酞嗪衍生物治疗肝纤维化疾病的用途

1.本发明涉及药物领域，具体涉及酞嗪衍生物治疗肝纤维化疾病的用途。


背景技术：

2.中国专利cn201810140689.6公开了一类含有酞嗪-1（2h）-酮结构的化合物，并且公开了该类化合物具有parp（聚腺苷二磷酸核糖聚合酶）抑制作用，因此具有抗肿瘤的活性，该类化合物与其它抗肿瘤药物联用，可以达到提高对肿瘤的疗效并降低剂量和毒性的效果。在碱基切除修复途径中，parp是一种关键的dna修复酶，具有调控细胞凋亡，维持基因组稳定等作用。parp抑制剂通过影响parp功能从而阻碍dna修复过程，使同源重组修复缺失的细胞死亡。近年来，parp作为抗肿瘤靶点得到广泛研究。奥拉帕尼是首个上市的parp抑制剂，用于复发性表皮卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌的治疗。专利cn201810140689.6中具体公开了11个化合物，其中化合物i-9的结构式如下：。
3.纤维化（fibrosis）是机体组织受到损伤时发生的自我修复，可发生于多种器官（如肺、肝脏、心肌、肾及皮肤等），研究发现在慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、肝硬化、系统性硬化症等疾病中，均有纤维化过程的参与，它们的共同之处是均有炎症反应、细胞外基质的过度沉积，靶器官和/或靶组织不同程度纤维化。目前纤维化疾病针对性治疗仍未取得满意效果。
4.肝纤维化是一个病理生理过程，是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生。任何肝脏损伤在肝脏修复愈合的过程中都有肝纤维化的过程，如果损伤因素长期不能去除，纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化。肝纤维化的病因有很多，在临床上多见有病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性疾病等。抗肝纤维化的治疗主要包括：针对原发病去除致病因素，如乙型肝炎和丙型肝炎的抗病毒治疗，抗血吸虫治疗，戒酒等。针对肝纤维化本身的治疗，如通过抑制炎症或脂质过氧化，或者抑制肝星状细胞的增生活化，以及促进胶原降解等。
5.肝纤维化是慢性肝病共有的病理改变，其本质是以胶原为主的细胞外基质（extracellularmatrix,ecm）合成增多，而降解相对减少，两者失去动态平衡，致使过多ecm沉积于肝内引起肝纤维化。肝纤维化的形成是由于各种损肝因子引起肝细胞损伤、坏
死、凋亡及肝组织炎症反应，激活枯否细胞分泌多种细胞因子；随同肝细胞、血小板和窦内皮细胞等分泌的细胞因子、脂质过氧化产物等化学递质共同作用于肝星状细胞，使之激活转变为肌纤维母细胞，发生表型及功能改变，通过旁分泌及自分泌机制，使肌纤维母细胞增殖，合成大量的胶原和蛋白多糖等，其发生机制是一个非常复杂的病理过程，涉及病理组织学、细胞学、细胞因子及其分子水平的调节。
6.目前认为肝星状细胞（hepatocellular stellate cell，hsc）的持续过度活化是促进肝纤维化发生发展的关键因素。在正常肝组织中，hsc常处于静息状态，但是当肝脏受到物理、化学和微生物感染等病理因素刺激时，hsc就会发生增殖活化转变为其活化形式—肌成纤维细胞（myofibroblasts，mfb），表现出明显的细胞增殖、收缩性增加、大量表达α-平滑肌动蛋白（α-sma），合成胶原（collagen i）能力增强，活化后的hsc有以下四个去向：（1）转化为静止型hsc；（2）细胞凋亡；（3）免疫清除；（4）细胞衰老。目前研究表明，hsc活化并分化为mfb，可以用“三步级联反应”解释: 第一步是前期炎性阶段，各种损伤因素导致肝细胞损伤后, 凋亡或坏死的肝细胞释放多种丝裂原样物质, 激活hsc转化为mfb（直接旁分泌通路）；第二步是炎性阶段，肝损伤导致肝内炎性细胞主要是活化的巨噬细胞以及血小板分泌大量细胞因子如tgf-β1、tnf-α、egf、pdgf等, 进一步刺激hsc活化转化为mfb（旁分泌活化通路）；第三步是炎症后阶段。mfb及hsc在转化中可以自分泌tgf-β1、tnf-α等因子，促进自身进一步活化（自分泌活化通路），在炎症后阶段即使去除原来的肝损伤因素。也足以持续肝纤维化形成过程， 它是重要的、可能永存的阶段。因此，tgf-β1对hsc的激活、转化、分化及调节具有极其重要的作用，是最强的促hsc纤维化生成因子。
