一种利用五味子藤茎高效提取总木脂素的方法

1.本发明涉及植物成分提取技术领域，更具体地说，它涉及一种利用五味子藤茎高效提取总木脂素的方法。


背景技术：

2.五味子总木脂素在初步提取后一般需要进行纯化处理，提取工艺有co2超临界萃取技术、乙醇回流提取法和渗漉法，纯化工艺有硅胶氧化铝混合物层析法、大孔树脂吸附法。
3.五味子总木脂素一般包含了五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素等多种成分，而五味子总木脂素初步提取一般受料液比、提取次数、提取时间等多种因素影响，而不同的提取条件变化将导致五味子总木脂素中的不同成分提取结果收到影响。现有的五味子总木脂素提取过程中主要关注总木脂素的提取总量，而忽略了总木脂素中各成分之间的平衡。
4.因此，如何研究设计一种能够克服上述缺陷的利用五味子藤茎高效提取总木脂素的方法是我们目前急需解决的问题。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种利用五味子藤茎高效提取总木脂素的方法，能够在总木脂素保持高提取总量的情况下，有效增强总木脂素中个成分的同步提取平衡性。
6.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种利用五味子藤茎高效提取总木脂素的方法，包括以下步骤：
7.以乙醇加热回流法提取五味子藤中的总木脂素，乙醇加热回流法中的料液比为1：10、提取次数为3次、提取时间为5h以及乙醇浓度为95％；
8.以大孔吸附树脂对所提取的总木脂素进行纯化处理，得到纯化后的总木脂素。
9.优选的，所述大孔吸附树脂纯化中的总木脂素浓度为1.5mg/ml、最大上样量约为6倍柱床体积、洗脱流速1mi/min、蒸馏水洗脱体积为8倍柱床体积以及洗脱荆95％乙醇用量为5倍柱床体积。
10.优选的，所述总木脂素包含五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素。
11.优选的，所述大孔吸附树脂的型号为hpd450、ab-8、d301、xad中的任意一种。
12.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
13.1、本发明提出的一种利用五味子藤茎高效提取总木脂素的方法，以无毒无害且价格低廉的乙醇作为提取溶剂，选择加热回流法作为五味子藤中提取总木脂素的操作方法，通过单因素分析确定了料液比、提取次数、提取时间和乙醇浓度的最佳因素水平范围；通过响应面法设计实验方案，综合考察4因素的交互作用，最终确定了乙醇加热回流提取五味子
藤中总木脂素的最佳提取工艺，即料液比1：10、提取次数3次、提取时间5h、乙醇浓度95％并进行了验证实验，证明了提取工艺的可靠性；
14.2、本发明对大孔吸附树脂纯化工艺进行了优化设计，设计的最佳工艺为：总木脂素浓度为1.5mg/ml，最大上样量约为6倍柱床体积，洗脱流速1mi/min，蒸馏水洗脱体积为8倍柱床体积，洗脱荆95％乙醇用量为5倍柱床体积，克服了现有技术中仅考察了藤茎中木脂素含量较低且处于总木脂素中等极性范围的五味子酯甲，通过实验验证：纯化工艺稳定可靠，5种木脂素的平均转移率及总木脂素转移率均在75％以上。
附图说明
15.此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本技术的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
16.图1是本发明实施例1中料液比与提取次数对总木脂素提取效果，a为交互影响曲面图，b为等高线图；
17.图2是本发明实施例1中料液比与提取时间对总木脂素提取效果，a为交互影响曲面图，b为等高线图；
18.图3是本发明实施例1中料液比与乙醇浓度对总木脂素提取效果，a为交互影响曲面图，b为等高线图；
