一种含铁皮石斛提取物的组合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及肠道健康领域，具体涉及一种含铁皮石斛提取物的组合物及其应用。


背景技术：

2.现代社会生活节奏快，工作压力大、饮食睡眠不规律，加之缺乏运动等容易带来肠道问题，影响肠道健康，如导致肠道炎症、肠粘膜损伤等。肠碱性磷酸酶(iap)是一种同源二聚体酶。现有的研究表明，iap在肠粘膜的保护发挥重要作用：如摄入外源性iap可降低囊性纤维化小鼠的肠通透性；同时iap可发挥碱性化学传感器的作用参与十二指肠表面的ph值调节，保护十二指肠黏膜免受胃酸损伤。而且ipa还可催化脂多糖的去磷酸化，降低脂多糖的毒性。因此适量的增强体内iap的含量，将有助于对肠粘膜损伤等的预防和修复。而铁蛋白(ferritin 28，fthl28)是一种急性时相反应蛋白，在急性炎症和细菌感染时候，可促进去铁铁蛋白合成，血清铁蛋白可明显升高，降低铁蛋白的水平对于保持肠道健康也是有益的。
3.石斛属于兰科石斛属，目前共发现1000余种。石斛的茎是重要的中药原料，国内药用石斛有30多种，如铁皮石斛、金叉石斛、鼓槌石斛等。铁皮石斛凭借独特的药用价值而与其他石斛区分，在《中国药典》中单独作为一味药列出。目前的研究表明，石斛具有“厚肠胃”的功效，体现修复胃黏膜损伤、促进消化液及消化酶分泌和增加胃肠运转率等；同时石斛还具有抗氧化、增强免疫力、降血糖等作用。但石斛尤其是铁皮石斛原料价格贵，野生铁皮石斛在《中国植物红皮书》中被收载为濒危植物。而石斛单味入药起到保健功效需要服用较大的剂量，保持较高浓度水平的摄入，导致石斛的市场接受程度不高。因此如何实现石斛能够在低剂量下发挥功效是石斛产业发展需要解决的重要问题。
4.裸藻即眼虫，含有能够进行光合作用的叶绿体，可制造营养供自己生长。裸藻中含有多种生物活性物质，如维生素、不饱和脂肪酸、多糖等，具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、降胆固醇、调节肠胃功能紊乱等多种功效。裸藻在保健领域的应用研究日益深化，目前市场上已经出现了商品化的裸藻粉，可服用以达到补充营养、增强免疫力、调节肠胃健康等目的，也可外用起到缓和皮肤炎症的功效。而且裸藻粉的原料充分、价格适中，原料来源具有可持续性。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种含铁皮石斛提取物的组合物，可提高体内肠碱性磷酸酶iap的浓度水平，而且能下调编码铁蛋白的基因fthl28的表达，降低铁蛋白的合成，有助于肠粘膜损伤等的预防和修复，改善胃肠道粘膜完整性，保持肠道健康。
6.本发明提供如下的技术方案：一种含铁皮石斛提取物的组合物，所述组合物包括铁皮石斛提取物和裸藻粉，裸藻粉与铁皮石斛提取物的质量比≥1.3；所述组合物以水溶液形式表示时，铁皮石斛提取物的浓度≥38μg/ml。
7.铁皮石斛提取物与裸藻粉的主要成分均为多糖，并且铁皮石斛提取物和裸藻粉在促进肠健康方面均有一定的效果，比如铁皮石斛提取物可以增加胃肠运转率，裸藻粉可以调节肠胃功能紊乱，但是目前尚未出现将铁皮石斛提取物与裸藻粉复合使用的研究。发明人团队将铁皮石斛提取物与裸藻粉复配使用，其中铁皮石斛提取物优选为铁皮石斛水提物，在斑马鱼上进行测试，首次发现铁皮石斛提取物和裸藻粉在特定的复合比例下使用可以提高肠道碱性磷酸酶的浓度水平，而且能够下调用于编码铁蛋白的基因fthl28的表达，降低铁蛋白的水平。进一步的研究中还发现，上述组合物还能够降低有肠道炎症反应的斑马鱼的中性粒细胞数量、减少肠腔面积，同时提升杯状细胞数量，改善肠道炎症症状。尤其是上述效果可以在铁皮石斛提取物和裸藻粉均较低浓度下实现。在以组合物水溶形式对斑马鱼的测试中，溶液中铁皮石斛提取物浓度达到38μg/ml即可，有利于肠道健康保持。考虑到单独低石斛供给水平下保健效果非常不明显，需服用较大剂量才能起到保健效果，本技术的铁皮石斛提取物和裸藻粉的组合物对于扩展石斛的应用和接受程度具有积极的作用。
8.作为本发明的优选，所述裸藻粉与铁皮石斛提取物的质量比为1.3～1.7:1。更优选的配比为裸藻粉与铁皮石斛提取物的质量比为1.5:1。
9.作为本发明的优选，所述铁皮石斛提取物的浓度为38～2000μg/ml。在以斑马鱼为受试对象的测试中，在铁皮石斛提取物保持上述浓度范围且铁皮石斛提取物和裸藻粉合适的配比范围内，均能起到目标效果，优选的浓度为41.7～2000μg/ml，更优选的浓度为41.7μg/ml，对应裸藻粉为62.5μg/ml。
10.作为本发明的优选，所用的铁皮石斛提取物为铁皮石斛水提物，该铁皮石斛水提物的水提方法非本技术技术方案的重点方向，可采用目前已经被公开的石斛常规水提工艺。发明人在研究中具体使用到的一种水提过程如下：将石斛的干燥茎粉碎至粉末，加入15～20倍质量的水在80～100℃加热回流提取，提取液离心得到上清液，将上清液浓缩、干燥得到铁皮石斛提取物。
11.本技术所用的铁皮石斛提取物为铁皮石斛水提物，提取产物与传统食用煎煮方法保持一致，从而保证其功能性和安全性，同时尽可能的维持石斛天然的营养成分。