7.tgf-β家族信号通路在调节不同细胞过程（包括增殖、分化、迁移或细胞死亡）中起着关键作用，这对于组织和器官的体内平衡至关重要。迁移和增殖是活化的hsc的基本特征，而这些至少有一部分是由tgf-β通过各种机制诱导。由于tgf-β在人体中发挥着重要的作用，其通路的失控会导致人类产生疾病。就肝脏而言，tgf-β信号传导参与疾病进展的所有阶段，从最初的肝损伤到炎症反应和纤维化，再到肝硬化和癌症。研究表明tgf-β在肝细胞中具有抑制细胞生长和凋亡的关键作用，这对于维持肝脏功能至关重要。tgf-β因其在hsc活化和ecm产生过程中的作用而被认为是促纤维化的细胞因子。tgf-β的促纤维化作用主要是通过激活hsc介导的，tgf-β还通过其它肝细胞类型，例如肝细胞和肝祖细胞中的信号传导，参与了纤维化的发生发展。tgf-β1是介导肝损伤及纤维化的最关键的细胞因子。因此，寻找能有效降低或控制tgf-β引起肝星状细胞活化的化合物有望给临床提供一种新的治疗肝纤维化的药物。


技术实现要素：

8.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供酞嗪衍生物治疗肝纤维化疾病的用途，本发明首次提出酞嗪衍生物即化合物（i）在抗肝纤维化领域的用途，本发明中的化合物（i）对肝纤维化具有抑制作用，可用于肝纤维化的治疗，可用于制备治疗肝纤维化疾病的药物。
9.技术方案：为了实现上述目的，本发明提供了化合物（i）所示的酞嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗肝纤维化疾病药物中的用途：
life. 2017; 69（2）:115-127.）在实验结束时收集各组的血液和肝脏样本，以进行后续分析。
22.本发明所述的化合物（i）的应用，在临床上的给药方式可以采用口服、注射等方式。
23.一般地，本发明的化合物（i）用于治疗时，人用剂量范围为1mg~1000mg/天。也可根据剂型的不同和疾病严重程度，使用剂量超出该范围。
24.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明首次提出了化合物（i）所示的酞嗪衍生物的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗肝纤维化疾病的药物中的用途，尤其是由肝星状细胞过度活化引起的肝纤维化疾病。
25.本发明通过上述药效学试验，发现化合物（i）能抑制tgf-β引起的肝星状细胞活化（加药组对比单刺激组collagen i在蛋白水平与mrna水平均下降）且对四氯化碳造模小鼠肝纤维化有明显改善作用，因此，化合物（i）对肝纤维化存在抑制作用，可用于肝纤维化的治疗。同时，采用在人半活化肝星状细胞系lx-2及四氯化碳造模小鼠上开展抗肝纤维化的药效学试验，试验结果进一步充分证明了化合物（i）具有治疗肝纤维化疾病的功效。本发明化合物（i）所示的酞嗪衍生物为开发具有临床治疗价值的药物奠定基础。
附图说明
26.图1是肝星状细胞系lx-2 western blot实验结果图；图2是图1实验结果图的数据分析图；图3是rt－qpcr实验结果分析图；图4是四氯化碳造模小鼠血清ast、alt实验结果图；图5是四氯化碳造模小鼠肝组织western blot实验结果图；图6是图5实验结果图的数据分析图；图7是四氯化碳造模小鼠肝组织切片he、masson及sirius red染色实验结果图。
具体实施方式
27.以下结合实施例对本发明做进一步说明。
28.实施例中代号t-5-9即化合物（i），是药效试验时所用的代号。
29.实施例1t-5-9的合成方法：
其中：boc为叔丁氧羰基，pybop为1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐；diea为n,n-二异丙基乙胺；(cl3co)2co为三光气。
30.4-((4-((2-氟苯基)氨甲酰基)苯基)氨甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯（2）将4-氨基-n-(2-氟苯基)苯甲酰胺(1) (4.75 g, 20.64 mmol)溶于30 ml无水二氯甲烷中，室温下，依次加入diea (7.19 ml, 41.28 mmol)和三光气(2.04 g, 6.88 mmol)的二氯甲烷溶液 (20 ml)，降温至0℃反应3 小时后，加入n-boc-哌嗪(5.77 g, 30.96 mmol)，室温搅拌过夜，tlc检测原料反应完全，过滤，滤液浓缩得粗品，粗品经柱层析分离(淋洗剂：二氯甲烷:甲醇 = 50：1)，得黄色固体7.12g，产率78.0%。m.p. 133-135℃。
