一种荧光-ct双模态分子探针、制备方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种荧光-ct双模态分子探针、制备方法及其应用。
背景技术：
2.稀据世界卫生组织国际癌症研究机构(iarc)发布的2020 年全球癌症数据显示，中国每天的癌症新发病人数和死亡人数均居世界第一。在中国，恶性发病肿瘤前五的疾病为：肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肝癌。医学影像在肿瘤的精准诊断和精准治疗的影像导航方面具有重要作用。荧光分子影像技术是生物学和医学研究中极为重要的手段，突破了传统影像技术只能显示病变所引起的解剖结构变化的局限，可对肿瘤进行精准影像定位诊断、边界识别，并对手术进行精准引导、实现肿瘤的彻底切除；然而，另一方面，因技术所限，荧光分子成像技术主要对浅表层组织成像，不能满足医生对病变组织或血管的纵深信息勘察的需求。ct影像技术可对含深层组织在内的人体组织进行三维断层成像，临床上一般通过引入ct造影剂来增强病变组织与正常组织的对比度，从而提高ct对病灶组织的分辨能力，目前应用广泛的造影剂基本是含碘元素的有机化合物，但其分子量较小，难以在血液中长循环，导致成像时间窗窄、缺乏组织特异性、难以对病灶组织造影。任何成像模式均有其固有缺陷，仅靠一种成像模式难以提供全面信息。将ct成像与荧光成像相结合，可充分实现优势互补，实现对肿瘤的精准影像诊断和(或)实现在手术过程中的精准导航。
技术实现要素：
3.本发明的主要目的在于提供一种荧光-ct双模态分子探针、制备方法及其应用，以克服现有技术中的不足。
4.本发明的一个目的通过以下技术方案来实现：
5.一种荧光-ct双模态分子探针，包括荧光染料、ct造影剂和纳米载体。
6.本发明的荧光染料指的是吸收特定波长的光能并以不同波长重新发光的化学物质。包括但不限于：cy系列菁染料，如cy3、 cy5、cy3.5、cy5.5、cy7、cy7.5等；氟化硼二吡咯bodipy 类染料，如bdp 558/568nhs ester、bdp 581/591nhs ester、bdp 630/650x nhs ester、bdp r6g nhs ester、bdp 630/650azide等；七甲川花菁系列染料，如ir780、ir783、ir808、ir820等；吲哚菁绿icg染料等。
7.本发明的ct造影剂是为增强ct影像观察效果而注入或服用到人体组织或器官的化学制品。这些化学制品的密度高于或低于周围组织，形成的对比用某些器械显示图像。ct造影剂优选为非离子型造影剂和/或离子型造影剂，优选为含碘造影剂，如碘普罗胺、碘海醇、泛影葡胺、泛影酸钠、碘化油、碘帕醇、碘佛醇、碘克沙醇等中的一种或多种。
8.本发明的纳米载体指的是粒径在10～1000nm的纳米粒子，包括但不限于聚合物纳米胶束、纳米微胶囊、纳米球、纳米脂质体、磁性纳米颗粒等。
9.作为优选，纳米载体为由两亲性嵌段聚合物形成的聚合物纳米胶束。
10.作为优选，两亲性嵌段聚合物的亲水端为聚乙二醇、单甲醚聚乙二醇、聚氧乙烯、聚环氧乙烷中的一种或多种；两亲性嵌段聚合物的疏水端为聚乳酸、磷脂、聚己内酯、乳酸-羟基乙酸共聚物、聚苯乙烯、聚环氧丙烷、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、聚乙烯亚胺中的一种或多种。
11.作为优选，两亲性嵌段聚合物为双嵌段共聚物或三嵌段共聚物。
12.两亲性嵌段聚合物可以为：聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇-磷脂共聚物、聚乙二醇-聚己内酯共聚物、单甲基醚聚乙二醇-聚乳酸共聚物、单甲基醚聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(mpeg-plga)、聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺共聚物、聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷共聚物等中的一种或多种。
