土槿皮丙酸在制备预防和/或治疗恶性肿瘤药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药新用途技术领域，具体涉及土槿皮丙酸在制备预防和/或治疗恶性肿瘤药物中的应用。


背景技术：

2.癌症在医学上统称为恶性肿瘤，是严重威胁人类健康的复杂重大疾病，是全球仅次于心脑血管疾病的导致人类死亡的第二大原因。
3.人脑胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，可见于各个年龄段，多发于成人，男女发病无明显差别，具有高致残率、高复发率和高死亡率的特点。人脑胶质瘤的治疗主要采用手术切除肿瘤，结合术后放疗和化疗。但是，who分级为iii级和iv级的脑胶质(高级别)瘤患者术后平均生存期不超过1年。目前，人脑胶质瘤治疗中采用的一线化疗药物替莫唑胺(temozolomide)对高级别脑胶质瘤(who分级为iii-iv级)的治疗效果一直不理想，与单纯采用外科手术治疗的高级别脑胶质瘤患者的平均生存期相比较，术后结合替莫唑胺治疗也仅仅能将患者的平均生存期延长3-5个月。因此，在人脑胶质瘤的化疗方面尚缺乏有效的药物。
4.肝癌分为原发性和继发性两大类，是指来源于肝细胞和肝胆管细胞的恶性肿瘤，是我国常见的恶性肿瘤之一。早期肝癌常症状无特异性，而中晚期肝癌的症状则较多，常见的临床表现有：肝区疼痛、腹胀、纳差、乏力、消瘦，进行性肝大或上腹部包块等；还有部分患者有低热、黄疸、腹泻、上消化道出血等情况。目前肝癌的治疗方法主要有：手术治疗、血管介入栓塞、消融、放射性治疗、靶向治疗、中医中药治疗等。因此，在肝癌的治疗方面尚缺乏有效的药物。
5.乳腺癌是发生于乳腺上皮或导管上皮的恶性肿瘤，病因尚不完全清楚，可能与家族史和乳腺癌相关基因、生殖因素、性激素、营养与饮食、环境因素等有关。早期乳腺癌多数无明显症状，很难发现，大多为乳房无痛性肿块，晚期出现乳头回缩、乳腺皮肤“酒窝症”或橘皮样变、腋窝淋巴结肿大等表现。乳腺癌的治疗方法主要包括：手术切除、化学治疗、放射治疗、内分泌治疗、靶向治疗。其中，手术治疗适用于肿块可以完全被切除者，根据病理分期、病理类型、分子分型，考虑是否联合其他治疗手段；靶向治疗：基因免疫组化方法检测her23个+以上，或fish方法检测her2扩增阳性者；放射治疗：利用高能x线放射乳腺局部、淋巴引流区；内分泌治疗：常用三苯氧胺、来曲唑。因此，在乳腺癌的治疗方面尚缺乏有效的药物。
6.卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，是指发生在卵巢的恶性肿瘤性疾病，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。卵巢癌以上皮癌最多见，其次是恶性生殖细胞肿瘤，其中卵巢上皮癌死亡率占各类妇科肿瘤的首位，对女性生命可造成严重威胁。卵巢癌早期多无症状，晚期可出现下腹不适、腹胀、食欲下降等消化道症状，治疗方式主要包括：手术切除、药物治疗和放射治疗，总体预后较差。因此，在卵巢癌的治疗方面尚缺乏有效的药物。
7.土槿皮丙酸(pseudolaricacid c)是从药用植物金钱松的干燥根皮或近根的树皮
中提取的天然小分子化合物，呈白色晶体，不溶于水，易溶于dmso等有机溶剂。分子式：c
21h26
o7；分子量：390；cas号：82601-41-0。土槿皮丙酸(pseudolaricacid c)具有取材方便、价格低等特点。土槿皮可以用于治疗局限性神经性皮炎。但是，从土槿皮中提取的天然小分子化合物土槿皮丙酸的用途以及作用机制等均尚不清楚，特别是土槿皮丙酸在针对恶性肿瘤的预防和/或治疗方面尚未见报道。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供土槿皮丙酸在制备预防和/或治疗恶性肿瘤药物中的新用途。
9.本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
10.本发明的土槿皮丙酸在制备预防和/或治疗恶性肿瘤药物中的应用。
11.作为优选的实施方式，所述恶性肿瘤包括：脑胶质瘤、肝癌、乳腺癌和卵巢癌。
12.作为优选的实施方式，所述土槿皮丙酸的浓度为12.5～200umol/l。
13.作为更优选的实施方式，所述土槿皮丙酸的浓度为25～50umol/l。
14.作为最优选的实施方式，所述土槿皮丙酸的浓度为25umol/l。
