一种用于化妆品白细胞提取物及其冻干粉的制备方法与流程

1.本发明涉及生物化妆品技术领域，具体为一种用于化妆品白细胞提取物及其冻干粉的制备方法。


背景技术：

2.所谓cik细胞，就是将白细胞(血液中单个核细胞)在体外用多种细胞因子，如抗cd3单抗、白细胞介素-2(il-2)和干扰素-γ(ifn-γ)共同培养一段时间后获得的，具有非主要组织相容性抗原(mhc)限制性杀瘤活性的一群异质细胞。
3.不同来源的cik细胞的扩增速度、杀瘤活性及杀瘤机制都存在一定的差别。脐血cik的细胞增殖能力及细胞杀伤能力均较外周血cik强，两类cik细胞作用于肿瘤细胞后均出现凋亡和坏死两种变化，不同的是脐血cik作用后坏死的细胞相对较多，而外周血cik组中发生凋亡的细胞相对较多。同时，脐血来源比较原始，免疫原性几乎可以忽略；提供脐血cik的机构会提供相应的安全指标认定，所以脐血cik的卫生安全及免疫排斥都不用担心。
4.脐血cik的主要效应细胞cd3；cd56细胞大量增殖,其相对百分率增长147倍(从0.21％到31％),绝对数增殖倍数为678.7倍,增殖高峰期在第12天。脐血cik细胞能分泌il-2,ifn-γ,tnf—α,从第4天开始稳定分泌,分泌il-2的高峰期在第12天,而ifn-γ,tnf—α分泌高峰在第17天.脐血cik细胞能分泌多种细胞因子,发挥免疫调节作用，对抗炎、消炎效果突出。
5.脐血cik上清液中还有大量的外泌体，外泌体内部包裹了蛋白质、mrna和microrna等物质。它可以在细胞之间运输和转移生物活性分子，如蛋白质和rna，介导靶向细胞间信号传递，甚至是遗传信息的功能性转移，是细胞间通讯的重要介质。研究发现脐血cik上清液中外泌体尤其是对皮肤组织损伤的再生和修复，如伤口愈合、光防护、促进毛发生长等具有多种作用。
6.为此，我们提出一种用于化妆品白细胞提取物及其冻干粉的制备方法。