13.作为优选，荧光染料以共价偶联方式连接在纳米载体上，ct 造影剂包覆在纳米载体内核内。
14.共价偶联指的是通过化学键等共价偶联的方式将荧光染料分子连接在纳米载体上。包覆是指在ct造影剂通过物理方式包裹在纳米载体内核中；
15.本发明的另一个目的通过以下技术方案来实现：
16.一种荧光-ct双模态分子探针的制备方法，包括以下步骤：
17.s1、在室温条件下，将修饰两亲性嵌段聚合物与荧光染料加入有机溶剂中，然后加入催化剂，在室温下搅拌反应24～60h，用透析袋透析24～60h后，蒸干得到共价偶联产物；
18.s2、将共价偶联产物与两亲性嵌段聚合物混合后溶于有机溶剂中，加入ct造影剂混合均匀；
19.s3、将步骤s2得到的混合溶液加入水中，搅拌后，蒸发去除有机溶剂，然后过滤膜得到产物。
20.作为优选，修饰两亲性嵌段聚合物为端基包括巯基、羧基、氨基和羟基中的一种或多种的两亲性嵌段聚合物。如巯基-聚乙二醇-磷脂共聚物(hs-peg-dspe)、羧基-聚乙二醇-磷脂共聚物、巯基-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物。两亲性嵌段聚合物的巯基、羧基、氨基或羟基端基易于与荧光染料分子发生共价偶联反应。
21.作为优选，共价偶联反应采用的催化剂为三乙胺、二异丙基乙基胺，n-甲基哌啶中的一种或多种。
22.作为优选，修饰两亲性嵌段聚合物与荧光染料的摩尔比为1： (1～2)，修饰两亲性嵌段聚合物与催化剂的摩尔比为1：(2～5)，共价偶联产物与两亲性嵌段聚合物的质量比为1：(8～12)，共价偶联产物与ct造影剂的质量比为(1～5)：1。
23.步骤s1和步骤s2的有机溶剂列举为甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、二氯亚砜和n,n－二甲基甲酰胺等。
24.步骤s2中将共价偶联产物与两亲性嵌段聚合物混合，此时两亲性嵌段聚合物的加入可以与共价偶联产物更好地形成胶束。且此时加入两亲性嵌段聚合物，可以降低共价偶联产物的浓度，避免共价偶联产物的荧光染料分子浓度太高造成荧光淬灭。
25.本发明的第三个目的通过以下技术方案来实现：
26.一种荧光-ct双模态分子探针在制备手术导航的成像试剂中的应用。
27.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
28.(1)本发明将荧光染料和ct造影剂一起集成于纳米载体上，形成荧光-ct双模态分
子探针，同时实现ct成像与荧光成像；
29.(2)荧光染料以共价偶联方式连接在纳米载体上，ct造影剂包覆在纳米载体内核内，不仅制备成本低、安全系数高，且由此形成的荧光-ct双模态分子探针性能稳定，成像质量高；
30.(3)本发明通过特殊方法成功制备获得了荧光染料与纳米载体共价偶联且ct造影剂与纳米载体包覆的荧光-ct双模态分子探针；
31.(4)本发明提供的荧光-ct双模态分子探针将ct成像与荧光成像相结合，可充分实现优势互补，实现对肿瘤的精准影像诊断和(或)实现在手术过程中的精准导航。
附图说明
32.图1为本发明提供的荧光-ct双模态分子探针应用于开放式外科手术的流程图；
33.图2为本发明提供的荧光-ct双模态分子探针应用于腔内微创或介入手术中的流程图。
具体实施方式
34.下面通过具体实施例和附图说明，对本发明的技术方案作进一步描述说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于帮助理解本发明，不用于本发明的具体限制。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