15.本发明的有益效果是：
16.本发明通过实验证实土槿皮丙酸能够以浓度依赖的方式有效地杀伤人脑胶质瘤细胞、人肝癌细胞、人乳腺癌细胞和人卵巢癌细胞等多种恶性肿瘤细胞，并且具有一定的量效关系。同时通过实验证实土槿皮丙酸对人正常细胞的毒性较小，土槿皮丙酸能够激活了人胶质瘤细胞内的自噬流，且土槿皮丙酸能通过激活人胶质瘤细胞内的自噬流来杀伤人胶质瘤细胞。
17.本发明发现土槿皮丙酸能够预防和/或治疗人脑胶质瘤细胞、人肝癌细胞、人乳腺癌细胞和人卵巢癌细胞等多种恶性肿瘤细胞，开拓了土槿皮丙酸的新用途，为治疗人脑胶质瘤细胞、人肝癌细胞、人乳腺癌细胞和人卵巢癌细胞等多种恶性肿瘤细胞提供了新的疗法和治疗方案。
附图说明
18.图1为实施例1中土槿皮丙酸对人脑胶质瘤细胞u251的增殖抑制作用。
19.图2为实施例1中土槿皮丙酸对人脑胶质瘤细胞u87的增殖抑制作用。
20.图3为实施例1中土槿皮丙酸对人脑胶质瘤细胞u118的增殖抑制作用。
21.图4为实施例2中土槿皮丙酸对人脐静脉上皮细胞huvec的毒性作用。
22.图5为实施例3中土槿皮丙酸对人脑胶质瘤细胞u87内自噬相关蛋白的调控作用。
23.图6为实施例3中土槿皮丙酸对人脑胶质瘤细胞u87内自噬流的激活作用。
24.图7为实施例3中3ma和巴弗洛霉素a1对土槿皮丙酸所诱导的人脑胶质瘤细胞死亡的抑制作用。
25.图8为实施例3中3ma和巴弗洛霉素a1对土槿皮丙酸所诱导的蛋白的调控作用。
26.图9为实施例4中土槿皮丙酸对人肝癌细胞的增殖抑制作用。
27.图10为实施例5中土槿皮丙酸对乳腺癌细胞的增殖抑制作用。
28.图11为实施例6中土槿皮丙酸对人卵巢癌细胞的增殖抑制作用。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.材料来源：
31.土槿皮丙酸，购自上海源叶生物科技有限公司，使用时用dmso液配制成所需浓度。
32.人脑胶质瘤细胞u251、u87和u118，均购自中国吉凯生物技术公司。
33.人脐静脉上皮细胞huvec，购自中国吉凯生物技术公司。
34.人肝癌细胞hep3b、乳腺癌细胞mb-231、人卵巢癌细胞a2780，均购自中国吉凯生物技术公司。
35.实施例1土槿皮丙酸对人脑胶质瘤细胞的增殖抑制作用
36.取人脑胶质瘤细胞u251、u87和u118分别接种于96孔板中的dmem培养基中，二氧化碳孵箱过夜，再分别与不同浓度的土槿皮丙酸(12.5umol/l、25umol/l、50umol/l、100umol/l、200umol/l)一起孵育48小时后，采用mtt法检测细胞增殖能力，结果如图1和表1所示，u251细胞生存率分别为96.67％、91.97％、68.75％、43.59％和34.05％；如图2和表2所示，u87细胞生存率分别为97.19％、91.73％、69.27％、46.51％和31.94％；如图3和表3所示，u118细胞生存率分别为98.36％、93.04％、67.57％、44.42％和34.60％。
37.通过检测结果可知，随着土槿皮丙酸浓度的增加，脑胶质瘤细胞的生存率则相应地下降。由此证实，土槿皮丙酸能够以浓度依赖的方式杀伤脑胶质瘤细胞。
38.表1土槿皮丙酸对人脑胶质瘤细胞u251的增殖抑制作用(**：p《0.01)
[0039][0040]
表2土槿皮丙酸对人脑胶质瘤细胞u87的增殖抑制作用(**：p《0.01)
[0041][0042]
表3土槿皮丙酸对人脑胶质瘤细胞u118的增殖抑制作用(*：p《0.05；**：p《0.01)
[0043][0044]
实施例2土槿皮丙酸对正常细胞的毒性作用
[0045]
为了检测土槿皮丙酸对正常细胞的毒性作用，本实验将人脐静脉上皮细胞huvec接种到96孔板中的dmem培养基中，二氧化碳孵箱过夜，分别与不同浓度的土槿皮丙酸(12.5umol/l、25umol/l、50umol/l、100umol/l、200umol/l)一起孵育48小时后，采用mtt法检测细胞增殖能力，结果如图4和表4所示，huvec细胞的存活率分别为100％、99.15％、95.84％、89.80％和82.42％。
[0046]
通过检测结果可知，与人脑胶质瘤细胞u251、u87和u118的存活率相比较，浓度为25umol/l和50umol/l的土槿皮丙酸对人脐静脉上皮细胞huvec的毒性较小，同时还能有效地杀伤人脑胶质瘤细胞。
[0047]
表4土槿皮丙酸对人脐静脉上皮细胞huvec的增殖抑制作用