19.图4是本发明实施例1中提取次数与提取时间对总木脂素提取效果，a为交互影响曲面图，b为等高线图；
20.图5是本发明实施例1中提取次数与乙醇浓度对总木脂素提取效果，a为交互影响曲面图，b为等高线图；
21.图6是本发明实施例1中提取时间与乙醇浓度对总木脂素提取效果，a为交互影响曲面图，b为等高线图；
22.图7是本发明实施例2中泄露曲线示意图；
23.图8是本发明实施例2中洗脱曲线示意图。
具体实施方式
24.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
25.实施例1：五味子藤茎中总木脂素的初步提取方法
26.一、单因素实验
27.1、乙醇浓度对提取效果的影响
28.使用加热回流法提取五味子藤茎中的总木脂素，固定料液比(1：15)、提取时间(1h)、提取次数(1次)，分别以55％、65％、75％、85％和95％的乙醇浓度进行提取，提取液定容后采用上述hplc法检测得木脂素含量进行比较，每个乙醇浓度做3次生物学重复，经ibm spss statistics26分析，测量结果见下表1。
29.表1乙醇浓度对总木脂素含量的影响
[0030][0031]
注：数据角标为spss软件差异性分析结果，相同字母表示差异性不显著。
[0032]
由表1可知，不同乙醇浓度对五味子醇甲、五味子甲素、五味子丙素的提取量差异性不显著；五味子醇乙在95％和55％的乙醇浓度具有显著性差异；五味子乙素在95％、65％和其他乙醇浓度有显著性差异。
[0033]
使用加热回流法以不同乙醇浓度提取五味子藤中总木脂素，其他条件相同的条件下，乙醇浓度在95％时，五味子藤的总木脂素含量最高。综上可考虑尽可能选择高浓度乙醇以提高总木脂素的提取率。
[0034]
2、料液比对提取效果的影响
[0035]
使用加热回流法提取五味子藤茎中的总木脂素，固定乙醇浓度(85％)、提取时间(1h)、提取次数(1次)，分别以1：10、1：15、1：20、1：25和1：30的料液比进行提取，提取液定容后采用上述hplc法检测得木脂素含量进行比较，每个料液比做3次生物学重复，经ibm spss statistics26分析，测量结果见下表2。
[0036]
表2料液比对总木脂素含量的影响
[0037][0038][0039]
注：数据角标为spss软件差异性分析结果，相同字母表示差异性不显著。
[0040]
由表2可知，各木脂素在1：20、1：25、1：30料液比与1：10、1：15料液比有显著性差异，但在这两组间无显著性差异。
[0041]
使用加热回流法以不同的料液比提取五味子藤中总木脂素，在其他条件相同的条件下，料液比在1：20时，五味子藤的总木脂素含量最高。可根据实际生产需要在1：20、1：25、1：30料液比间进行选择。
[0042]
3、提取时间对提取效果的影响
[0043]
使用加热回流法提取五味子藤茎中的总木脂素，固定乙醇浓度(85％)、料液比(1：15)、提取次数(1次)，分别以1h、2h、3h、4h和5h的提取时间进行提取，提取液定容后采用上述hplc法检测得木脂素含量进行比较，每个提取时间做3次生物学重复，经ibm spss statistics26分析，测量结果见下表3。
[0044]
表3提取时间对总木脂素含量的影响
[0045][0046]
注：数据角标为spss软件差异性分析结果，相同字母表示差异性不显著。
[0047]
由表3可知，各木脂素在不同的提取时间下均有显著性差异，除五味子甲素外，各种木脂素均在提取5h出现最大值。
[0048]
综上，使用加热回流法以不同的提取时间提取五味子藤中总木脂素，在其他条件相同的条件下，提取时间在5h时，五味子藤的总木脂素含量最高。可根据实际生产需要控制提取时间在3-5h可得到较理想的提取效果。
[0049]
4、提取次数对提取效果的影响
[0050]
