抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法及应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法及应用。


背景技术：

2.恶性黑色素瘤是一种侵袭性极强、易发生治疗耐受的恶性肿瘤，在世界范围内，黑色素瘤的发病率稳步上升，导致公共卫生问题日益严重，目前正成为皮肤首位致死性疾病。
3.目前，化疗成为治疗已有转移的黑色素瘤晚期患者的主要治疗方式，比如单药化疗或者联合化疗。然而化疗往往存在副作用大、远期效果无法令人满意以及容易产生耐药性的缺点。随着肿瘤免疫学的发展，研究发现黑色素瘤免疫原性较高，免疫治疗在恶性黑色素瘤生物治疗中获得广泛应用并成为其个性化治疗的研究热点，但是由于肿瘤的发生发展是一个多基因变异、多因素共同作用的结果，单一方法治疗难以达到理想效果，因而免疫治疗与其他治疗手段联合成为黑色素瘤治疗的发展趋势。比如将化疗与免疫治疗进行联合，一方面免疫治疗可通过在抗原释放前激活和增强免疫反应扩增识别抗原来激活t细胞以增强化疗效果；另外一方面化疗可通过诱导提高肿瘤细胞的免疫原性，化疗与免疫治疗联合存在相辅相成的联系。
4.受到上述启发，发明人拟将阿霉素(doxorubicin，dox)与免疫疗法联合治疗小鼠黑色素瘤。2017年《nature》报道，ptpn2的缺失能够：
①
增强肿瘤细胞对免疫治疗的敏感作用；
②
增强肿瘤细胞内细胞毒性t细胞cd8
+
的活性；
③
增强ifn-γ释放及肿瘤对ifn-γ的敏感性；
④
促进肿瘤微环境中m0型巨噬细胞向m1型巨噬细胞极化。因而，靶向下调ptpn2基因能发挥肿瘤免疫治疗效果。由于阿霉素较强的毒副作用尤其是心脏毒性，导致其在临床应用中给患者造成了极大的身体负担。纳米载药系统因具有特有的表面效应，比如比表面积较大且根据制备工艺及原料不同可进行多功能修饰，因而可作为治疗药物输送载体，实现药物的靶向及可控释放，并且可实现同时包载多种治疗药物及生物大分子，从而达到多种治疗手段协作的目的。随着纳米载药系统在免疫治疗领域的发展，受启发于脂质体中磷脂双分子层可用于药物递送，许多功能性细胞膜被用于纳米粒的设计以达到生物治疗的目的，比如红细胞膜、肿瘤细胞膜、中性粒细胞膜、巨噬细胞膜等，其细胞膜表面天然携带的许多生物标记分子可使载药系统在体内达到长循环或者靶向递送，甚至发挥免疫治疗的目的。研究发现m1型巨噬细胞膜可通过与肿瘤细胞间形成纳米管隧道及上调本身趋化因子受体2(chemoattractant cell receptor 2，ccr2)以及ccr4从而对肿瘤细胞等有优异的靶向作用。


技术实现要素：

5.基于以上问题，本发明提供抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法及应用，本发明的纳米载药系统能高效率转染黑色素瘤细胞、具有良好的稳定性、能自我复制、能发挥高效的黑色素瘤治疗率，为目前对黑色素瘤无显著有效的治疗方案的困境提供了新
的攻破方向。
6.为解决以上技术问题，本发明提供了抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法，具体步骤如下：
7.s1：构建shrna-ptpn2质粒
8.利用引物设计制备shrna-ptpn2基因，将shrna-ptpn2基因搭载于pgpu6/gfp/neo质粒中构建靶向下调ptpn2的shrna-ptpn2质粒，再通过大肠杆菌扩增shrna-ptpn2质粒；
9.s2：合成ha-dox
10.将透明质酸ha氧化后形成的芳香醛与阿霉素dox的氨基通过亚胺键形成席夫碱ha-dox，简称hd；
11.s3：制备m1巨噬细胞膜
12.s4：制备纳米载药系统m1hd@rpr
