一种藤茶提取物的制备方法与流程

1.本发明涉及藤茶提取技术领域，具体涉及一种藤茶提取物的制备方法。


背景技术：

2.藤茶，学名显齿蛇葡萄(ampelopsis grossedentata)，是葡萄科蛇葡萄属的一种野生藤本植物，俗称甘露茶、白茶、白毛猴等。是一种多年生的藤本植物， 广泛分布于中国长江以南，是一种古老的药食两用植物，长期作为茶植物和中草药在民间广泛使用。它是一种具有独特保健功效和饮用价值的野生天然茶类植物代用茶，全株都具有药用价值，味道甘淡、属于凉性、具有祛风湿、清热解毒、强筋骨等功效。而且藤茶性凉，有止血、祛瘀消肿、除风湿及消炎，抗血栓、降血脂和抗氧化等较高的药用价值和营养价值，藤茶嫩茎、叶中含有多种化学成分，包括水分、蛋白质、维生素、多酚和黄酮等。其中黄酮类化合物具有重要的药理作用。二氢杨梅素是其中重要的黄酮类化合物。因此，藤茶的提取检测受到国内外的广泛关注。
3.现有技术中，藤茶的提取工艺主要有水提和醇提2种方法并以水提法研究较多。王岩等用正交法探讨了乙醇浓度、用量、提取时间和次数对藤茶二氢杨梅素的影响。杨铃用正交设计法考察了微波提取的温度、辐射时间及料液比3个因素对藤茶中二氢杨梅素得率的影响。成凤桂探讨了以水为提取剂提取温度、时间和体积对藤茶黄酮提取率的影响。以水为提取剂虽然提取剂成本低但提取温度高、时间长黄酮提取率和纯度低，增加了后续分离纯化的难度同时在长时间高温作用下势必降低黄酮等有效物质的活性。而以醇为提取剂提取率较低，分离出的有效物质含量少，而且存在着溶剂残留的不足。
4.现有技术中，藤茶的提取还包括超临界二氧化碳萃取法，该方法虽然污染小，萃取条件温和，不易破坏原料中的生物活性物质，但是设备投资量大，且不能最大限度地提取出藤茶有效活性物质。
5.例如申请号为【cn202110979359.8】的一种藤茶中二氢杨梅素的提取工艺及藤茶功能饮料的制备工艺，其中浸提方法包括预处理、逆流浸提处理、滤渣的预处理、滤渣的提取及合并、黄酮类提取物的减压浓缩、结晶等步骤。所述浸提方法既能够使得对原材料的浸提充分，还能够使得对滤渣中残留的黄酮类物质的浸提更加彻底，保证了黄酮类物质的高效提取，浸提率高、黄酮含量高。同时，该提取方法采用水浸提、超声浸提以及高压浸提相结合的方法，避免了乙醇等有机溶剂的使用带来的潜在污染。
6.上述提取工艺采用低温逆流浸提、溶剂采用表面活性剂，极大地提高了浸提量，充分浸提滤渣中的残留黄酮物质。但是采用低温逆流浸提，然后添加表面活性剂不仅存在溶剂残留的问题，表面活性剂还可能破坏原料中的生物活性物质，从而降低藤茶中的有效物质含量。


技术实现要素：

7.为解决上述问题，本发明提供了一种藤茶提取物的制备方法，该方法以藤茶为原
料进行提取，其提取物含有丰富的活性成分，具有较好的抗氧化、抑菌等作用，且该方法提取时间短、温度低，能充分提取藤茶中的活性成分。
8.为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：本发明提供了一种藤茶提取物的制备方法，包括以下步骤：s1、将藤茶溶于溶剂中，然后加入组合酶酶解40min，过滤得到滤渣a和滤液a；优选的，所述s1中溶剂为去离子水或质量浓度60%的乙醇溶液。
9.优选的，所述s1中藤茶、组合酶、溶剂的质量比为40：（0.4-2）：400。
10.本发明首先将藤茶洗涤除杂，然后将藤茶溶于溶剂中。
11.若溶剂中含钙、镁等离子，藤茶中的有效成分就会与多酚反应。特别是在水的硬度超过3 mg/l 时，进行藤茶的浸提，会发现浸提的茶汤中有大量沉淀。因此，对藤茶进行提取宜采用经过处理净化的低硬水，本发明中，所述s1中溶剂为去离子水。同时，还可以采用质量浓度60%的乙醇溶液代替去离子水进行溶解。