12.作为本发明的优选，所述加热回流提取2～5次，合并各次提取液并离心后得到的上清液，浓缩、干燥得到铁皮石斛提取物。
13.作为本发明的优选，所述上清液浓缩至原体积的10～30％后干燥。
14.作为本发明的优选，所述铁皮石斛提取物中多糖含量≥25％；所述裸藻粉中β-1,3-葡聚糖的含量≥50g/100g。
15.作为本发明的优选，成人每日服用组合物中，铁皮石斛提取物含量≥228mg。通过斑马鱼的测试得出，以水溶形式给予斑马鱼上述组合物时，水溶液中铁皮石斛提取物的合适浓度≥38μg/ml，将其转化成成人服用剂量，即每日服用组合物(固态，非溶液形式)中，铁皮石斛提取物≥228mg。更优选的，铁皮石斛提取物的含量为250mg，裸藻粉的含量为375.0mg，此时对于以水溶形式给予斑马鱼组合物，对应铁皮石斛提取物浓度41.7μg/ml，裸藻粉浓度62.5μg/ml。
16.上述组合物在提高肠碱性磷酸酶浓度水平上的应用。
17.上述组合物在下调基因fthl28的表达上的应用。
18.本发明的有益效果如下：
本发明提供的组合物由铁皮石斛提取物和裸藻粉组成，铁皮石斛提取物和裸藻粉复配具有协同作用的最佳配比，可以实现铁皮石斛提取物在较低浓度下具有较强的活性作用，能够提升肠碱性磷酸酶浓度、下调基因fthl28的表达，有利于肠道健康的保持；而且还能够降低有肠道炎症反应的斑马鱼的中性粒细胞数量、减少肠腔面积，同时提升杯状细胞数量，改善肠道炎症症状，改善胃肠道粘膜完整性。
附图说明
19.图1是斑马鱼肠道中性粒细胞典型图。
20.图2是样品处理后斑马鱼肠道面积典型图。
21.图3是斑马鱼肠道杯状细胞典型图。
具体实施方式
22.下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
23.如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
24.总实施例一种含铁皮石斛提取物的组合物，该组合物包括铁皮石斛提取物和裸藻粉，裸藻粉与铁皮石斛提取物的质量比≥1.3，优选的质量比为1.3～1.7:1，更优选的质量比为1.5；组合物以水溶液形式表示时，铁皮石斛提取物的浓度≥38μg/ml，优选的铁皮石斛提取物的浓度为38～2000μg/ml，进一步优选的铁皮石斛提取物的浓度为41.7～2000μg/ml，更优选的铁皮石斛提取物的浓度为41.7μg/ml、裸藻粉的浓度为62.5μg/ml。
25.该组合物中，裸藻粉的β-1,3-葡聚糖含量≥50g/100g，铁皮石斛提取物中多糖含量≥25％。
26.所用铁皮石斛提取物可选取常规的铁皮石斛的提取产品，也可经以下过程制备得到：将铁皮石斛的干燥茎粉碎至粉末，加入15～20倍质量的水在80～100℃加热回流提取，提取液离心得到上清液，然后将残渣再次加入后加热回流提取，如此重复2～5次，合并各次提取液并离心后得到的上清液，浓缩至原体积的10～30％后干燥得到铁皮石斛提取物。
27.上述组合物的成人每日服用剂量中(固态，非水溶液形式存在)，铁皮石斛提取物含量≥228mg。更优选的铁皮石斛提取物含量为250mg，此时对于斑马鱼而言，组合物以水溶液形式表示，铁皮石斛提取物浓度41.7μg/ml，裸藻粉浓度62.5μg/ml。
28.实施例1一种含铁皮石斛提取物的组合物，该组合物以水溶液形式存在，溶质为铁皮石斛提取物和裸藻粉，其中铁皮石斛提取物的浓度为41.7μg/ml，裸藻粉的浓度为62.5μg/ml，两者质量比为1:1.5；所用裸藻粉购自建明公司(kemin)，铁皮石斛提取物经以下过程制备得到：将铁皮石斛的干燥茎粉碎至粉末，加入15倍质量的水在100℃加热回流提取，提取液离心得到上清液，然后将残渣再次加入后加热回流提取，如此重复3次，合并各次提取液并离心后得到的上清液，浓缩至原体积的20％后冷冻干燥得到铁皮石斛提取物。
29.实施例2
一种含铁皮石斛提取物的组合物，该组合物以水溶液形式存在，溶质为铁皮石斛提取物和裸藻粉，其中铁皮石斛提取物的浓度为38.0μg/ml，裸藻粉的浓度为64.6μg/ml，两种质量比为1:1.7；所用裸藻粉购自建明公司(kemin)，铁皮石斛提取物经以下过程制备得到：将铁皮石斛的干燥茎粉碎至粉末，加入17倍质量的水在90℃加热回流提取，提取液离心得到上清液，然后将残渣再次加入后加热回流提取，如此重复2次，合并各次提取液并离心后得到的上清液，浓缩至原体积的10％后冷冻干燥得到铁皮石斛提取物。
30.实施例3一种含铁皮石斛提取物的组合物，该组合物以水溶液形式存在，溶质为铁皮石斛提取物和裸藻粉，其中铁皮石斛提取物的浓度为100μg/ml，裸藻粉的浓度为130μg/ml，两种质量比为1:1.3；所用裸藻粉购自建明公司(kemin)，铁皮石斛提取物经以下过程制备得到：将铁皮石斛的干燥茎粉碎至粉末，加入20倍质量的水在80℃加热回流提取，提取液离心得到上清液，然后将残渣再次加入后加热回流提取，如此重复5次，合并各次提取液并离心后得到的上清液，浓缩至原体积的30％后冷冻干燥得到铁皮石斛提取物。