13.将5μg步骤s1构建的shrna-ptpn2质粒与25μg细胞穿膜肽irgd混合，静置5min，形成irgd与shrna-ptpn2的共混物irgd-shrna-ptpn2，简称rr；向共混物rr中加入125μg pei，静置混合5min，得pei与rr的复合物irgd-pei-shrna-ptpn2，简称rpr；再静置混合5min，加入含50μg dox的ha-dox，混匀自组装得hd@rpr纳米粒ha-dox@irgd-pei-shrna-ptpn2；之后采用微型挤出器将步骤s3中制备的m1巨噬细胞膜与hd@rpr纳米粒反复过400nm聚碳酸酯膜后得m1hd@rpr纳米载药系统，4℃保存即可。
14.进一步的，步骤s1中的引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列见seq id no.1，反向引物的核苷酸序列见seq id no.2。
15.进一步的，步骤s2中的ha-dox的合成方法具体如下：
16.a.ha的氧化
17.将0.4g ha溶于10ml去离子水中制得ha溶液，然后将0.053gnaio4溶于5ml去离子水中，制备naio4溶液，将naio4溶液逐滴加入ha溶液中，避光搅拌12h，再加入乙二醇继续搅拌0.5h，将得到的溶液用去离子水透析除去naio4，纯化48h后冷冻干燥得海绵状产物oha；
18.b.合成ha-dox
19.取步骤a中的oha0.2g，将0.2g oha和40mg dox
·
hcl共同加至30ml经超声脱气的ddh2o中，在氮气保护下于50℃条件下避光反应48h，之后再用去离子水透析48h以除去未参加反应的dox
·
hcl，冷冻干燥得红色海绵状产物hd。
20.进一步的，步骤s3中的m1巨噬细胞膜的制备方法如下：取对数生长期的raw264.7细胞，待细胞密度达到70％时，加入100ng/ml脂多糖lps及10ng/ml ifn-γ，作用24h后，收集m1型巨噬细胞；之后采用预冷的tris-镁盐缓冲盐重悬细胞，使细胞浓度为2
×
107个/ml，在微型挤出器仅用垫片情况下反复挤出20次以破坏细胞，然后采用蔗糖梯度离心法提取细胞膜，再采用100w功率超声2min，即得所需m1巨噬细胞膜。
21.进一步的，步骤s4中的m1巨噬细胞膜与shrna-ptpn2的配比如下：每5μg shrna-ptpn2加入0.034mg m1巨噬细胞膜。
22.进一步的，步骤s4中m1巨噬细胞膜与hd@rpr纳米粒过400nm聚碳酸酯膜的次数为20次。
23.为解决以上技术问题，本发明还提供了纳米载药系统。
24.为解决以上技术问题，本发明还提供了纳米载药系统在制备治疗黑色素瘤或肺转
移黑色素瘤的药物中的应用。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过将化疗药物阿霉素与沉默免疫抑制基因shrna-ptpn2进行巧妙联合，并采用m1型巨噬细胞膜包覆，实现药物在体内肿瘤部位的靶向递送，用于黑色素瘤原发及肺转移瘤抑制治疗，为目前对黑色素瘤无显著有效的治疗方案的困境提供了新的攻破方向；由于shrna-ptpn2作为核酸生物大分子在体内易受核酸酶降解，为了使其能高效率转染黑色素瘤细胞、具有良好的稳定性、能自我复制、发挥高效的黑色素瘤治疗率，本发明通过shrna在细胞内切割转变成为sirna，从而发挥rnai的作用使基因沉默，利用shrna是小干扰rna序列作为“短发夹”克隆进质粒载体，使得其能在细胞内较为稳定的发挥rnai作用。
附图说明
26.图1为本发明的实施例的m1hd@rpr的构建路线及其在癌症联合治疗中的应用机制示意图；
27.图2为本发明的ha-dox的合成路线示意图；
28.图3为本发明的实施例的ha-dox的结构验证图；
29.图4为本发明的实施例的纳米载药系统的表征结果图；
30.图5为本发明的实施例的小鼠尾静脉注射free dox、hd@rpr、m1hd@rpr后小鼠脏器分布结果图；
31.图6为本发明的实施例的小鼠尾静脉注射free dox、hd@rpr、m1hd@rpr 24h后肿瘤组织切片dox荧光分布共聚焦图片(标尺为200μm)；
32.图7和图8均为本发明的实施例的小鼠肿瘤生长情况图；