[0031]1h-nmr (300 mhz, dmso-d6)δ(ppm): 10.11 (1h, s, conh), 8.92 (1h, s, conh), 7.89 (2h, d, j = 8.7 hz, arh), 7.60-7.49 (1h, m, arh), 7.35-7.11 (3h, m, arh), 6.60 (2h, d, j = 7.5 hz, arh), 4.16-4.08 (4h, m, 2ch2n), 3.52-3.48 (4h, m, 2ch2n), 1.41 (9h, s, (ch3)3c)。
[0032]
n-(4-((2-氟苯基)氨甲酰基)苯基)哌嗪-1-甲酰胺盐酸盐（3）将4-((4-((2-氟苯基)氨甲酰基)苯基)氨甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯（2） (5.64 g, 12.74 mmol) 溶解于100 ml乙酸乙酯中，室温滴加饱和氯化氢的乙酸乙酯溶液(10 ml)，析出白色固体，室温搅拌1小时，过滤，滤饼用乙酸乙酯(20 ml
×
3)洗涤得白色固体4.31 g，产率89.3%。m.p. ＞250℃。
[0033]1h-nmr (300 mhz, dmso-d6)δ(ppm): 10.10 (1h, s, conh), 9.00 (2h, brs, nh, hcl), 8.98 (1h, s, conh), 7.90 (2h, d, j = 8.8 hz, arh), 7.64-7.49 (1h, m, arh), 7.35-7.11 (3h, m, arh), 6.60 (2h, d, j = 7.5 hz, arh), 4.11-4.00 (4h, m, 2ch2n), 3.55-3.48 (4h, m, 2ch2n)。
[0034]
4-(2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基)苯甲酰基)-n-(4-((2-氟苯基) 氨基甲酰基)苯基)哌嗪-1-甲酰胺(t-5-9)将2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基)苯甲酸（4）(0.75 g, 2.51 mmol)
和n-(4-((2-氟苯基)氨甲酰基)苯基)哌嗪-1-甲酰胺盐酸盐（3）(0.95 g, 2.51 mmol)溶于10 ml n, n-二甲基甲酰胺中，加入pybop (1.52 g, 3.01 mmol)、n,n-二异丙基乙胺 (1.56 ml, 8.93 mmol)，室温搅拌过夜后，tlc检测原料反应完全，将反应液缓慢倒入水(30 ml)中，搅拌1 小时，析出固体，抽滤，滤饼用水(5 ml
×
2)洗涤得粗品。该粗品经柱层析分离（淋洗剂：二氯甲烷：甲醇=50:1）得白色固体1.3 g，产率83.2 %。
[0035]1h-nmr(300mhz, dmso-d6)δ(ppm): 12.63 (s, 1h, conhn), 9.93 (s, 1h, conh), 8.96 (s, 1h, conh), 8.30 (d, j = 8.5 hz, 1h, arh), 8.01-7.83 (m, 5h, arh), 7.63 (d, j = 9.2 hz, 2h, arh), 7.47-7.41 (m, 1h, arh), 7.36-7.33 (m, 1h, arh), 7.33-7.21 (m, 5h, arh), 4.36 (s, 2h, arch2), 3.73-3.68 (m, 2h, ch2n), 3.62-3.57 (m, 2h, ch2n), 3.46-3.42 (m, 2h, ch2n), 3.29-3.24 (m, 2h, ch2n). hrms (ei): m/z [m+1]
+ calcd for c
34h29
f2n6o4: 623.2218, found 623.2222。
[0036]