31.组合物的性能测试以实施例1中提供的组合物(水溶形式，铁皮石斛提取物的浓度为41.7μg/ml，裸藻粉的浓度为62.5μg/ml，两者质量比为1:1.5；)作为样品进行测试。
32.1、提升肠碱性磷酸酶iap浓度水平1.1实验动物野生型ab品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，年龄为受精后3天(3dpf)的斑马鱼饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1l反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μs/cm；ph为6.5～8.5；硬度为50～100mg/l caco3)，实验动物使用许可证号为：syxk(浙)2012-0171。饲养管理符合国际aaalac认证(认证编号：001458)的要求。
33.1.2仪器、耗材与试剂解剖显微镜(szx7，olympus，japan)；ccd相机(verta1，上海土森视觉科技有限公司，china)；精密电子天平(cp214，ohaus，america)；多功能酶标仪(spark，tecan，switzerland)；6孔板(nest biotech，china)；三硝基苯磺酸(tnbs，批号slck4178，sigma，usa)；甲基纤维素(批号b2006074，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，china)；二甲基亚砜(dmso，批号bccd8942，sigma，switzerland)；fish alp elisa kit(批号092021，上海酶联生物科技有限公司，china)。
34.1.3检测方法随机选取3dpf野生型ab品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予tnbs建立斑马鱼胃肠粘膜损伤模型。28℃处理2天后，移除tnbs，分别给予样品、泼尼松(阳性对照组，浓度15.0μg/ml)，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3ml。28℃继续处理2天后，收样，利用碱性磷酸酶试剂盒，使用多功能酶标仪软件采集数据，分析斑马鱼碱性磷酸酶含量，以该指标的统计学分析结果评价样品对斑马鱼碱性磷酸酶含量的影响，结果如表1所示。统计学处理结果采用mean
±
se表示。用spss26.0软件进行统计学分析，p《0.05表明差异具有统计学意义。
35.1.4测试结果
表1.样品对碱性磷酸酶含量评价实验结果(n＝6)注：与模型对照组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
36.通过上表中可以看出，采用本发明的组合物可以提高斑马鱼肠道碱性磷酸酶的浓度水平，并且与模型对照组相比具有统计学意义。
37.2、下调编码铁蛋白fthl28的基因fthl28的表达2.1实验动物野生型ab品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，年龄为受精后3天(3dpf)的斑马鱼饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1l反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μs/cm；ph为6.5～8.5；硬度为50～100mg/l caco3)，实验动物使用许可证号为：syxk(浙)2012-0171。饲养管理符合国际aaalac认证(认证编号：001458)的要求。
38.2.2仪器、耗材与试剂解剖显微镜(szx7，olympus，japan)；ccd相机(verta1，上海土森视觉科技有限公司，china)；精密电子天平(cp214，ohaus，usa)；6孔板(nest biotech，china)；普通pcr扩增仪(t100，bio-rad，singapore)；荧光定量pcr仪(cfx connect，bio-rad，singapore)；高速冷冻离心机(heraeus fresco17，thermofisher，germany)；紫外-可见光分光光度计(nanodrop2000，thermo，usa)；微孔板迷你离心机(be-6100，海门市其林贝尔仪器制造有限公司，china)；低位裙边96孔板(透明)(hsp9601，bio-rad，usa)；光学粘性封膜b(msb1001，bio-rad，usa)。
39.tnbs(批号slck4178，sigma，usa)；无水乙醇(批号20210529，国药集团化学试剂有限公司，china)；itaq universal sybr green supermix(货号1725124，bio-rad，usa)；amplextm red reagent(批号2103464，invitrogen，usa)；rna-quick purification kit(rna快速提取试剂盒)(货号rn001，上海奕杉生物，china)。
