一种负载天然抗氧化剂的抗肿瘤纳米药物及其负载比例筛选方法

本发明属于生物医药，特别是涉及天然抗氧化剂纳米药物。

背景技术：

0、技术背景

1、天然抗氧化剂具有一定的抗肿瘤活性，且对肿瘤细胞和正常细胞具有选择性抑制作用，是一种较为理想的肿瘤治疗药物。然而，由于这些抗氧化剂自身具有低的毒性，且在体内循环时间短，无肿瘤靶向性，因此仅在极高剂量下表出一定的肿瘤抑制作用，没有实际临床应用价值。同时，在高剂量条件下，其也不可避免地带来一定的副作用。

2、联合策略是一种提高药物疗效的有效方法。将多种天然抗氧化剂物理混合联用具有提高其肿瘤细胞抑制效果，降低单药使用剂量，但其使用剂量仍远远超过化疗药物；同时，其在体内仍存在单独使用时血液循环时间短、无肿瘤靶向性等缺点。众所周知，药物联用时，联合的比例至关重要，其将影响药物的联合效果。抗氧化剂物理混合联用时，在体内无法实现按固定的比例进入肿瘤细胞。因此，目前的抗氧化剂联合在体内无法达到高效协同肿瘤抑制效果。

技术实现思路

1、针对以上问题，本发明结合纳米技术和天然抗氧化剂的优点，开发了一种新型的天然抗氧化剂纳米药物，将2种及其以上的天然抗氧化剂按一定比例同时负载于纳米载体中，该纳米药物能有效延长抗氧化剂的血液循环时间，促进抗氧化剂在肿瘤组织处富集，且能以固定比例同时递送天然抗氧化剂进入肿瘤细胞，进而产生高效协同肿瘤抑制效果，使得天然抗氧化剂纳米药物产生与化疗药物相当的治疗效果。同时，该纳米药物具有优异的生物相容性和抗多药耐药作用，对机体几乎不造成任何毒副作用，有效克服了化疗药物易产生毒副作用的问题，为肿瘤治疗提供了一种新的选择。

2、本发明包含以下技术方案：

3、一种负载天然抗氧化剂的抗肿瘤纳米药物，包括纳米载体以及按一定比例同时负载于所述纳米载体中的2种及其以上的天然抗氧化剂。通过同时负载能够实现各种天然抗氧化剂以固定比例进入细胞，达到最佳的协同效果。

4、作为可选方式，在上述纳米药物中，所述天然抗氧化剂选至硫辛酸(la)、维生素c(vc)、维生素k3(vk3)、花青素(atc)、百里香醌(tq)、姜黄素(cur)、染料木黄酮及其药学上可接受的衍生物，所述衍生物为药学上可接受的盐或对天然抗氧化剂进行的不影响其核心作用发挥的非实质性改性而获得的药学上可接受的改性物(包括但不限于在天然抗氧化剂分子上接枝官能团)。

5、作为可选方式，在上述纳米药物中，所述纳米载体选至脂质体、囊泡、胶束等常用的纳米药物载体。

6、作为可选方式，在上述纳米药物中，所述天然抗氧化剂为小分子抗氧化剂；所述小分子抗氧化剂的分子量小于1000.0da，其能有效地被负载于纳米载体中。

7、作为可选方式，在上述纳米药物中，所述天然抗氧化剂之间的摩尔比为1:100～100:1。

8、作为可选方式，在上述纳米药物中，所述天然抗氧化剂之间的配比是通过体外方法筛选得到抗氧化剂协同效果最优比。

9、作为可选方式，在上述纳米药物中，所述天然抗氧化剂能够在细胞内相互循环再生。

10、作为可选方式，在上述纳米药物中，其中一种天然抗氧化剂为硫辛酸和/或硫辛酸衍生物。进一步的，其余的天然抗氧化剂是能够与硫辛酸相互循环再生的抗氧化剂。所述其余的天然抗氧化剂与硫辛酸相互循环再生的过程中，能够促进活性氧(ros)的产生。这些小分子抗氧化剂单独存在于细胞内时，易快速被代谢掉。所述其余的天然抗氧化剂在细胞内可以通过失去电子产生ros，而自己被氧化(处于氧化态，无法再继续产生ros)；而所述la在细胞内被还原生成的二氢硫辛酸(dhla)是一种强的还原剂，dhla可以还原这些被氧化的化合物，进而又可继续产生ros，此时dhla被氧化成la(可再次被还原成dhla，实现la循环)。同时dhla循环过程中也可产生ros。从而实现la和其它抗氧化剂的相互循环再生，la和其它抗氧化剂相互循环，减缓la与其余的天然抗氧化剂的代谢，降低其被排出胞外的量，同时可以促进ros的产生，以维持胞内高水平的天然抗氧化剂含量，发挥更强的抗肿瘤作用。