使用加热回流法提取五味子藤茎中的总木脂素，固定乙醇浓度(85％)、料液比(1：15)、提取时间(1h)，分别以1次、2次、3次和4次的提取次数进行提取，提取液定容后采用上述hplc法检测得木脂素含量进行比较，每个提取次数做3次生物学重复，经ibm spss statistics26分析，测量结果见下表4。
[0051]
表4提取次数对总木脂素含量的影响
[0052][0053]
注：数据角标为spss软件差异性分析结果，相同字母表示差异性不显著。
[0054]
由表4可知，各木脂素在提取4次、3次、2次与提取1次具有显著性差异，但在提取4次、3次、2次之间差异性并不显著。
[0055]
使用加热回流法以不同的提取次数提取五味子藤中总木脂素，在其他条件相同的条件下，提取次数在4次时，五味子藤的总木脂素含量最高。随着提取次数的增加，总木脂素
含量成正比例增加，但2次以上并无显著性差异。可根据实际生产需要控制提取时间在2-4次可得到较理想的提取效果。
[0056]
二、响应面法结果与分析
[0057]
通过方法学考察和单因素实验可知，五味子藤5种木脂素中，五味子醇乙和乙素约占五味子藤总木脂素的2/3。所以在单因素实验确定各因素最佳水平范围的基础上，分别以五味子醇乙、五味子乙素两种木脂素单体以及5种木脂素总量为响应值，综合考察各因素的交互影响效果，通过响应曲面进行分析及提取工艺的优化。响应面因素水平表如表5。
[0058]
表5响应面因素水平表
[0059][0060]
1、响应面实验设计方案与检测结果
[0061]
以乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数等四因素、每个因素考察3个因素水平，运用design-expert 8.0.6中的box-behnken design设计实验方案，按照方案提取五味子藤中总木脂素。设计结果及各提取条件下的五味子醇乙、五味子醇甲以及总木脂素含量见下表6。
[0062]
表6响应面优化实验方案及检测结果
[0063][0064]
(续表)
[0065][0066][0067]
2、模型的建立
[0068]
运用design-expert8.0.6软件对表6所测得数据进行分析，得到拟合方程。总木脂素：y＝27.28+1.27
×
a+3.30
×
b-0.055
×
c+5.83
×
d-2.69
×a×
b-0.83
×a×
c+5.63
×a×
d-1.60
×b×
c+5.11
×b×
d+0.96
×c×
d-0.39
×a2-3.42
×b2-5.31
×
d2+1.21
×
a2×
c+1.14
×a×b2-5.85
×a×
d2+2.12
×
b2×
c-0.81
×
b2×
d-2.94
×b×
d2。
[0069]
总木脂素响应面方差分析二次模型方差分析见下表7。
[0070]
表7总木脂素响应面方差分析二次模型方差分析
[0071][0072][0073]
注：p《0.01为极显著**；p《0.05为显著*
[0074]
通过表7中数据可知，该模型的f值为192.1356，相对应的p值＜0.0001，表示实验中所确定的二次多项式模型极为显著，回归方程拟合度好且具有统计学意义。失拟项p值＝0.3693＞0.05，表示不确定因素对提取五味子藤中总木脂素的提取量干扰很小，失拟项差异不显著，回归模型较好。影响乙醇回流法提取总木脂素的因素中，a(料液比)、b(提取次数)、d(乙醇浓度)、ab、ac、ad、bc、bd、cd项(p值＜0.01)对木脂素的提取量的影响均非常显著；c(提取时间)对于总木脂素提取的综合影响不显著，但ac、bc和cd的显著性较好。回归方程的置信度分析见下表8。
[0075]
表8总木脂素回归方程的置信度分析
[0076][0077]