12.将藤茶溶解后，为了破除藤茶的细胞壁，本发明采用组合酶对其进行酶解。
13.优选的，组合酶包括果胶酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶的质量比为1：1：1：1。组合酶可以同时破坏细胞之间的胞间层和细胞壁，进而破坏细胞内层，使大分子物质转化成小分子物质，进而使得二氢杨梅素、多糖等有效物质在后续处理中易于萃取出来。
14.然后将酶解后的藤茶溶液过滤可以得到滤渣a和滤液a，但是仅凭酶解破坏细胞壁达到的提取效果并不完全，因此本发明对滤渣a进行酸碱处理。
15.s2、取上述s1中得到的滤渣a溶解，加入缓冲液，调节ph值为2.5-3.5，高压微波处理，过滤得滤渣b和滤液b；s3、取上述s2中得到的滤渣b溶解，加入缓冲液，调节ph值为8-9，高压微波处理，过滤得滤渣c和滤液c；优选的，所述s2-s3中高压微波处理的压力为400-600 kpa，时间为10 min。
16.本发明中，将酶解后的藤茶滤渣先进行酸处理，然后进行碱处理，同时由高压微波辅助，结合滤渣a中残留的蛋白酶，可以高度模拟口服药物经胃肠道转运吸收的环境，对藤茶滤渣进行深度消化处理，这样非常利于藤茶中的活性成分浸出。
17.其次，为了进一步提取藤茶残渣，将经过酸碱处理后得到的滤渣c进行超声提取。具体如下：s4、取上述s3中得到的滤渣c，加入缓冲剂，调整溶液ph为3.0-5.0，超声提取，过滤得滤液d，合并上述步骤中得到的滤液a、滤液b、滤液c和滤液d，即得粗提物。
18.优选的，所述s4中超声提取的条件为：在50℃下，超声功率100w超声提取30min。
19.优选的，所述s4中超声提取液经0.8um滤膜过滤。
20.优选的，所述s2-s3中缓冲液为枸橼酸-磷酸氢二钠，所述s4中缓冲剂为柠檬酸。主要起对ph调节的缓冲作用。
21.本发明中，在滤渣c中添加缓冲剂柠檬酸，调节溶液ph为3.0-5.0，以去离子水为溶剂，采用低温超声萃取技术，在较短时间内充分提取藤茶残渣中的活性成分。
22.超声波辅助提取法的作用机制主要是利用超声波产生的机械作用、空穴作用及热效应导致原料细胞壁破坏，使目标物穿透细胞膜，且能缩短提取时间，减少容积的使用，降低提取温度，较大程度提高目标产物的品质及产量。利用超声波辅助提取藤茶，不对提取物
的结构、活性产生影响，以期更大程度地提高其得率。
23.在将藤茶进行一系列处理后，本发明将经过酶处理得到的滤液a、酸处理得到的滤液b、碱处理得到的滤液c以及低温超声萃取得到的滤液d混合在一起即得所有藤茶的粗提物。
24.为了提纯藤茶的粗提物，本发明采用低温醇沉，使提取物中不稳定沉淀充分析出，经过滤浓缩和离心，由此制备的藤茶提取物色泽明亮，产品得率（成品质量m/原材料藤茶质量m）为80%-95%，而且该藤茶提取物中含多糖等成分。提纯步骤具体如下：s5、将上述s4中得到的粗提物浓缩至密度0.9000-1.0000g/cm3，然后加入质量浓度95%的乙醇进行醇沉46-48h，然后将醇沉液过滤得滤液e；s6、将上述s5中过滤得到的滤液e浓缩至密度0.9000-1.0500g/cm3，离心，取上清液于4-5℃下沉降22-24h，过滤得藤茶提取物。
25.优选的，所述s5中加入的质量浓度95%乙醇与浓缩后粗提物的质量比为1：1。
26.优选的，所述s6中离心条件为：在4000r/min速度下离心20min。