35.以下实施例和对比例中，hs-peg-dspe为西安瑞禧生物科技有限公司的r-0047，mpeg-plga为西安瑞禧生物科技有限公司的r-pl1026。
36.实施例1
37.本实施例的荧光-ct双模态分子探针由以下方法制备：
38.(1)在室温下将摩尔比为1:1.5的hs-peg-dspe和荧光染料ir-780加入甲醇中，而后加入三乙胺(三乙胺与hs-peg-dspe 的摩尔比为3:1)，在室温下搅拌48小时后，用分子量为3000的透析袋透析48小时后，蒸干得到共价偶联产物ir780-peg-dspe。
39.(2)取共价偶联产物与mpeg-plga以质量比为1:10混合共 22mg溶于2ml丙酮，加入到1ml碘海醇(1mg/ml)的丙酮溶液中混合均匀；
40.(3)将步骤(2)得到的混合溶液逐滴加入到2ml去离子水中，搅拌5min，在37℃下旋转蒸发去除丙酮，然后过0.22μm 的亲水滤膜后得到产物。
41.实施例2
42.本实施例的荧光-ct双模态分子探针由以下方法制备：
43.(1)在室温下将摩尔比为1:1.3的hs-peg-dspe和荧光染料ir-783加入甲醇中，而后加入三乙胺(三乙胺与hs-peg-dspe 的摩尔比为2.5:1)，在室温下搅拌50小时后，用分子量为3000 的透析袋透析48小时后，蒸干得到共价偶联产物 ir783-peg-dspe。
44.(2)取共价偶联产物与mpeg-plga以质量比为1:10混合共 22mg溶于2ml丙酮，加入到1ml碘帕醇(1mg/ml)的丙酮溶液中混合均匀；
45.(3)将步骤(2)得到的混合溶液逐滴加入到3ml去离子水中，搅拌10min，在37℃下旋转蒸发去除丙酮，然后过0.22μm 的亲水滤膜后得到产物。
46.实施例3
47.本实施例的荧光-ct双模态分子探针由以下方法制备：
48.(1)在室温下将摩尔比为1:1.8的hs-peg-dspe和荧光染料ir-820加入甲醇中，而后加入三乙胺(三乙胺与hs-peg-dspe 的摩尔比为4:1)，在室温下搅拌60小时后，用分子量为3000的透析袋透析48小时后，蒸干得到共价偶联产物ir820-peg-dspe。
49.(2)取共价偶联产物与mpeg-plga以质量比为1:10混合共 22mg溶于2ml丙酮，加入到1ml碘克沙醇(1mg/ml)的丙酮溶液中混合均匀；
50.(3)将步骤(2)得到的混合溶液逐滴加入到3ml去离子水中，搅拌8min，在37℃下旋转蒸发去除丙酮，然后过0.22μm 的亲水滤膜后得到产物。
51.对比例1
52.对比例1的荧光-ct双模态分子探针由以下制备方法获得：
53.(1)在室温下将摩尔比为1:1.5的hs-peg-dspe和荧光染料ir-780加入甲醇中，而后加入三乙胺(三乙胺与hs-peg-dspe 的摩尔比为3:1)，在室温下搅拌48小时后，用分子量为3000的透析袋透析48小时后，蒸干得到共价偶联产物ir780-peg-dspe。
54.(2)将摩尔比为1:1.2的碘海醇和4-碘丁酰氯加入dmf中，而后加入氯化铁(氯化铁与碘海醇的摩尔比为2:1)，在氮气保护下升温至60℃下反应30min，而后抽滤得到澄清溶液，再用去离子水分三次萃取，合并水相蒸干后得到如下浅黄色固体化合物1。
[0055][0056]
(3)在室温下将摩尔比为1:1.5的hs-peg-dspe和化合物 1加入甲醇中，而后加入而后加入三乙胺(三乙胺与hs-peg-dspe 的摩尔比为2:1)，在室温下搅拌24小时后，用分子量为3000的透析袋透析48小时，蒸干得到白色粉末碘海醇-peg-dspe。
[0057]
(4)将ir780-peg-dspe与碘海醇-peg-dspe以质量比1:1 混合，而后将混合物与mpeg-plga以质量比1:10混合共22mg 溶于2ml丙酮，混合均匀后逐滴加入到2ml去离子水中，搅拌5 分钟，在37℃下旋转蒸发去除丙酮；然后过0.22μm的亲水滤膜后得到产物。
[0058]