40.2.3检测方法随机选取3dpf野生型ab品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。除正常对照组外，其余各组均水溶给予tnbs建立斑马鱼胃肠粘膜损伤模型。28℃处理2天后，移除tnbs，分别给予样品和泼尼松(阳性对照，浓度15.0μg/ml)，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3ml。平行设置3次生物学重复实验。28℃继续处理2天后，使用rna快速提取试剂盒提取各组斑马鱼总rna，利用紫外-可见光分光光度计对总rna浓度和纯度进行测定。取2.00μg斑马鱼样品总rna，按照cdna第一链合成试剂盒说明操作，合成20.0μl cdna，通过q-pcr检测β-actin和fthl28基因的表达。用β-actin作为基因表达的内参，计算fthl28基因的rna相对表达量。统计学处理结果采用mean
±
se表示。用spss26.0软件进行统计学分析，p《0.05表明差异具有统计学意义。
41.2.4检测结果
2.41rna提取结果及引物序列信息处理结束后，提取斑马鱼总rna，用紫外-可见光分光光度计测定rna的浓度及a260/a280比值，结果见表2所示。
42.表2.总rna的浓度及a260/a280比值(n＝30)从表中可以看出，a260/a280比值均在1.8-2.2之间，表明提取得到斑马鱼总rna质量较好，可用于后续q-pcr实验。引物序列见表3。
43.表3.引物序列信息2.42.样品对fthl28基因的影响根据基因相对表达量公式计算，模型对照组fthl28基因相对表达量为18.2，与正常对照组(1.00)比较p《0.001，提示tnbs诱发斑马鱼结肠炎症模型成功；阳性对照组泼尼松的fthl28基因相对表达量为16.9，与模型对照组比较p》0.05；样品组的fthl28相对表达量为4.40，与模型对照组(18.2)比较p《0.001，见表4。
44.表4.样品对fthl28基因表达的影响(n＝3)组别浓度(μg/ml)fthl28相对表达量(mean
±
se)p正常对照组-1.00
±
0.057***4.9462e-7模型对照组-18.2
±
0.285-阳性对照组15.016.9
±
0.6760.172821样品组62.5+41.74.40
±
0.242***0.000003注：与模型对照组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
45.研究结果表明，在本实验条件下，泼尼松对fthl28基因在模型斑马鱼上的相对表达量变化不明显，不是通过下调fthl28来缓解tnbs诱导的结肠炎。样品能明显下调fthl28基因表达缓解了tnbs诱导的结肠炎。
46.3、对肠道内中性粒细胞的影响3.1实验动物转基因中性粒细胞绿色荧光mpx品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，年龄
为受精后3天(3dpf)的斑马鱼，饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1l反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μs/cm；ph为6.5～8.5；硬度为50～100mg/l caco3)，由本公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：syxk(浙)2012-0171，饲养管理符合国际aaalac认证(认证编号：001458)的要求。
47.3.2仪器、耗材与试剂电动聚焦连续变倍荧光显微镜(az100，nikon，japan)；ccd相机(verta1，上海土森视觉科技有限公司，china)；精密电子天平(cp214，ohaus，america)；6孔板(nest biotech，china)。
48.三硝基苯磺酸(tnbs，批号slbt1675，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，france)，甲基纤维素(批号b2006074，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，china)；二甲基亚砜(dmso，批号bccd7238，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，switzerland)。
49.3.3检测方法随机选取3dpf转基因中性粒细胞绿色荧光mpx品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予tnbs建立斑马鱼胃肠粘膜损伤模型。28℃处理2天后，移除tnbs，分别水溶给予不同配比组合物、泼尼松(阳性对照，浓度15.0μg/ml)，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3ml。28℃继续处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用nis-elements d 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼肠道中性粒细胞数，以上述指标的统计学分析结果评价样品肠道炎症消退功效。统计学处理结果采用mean