[0048][0049]
实施例3土槿皮丙酸对人脑胶质瘤细胞杀伤作用机制研究
[0050]
(1)土槿皮丙酸对人脑胶质瘤细胞内自噬流的激活作用
[0051]
为了阐明土槿皮丙酸对人脑胶质瘤细胞杀伤作用机制，本实验采用50umol/l的土槿皮丙酸与人脑胶质瘤细胞u87一起孵育6、12、24和48h，提取蛋白后采用westernblotting方法检测了自噬相关蛋白的表达情况，结果如图5所示，土槿皮丙酸能够以时间依赖的方式上调蛋白atg5和蛋白lc3b ii的表达，同时还相应地抑制了自噬底物蛋白p62的表达。采用慢病毒将红绿串联荧光lc3b蛋白质粒转染到人脑胶质瘤细胞u87中，进一步验证土槿皮丙酸是否诱导了自噬。结果如图6所示，同对照组相比，50umol/l土槿皮丙酸作用48h后，u87细胞内出现了红色、绿色、黄色的斑点，而且红色荧光斑点显著增加。由此证明，土槿皮丙酸激活了人脑胶质瘤细胞内的自噬流。
[0052]
(2)土槿皮丙酸通过激活自噬杀伤人脑胶质瘤细胞
[0053]
为了说明自噬在土槿皮丙酸杀伤人脑胶质瘤细胞中的作用，本实验采用自噬启动
的抑制剂3ma(浓度5mmol/l)和自噬流抑制剂巴弗洛霉素a1(浓度0.2umol/l)与人脑胶质瘤细胞u87一起孵育1h后，再加入50umol/l土槿皮丙酸，作用48h后采用ldh释放的方法检测细胞的死亡情况，结果如图7所示，3ma和巴弗洛霉素a1均能有效地抑制土槿皮丙酸所诱导的人脑胶质瘤细胞的死亡。提取蛋白后采用westernblotting方法进行分析，结果如图8所示，3ma有效地抑制了土槿皮丙酸所诱导的蛋白lc3b ii的增加以及自噬底物蛋白p62的减少；巴弗洛霉素a1在抑制自噬底物蛋白p62减少的同时，进一步提高了蛋白lc3b ii的水平。由此证明，土槿皮丙酸通过激活自噬杀伤了人脑胶质瘤细胞。
[0054]
实施例4土槿皮丙酸对人肝癌细胞的增殖抑制作用
[0055]
为了验证土槿皮丙酸能够杀伤其他种类的恶性肿瘤细胞如人肝癌细胞，本实验将人肝癌细胞hep3b接种到96孔板中的dmem培养基中，二氧化碳孵箱过夜，分别与不同浓度土槿皮丙酸(12.5umol/l、25umol/l、50umol/l、100umol/l、200umol/l)一起孵育48小时后，采用mtt法检测细胞增殖能力。结果如图9和表5所示，人肝癌细胞hep3b的存活率分别降至98.37％、94.82％、81.62％、56.02％、40.10％。因此，土槿皮丙酸能够以浓度依赖的方式杀伤人肝癌细胞。
[0056]
表5土槿皮丙酸对人肝癌细胞heb3b的增殖抑制作用(**：p《0.01)
[0057][0058]
实施例5土槿皮丙酸对乳腺癌细胞的增殖抑制作用
[0059]
为了验证土槿皮丙酸能够杀伤其他种类的恶性肿瘤细胞如人乳腺癌细胞，本实验将人乳腺癌细胞mb-231接种到96孔板中的dmem培养基中，二氧化碳孵箱过夜，分别与不同浓度土槿皮丙酸(12.5umol/l、25umol/l、50umol/l、100umol/l、200umol/l)一起孵育48小时后，采用mtt法检测细胞增殖能力。结果如图10和表6所示，人乳腺癌细胞mb-231的存活率分别降至：94.02％、88.34％、75.90％、58.83％、43.87％。因此，土槿皮丙酸能够以浓度依赖的方式杀伤人乳腺癌细胞。
[0060]
表6土槿皮丙酸对人乳腺癌细胞mb-231的增殖抑制作用(**：p《0.01)
[0061][0062]
实施例6土槿皮丙酸对人卵巢癌细胞的增殖抑制作用
[0063]
为了验证土槿皮丙酸能够杀伤其他种类的恶性肿瘤细胞如人卵巢癌细胞，本实验将人卵巢癌细胞a2780接种到96孔板中的dmem培养基中，二氧化碳孵箱过夜，分别与不同浓度土槿皮丙酸(12.5umol/l、25umol/l、50umol/l、100umol/l、200umol/l)一起孵育48小时后，采用mtt法检测细胞增殖能力。结果如图11和表7所示，人卵巢癌细胞a2780的存活率分别降至：93.78％、87.34％、71.82％、55.64％、41.39％。因此，土槿皮丙酸能够以浓度依赖的方式杀伤人卵巢癌细胞。
[0064]
表7土槿皮丙酸对人卵巢癌细胞a2780的增殖抑制作用(**：p《0.01)
[0065][0066]
本发明公开了一种土槿皮丙酸在制备预防和/或治疗恶性肿瘤药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。