通过表8可知，实验模型的决定系数r2＝99.75％，说明总木脂素的含量结果与模型预测结果具有高度的一致性，仅有不到0.25％的数据不能用模型解释；校正系数adj r2＝99.23％表明实验结果有99.23％受到实验因素影响，且相关系数与校正系数的高度接近，充分说明回归方程的拟合度高，此模型可以准确对给定条件下总木脂素的提取量进行分析和预测，对实际生产具有可靠的指导意义。
[0078]
3、响应面曲面分析
[0079]
在box-behnken design中设定实验中两个因素水平为零(乙醇浓度75％、料液比1：20、提取时间3h、提取次数2次)条件下，同时考查另外两个因素对五味子藤中总木脂素提取效果的交互影响。
[0080]
(1)料液比与提取次数的交互作用
[0081]
提取时间3h、乙醇浓度75％条件下，料液比与提取次数对五味子藤总木脂素提取效果的交互影响如图1所示，a为料液比与提取次数对总木脂素提取效果交互影响曲面图，b为等高线图。
[0082]
由图1可知，料液比与提取次数对总木脂素提取效果的交互影响极为明显，尤其是在较低的提取次数和料液比条件下，曲面坡度较大；随着提取次数和料液比的增加，曲面坡度趋向于平缓；在较高的料液比下，提取次数在2次左右范围内出现峰值；在较高的提取次数下，料液比差异性并不显著。等高线图可见响应值峰值出现在料液比1：20以上、提取次数2～2.6次范围。
[0083]
(2)料液比与提取时间的交互作用
[0084]
提取次数2次、乙醇浓度75％条件下，料液比与提取时间对五味子藤总木脂素提取效果的交互影响见图2，a为料液比与提取时间对总木脂素提取效果交互影响曲面图，b为等高线图。
[0085]
由图2可知，料液比与提取时间对木脂素提取效果的交互影响并不十分明显，曲面较为接近平面。
[0086]
(3)料液比与乙醇浓度的交互作用
[0087]
由图3可知，料液比与乙醇浓度对木脂素提取效果的交互影响极为明显。尤其是乙醇浓度的改变，响应值曲面坡度较大，在87％附近出现峰值；高浓度乙醇下，随料液比的增大响应值呈现平缓的增加。
[0088]
(4)提取次数与提取时间的交互作用
[0089]
由图4可知，提取次数与提取时间对总木脂素提取效果的交互影响极为明显。提取次数2～3次、提取时间1～3.5h曲面出现峰值。
[0090]
(5)提取次数与乙醇浓度的交互作用
[0091]
由图可知，提取次数与乙醇浓度对总木脂素提取效果交互影响极为明显。随着两项变量的增加响应值变化显著，并在提取次数2～3次、乙醇浓度81％～93％曲面出现峰值。
[0092]
(6)提取时间与乙醇浓度的交互作用
[0093]
由图6可知，提取时间与乙醇浓度对总木脂素提取效果交互影响极为显著。尤其是乙醇浓度影响较为明显，随着乙醇浓度的变化响应值在87％附近出现峰值；相对同一浓度下提取时间的影响并不显著。
[0094]
综合料液比、提取次数、提取时间和提取剂浓度等4因素不同水平对五味子藤中总木脂素提取效果的影响，由box-behnken design建立的模型进行模拟分析，分别得出乙醇回流提取五味子藤中总木脂素的最佳工艺为：
[0095]
料液比1：10、提取次数2.99次、提取时间5h、乙醇浓度95％，模拟条件下总木脂素含量为32.5712mg/g。
[0096]
(7)提取工艺验证实验
[0097]
考虑到实际操作性，调整为料液比1：10、提取次数3次、提取时间5h、乙醇浓度95％。按照此条件提取五味子藤中总木脂素，实验平行进行3次，分别测得五味子醇乙。验证实验数据见表9。
[0098]
表9验证实验数据汇总
[0099][0100]
实测平均值五味子醇乙：15.2987mg/g、五味子乙素：10.8967mg/g、总木脂素：31.7395mg/g，与预测值rsd分别为2.10％、2.03％、1.83％，验证结果较好，证明在此条件下预测模型稳定可靠。
[0101]