11、作为可选方式，在上述纳米药物中，所述天然抗氧化剂为la与vc，进一步的，所述vc与la的摩尔比为2:1。

12、作为可选方式，在上述纳米药物中，所述天然抗氧化剂为la、vc和vk3。进一步的，所述la、vc和vk3的摩尔比为2:1:1。

13、作为可选方式，在上述纳米药物中，所述其余的天然抗氧化剂为vc和atc。进一步的，所述vc和atc的摩尔比为2:1。

14、作为可选方式，在上述纳米药物中，所述其余的天然抗氧化剂为la与tq，进一步的，所述vc与tq的摩尔比为1:1。

15、作为可选方式，在上述纳米药物中，所述其余的天然抗氧化剂为la与cur。进一步的，所述la与cur的摩尔比为2:1。

16、作为可选方式，所述纳米药物的粒径小于500nm，优选为100～200nm。该粒径范围的纳米药物能够通过实体瘤组织的高通透性和滞留效应(epr效应)在肿瘤部位富集，实现被动靶向效果。

17、本发明还公开了一种上述纳米药物中天然抗氧化剂负载比例的体外筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：

18、(1)将所述2种及其以上的天然抗氧化剂按照不同比例混合并负载于纳米载体中，制备得到一系列负载比例不同的天然抗氧化剂纳米药物；

19、(2)将步骤(1)中制备的负载比例不同的纳米药物分别以不同的浓度与肿瘤细胞进行体外共培养一段时间后，计算肿瘤细胞的存活率，通过细胞存活率计算协同指数(ci)，选择具有最低ci值且ci值小于0.9的纳米药物对应的天然抗氧化剂负载比例作为目标配比。

20、作为可选方式，在上述体外筛选方法中，还包括步骤(3)：将单独负载各天然抗氧化剂的纳米载体按照步骤(2)中得到的目标配比混合后形成的载体混合物以不同的浓度与肿瘤细胞进体外共培养一段时间后，计算肿瘤细胞的存活率，计算该载体混合物以及具有目标配比的纳米药物中天然抗氧化剂之间的协同指数，如果具有目标配比的纳米药物的协同指数小于载体混合物对应的协同指数，则说明目标配比具有较好的协同抗肿瘤效果。

21、作为可选方式，在上述体外筛选方法中，协同指数(ci)的计算方法具体为：根据共培养实验中得到的一系列细胞存活率，绘制联合用药时的肿瘤抑制率-浓度曲线，根据曲线得到联合用药达到某一特定肿瘤抑制率时(如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％)所对应的各天然抗氧化剂的浓度d1、d2、…、dn，然后，按照以下公式计算协同指数(ci)：

22、ci＝d1/dx1+d2/dx2+…+dn/dxn；

23、其中dx1、dx2、…、dxn分别为单独使用对应的天然抗氧化剂达到该特定肿瘤抑制率时对应的浓度。作为可选，分别将各天然抗氧化剂单独以不同的浓度与肿瘤细胞进行体外共培养一段时间后，计算肿瘤细胞的存活率，绘制对应天然抗氧化剂的肿瘤抑制率-浓度曲线，然后根据曲线得到单独使用各天然抗氧化剂达到该特定肿瘤抑制率时对应的浓度dx1、dx2、…、dxn；ci≤0.1表示很强的协同作用(+++++)，0.1<ci≤0.3表示强协同作用(++++)；0.3<ci≤0.7为增效作用(+++)；0.7<ci≤0.85为中度协同作用(++)；0.85<ci≤0.9为轻度增效(+)；0.9<ci≤1.1表示近似相加，1.1<ci≤1.2表示轻微相加对抗；1.2<ci≤1.45为中度拮抗。

24、本发明还公开了一种上述纳米药物的应用，其特征在于，将其用于体内或体外抗肿瘤效果测试以及制备临床抗肿瘤药物。

25、本发明还公开了一种上述纳米药物的应用，其特征在于，将其用于制备具备抗多药耐药作用的抗肿瘤药物。

26、本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

27、本发明的有益效果：

28、1.本发明所述纳米药物将不同的天然抗氧剂固定比例同时负载于载体内，能实现天然抗氧剂以固定比例进入细胞增强这些抗氧化剂的抗肿瘤活性，使得其在低剂量下(100mg/kg)实现优异的抗肿瘤效果。开发该类天然抗氧化剂纳米药物，可推进天然抗氧化剂在临床肿瘤治疗的应用。

29、2.本发明所述纳米药物抗肿瘤效果比单纯物理混合有大幅提高，接近甚至超过一般的化疗药物的肿瘤细胞毒性，使得天然抗氧化剂纳米药物在与化疗药物使用剂量相当的情况下高效杀死肿瘤及其耐药肿瘤细胞，且对多种肿瘤模型有较高的肿瘤抑制效果。所述纳米药物具有良好的体内生物相容性和生物安全性，在肿瘤治疗过程中对机体几乎不造成毒副作用，大大提高动物存活率。