应的杂质后，得到用于半月板替代的3d打印支架(交错pcl-2-pnaga)，用于半月板替代的3d打印支架低温无
菌保存。
64.实施例5
65.步骤1，使用捷诺飞3d bio-architect
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sparrow打印机自带软件设计径向和环向排列纤维的半月板模型，打印模式为交错模式，纤维间距为4mm，数均分子量为8w的聚(ε-己内酯)(pcl)粒料装入3d打印机的料筒中，将打印平台加热至45℃，料筒加热至80℃后进行熔融沉积成型3d打印，得到3d打印半月板支架(交错pcl-4)。
66.步骤2，将步骤1制备得到的3d打印半月板支架(交错pcl-4)置入5mol/l氢氧化钠溶液中，在37℃下振荡条件下对其进行表面处理1h。
67.步骤3，用去离子水将步骤2得到的处理后的3d打印支架的表面充分冲洗和干燥，将其放到半月板形状的模具中。
68.步骤4，用分析天平称取0.03g n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)放入离心管中，加100μl去离子水，涡旋使其完全溶解后，向其中加入0.3μl光引发剂2-羟基-2-甲基苯基丙酮，通氮气10min，除氧后得到均匀混合溶液。
69.步骤5，将步骤4中得到的均匀混合溶液加入到步骤3的模具中，将其置于紫外光下辐照60min进行自由基聚合反应，用去离子水对支架进行透析以除去未反应的杂质后，得到用于半月板替代的3d打印支架(交错pcl-4-pnaga)，用于半月板替代的3d打印支架低温无菌保存。
70.实施例6
71.步骤1，使用捷诺飞3d bio-architect
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sparrow打印机自带软件设计径向和环向排列纤维的半月板模型，打印模式为交错模式，纤维间距为6mm，数均分子量为8w的聚(ε-己内酯)(pcl)粒料装入3d打印机的料筒中，将打印平台加热至45℃，料筒加热至80℃后进行熔融沉积成型3d打印，得到3d打印半月板支架(交错pcl-6)。
72.步骤2，将步骤1制备得到的3d打印半月板支架(交错pcl-6)置入5mol/l氢氧化钠溶液中，在37℃下振荡条件下对其进行表面处理1h。
73.步骤3，用去离子水将步骤2得到的处理后的3d打印支架的表面充分冲洗和干燥，将其放到半月板形状的模具中。
74.步骤4，用分析天平称取0.03g n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)放入离心管中，加100μl去离子水，涡旋使其完全溶解后，向其中加入0.3μl光引发剂2-羟基-2-甲基苯基丙酮，通氮气10min，除氧后得到均匀混合溶液。
75.步骤5，将步骤4中得到的均匀混合溶液加入到步骤3的模具中，将其置于紫外光下辐照60min进行自由基聚合反应，用去离子水对支架进行透析以除去未反应的杂质后，得到用于半月板替代的3d打印支架(交错pcl-6-pnaga)，用于半月板替代的3d打印支架低温无菌保存。
76.实施例7
77.步骤1，使用捷诺飞3d bio-architect
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sparrow打印机自带软件设计径向和环向排列纤维的半月板模型，打印模式为交错模式，纤维间距从外向内梯度降低，数均分子量为8w的聚(ε-己内酯)(pcl)粒料装入3d打印机的料筒中，将打印平台加热至45℃，料筒加热至80℃后进行熔融沉积成型3d打印，得到3d打印半月板支架(pcl)。
78.步骤2，将步骤1制备得到的3d打印半月板支架(pcl)置入5mol/l氢氧化钠溶液中，
pnaga支架的压缩强度(6.91
±
0.54mpa)和压缩模量(9.72
±
1.16mpa)比对齐pcl-1支架的更低，但交错pcl-2-pnaga支架的压缩强度(5.50
±
1.31mpa)和压缩模量(7.60
±
0.36mpa)超过了交错pcl-2支架的强度和模量，这是在交错支架中更高的弹性pnaga水凝胶含量更有利于抵抗压缩载荷导致的。因此，具有交错排列的pcl-pnaga支架比对齐pcl-pnaga支架具有更加柔软的压缩性能，更加适合半月板应用。
85.为了探究pcl-pnaga半月板支架作为半月板替代物的适用性，考察了用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga，实施例7)的力学性能。如图7—12所示，对pcl-pnaga半月板支架在环向方向上进行拉伸测试，支架达到3.40
±
0.19mpa的拉伸强度和20.15
±
1.37mpa的杨氏模量；对pcl-pnaga半月板支架在径向方向上进行拉伸测试，支架达到1.41
±
0.08mpa的拉伸强度和10.43
±
1.54mpa的杨氏模量，说明支架能够抵抗环向和径向的拉伸应力，避免在膝关节中发生径向和桶柄状撕裂。对pcl-pnaga半月板支架在轴向方向上进行压缩测试，支架显示出相对低的压缩模量(1.11
±