综上，本发明确定了无毒无害且价格低廉的乙醇作为提取溶剂；然后根据产品特点和方法特点从目前工业上常用的提取方法中选择了加热回流法作为五味子藤中提取总木脂素的操作方法；通过单因素分析确定了料液比、提取次数、提取时间和乙醇浓度的最佳因素水平范围；通过响应面法设计实验方案，综合考察4因素的交互作用，最终确定了乙醇加热回流提取五味子藤中总木脂素的最佳提取工艺，即料液比1：10、提取次数3次、提取时间5h、乙醇浓度95％并进行了验证实验，证明了预测模型的可靠性。
[0102]
实施例2：五味子藤茎中总木脂素的纯化处理方法
[0103]
大孔吸附树脂是一类不溶于酸、碱及各种有机溶剂且有良好吸附性能的有机高聚物吸附剂，近年来被广泛用于医药、环保和食品等领域，在中草药研究方面也有广泛应用。大孔树脂的吸附作用主要取决于吸附剂与吸附物质之间的范德华力和氢键，同时其吸附能力与比表面积等因素关系密切，与分子量接近的比表面积的树脂型号更有利于吸附。根据木脂素弱极性的性质和平均600左右的分子量，选定出5种非极性或弱极性大孔树脂，通过静态吸附和解吸性能，确定大孔树脂型号。再通过动态吸附与洗脱，确定吸附条件。
[0104]
一、大孔树脂预处理
[0105]
分别称取hpd450、ab-8、d301、s-8、xad大孔树脂各10g置250ml具塞三角瓶中，加入约5倍树脂体积的95％的乙醇，封盖浸泡24h，使之充分溶胀，除去破碎及细小的树脂，再用约3倍树脂体积的95％乙醇与蒸馏水交替洗脱3次，再以大量的蒸馏水洗脱至流出液加水不出现乳白色浑浊，密封放置24h备用。
[0106]
二、上柱样品液制备
[0107]
实验前取出五味子藤醇浸膏，用50％乙醇复溶至每ml溶液中含有相当于50mg原药材浓度的复溶液作为上柱样品液，并测定上柱样品液浓度。
[0108]
三、大孔树脂型号的确定
[0109]
1、静态吸附量
[0110]
取出平衡水分后的湿树脂，用滤纸吸干树脂表面的水分，分别称取大孔树脂各2g置于250ml具塞锥形瓶中，加入50ml已知浓度的五味子藤提取液，密封后置摇床中振摇12h，过滤，用少量蒸馏水冲洗树脂表面，合并吸附残液与水洗液，测定合并液体积和总木脂素浓度，计算每种大孔树脂的静态吸附量。静态吸附量计算公式：
[0111]
静态吸附量(mg/g)＝(c
0v0-c
eve
)/m
[0112]
式中：c0(mg/ml)和v0(ml)为五味子藤提取液静态吸附前的初始浓度和体积；ce(mg/ml)和ve(ml)为静态吸附后的合并液浓度和体积；m(g)为湿大孔树脂质量。
[0113]
2、解吸率
[0114]
将饱和吸附木脂素并冲洗后的大孔树脂置250ml具塞三角瓶中，加入50ml 95％乙醇，密封后置摇床中振摇8h进行解吸。解吸平衡后过滤，用少量95％乙醇冲洗树脂表面，合并解吸液与醇洗液，测定合并液体积和总木脂素浓度，计算每种大孔树脂的解吸率。解吸率计算公式：
[0115]
解吸量(mg/g)＝(c
dvd
)/m
[0116]
解吸率(％)＝解吸量/静态吸附量
×
100％
[0117]
式中：cd(mg/ml)和vd(ml)为五味子藤提取液解吸平衡后木脂素浓度和体积；m(g)为湿大孔树脂质量。
[0118]
各种大孔树脂静态吸附量汇总见表10。
[0119]
表10大孔树脂静态吸附效果汇总
[0120][0121][0122]
由表10可知，hpd450、ab-8、d301、xad大孔树脂静态吸附效果较好，s-8次之。
[0123]
四、总木脂素纯化工艺的优化
[0124]
取内径1cm，高20cm的玻璃柱，柱底垫入少许医用纱布。在玻璃柱中加入1/2柱高度的蒸馏水，取经预处理后的大孔树脂湿法装柱，径高比1：15。
[0125]
1、上样浓度的优化
[0126]
制备5根ab-8大孔树脂柱，将上柱样品液用50％乙醇分别稀释成0.375mg/ml、0.75mg/ml、1.5mg/ml、1.875mg/ml、2.25mg/ml等5个浓度，每个浓度取总木脂素含量相同的体积，即40bv、20bv、10bv、8bv、6.7bv，以2bv/h流速通过树脂柱，测定流出液中的总木脂素含量，计算每种上样浓度下ab-8大孔树脂的吸附量，确定最佳上样浓度。