技术实现要素：

7.(一)解决的技术问题
8.针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于化妆品白细胞提取物及其冻干粉的制备方法，具有良好的安全性，在对皮肤抑菌、消炎、修复效果明显，同时还具备了较强的修复能力。
9.(二)技术方案
10.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种用于化妆品白细胞提取物及其冻干粉的制备方法，其制备方法包括以下步骤：
11.s1：采集健康的脐带血，并采用血液分析仪进行培养，对培养后的脐血进行cik细胞计数；
12.s2：用淋巴细胞分离液分离单个核细胞；
13.s3：把所得单核细胞悬浮在cik细胞无血清培养液中，形成混合液；
14.s4：在步骤s3所得的混合液中添加添加il-2、干扰素与cd3单抗，并在co2孵箱中通过37℃的温度培养14-18天，得到最终培养液；
15.s5：将步骤s4收集到最终培养的上清液经过3000r，20min离心去细胞碎片及颗粒，再进行10kd超滤,最终获得白细胞提取物。
16.优选的，所述步骤s3中的无血清培养液是无血清、不含酚红的培养液。
17.优选的，所述步骤s1中培养的脐血cik细胞每升≥3
×
1010个。
18.优选的，包括以下步骤：
19.(1)澄清：白细胞提取物在4℃3000rpm的条件下离心20min，并收集上清液；
20.(2)加入辅料：在收集的上清液中加入5％-15％的甘露醇进行混匀；
21.(3)除菌：将步骤(2)所得溶液经过0.2μm的滤膜进行除菌过程；
22.(4)分装：将除菌后的溶液分装在玻璃瓶中，液面不超过西林瓶1cm；
23.(5)冻干：将含改溶液的西林瓶置于-25℃的无菌条件下进行预冻，预冻至上清液凝固；
24.(6)升华干燥：将凝固的上清液抽真空，进行升华干燥；
25.(7)除冰密封：干燥后的上清液除去冰晶后进行粉碎，最后加塞加盖，进行密封；
26.(8)保存：于4℃保存冻干粉。
27.(三)有益效果
28.本发明提供了一种用于化妆品白细胞提取物及其冻干粉的制备方法，具备以下有益效果：
29.该用于化妆品白细胞提取物及其冻干粉的制备方法，在实际的使用过程中具有良好的安全性，在对皮肤抑菌、消炎、修复效果明显，同时还具备了较强的修复能力。
附图说明
30.图1为本发明的白细胞提取物5％添加抑菌实验示意图；
31.图2为本发明的白细胞提取物5％添加对皮肤消炎实验示意图；
32.图3为本发明的白细胞提取物5％添加对皮肤修复实验示意图。
具体实施方式
33.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.请参阅图1-3，本发明提供一种技术方案：一种用于化妆品白细胞提取物及其冻干粉的制备方法，其制备方法包括以下步骤：
35.s1：采集健康的脐带血，并采用血液分析仪进行培养，对培养后的脐血进行cik细胞计数；
36.s2：用淋巴细胞分离液分离单个核细胞；
37.s3：把所得单核细胞悬浮在cik细胞无血清培养液中，形成混合液；
38.s4：在步骤s3所得的混合液中添加添加il-2、干扰素与cd3单抗，并在co2孵箱中通过37℃的温度培养14-18天，得到最终培养液；
39.s5：将步骤s4收集到最终培养的上清液经过3000r，20min离心去细胞碎片及颗粒，再进行10kd超滤,最终获得白细胞提取物，在此过程中对所得的细胞悬液进行流式鉴定，取含有1
×
106cells的细胞悬液进行流式鉴定，500g离心5min，弃上清，用含5％fbs的pbs清洗两遍；用10％fbs的pbs重悬脐血cik细胞，加入cd56及cd3的抗体各2.5μl，充分混匀，避光孵育30min，上流式仪检测cd56+cd3-的细胞含量。其中，cd56+cd3-的nk细胞含量为60％以上。。
40.步骤s3中的无血清培养液是无血清、不含酚红的培养液。
41.步骤s1中培养的脐血cik细胞每升≥3
×
1010个。
42.包括以下步骤：
43.(1)澄清：白细胞提取物在4℃3000rpm的条件下离心20min，并收集上清液；
44.(2)加入辅料：在收集的上清液中加入5％-15％的甘露醇进行混匀；
45.(3)除菌：将步骤(2)所得溶液经过0.2μm的滤膜进行除菌过程；
46.(4)分装：将除菌后的溶液分装在玻璃瓶中，液面不超过西林瓶1cm；
47.(5)冻干：将含改溶液的西林瓶置于-25℃的无菌条件下进行预冻，预冻至上清液凝固；
48.(6)升华干燥：将凝固的上清液抽真空，进行升华干燥；
49.(7)除冰密封：干燥后的上清液除去冰晶后进行粉碎，最后加塞加盖，进行密封；
50.(8)保存：于4℃保存冻干粉。
51.综上所述：
52.图1的实验方法为：菌种为黄金色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌。样品1：用盐水稀释50：1，样品2：用含5％白细胞提取物的盐水稀释50：1，各取样品1ml接种到营养琼脂平板恒温37℃培养24小时。观察菌落的数量；
53.图2的实验方法为：样品1：生理盐水；样品2：含5％白细胞提取物的生理盐水。分别涂抹在皮肤红斑、丘疹、瘙痒感的部位，12小时观察；
54.图3的实验方法为：样品1：生理盐水；样品2：含5％白细胞提取物的生理盐水。分别涂抹在皮肤受损红血丝部位，每12消失涂抹一次，72小时观察。在使用时白细胞提取物与其他化妆品原料复配：
55.最后得出以下结论：该用于化妆品白细胞提取物，在对皮肤抑菌、消炎、修复效果明显。
56.同时在使用时需要注意：
57.(1)本液为水溶性液体。与脂溶性基质配伍，则需加入相应的表面活性剂进行配伍优化。
58.(2)本液中所含活性物有不耐受高温特性。作为配料使用过程中，避免其使用温度超过40℃。若配料过程中有步骤的温度超过该温度时，请先进行高温度反应步骤，待反应完成后，温度降至40℃以下后，加入本品进行混匀。
59.(3)本液为无菌液。保存时需要无菌保存。若打开后应用，不能一次性用完的，请在无菌条件下使用。
60.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下。由语句“包括一个......限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素”。
61.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。