一种具有微米结构层的骨科内植物及其制备方法与流程

1.本发明涉及医用材料表面处理技术领域，具体讲是一种具有微米结构层的骨科内植物及其制备方法。


背景技术：

2.在过去的几十年中，随着手术技术的进步和医用材料的发展，骨科内植物的使用已在骨科手术中起到了举足轻重的作用，其中钛合金作为一种常用的骨科内植物材料已被广泛使用于各类骨科手术中。随着骨科内植物使用的增多而钛合金本身不具有抗菌活性，骨科内植物周围感染的发病率也随之提高，据统计，骨科内植物周围感染的发病率到达了2-5%，从数值上来看，这个发病率并不足以引起重视，但骨科内植物周围感染的发生常导致毁灭性的后果，这会导致内植物周围骨质、软组织甚至皮肤坏死，给患者造成极大痛苦并对患者预后造成极大影响，再加上致病菌定形成的细菌生物被膜提高了细菌对抗生素的抵抗力且减少了抗生素的渗透，使用抗生素等常规临床手段难以延缓疾病发展，因此骨科内植物周围感染发生后常常需要翻修手术才能彻底解决。除细菌感染这一原因之外，另一个导致骨科内植物手术失败的常见原因是内植物的无菌性松动，由于钛合金是一种惰性材料，促骨整合能力不强，在骨质疏松患者、合并糖尿病患者或其他原因导致基础情况较差的患者中常常出现骨不连而导致手术失败。因此，开发一种方案使得骨科内植物同时具有抗菌活性和较好的生物相容性具有广阔的临床前景和重要的社会意义。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是，克服以上现有技术的缺点：提供一种具有抗菌活性和较好的生物相容性的具有微米结构层的骨科内植物及其制备方法。
4.本发明的技术解决方案如下：一种具有微米结构层的骨科内植物，其表面具有微米结构层，所述微米结构层由飞秒激光工艺烧蚀所述骨科内植物表面形成，所述微米结构层的纹路结构为圆形凹坑阵列、定向纹路阵列或条形凹槽阵列中的一种或几种；所述圆形凹坑阵列由直径为4-6 μm的圆形凹坑等距分布而成，相邻圆形凹坑之间的间距为18-22 μm，所述圆形凹坑的最大深度为2-3 μm；所述定向纹路阵列由“《”形或“》”形的凹槽阵列构成，所述“《”形或“》”形的凹槽最大深度为3-5 μm、凹槽最大宽度为4-6 μm，相邻凹槽之间的列间距为5-8 μm、行间距为5-8 μm；所述条形凹槽阵列以条形凹槽簇构成的菱形单元为基本单元周期性排列而成，所述条形凹槽的最大深度为1-3 μm、最大宽度为4-6 μm，相邻条形凹槽之间的间距为14-16 μm；相邻所述菱形单元之间的间距为3-5 μm。
5.所述具有微米结构层的骨科内植物的制备方法，采用飞秒激光刻蚀处理所述骨科内植物的表面，通过控制三维移动平台的移动实现激光焦点在其表面进行扫描，实现上述微米结构层的形成。
6.所述骨科内植物的材质为钛、镁、钛合金及镁合金中的一种。
7.本发明的有益效果：由于骨科内植物感染的始发因素是致病菌在内植物表面定植并形成生物膜，如何减少细菌的早期粘附已成为研究重点，其中物理改性手段因对生物相容性的干扰较少而被认为极具潜力。许多研究表明微纳米结构可以有效减少细菌的粘附，包括线形结构、微孔结构，圆柱结构在内的许多微米结构都已被证实具有抗细菌粘附的作用，甚至有些结构可以产生对细菌壁的直接破坏，自然界中许多天然微纳米表面结构也已被证实有较好抗粘附甚至直接破坏细菌细胞壁的作用，比如蝉翅和壁虎皮。基于以上思路，本发明使用飞秒激光加工技术制备得到一类具有较好的抗菌活性和生物相容性的表面结构，并通过扫描电子显微镜（sem）表征其表面结构；水接触角测量仪观察其粗糙度及浸润性。使用金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌作为实验菌株检测其抗菌性能和对细菌早期粘附及细菌生物被膜形成的影响，利用骨髓间充质干细胞检测其生物相容性，发现本发明的微米结构层纹路兼具较佳的上述特性。
附图说明
8.图1为实施例1制备的微米结构层电镜图。
9.图2为实施例2制备的微米结构层示意图。
10.图3为实施例3制备的微米结构层示意图。
11.图4为实施例1制备的tc4钛合金样本表面平均水接触角示意图。
12.图5为实施例2制备的tc4钛合金样本表面平均水接触角示意图。
13.图6为实施例3制备的tc4钛合金样本表面平均水接触角示意图。
14.图7为实施例1-3制备的样品a、b、c与对比例1制备的样品d抗菌实验涂布平板对比结果图。
15.图8为实施例1-3制备的样品a、b、c与对比例1制备的样品d抗菌实验扫描电子显微镜对比结果图。
16.图9为实施例1-3制备的样品a、b、c与对比例1制备的样品d细胞生物相容性实验对比结果图。
17.图10为实施例1-3制备的样品a、b、c与对比例1制备的样品d骨髓间充质干细胞增殖实验对比结果图。
具体实施方式
18.下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