±
se表示。用spss26.0软件进行统计学分析，p《0.05表明差异具有统计学意义。
50.3.4检测结果试验和分析结果见表5和图1。图1中，虚线所画区域为斑马鱼肠道，小点为斑马鱼中性粒细胞，我们分析肠道内中性粒细胞个数。若肠道内发生炎症则中性粒细胞增加，反之中性粒细胞减少则为具有改善作用。模型对照组为具有结肠炎疾病的斑马鱼，泼尼松为阳性药。
51.表5.样品肠道炎症消退功效评价实验结果(n＝10)
组别浓度(μg/ml)肠道中性粒细胞数(个，mean
±
se)正常对照组-3.60
±
0.306***模型对照组-9.20
±
0.680泼尼松15.06.20
±
0.442**配方一裸藻粉62.5+铁皮石斛提取物0.009.20
±
0.904配方二裸藻粉62.5+铁皮石斛提取物8.339.10
±
0.526配方三裸藻粉62.5+铁皮石斛提取物25.08.60
±
0.618配方四裸藻粉62.5+铁皮石斛提取物41.76.40
±
0.521**配方五裸藻粉0.00+铁皮石斛提取物41.78.80
±
0.593
注：与模型对照组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
52.从表中可以看出，在本实验条件下，配方四可以明显的降低中性粒细胞数量，具有肠道炎症消退功效。
53.4、对肠腔面积的影响
4.1实验动物转基因中性粒细胞绿色荧光mpx品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，年龄为3dpf斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1l反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μs/cm；ph为6.5～8.5；硬度为50～100mg/l caco3)，由本公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：syxk(浙)2012-0171，饲养管理符合国际aaalac认证(认证编号：001458)的要求。
54.4.2仪器、耗材与试剂解剖显微镜(szx7，olympus，japan)；ccd相机(verta1，上海土森视觉科技有限公司，china)；精密电子天平(cp214，ohaus，america)；6孔板(nest biotech，china)。
55.三硝基苯磺酸(tnbs，批号slbt1675，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，france)，甲基纤维素(批号b2006074，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，china)；二甲基亚砜(dmso，批号bccd7238，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，switzerland)。
56.4.3检测方法随机选取3dpf转基因中性粒细胞绿色荧光mpx品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予tnbs建立斑马鱼胃肠粘膜损伤模型。28℃处理2天后，移除tnbs，分别给予样品、泼尼松(阳性对照，浓度15.0μg/ml)，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3ml。28℃继续处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用用nis-elements d 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼肠道面积，以上述指标的统计学分析结果评价样品肠道粘膜损伤修复功效。统计学处理结果采用mean
±
se表示。用spss26.0软件进行统计学分析，p《0.05表明差异具有统计学意义。
57.4.4检测结果试验和分析结果见表6和图2。图2中虚线所画区域为斑马鱼肠道，所画区域内为肠道面积。
58.三硝基苯磺酸(tnbs)渗入结肠黏膜组织与大分子物质结合，形成全抗原，引起肠壁一系列免疫应答和炎症反应，可见肠道腺体萎缩、粘膜脱落从而肠腔扩大、杯状细胞缺失。tnbs诱导后常规是以溃疡和绒毛脱落的形式破坏上皮完整性。肠道上皮完整性被破坏，绒毛脱落，最直观的表现为肠道面积扩张。若肠腔面积增加(即模型对照组，则认为诱导模型成功)，反之肠腔面积减少则为具有改善作用。
59.表6.样品肠道粘膜损伤修复功效评价实验结果(n＝10)组别浓度(μg/ml)肠道面积(像素，mean
±
se)正常对照组-38561
±