33.图9为本发明的实施例不同组治疗后b16f10肺转移小鼠肺部代表图片及h&e结果图(标尺为2000μm)。
具体实施方式
34.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
35.实施例：
36.本实施例提供抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法，具体步骤如下：
37.s1：构建shrna-ptpn2质粒
38.利用引物设计制备shrna-ptpn2基因，将shrna-ptpn2基因搭载于pgpu6/gfp/neo质粒中构建靶向下调ptpn2的shrna-ptpn2质粒，再通过大肠杆菌扩增shrna-ptpn2质粒；本实施例所用引物包括正向引物和反向引物，序列如下：
39.正向引物5
′‑3′
：cacaaagaagttacatctt；
40.反向引物3
′‑5′
：aagatgtaacttctt tgtg；
41.正向引物的核苷酸序列见seq id no.1，反向引物的核苷酸序列见seq id no.2；
42.s2：合成ha-dox
43.将透明质酸ha氧化后形成的芳香醛与阿霉素(dox)的氨基通过亚胺键形成席夫碱
ha-dox，简称hd，因为席夫碱具有ph敏感性，因而可实现阿霉素在弱酸性肿瘤微环境中的定位释放；见附图2，本实施例的ha-dox的合成方法具体如下：
44.ha的氧化：将0.4g ha溶于10ml去离子水中制得ha溶液，然后将0.053g naio4溶于5ml去离子水中，制备naio4溶液，将naio4溶液逐滴加入ha溶液中，避光搅拌12h，再加入乙二醇继续搅拌0.5h以终止反应，将得到的溶液用去离子水透析(mn＝1000da)除去naio4，纯化48h后冷冻干燥得海绵状产物oha；
45.合成ha-dox：取步骤a中的oha 0.2g，将0.2g oha和40mg dox
·
hcl共同加至30ml经超声脱气的ddh2o中，在氮气保护下于50℃条件下避光反应48h，之后再用去离子水透析(mw＝1000da)48h以除去未参加反应的dox
·
hcl，冷冻干燥得红色海绵状产物hd；之后利用紫外分光光度计测定dox含量，计算dox的接枝率，接枝率为12％，并于4℃条件下避光保存备用；ha-dox结构表征：采用1h-nmr核磁共振仪以及ft-ir红外光谱进行结构确认，结果见附图3，其中：a、ha，b、oha，c、dox，d、ha-dox；1h-nmr结果显示，相对于ha，oha在化学位移8.3ppm出现醛基质子峰及5.0～5.25ppm之间出现共振半缩醛质子峰，表明ha被成功氧化为oha；而相对于oha及dox，ha-dox中dox在6.85～7.25ppm处的芳香环质子峰减弱以及在7.85处的氨基质子峰消失，而相对于oha，在8.3ppm处醛基质子峰减弱，表明ha-dox成功合成；由ft-ir红外图谱可见，相对于ha，oha在1731cm-1
处出现典型的醛基c＝o伸缩振动带，而在2750cm-1
处c(o)-h与ha本身c-h吸收峰重合，而相对于oha的ft-ir，ha-dox图谱在1604cm-1
出现属于dox芳香环的伸缩带，因此fitr及1h nmr均表明ha-dox成功合成；
46.s3：制备m1巨噬细胞膜
47.本实施例的m1巨噬细胞膜的制备方法如下：取对数生长期的raw264.7细胞(m0)，待细胞密度达到70％时，加入100ng/ml脂多糖(lps)及10ng/ml ifn-γ，作用24h后，收集m1型巨噬细胞；之后采用预冷的tris-镁盐缓冲盐(tm buffer，ph7.4，0.01m tris and 0.001m mgcl)重悬细胞，使细胞浓度为2
×
107个/ml，在微型挤出器仅用垫片情况下反复挤出20次以破坏细胞，然后采用蔗糖梯度离心法提取细胞膜，再采用100w功率超声2min，即得所需m1巨噬细胞膜；本实施例的蔗糖梯度离心法提取细胞膜的具体操作方法如下：采用1m蔗糖溶液将上述tm缓冲液稀释到蔗糖浓度为0.25m，2000g 4℃离心10min，收集上清液，4000g4℃离心30min，将下沉淀用含0.25m蔗糖的tm缓冲液重悬洗涤，4000g 4℃离心30min，收集细胞膜即可；