27.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：1.本发明提供的一种藤茶提取物的制备方法，通过酶解对藤茶进行初步提取，可以同时破坏藤茶细胞之间的胞间层和细胞壁，进而破坏细胞内层，然后模拟口服药物经胃肠道转运吸收的环境，对藤茶滤渣进行深度酸碱消化处理，这样非常利于藤茶中的活性成分浸出，然后采用超声辅助技术，通过超声波产生的机械作用、空穴作用及热效应导致原料细胞壁破坏，在低温条件下，短时间内充分萃取藤茶中的活性成分，最后加入高浓度酒精萃取一定时间，除去提取物中蛋白质、果胶等负作用成分，更大程度地提高藤茶黄酮、多糖等活性成分得率。由该方法制备的藤茶提取物色泽明亮，酸甜适口，产品稳定性好。
28.2.本发明提供的一种藤茶提取物的制备方法，该方法提取时间短、温度低，能充分提取藤茶中的活性成分，而且在提取过程中调整ph，通过低温醇沉等方式，可以使得制备所得藤茶提取物性质更稳定。
附图说明
29.图1是本发明实施例3中6种糖的混合标准物质液相图。
具体实施方式
30.为了更清楚地说明本发明实施例和现有技术中的技术方案，下面将对照附图说明本发明的具体实施方式。
31.显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，并获得其他的实施方式，本发明并不限制于该实施例。
32.本发明具体实施例如下：实施例1一种藤茶提取物的制备方法，包括以下步骤：s1、称取40g藤茶，加入400g去离子水中，然后加入0.4g组合酶酶解40min，过滤得到滤渣a和滤液a，其中，组合酶包括果胶酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶的质量比为1：1：1：1；
s2、取上述s1中得到的滤渣a溶于400g去离子水中，加入0.8g枸橼酸-磷酸氢二钠，调节ph值为2.5，高压微波处理，过滤得滤渣b和滤液b，其中，高压微波处理的压力为400kpa，时间为10 min；s3、取上述s2中得到的滤渣b溶于400g去离子水中，加入0.8g枸橼酸-磷酸氢二钠，调节ph值为8，高压微波处理，过滤得滤渣c和滤液c；s4、取上述s3中得到的滤渣c，加入0.8g柠檬酸，调整溶液ph为3.0，在50℃下，超声功率100w超声提取30min，经0.8um滤膜过滤得到滤液d，合并上述步骤中得到的滤液a、滤液b、滤液c和滤液d，即得粗提物；s5、将上述s4中得到的粗提物浓缩至密度0.9000g/cm3，然后按质量比1：1加入质量浓度95%的乙醇进行醇沉46h，然后将醇沉液过滤得滤液e；s6、将上述s5中过滤得到的滤液e浓缩至密度0.9000g/cm3，在4000r/min速度下离心20min，取上清液于4℃下沉降22h，过滤得藤茶提取物，提取物得率为80.1%。
33.实施例2一种藤茶提取物的制备方法，包括以下步骤：s1、称取40g藤茶，加入400g去离子水中，然后加入1.2g组合酶酶解40min，过滤得到滤渣a和滤液a，其中，组合酶包括果胶酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶的质量比为1：1：1：1；s2、取上述s1中得到的滤渣a溶于400g去离子水中，加入0.8g枸橼酸-磷酸氢二钠，调节ph值为3，高压微波处理，过滤得滤渣b和滤液b，其中，高压微波处理的压力为400kpa，时间为10 min；s3、取上述s2中得到的滤渣b溶于400g去离子水中，加入0.8g枸橼酸-磷酸氢二钠，调节ph值为8.5，高压微波处理，过滤得滤渣c和滤液c；s4、取上述s3中得到的滤渣c，加入0.8g柠檬酸，调整溶液ph为4.0，在50℃下，超声功率100w超声提取30min，经0.8um滤膜过滤得到滤液d，合并上述步骤中得到的滤液a、滤液b、滤液c和滤液d，即得粗提物；s5、将上述s4中得到的粗提物浓缩至密度0.9500g/cm3，然后按质量比1：1加入质量浓度95%的乙醇进行醇沉47h，然后将醇沉液过滤得滤液e；s6、将上述s5中过滤得到的滤液e浓缩至密度0.9500g/cm3，在4000r/min速度下离心20min，取上清液于4℃下沉降23h，过滤得藤茶提取物，提取物得率为82.2%。