对比例1的荧光-ct双模态分子探针中，荧光染料和ct造影剂均与纳米载体共价偶联，这种模式获得的荧光-ct双模态分子探针可以达到与实施例1相同的技术效果，但是很显然，制备过程很繁琐，制备成本较高，且不可避免的使用到金属催化剂，可能存在催化剂残留的风险。
[0059]
对比例2
[0060]
对比例2的荧光-ct双模态分子探针由以下制备方法获得：
[0061]
(1)取peg-dspe与mpeg-plga以质量比为1:10混合共 22mg溶于2ml丙酮，加入到1ml碘海醇(1mg/ml)的丙酮溶液中混合均匀，而后再加入1ml ir-780(667μg/ml)的甲醇溶液并混合均匀；
[0062]
(2)将步骤(1)得到的混合溶液逐滴加入到2ml去离子水中，搅拌5min，在37℃下旋转蒸发去除丙酮和甲醇，然后过0.22 μm的亲水滤膜后得到产物。
[0063]
对比例2的荧光-ct双模态分子探针中，荧光染料和ct造影剂均包覆在纳米载体内核内。荧光染料ir-780包覆在聚合物胶束内，进入体内后容易出现荧光聚集淬灭的现象，从而容易导致荧光信号丢失；聚合物胶束包覆ir-780很容易出现荧光分子泄露而导致无法定位成像信号的情况；且步骤(1)中荧光染料ir-780 溶液的加入会降低两亲性聚合物成型为胶束的成功率。
[0064]
本发明提供的荧光-ct双模态分子探针作为一种成像试剂可以应用在复合手术中，复合手术包括开放式外科手术、腔内微创或介入手术等。
[0065]
将荧光-ct双模态分子探针应用于开放式外科手术，如图1 所示，包括如下步骤：
[0066]
(1)注射荧光-ct双模态分子探针，对注射该双模态分子探针的组织区域分别进行ct增强成像和红外荧光成像，获得手术区域组织的三维ct图像和浅表组织的荧光图像；
[0067]
(2)ct图像和荧光图像配准和融合，形成既有手术区域浅表组织精准标识肿瘤位置和边界信息、又有手术区域纵深方向危急器官/血管信息的双模态融合图像；
[0068]
(3)将所述双模态融合图像转换为图片或视频的形式，显示在用户界面上；
[0069]
(4)根据实际手术需求的图像范围，结合投影光显示在不同部位上的特点，对双模态融合图像进行修正。
[0070]
(5)将修正后的ct-荧光双模态融合图像，通过投影机，原位投影至需要进行手术的部位。
[0071]
(6)根据需要，通过图像采集器获取投影在不同部位上的显示情况，调整投影机的投影光的发射参数以匹配手术需求；
[0072]
(7)以双模态融合图像投影结合用户界面显示，对手术进行导航，开展高精准的ct-荧光联合引导下的开放式外科手术。
[0073]
将荧光-ct双模态分子探针应用于腔内微创或介入手术中，如图2所示，包括如下步骤：
[0074]
(1)注射荧光-ct双模态分子探针，对注射该双模态分子探针的组织区域分别进行ct增强成像和红外荧光内镜成像，获得手术区域组织的三维ct图像和腔内荧光图像；
[0075]
(2)采用虚拟ct内窥镜功能，对ct图像进行后处理，获得虚拟ct内窥镜3d图像；
[0076]
(3)虚拟ct内窥镜3d图像和荧光图像配准和融合，形成既有腔内手术区域浅表组织精准标识肿瘤位置和边界信息、又有手术区域纵深方向危急器官/血管信息的双模态融合图像；
[0077]
(4)以双模态融合图像对手术导航，开展高精准的ct-荧光联合引导下的微创/介入手术。
[0078]
最后应说明的是，本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明，而并非对本发明的实施方式的限定。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具有实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，这里无需也无法对所有的实施方式予以全例。而这些属于本发明的实质精神所引申出的显而易见的变化或变动仍属于本发明的保护范围，把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。