0.14mpa)，这是由于pcl框架中纤维交错排列的设计以及弹性的pnaga水凝胶浇注导致了支架在轴向方向上的软弹性。合适的压缩模量能够避免过高的刚性造成股骨髁与胫骨平台表面磨损，从而延缓骨关节炎发展。此外，pcl-pnaga半月板支架在1000次循环压缩加载-卸载测试中表现出优异的抗疲劳性能。由于3d打印的pcl纤维中储存的弹性能释放，能够达到钉扎裂纹和有效抑制裂纹扩展的目的，因此pcl-pnaga表现出超高韧性，撕裂能达到17.00
±
2.07kj/m2。因此，用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)具有优异的力学性能，有望在体内实现进一步应用。
86.植入兔模型的动物实验：选用体重在2.5～3.0kg的雄性家兔39只，分别进行4，8和12周的试验，将所有家兔随机分为4组：假手术组(每个时间点n＝2)，半月板切除术组(每个时间点n＝3)，pcl组(实验组，每个时间点n＝4)和pcl-pnaga组(实验组，每个时间点n＝4)，手术过程如图13所示，半月板植入物75％酒精浸泡后，术前用紫外灯消毒1h，所有手术均在无菌条件下进行，术前采用10％水合氯醛(3.5ml/kg)耳廓静脉注射全麻，术中采用盐酸塞拉嗪(0.2ml/kg)局麻，然后将兔子固定在手术台上，刮腿毛，用碘消毒，在此之后，在兔双膝内侧半月板全切除术，首先切开皮肤组织和筋膜组织，形成一个2cm的切口，然后切断内侧副韧带，显露内侧半月板后角，随后，囊被打开并进行半月板切除术，用尖刀沿着内侧半月板和胫骨平台的交界处切开半月板的前角和后角，然后将整个半月板切除，然后，通过手术时的大体观察，选择合适大小的半月板替代物植入，将实施例7中的pcl和pcl-pnaga半月板植入膝关节，将其前角与韧带缝合，后角与关节囊组织缝合，将半月板支架水平固定在内侧半月板初始位置，将仅暴露半月板的兔设为假手术组，将半月板切除的兔设为半月板切除组，用不可吸收的手术缝线连接内侧副韧带，闭合关节囊，随后缝合筋膜组织和皮肤组织，用酒精垫清洁手术腿，最后所有家兔术后均注射青霉素三天，防止感染，术后将家兔放回笼内，保证家兔自由活动，随后观察并记录兔膝关节状况及活动情况，分别于术后4、8和12周对所有家兔实施安乐死，取其股骨、胫骨和半月板植入物，进行大体观察和组织学评价。
87.对上述股骨髁(fc)、胫骨平台(tp)以及半月板植入物进行大体观察，宏观照片如图13所示。在半月板切除术组中，4周和8周后的股骨和胫骨表面出现分散的裂纹，甚至12周后暴露出软骨下骨。相对比，在pcl-pnaga组，股骨与胫骨的软骨表面依然是完整和光滑的，与假手术组的情况类似，即使在12周后软骨表面也只有轻微磨损，而且pcl-pnaga半月板支架仍然处于股骨髁和胫骨平台之间初始半月板的正确位置上，在各个时间点也没有出现支
架的断裂或变形。pcl-pnaga支架能够保持正确的位置和完整的结构可以归因于，pcl框架提供了高强度的力学支撑，而pnaga水凝胶的黏弹性能够提供缓冲和吸收能量的功能。在pcl组中，由于pcl自身不足的亲水性，造成pcl支架表面出现了严重的纤维包囊，并且pcl的高刚性导致了股骨髁和胫骨平台产生明显的磨损。半月板切除术组和pcl组的股骨髁和胫骨平台均出现了明显的退行性变化，并且这种情况随着时间恶化。因此，大体观察显示了pcl-pnaga半月板支架对股骨髁和胫骨平台的软骨保护作用。
88.进一步对上述股骨髁(fc)和胫骨平台(tp)进行微观的组织学评价，如图14所示，通过苏木精-伊红(h&e)染色和番红o-固绿(sofg)染色评估所有组中股骨髁与胫骨平台的软骨退变情况。图14是本发明中动物实验中用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)在兔模型中植入后4、8和12周股骨髁(fc)和胫骨平台(tp)组织学评价图(苏木精-伊红h&e染色图和番红o-固绿sofg染色图)，只暴露兔半月板的组设为假手术组，只进行半月板切除术的组设为半月板切除组，3d打印半月板支架(pcl)组和用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)组为实验组，对兔的双膝的内侧进行半月板切除术之后分别植入3d打印半月板支架(pcl)和用于半月板替代的3d打印支架(pcl-pnaga)(标尺：500微米)。在4周时，半月板切除组中的股骨髁与胫骨平台的表面显示出不连续性，而pcl组和pcl-pnaga组的软骨具有完整的表面或仅出现轻微的表面磨损。随着植入时间的延长，半月板切除组的软骨显示出明显的退行性变化，在12周后表面明显被剥蚀。相比较，直到8周和12周，pcl-pnaga组的股骨髁与胫骨平台仍然具有光滑且连续的表面，与假手术组的正常形态相似。而pcl组的软骨表面则在8周后显示出纤维化，甚至在12周后显示出表层剥离。因此，组织学分析结果也显示出pcl-pnaga半月板支架对软骨的保护作用，能够减轻软骨表面磨损并延缓骨关节炎进程。
89.根据本发明内容的记载调整制备工艺参数，均可实现本发明中用于半月板替代的3d打印支架的制备，经测试表现出与本发明基本一致的性能。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。