34.实施例3一种藤茶提取物的制备方法，包括以下步骤：s1、称取40g藤茶，加入400g质量浓度60%的乙醇溶液中，然后加入1.2g组合酶酶解40min，过滤得到滤渣a和滤液a，其中，组合酶包括果胶酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶的质量比为1：1：1：1；s2、取上述s1中得到的滤渣a溶于400g去离子水中，加入0.8g枸橼酸-磷酸氢二钠，调节ph值为3，高压微波处理，过滤得滤渣b和滤液b，其中，高压微波处理的压力为400kpa，时间为10 min；s3、取上述s2中得到的滤渣b溶于400g去离子水中，加入0.8g枸橼酸-磷酸氢二钠，调节ph值为8.5，高压微波处理，过滤得滤渣c和滤液c；s4、取上述s3中得到的滤渣c，加入0.8g柠檬酸，调整溶液ph为4.0，在50℃下，超声
功率100w超声提取30min，经0.8um滤膜过滤得到滤液d，合并上述步骤中得到的滤液a、滤液b、滤液c和滤液d，即得粗提物；s5、将上述s4中得到的粗提物浓缩至密度0.9500g/cm3，然后按质量比1：1加入质量浓度95%的乙醇进行醇沉47h，然后将醇沉液过滤得滤液e；s6、将上述s5中过滤得到的滤液e浓缩至密度0.9500g/cm3，在4000r/min速度下离心20min，取上清液于4℃下沉降23h，过滤得藤茶提取物，提取物得率为82.5%。
35.实施例4一种藤茶提取物的制备方法，包括以下步骤：s1、称取40g藤茶，加入400g去离子水中，然后加入1.6g组合酶酶解40min，过滤得到滤渣a和滤液a，其中，组合酶包括果胶酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶的质量比为1：1：1：1；s2、取上述s1中得到的滤渣a溶于400g去离子水中，加入0.8g枸橼酸-磷酸氢二钠，调节ph值为3.2，高压微波处理，过滤得滤渣b和滤液b，其中，高压微波处理的压力为400kpa，时间为10 min；s3、取上述s2中得到的滤渣b溶于400g去离子水中，加入0.8g枸橼酸-磷酸氢二钠，调节ph值为8.8，高压微波处理，过滤得滤渣c和滤液c；s4、取上述s3中得到的滤渣c，加入0.8g柠檬酸，调整溶液ph为4.5，在50℃下，超声功率100w超声提取30min，经0.8um滤膜过滤得到滤液d，合并上述步骤中得到的滤液a、滤液b、滤液c和滤液d，即得粗提物；s5、将上述s4中得到的粗提物浓缩至密度0.9800g/cm3，然后按质量比1：1加入质量浓度95%的乙醇进行醇沉47.5h，然后将醇沉液过滤得滤液e；s6、将上述s5中过滤得到的滤液e浓缩至密度0.9800g/cm3，在4000r/min速度下离心20min，取上清液于4℃下沉降23.5h，过滤得藤茶提取物，提取物得率为82.0%。
36.实施例5一种藤茶提取物的制备方法，包括以下步骤：s1、称取40g藤茶，加入400g去离子水中，然后加入2.0g组合酶酶解40min，过滤得到滤渣a和滤液a，其中，组合酶包括果胶酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶的质量比为1：1：1：1；s2、取上述s1中得到的滤渣a溶于400g去离子水中，加入0.8g枸橼酸-磷酸氢二钠，调节ph值为3.5，高压微波处理，过滤得滤渣b和滤液b，其中，高压微波处理的压力为400kpa，时间为10 