48.采用bca蛋白定量法对所提取的m1巨噬细胞膜进行蛋白定量，结果显示每108个细胞的蛋白含量约为0.17mg；
49.s4：制备纳米载药系统m1hd@rpr
50.采用静电吸附法制备m1hd@rpr，最终进行纳米粒尺寸及转染效率确定，见附图1，具体方法如下：将5μg步骤s1构建的shrna-ptpn2质粒与25μg细胞穿膜肽线性精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽(irgd)混合，静置5min，形成irgd与shrna-ptpn2的共混物irgd-shrna-ptpn2，简称rr；向共混物rr中加入125μg聚乙烯亚胺(pei)，静置混合5min，得pei与rr的复合物irgd-pei-shrna-ptpn2，简称rpr；再静置混合5min，加入含50μg dox的ha-dox，混匀自组装得hd@rpr纳米粒ha-dox@irgd-pei-shrna-ptpn2；之后采用微型挤出器将步骤s3中制备的m1巨噬细胞膜与hd@rpr纳米粒反复过400nm聚碳酸酯膜后得m1hd@rpr纳米载药系统，4℃保存，并尽快使用；本实施例的m1巨噬细胞膜的加入量以m1巨噬细胞膜与shrna-ptpn2的
如下配比来加入：每5μg shrna-ptpn2加入0.034mg m1巨噬细胞膜；本实施例的m1巨噬细胞膜与hd@rpr纳米粒过400nm聚碳酸酯膜的次数为20次；
51.本步骤同时采用与m1hd@rpr等量的pei、irgd、oha通过自组装制备空白纳米粒(blanknps)，并采用马尔文粒度仪、透射电子显微镜对m1hd@rpr的粒径电位以及外观形貌进行表征，结果见附图4，其中a为hd@rpr纳米载药系统粒径、zeta电位及外观形态表征结果，b为m1hd@rpr纳米粒粒径、zeta电位及外观形态表征结果，由于静电自组装作用，hd@rpr自组装为较为均一的复合物，其粒径123.6
±
14.4nm，平均表面电荷为-13.5
±
6.8mv，且透射电子显微镜(tem)结果显示外观形态为均一的类圆形；由于细胞膜为外负内正的磷脂双分子层结构，因此可包覆于带负电荷的hd@rpr表面，形成m1hd@rpr；与hd@rpr相比较，m1hd@rpr粒径明显增加，达到155.2
±
17.7nm，表面电荷为-27.6
±
5.3mv，tem结果也显示形成较为完整的壳核结构。
52.本实施例对上述制备的m1hd@rpr纳米载药系统在黑色素瘤体内靶向缓释的作用进行了验证，本实施例采用尾静脉注射dox含量为2.5mg/kg的free dox、hd@rpr(未包裹m1细胞膜)、m1hd@rpr于小鼠体内，并于1h、4h、12h和24h时间点取血并处死小鼠，测定不同时间点小鼠血液及脏器中dox的含量以分析不同制剂dox的体内分布情况。结果见附图5，可见free dox组在注射1h后，除了在血液之中外，迅速分布至心脏部位，这就是导致dox有较强心脏毒性的原因；注射4h后在心脏部位、肝脏、脾脏及肺部的dox含量迅速增加，到12h及24h后在心脏中的分布迅速减少，表明dox在被迅速代谢。而对于hd@rpr组，由于纳米粒包裹，使得dox迅速分布到肝脏之中，在心脏中分布较少，并且由于纳米粒径效应，使得血液之中也有较多分布，到4h时肝脏中dox分布进一步增多，脾脏及肾脏中分布也在增加，而在血液中逐渐减少，肿瘤中也较free dox分布多，这是因为席夫碱修饰的dox对肿瘤微环境敏感释放所致，到24h后，dox分布也减少，接近于free dox，但是在肿瘤部位中分布显著多于free dox组。
53.附图5中对于m1hd@rpr组，由于m1巨噬细胞膜包裹的长循环作用，在1h及4h时血液中仍然分布较多，次之为肝脏，这是由于巨噬细胞对m1hd@rpr清除作用较弱所致。在4h时，肿瘤部位dox分布达到最大，甚至到24h时，肿瘤中仍然有较多dox分布，并且单独对各组肿瘤部位dox分布进行统计可见，m1hd@rpr在肿瘤部位分布显著高于free dox组，甚至高于hd@rpr组，因而证明m1巨噬细胞膜包裹能显著提高dox在肿瘤部位的分布。