19.实施例1采用飞秒激光刻蚀处理tc4钛合金样本表面，通过控制三维移动平台的移动实现激光焦点在样品表面进行扫描，并通过实验平台上的ccd及共聚焦光学显微系统实时监控过程，准确构建出如图1所示的圆形凹坑阵列：所述圆形凹坑阵列由直径为5 μm的圆形凹坑等距分布而成，相邻圆形凹坑之间的间距为20 μm，所述圆形凹坑的最大深度为2 μm。所得样品编号a。
20.实施例2
采用飞秒激光刻蚀处理tc4钛合金样本表面，通过控制三维移动平台的移动实现激光焦点在样品表面进行扫描，并通过实验平台上的ccd及共聚焦光学显微系统实时监控过程，准确构建出如图2所示的定向纹路阵列：所述定向纹路阵列由“《”形的凹槽阵列构成，所述“《”形的凹槽最大深度为4 μm、凹槽最大宽度为5 μm，相邻凹槽之间的列间距为5μm、行间距为5μm；所得样品编号b。
21.实施例3采用飞秒激光刻蚀处理tc4钛合金样本表面，通过控制三维移动平台的移动实现激光焦点在样品表面进行扫描，并通过实验平台上的ccd及共聚焦光学显微系统实时监控过程，准确构建出如图3所示的条形凹槽阵列：所述条形凹槽阵列以条形凹槽簇构成的菱形单元为基本单元周期性排列而成，所述条形凹槽的最大深度为2 μm、最大宽度为5 μm，相邻条形凹槽之间的间距为15 μm；相邻所述菱形单元之间的间距为4 μm。所得样品编号c。
22.对比例1未经飞秒激光技术处理，仅通过超声清洗处理的tc4钛合金样本表面，所得样品编号d。
23.样本表面亲疏水性分析： 如图4所示，实施例1制备的tc4钛合金样本表面平均水接触角为141.6
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如图5所示，实施例2制备的tc4钛合金样本表面平均水接触角为78.73
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如图6所示，实施例3制备的tc4钛合金样本表面平均水接触角为76.23
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抗菌实验：涂布平板实验：制备浓度为1x106cfu/ml的金黄色葡萄球菌悬液加入实施例1-3制备的样品a、b、c与对比例1制备的样品d（普通钛片）上共培养6h，6h后用无菌镊子取出底物，放入新96孔板中，用无菌pbs清洗3次，去除松散附着的细菌。然后分别将样品a、b、c、d放入0.5ml tsa中超声5min将样品钛片上的粘附细菌洗脱下来，洗脱液倍比稀释后涂布于tsa固定培养基，恒温培养箱培养24h。菌落计数，结果图7所示。结果显示，相对于对比例1制备的样品d（普通钛片），样品a、b、c抗菌效果明显提升。
24.扫描电子显微镜实验：制备浓度为1x106cfu/ml的金黄色葡萄球菌悬液加入实施例1-3制备的样品a、b、c与对比例1制备的样品d（普通钛片）上共培养6h，6h后用无菌镊子取出底物，放入新96孔板中，用无菌pbs清洗3次，去除松散附着的细菌。依次将钛片进行固定、脱水、干燥、喷金等操作后以扫面电子显微镜观察样本表面细菌粘附情况。结果如图8所示。结果显示，相对于对比例1制备的样品d（普通钛片），样品a、b、c抗菌效果明显提升。
25.细胞生物相容性实验：cck-8实验：兔骨髓间充质干细胞用其配套的兔骨髓间充质干细胞培养基进行培养，细胞置于生物培养箱中培养（37℃，5% co2）。细胞生长密度至80%以上，使用胰酶进行消化传代/种板。将生长状态良好的细胞消化下来，计数，调整细胞浓度10000个/ml，取100ul细胞悬液接种到实施例1-3制备的样品a、b、c与对比例1制备的样品d（普通钛片）上共培养1d（37℃，5% co2）。共培养1d后加入cck-8试剂并孵育4h，读取od450nm的吸光值，结果如图9所示。结果显示，相对于对比例1样品d（普通钛片），样品a、b、c生物相容性无明显破坏。
26.骨髓间充质干细胞增殖实验：兔骨髓间充质干细胞用其配套的兔骨髓间充质干细胞培养基进行培养，细胞置于生物培养箱中培养（37℃，5% co2）。细胞生长密度至80%以上，使用胰酶进行消化传代/种板。将生长状态良好的细胞消化下来，计数，调整细胞浓度10000个/ml，取100ul细胞悬液接种到实施例1-3制备的样品a、b、c与对比例（普通钛片）上共培养1d（37℃，5% co2）。1d后分别用fitc和dapi染剂染色细胞，激光共聚焦显微镜观察结果，结果如图10所示，结果显示，相对于对比例1的样品d（普通钛片），样品a、b、c生物相容性无明显破坏。
27.综上所述，本发明通过飞秒激光技术制备得到了的具有微米结构层的骨科内植物表面与普通钛片组相比都表现出了具有统计学差异的抗菌效果和良好的生物相容性。
28.以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。