min；s3、取上述s2中得到的滤渣b溶于400g去离子水中，加入0.8g枸橼酸-磷酸氢二钠，调节ph值为9，高压微波处理，过滤得滤渣c和滤液c；s4、取上述s3中得到的滤渣c，加入0.8g柠檬酸，调整溶液ph为5，在50℃下，超声功率100w超声提取30min，经0.8um滤膜过滤得到滤液d，合并上述步骤中得到的滤液a、滤液b、滤液c和滤液d，即得粗提物；s5、将上述s4中得到的粗提物浓缩至密度1.0000g/cm3，然后按质量比1：1加入质量浓度95%的乙醇进行醇沉48h，然后将醇沉液过滤得滤液e；s6、将上述s5中过滤得到的滤液e浓缩至密度1.0000g/cm3，在4000r/min速度下离心20min，取上清液于4℃下沉降24h，过滤得藤茶提取物，提取物得率为81.9%。
37.对比例1
对比例1与实施例3的区别在于，对比例1中不添加组合酶进行酶解。具体如下：一种藤茶提取物的制备方法，包括以下步骤：s1、称取40g藤茶；s2、取上述s1中的藤茶溶于400g去离子水中，加入0.8g枸橼酸-磷酸氢二钠，调节ph值为3，高压微波处理，过滤得滤渣b和滤液b，其中，高压微波处理的压力为400kpa，时间为10 min；s3、取上述s2中得到的滤渣b溶于400g去离子水中，加入0.8g枸橼酸-磷酸氢二钠，调节ph值为8.5，高压微波处理，过滤得滤渣c和滤液c；s4、取上述s3中得到的滤渣c，加入0.8g柠檬酸，调整溶液ph为4.0，在50℃下，超声功率100w超声提取30min，经0.8um滤膜过滤得到滤液d，合并上述步骤中得到的滤液b、滤液c和滤液d，即得粗提物；s5、将上述s4中得到的粗提物浓缩至密度0.9500g/cm3，然后按质量比1：1加入质量浓度95%的乙醇进行醇沉47h，然后将醇沉液过滤得滤液e；s6、将上述s5中过滤得到的滤液e浓缩至密度0.9500g/cm3，在4000r/min速度下离心20min，取上清液于4℃下沉降23h，过滤得藤茶提取物，提取物得率为75.1%。
38.对比例2对比例2与实施例3的区别在于，对比例2中不模拟口服药物经胃肠道转运吸收的环境，对藤茶滤渣进行深度酸碱消化处理。具体如下：一种藤茶提取物的制备方法，包括以下步骤：s1、称取40g藤茶，加入400g质量浓度60%的乙醇溶液中，然后加入1.2g组合酶酶解40min，过滤得到滤渣a和滤液a，其中，组合酶包括果胶酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶的质量比为1：1：1：1；s2、取上述s1中得到的滤渣a，加入0.8g柠檬酸，调整溶液ph为4.0，在50℃下，超声功率100w超声提取30min，经0.8um滤膜过滤得到滤液d，合并上述步骤中得到的滤液a和滤液d，即得粗提物；s3、将上述s2中得到的粗提物浓缩至密度0.9500g/cm3，然后按质量比1：1加入质量浓度95%的乙醇进行醇沉47h，然后将醇沉液过滤得滤液e；s4、将上述s3中过滤得到的滤液e浓缩至密度0.9500g/cm3，在4000r/min速度下离心20min，取上清液于4℃下沉降23h，过滤得藤茶提取物，提取物得率为79.3%。
39.对比例3对比例3与实施例3的区别在于，对比例3中不进行超声辅助提取。具体如下：一种藤茶提取物的制备方法，包括以下步骤：s1、称取40g藤茶，加入400g质量浓度60%的乙醇溶液中，然后加入1.2g组合酶酶解40min，过滤得到滤渣a和滤液a，其中，组合酶包括果胶酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶的质量比为1：1：1：1；s2、取上述s1中得到的滤渣a溶于400g去离子水中，加入0.8g枸橼酸-磷酸氢二钠，调节ph值为3，高压微波处理，过滤得滤渣b和滤液b，其中，高压微波处理的压力为400kpa，时间为10 min；s3、取上述s2中得到的滤渣b溶于400g去离子水中，加入0.8g枸橼酸-磷酸氢二钠，