[0127]
不同上样浓度下木脂素吸附量的检测计算结果见表11。
[0128]
表11不同上样浓度下木脂素吸附量汇总
[0129][0130]
由表11可知，上样液浓度为1.5mg/ml时，总木脂素吸附量最高。
[0131]
2、吸附速率的优化
[0132]
制备5根ab-8大孔树脂柱，配制1.5mg/ml上样液5份，每份10bv；通过蠕动泵分别以1bv/h、2bv/h、3bv/h、4bv/h、5bv/h的流速上样，计算不同流速下总木脂素的吸附率，比较大小，确定最佳上样速度。不同上样速度下木脂素吸附量的检测计算结果见表12。
[0133]
表12不同上样速度下木脂素吸附量汇总
[0134][0135]
由表12可知，随着上样速度的增加，各木脂素吸附量总体呈现减少趋势。说明流速越缓慢，大孔树脂吸附作用时间长，越有利于吸附量的增长。吸附速率为1bv/h和2bv/h时，总木脂素吸附量较大。考虑到纯化效率，选取2bv/h作为最佳吸附速率。
[0136]
3、最大上样量的优化
[0137]
取1.5mg/ml的上样液120ml，以2bv/h上样流速进行上样，用量筒每12ml(1bv)收集一次，将每次收集流出液取10ml置10ml具塞离心管中密封后冰箱保鲜室保存，做好标记。分别测定每管木脂素单体含量和总木脂素含量，当流出液中木脂素含量达到上样浓度的10％为吸附终点。以流出体积为横坐标，泄露率为纵坐标，绘制泄露曲线，确定最大上样量。不同上样量下流出液含量占上样液含量比率汇总见表13。
[0138]
表13不同上样量下木脂素泄露率汇总
[0139][0140]
由表13可知，随流出体积的不断增加，泄漏率呈现逐渐升高的趋势。以流出体积(以bv计)为横坐标，泄露率为纵坐标，绘制泄露曲线。泄露曲线如图7所示。
[0141]
由图7可知，随着流出体积的增加，流出液木脂素含量呈现上升趋势。上样体积在6bv时，样品溶液中的总木脂素含量达到进样浓度的10％，即认为总木脂素开始泄露。所以选取6bv为最大上样量。
[0142]
4、洗脱剂浓度的优化
[0143]
制备3根ab-8大孔树脂柱，配制1.5mg/ml上样液3份，每份6bv，以2bv/h上样流速进行吸附结束后，测定流出液木脂素含量和体积，计算吸附量；取2bv的蒸馏水冲洗树脂柱，置换出树脂层中的原液；分别以55％、75％、95％浓度乙醇进行洗脱，洗脱速率2bv/h，洗脱剂用量8bv。测定洗脱液中木脂素含量和体积，计算洗脱率，确定最佳洗脱剂浓度。
[0144]
表14不同洗脱剂浓度下木脂素洗脱率汇总
[0145][0146][0147]
由表14可知，95％乙醇对总木脂素的洗脱率最高。这可能由于ab-8树脂为弱极性大孔树脂，最适宜从极性溶剂中吸附非极性物质，然后用低极性溶剂洗脱。95％的乙醇相对拥有更好的洗脱低极性。
[0148]
5、洗脱速率的优化
[0149]
制备3根ab-8大孔树脂柱，配制1.5mg/ml上样液3份，每份6bv，以2bv/h上样流速进行吸附结束后，测定流出液木脂素含量和体积，计算吸附量；取2bv的蒸馏水冲洗树脂柱，置换出树脂层中的原液；用95％乙醇分别以2bv/h、3bv/h、4bv/h的洗脱速率进行洗脱，洗脱剂用量8bv，测定洗脱液中木脂素含量和体积，计算洗脱率，确定最佳洗脱速度。不同洗脱速率下木脂素洗脱率汇总见表15。
[0150]
表15不同洗脱速率下木脂素洗脱率汇总
[0151][0152]
由表15可知，洗脱速率为2bv/h和3bv/h总木脂素洗脱率较高。洗脱速度越慢，总木脂素解吸越充分，所以选择2bv/h为最佳洗脱速率。由于2bv/h和3bv/h洗脱速率下总木脂素洗脱率较为接近，从生产效率的角度可选择3bv/h的洗脱速率节省生产时间。
[0153]
6、洗脱剂用量的优化
[0154]