实施例2人半活化肝星状细胞系lx-2细胞试验本实施例lx-2细胞培养方式：将lx-2细胞从-80 ℃冰箱取出，用含10%胎牛血清dmem培养基，在10 cm
2 培养皿中，37 ℃、5% co2培养箱中培养，换液，传代，取3至 6 代细胞进行实验。
[0037]
一、 western blot实验在6孔板中接种人半活化肝星状细胞lx-2（5*10
5 个/孔），设立
①
空白对照组、
②
tgf-β刺激组、
③
t-5-9（0.1 μm）组、
④
t-5-9（1 μm）组、
⑤
t-5-9（10 μm）组。孔内细胞密度为70%时，如表1所示方式处理细胞，24 h后裂解蛋白定量收样，用western blot 法检测lx-2中collagen i蛋白表达量，分析结果，通过对比tgf-β刺激组及加药组collagen i表达情况，检验t-5-9是否能从蛋白水平抑制tgf-β引起的lx-2活化。
[0038]
表1 各试验组的细胞处理方式实验结果如图1所示，图1显示细胞蛋白样品中目的蛋白collagen i与内参蛋白gapdh含量，颜色深浅代表含量多少。
[0039]
从图1可以看出：
①
代表空白对照组，显示lx-2细胞本底collagen i与gapdh表达量。
[0040]
②
代表tgf-β刺激组，显示lx-2细胞加入tgf-β刺激活化后细胞中collagen i与gapdh的表达量，对比
①
组collagen i明显加强。
[0041]
③
代表t-5-9（0.1 μm）组，显示lx-2细胞加入tgf-β刺激并同时使用t-5-9给药后细胞中collagen i与gapdh的表达量，对比
②
组collagen i表达降低。
[0042]
④
代表t-5-9（1 μm）组，显示lx-2细胞加入tgf-β刺激并同时使用t-5-9给药后细胞中collagen i与gapdh的表达量，对比
②
组collagen i表达降低并恢复至
①
组本底水平。
[0043]
⑤
代表t-5-9（10 μm）组，显示lx-2细胞加入tgf-β刺激并同时使用t-5-9给药后细胞中collagen i与gapdh的表达量，对比
②
组collagen i表达明显降低，比
①
组本底水平还低。
[0044]
试验结果分析如图2所示。将图1导入图像处理软件image j进行灰度分析，得到每一个蛋白条带的灰度值，再分别将每组中目的蛋白collagen i灰度值除以gapdh蛋白灰度值，得到目的蛋白collagen i相对灰度值，把其导入graphpad软件做成柱状图，获得图2。（参考卢进，周东东，杨永清等.不同参数对蛋白免疫印迹法结果的影响.生物技术，29（4）: 371 aug.2019）。
[0045]
从图2可以看出：对比空白对照组，tgf-β刺激组collagen i升高；对比tgf-β刺激组，
③④⑤
t-5-9给药组中collagen i均下降且呈现出剂量依赖性。
[0046]
由图1和图2可知：t-5-9（即化合物（i））能剂量依赖性抑制tgf-β引起的肝星状细胞活化（collagen i上升）。因此，t-5-9具有治疗肝纤维化的功效。
[0047]
二、qpcr实验在6孔板中接种人半活化肝星状细胞lx-2（5*10
5 个/孔），设立
①
空白对照组、
②
tgf-β刺激组、
③
t-5-9组。孔内细胞密度为60%时，如表2所示方式处理细胞，24 h后加入trizol提取细胞rna并反转成dna，采用rt－qpcr法检测lx-2中 collagen i mrna 含量，分析结果——t-5-9是否能从mrna水平抑制tgf-β引起的lx-2活化（collagen i mrna表达增强）。
[0048]
表2 各组细胞处理方式实验结果分析如图3所示，图3中柱子高低显示细胞mrna样品中目的基因（collagen i）mrna的相对含量高低。（参考关珠珠 ，李雅楠 ，郭锦秋.graphpad prism软件在医学论文数据审核中的应用.科技传播，1674-6708（2021）278-0118-03.2021）。
[0049]
从图3可以看出：对比空白对照组，tgf-β刺激组collagen i mrna表达显著增强；对比tgf-β刺激组，使用tgf-β刺激并同时加入t-5-9的t-5-9组collagen i mrna表达显著下降，由此说明t-5-9能抑制tgf-β引起的肝星状细胞活化（collagen i mrna表达增强），对肝纤维化存在抑制作用。
[0050]