调节ph值为8.5，高压微波处理，过滤得滤渣c和滤液c；s4、合并上述步骤中得到的滤液a、滤液b和滤液c，即得粗提物；s5、将上述s4中得到的粗提物浓缩至密度0.9500g/cm3，然后按质量比1：1加入质量浓度95%的乙醇进行醇沉47h，然后将醇沉液过滤得滤液e；s6、将上述s5中过滤得到的滤液e浓缩至密度0.9500g/cm3，在4000r/min速度下离心20min，取上清液于4℃下沉降23h，过滤得藤茶提取物，提取物得率为76.6%。
40.由实施例1-5和对比例1-3的结果可知，实施例1-5的得率明显高于对比例1-3，说明本发明提供的藤茶提取方法能更加充分的提取其中的活性成分。
41.试验例1由于实施例3制备的藤茶提取物得率最高，因此本发明对实施例3得到的提取物进行液相色谱分析，色谱条件为：采用hplc-cad法分析，以乙腈-水为流动相，流速为1ml/min，柱温30℃，进样量10ul，采用梯度洗脱方式，电喷雾检测器(cad)参数为：采集频率10hz；滤光片10s；温度35℃；气源：氮气。梯度洗脱程序为：0~16min，80%~20%；16~22min，75%~25%；22~33min，55%~45%；33~36min，80%~20%。
42.实施例3中6种糖的混合标准物质液相图如图1所示。
43.试验例2本发明中，实施例2与实施例3两者得率较高，其主要区别在于步骤s1中溶剂采用的是水还是60%乙醇，因此，本发明对实施例2和实施例3进行6种糖含量的测定，并对6种糖的含量进行统计结果如下表1所示。
44.表1 实施案例1中藤茶提取物糖类成分含量组分保留时间（min）实施例2（mg/g）实施例3（mg/g）阿拉伯糖醇12.4320.29/果糖13.6630.250.21山梨醇15.7940.06/葡萄糖19.6430.370.09蔗糖27.782/0.19麦芽糖醇28.9530.260.07从表1中可以看出，以水作为提取液和以60%乙醇为提取液时，两者在多糖含量及组分上均存在差异，用水为提取液时，藤茶提取物中含有5种糖成分，包括阿拉伯糖醇、果糖、山梨醇、葡糖糖和麦芽糖醇，其中含量最高的是葡萄糖，为0.37mg/g；用60%乙醇为提取液时，藤茶提取物中含有4种糖成分，包括果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖醇，其中含量最高的是果糖，为0.21mg/g。
45.因此，本发明提供的藤茶提取物制备方法，其提取物含有丰富的活性成分，具有较好的抗氧化、抑菌等作用，相比传统提取方法，该方法提取时间短、温度低，能充分提取活性成分。
46.上面描述的内容可以单独地或者以各种方式组合起来实施，而这些变型方式都在本发明的保护范围之内。
47.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存
在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包含一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
…”
限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
48.以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施例只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。