配制总木脂素浓度为1.5mg/ml的上样液72ml，以2bv/h上样流速进行上样；吸附结束后，取2bv的蒸馏水冲洗树脂柱，置换出树脂层中的原液；取95％乙醇120ml以2bv/h的洗脱速率进行洗脱，用量筒每12ml(1bv)收集一次，将每次收集流出液取10ml置10ml具塞离心管中密封后冰箱保鲜室保存，做好标记。分别测定木脂素含量。不同洗脱剂用量下木脂素洗脱液含量见表16。
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表16不同洗脱剂用量下木脂素洗脱液含量汇总
[0156][0157][0158]
以洗脱体积为横坐标，洗脱液中木脂素含量为纵坐标绘制洗脱曲线。五味子藤木脂素洗脱曲线如图8所示。
[0159]
由图8可知，随着洗脱的进行，洗脱液中的总木脂素浓度在3bv附近达到峰值，随后在8bv趋近平稳；洗脱曲线下方的面积表示木脂素的洗脱量。为保证洗脱的充分，洗脱剂用量设定为8bv。
[0160]
五、纯化工艺验证实验
[0161]
根据总木脂素纯化工艺优化结果，制备3根ab-8大孔树脂柱进行3次生物学重复，上样浓度为1.5mg/ml，吸附速率为2bv/h，上样量6bv(72ml)，吸附结束后取2bv的蒸馏水冲洗树脂柱，置换出树脂层中的原液，以95％浓度乙醇进行洗脱，洗脱速率2bv/h，洗脱剂用量8bv(96ml)。收集洗脱液，测定洗脱液木脂素含量，计算3次纯化工艺的转移率及rsd。验证实验上样液和洗脱液含量汇总见表17。
[0162]
表17验证实验纯化前后木脂素含量汇总
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转移率(％)＝洗脱液含量(mg)/上样液含量(mg)
×
100％
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表18验证实验转移率汇总
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3次纯化实验对应上表rsd分别为：1.03％、0.44％、0.48％、0.39％、0.30％、0.27％。可见纯化工艺稳定可靠，5种木脂素的平均转移率及总木脂素转移率均在75％以上。
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六、大孔树脂纯化固形物中木脂素的含量测定
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将木脂素洗脱液置蒸发皿85℃下干燥至恒重，测得固形物质量；用95％乙醇复溶上述固形物，置100ml容量瓶定容，检测木脂素含量。固形物木脂素含量和总木脂素纯度见表19。
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表19固形物中木脂素含量和总木脂素纯度汇总
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由表19可知，大孔树脂纯化固形物中木脂素所占百分比均在59％以上，平均纯度59.7％。
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综上，本发明对大孔吸附树脂纯化工艺进行了优化设计，设计的最佳工艺为：总木脂素浓度为1.5mg/ml，最大上样量约为6倍柱床体积，洗脱流速1mi/min，蒸馏水洗脱体积为8倍柱床体积，洗脱荆95％乙醇用量为5倍柱床体积，克服了现有技术中仅考察了藤茎中木脂素含量较低且处于总木脂素中等极性范围的五味子酯甲，通过实验验证：纯化工艺稳定可靠，5种木脂素的平均转移率及总木脂素转移率均在75％以上。
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以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。