实施例3抗肝纤维化动物试验本实施例小鼠肝纤维化疾病模型造模方法：24只雄性小鼠（6周龄，体重18-22克），随机分为4组，每组6只。通过注射10%四氯化碳（ccl4，0.5 ml/100 g体重）8周（每周三次）在野生型小鼠中诱导肝纤维化。对照组小鼠腹腔注射等量橄榄油代替四氯化碳；模型组小鼠腹腔注射四氯化碳；阳性药组小鼠腹腔注射ccl4，并给予秋水仙碱（0.1 mg/kg，每天一次，第5-8周）；治疗组小鼠腹腔注射ccl4，并给予t-5-9（12.5mg/kg，每天一次，第5-8周）；后续实验和附图中分别命名为：
①
对照组、
②
模型组、
③
阳性药组、
④
t-5-9组。在实验结束时收集各组的血液和肝脏样本，以进行后续分析。
[0051]
一、小鼠血清ast、alt实验取小鼠血清样本，每组3个样，按照南京建成ast、alt试剂盒检测方法检测小鼠血清中ast、alt含量。
[0052]
试验结果分析如图4所示，图4中左图与右图柱子高低分别显示小鼠血清中ast、alt含量。
[0053]
从图4可以看出，对比对照组，模型组ast、alt含量明显上升，小鼠肝功能异常；对比模型组，阳性药组ast、alt含量明显下降，说明阳性药秋水仙碱治疗后小鼠肝功能恢复；对比模型组，t-5-9组ast、alt含量明显下降，说明t-5-9治疗后小鼠肝功能恢复。由此说明t-5-9能恢复小鼠肝纤维化模型中肝功能异常指标，对肝纤维化存在缓解作用。
[0054]
二、小鼠肝组织实验取上述小鼠肝组织样本，经ripa强裂解液提取蛋白后定量制成样本，用western blot 法检测肝组织中collagen i、α-sma蛋白表达量，分析结果，通过对比模型组及加药组（阳性药组与t-5-9组）collagen i、α-sma蛋白表达情况，判断t-5-9是否能在动物模型上起到抗肝纤维化作用。
[0055]
试验结果分析如图5所示，图5显示细胞蛋白样品中目的蛋白collagen i、α-sma与内参蛋白gapdh含量，颜色深浅代表含量多少。从图5可以看出：对比对照组，模型组collagen i、α-sma表达上升，说明小鼠发生肝纤维化，模型有效。
[0056]
对比模型组，阳性药组collagen i、α-sma表达下降，说明阳性药秋水仙碱对小鼠肝纤维化有治疗作用。
[0057]
对比模型组，t-5-9组collagen i、α-sma表达下降，说明t-5-9对小鼠肝纤维化有治疗作用。
[0058]
试验结果分析如图6所示。将图5导入图像处理软件image j进行灰度分析，得到每一个蛋白条带的灰度值，再分别将每组中目的蛋白collagen i、α-sma灰度值除以gapdh蛋白灰度值，得到目的蛋白collagen i、α-sma相对灰度值，把其导入graphpad软件做成柱状图，获得图6。
[0059]
从图6可以看出：对比对照组，模型组小鼠使用ccl4造模collagen i、α-sma表达上升，发生肝纤维化；对比模型组，阳性药组与t-5-9组小鼠使用ccl4造模后分别用阳性药秋水仙碱及t-5-9治疗，collagen i、α-sma表达均下降，肝纤维化被抑制。
[0060]
由图5和图6可知：t-5-9对肝纤维化小鼠具治疗作用。
[0061]
三、小鼠肝组织切片染色实验将新鲜采集的小鼠肝组织放置于4%的多聚甲醛中常温固定过夜。组织固定完成后完成包埋、切片以及进行he、sirius red及masson染色。
[0062]
试验结果如图7所示，图7显示肝组织切片he、masson及sirius red染色情况。从图7可以看出：对照组he、masson及sirius red染色均呈现正常形态。
[0063]
对比对照组，模型组he染色显示肝细胞变性、坏死，呈现大面积假小叶组织结构；masson染色显示大量蓝色胶原纤维沉积，自汇管区周围向外延伸，纤维条索较粗且染色着色较深，表明胶原纤维较多；sirius red染色显示大量红色i型胶原纤维沉积，由此说明小鼠发生肝纤维化，模型有效。
[0064]
对比模型组，阳性药组he、masson及sirius red染色趋向正常形态，说明阳性药秋水仙碱对小鼠肝纤维化具有治疗作用。
[0065]
对比模型组，t-5-9组he、masson及sirius red染色趋向正常形态，说明t-5-9对小鼠肝纤维化有治疗作用。
[0066]
综上试验证明，t-5-9即化合物（i）能抑制肝星状细胞活化，治疗小鼠肝纤维化，对肝纤维化疾病具有治疗功效。