1294***模型对照组-48416
±
2093泼尼松15.041355
±
2149*配方一裸藻粉62.5+铁皮石斛提取物0.0048247
±
2879配方二裸藻粉62.5+铁皮石斛提取物8.3346791
±
1682配方三裸藻粉62.5+铁皮石斛提取物25.045745
±
3370配方四裸藻粉62.5+铁皮石斛提取物41.741853
±
1950*配方五裸藻粉0.00+铁皮石斛提取物41.745369
±
2482
与模型对照组比较，*p《0.05，***p《0.001。
60.从上表6和图2中可以看出，配方四在几个配方中面积最小，且只有配方四的肠道面积与模型对照组比较具有显著性差异，在本实验条件下，配方四具有肠道粘膜损伤修复功效。
61.5、对杯状细胞的影响5.1实验动物野生型ab品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，年龄为3dpf斑马鱼，均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1l反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μs/cm；ph为6.5～8.5；硬度为50～100mg/l caco3)，由本公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：syxk(浙)2012-0171，饲养管理符合国际aaalac认证(认证编号：001458)的要求。
62.5.2仪器、耗材与试剂解剖显微镜(szx7，olympus，japan)；ccd相机(verta1，上海土森视觉科技有限公司，china)；精密电子天平(cp214，ohaus，america)；6孔板(nest biotech，china)。
63.二甲基亚砜(dmso，批号bcbz1685，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，france)；甲基纤维素(批号079k0054v，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，france)；无水乙醇(批号20200415，国药集团化学试剂有限公司，china)；冰醋酸(批号i1712010，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，china)；4％细胞组织固定液(批号20200330，北京索莱宝科技有限公司，china)；阿尔新蓝(批号bcbv8028，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，france)；三硝基苯磺酸(d1326018，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，france)。
64.5.3检测方法随机选取3dpf野生型ab品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予tnbs建立斑马鱼胃肠粘膜损伤模型。28℃处理2天后，移除tnbs，分别给予不同配比组合物、泼尼松(阳性对照，浓度15.0μg/ml)，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3ml。28℃继续处理2天后，用阿尔新蓝染色，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，使用nis-elements d 3.20高级图像处理软件采集数据，分析斑马鱼肠道杯状细胞数，以该指标的统计学分析结果评价样品肠道杯状细胞调节功效。统计学处理结果采用mean
±
se表示。用spss26.0软件进行统计学分析，p《0.05表明差异具有统计学意义。
65.5.4检测结果结果见表7和图3。图中虚线方框表示斑马鱼肠道的分子区域，所画区域内灰色小点为斑马鱼肠道内杯状细胞。
66.表7.样品肠道杯状细胞调节功效评价实验结果(n＝10)
与模型对照组比较，*p《0.05，***p《0.001。
67.肠杯状细胞是分散分布于肠粘膜上皮中的黏液分泌细胞，主要功能是分泌黏蛋白。其具有抗原呈递功能，参与免疫调节。在肠道固有屏障中发挥重要作用肠杯状细胞的数量、结构、功能的缺陷及其分泌的黏蛋白的缺陷都会对肠道微生态及免疫平衡产生不利影响。杯状细胞的形态和数量反应了肠黏膜的健康状况，是粘膜异常的一个敏感指标。若杯状细胞数量减少(即模型对照组，则认为诱导模型成功)，反之杯状细胞数目增加则为具有改善作用。
68.从表7和图3中可以看出，配方四在几个配方中杯状细胞数目最多的，且只有配方四的杯状细胞数目与模型对照组比较具有显著性差异。
69.通过上述实验可以看出，本发明提供的组合物在铁皮石斛提取物和裸藻粉较低浓度下提升肠碱性磷酸酶浓度、下调基因fthl28的表达，还能够降低有肠道炎症反应的斑马鱼的中性粒细胞数量、减少肠腔面积，同时提升杯状细胞数量，改善肠道炎症症状，有利于肠道健康的保持。