54.本实施例为直观观察给药24h后free dox、hd@rpr、m1hd@rpr在肿瘤中的分布情况，进行了石蜡包埋切片，并拍照观察dox分布，结果见附图6，由结果可知free dox组24h后dox红色荧光显著弱于纳米粒组，并且m1hd@rpr组显著强于hd@rpr组，进一步证明m1巨噬细胞膜包裹能显著增强dox在肿瘤部位的蓄积。
55.本实施例还对m1hd@rpr纳米载药系统对黑色素原发肿瘤的抑制作用进行了验证。受到m1hd@rpr纳米颗粒的体外抗肿瘤作用和体内靶向抗肿瘤作用的启发，本实施例以b16f10荷瘤小鼠为实验对象，评价纳米颗粒的体内抗肿瘤效果。本实施例对每一组小鼠的肿瘤隔天记录体积，绘制肿瘤体积生长曲线，处死小鼠后取出肿瘤组织拍照并称重，具体结果见附图7和附图8，附图7中a为各组治疗结束后小鼠肿瘤离体图片，b为各组治疗后小鼠肿瘤体积生长曲(n＝5)；图8中a为各组治疗后瘤重比较，b为各组治疗后小鼠体重生长曲线。由图可见，pbs组小鼠肿瘤体积的增长速度非常快，在接种后第15天即生长到1500mm3左右，
空白纳米粒组呈现出接近于pbs组的生长曲线；m1组(仅注射游离的m1细胞膜)及oha@rpr组(仅有shrna-ppn2基因单独治疗组)最终肿瘤体积较pbs组显著降低，hd@rpr及m1hd@rpr组较pbs组肿瘤体积生长显著缓慢，甚至肿瘤完全消失，表明dox化疗联合shrna-ptpn2免疫治疗具有良好的效果，这归功于dox的敏感释放以及m1巨噬细胞膜的体内肿瘤微环境靶向作用。
56.本实施例还对m1hd@rpr纳米载药系统对黑色素肺转移肿瘤的抑制作用进行了验证。本实施例通过小鼠尾静脉注射黑色素瘤细胞以建立黑色素瘤肺转移模型，然后通过尾静脉注射各治疗组分，于治疗结束后10天处死小鼠，观察小鼠肺部黑色素瘤生长情况，结果见附图9，由图可见，pbs组、blanknps组小鼠肿瘤几乎长满黑色素瘤，肺组织已经严重破坏，表明黑色素瘤对肺部侵袭性极大，并且通过对各组小鼠肺部进行h&e组化分析可见肺部有致密清晰的肿瘤组织，几乎占据50％以上的肺部空间；而m1组有明显改善可能是因为m1巨噬细胞首先沉积在肺部，其表面蛋白会介导肺部肿瘤细胞的杀伤，减少肺部转移肿瘤的发生；oha@rpr、hd@rpr、m1hd@rpr组几乎没有黑色素瘤细胞，肺部完整，h&e结果可见肺部细胞完整、肺泡未发现扩展、结构清晰，表明几乎无肺转移肿瘤发生。该研究结果表明，纳米粒因激活免疫治疗对肺转移黑色素瘤有极好的治疗效果。
57.本实施例巧妙的利用静电自组装构建一个双载基因及化疗药物的递送系统(m1hd@rpr)发挥化疗联合免疫治疗小鼠黑色素原发肿瘤及转移瘤的效果，本实施例首次采用非病毒载体将靶向下调ptpn2基因的shrna系统靶向递送入肿瘤部位，下调ptpn2基因，进而达到发挥基因免疫治疗的作用，为制剂学手段在肿瘤靶向免疫治疗中的应用提供了重要依据。
58.综上所述，本实施例成功构建了靶向沉默细胞ptpn2基因的shrna系统shrna-ptpn2，以发挥免疫治疗的作用；并采用席夫碱作为ha及dox的桥接臂制备ha-dox，带负电的ha修饰dox，使其可通过静电作用包裹dox，并且席夫碱的ph敏感作用可使dox在肿瘤微环境中敏感释放，提高dox的靶向治疗作用以及减小其毒性；采用m1巨噬细胞膜将shrna-ptpn2及ha-dox成功包裹于其内制备成m1hd@rpr纳米粒，减缓巨噬细胞内吞从而延长体内循环时间，实现肿瘤部位靶向递送；本实施例构建的m1hd@rpr纳米载药系统能在体外显著杀伤b16f10肿瘤细胞，且在体内显著抑制肿瘤体积生长，体内外抑瘤作用显著，并且m1hd@rpr纳米粒能显著增强黑色素瘤转移病灶的治疗。
59.如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。