基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器和系统的制作方法

1.本发明涉及细胞生物学、仿生学和医学技术领域，具体而言，涉及一种基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器和系统。


背景技术：

2.肝衰竭是临床常见的严重肝病症候群，病死率极高。人工肝是治疗肝衰竭的有效方法之一。通过一个体外的机械、理化和生物装置，清除各种有害物质，补充必需物质，改善内环境，暂时替代衰竭肝脏的部分功能，为肝细胞再生及肝功能恢复创造条件或等待机会进行肝移植。人工肝支持系统分为非生物型、生物型和混合型三种。相比于非生物型人工肝，生物型和混合型人工肝包含具有生物活性的细胞成分，提供肝细胞特有的生化功能。
3.但是，目前生物型和混合型人工肝存在如何在体外维持细胞活性及充分恢复其功能，装载足够的细胞数量以及进行充分的物质交换等难题，使其应用受到一定限制。
4.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的包括，例如，提供了一种基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器和系统，其能够实现肝细胞的长期稳定增殖并表达肝细胞特有的生化功能。
6.本发明的实施例可以这样实现：
7.第一方面，本发明提供一种基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器，包括罐体和反应腔室，所述罐体设置有进液端口和出液端口，所述反应腔室安装于所述罐体内，所述反应腔室包括柱体、半透膜和水凝胶丝，所述柱体是由多根间隔的附着杆围成的柱状结构，每根所述附着杆上均缠绕有所述水凝胶丝，所述水凝胶丝为包裹仿肝板结构的水凝胶丝，所述仿肝板结构含有肝细胞和肝窦内皮细胞，任意两个相邻的所述附着杆之间均安装有所述半透膜，所述半透膜以及缠绕有所述水凝胶丝的附着杆形成分隔所述罐体和所述反应腔室的侧壁，所述进液端口与所述罐体或所述反应腔室中的一者连通，所述出液端口与另一者连通。
8.在可选的实施方式中，所述附着杆上设置有多个用于对所述水凝胶丝进行限位的限位凸点。
9.在可选的实施方式中，所述半透膜为生物相容性半透膜；所述生物相容性半透膜材质为聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚二甲基硅氧烷。
10.在可选的实施方式中，所述反应腔室可拆卸的安装于所述罐体内；所述罐体内还设置有多个用于安装所述反应腔室的装载柱，所述柱体的底部设置有用于与所述装载柱配合安装的装载端口。
11.在可选的实施方式中，所述基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器还包括罐体盖，所述罐体盖与所述罐体螺纹连接或压力扣连接；所述罐体盖和所述罐体之间还设置有密封胶圈。
12.在可选的实施方式中，所述基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器还包括缠绕至连接的所述罐体盖和所述罐体的缝隙处的医用胶布密封层。
13.在可选的实施方式中，所述反应腔室为多个且均匀分布于所述罐体内，所述进液端口设置于所述罐体盖的中部，所述进液端口通过分液管分别与多个所述反应腔室连通，所述出液端口设置于所述罐体盖的一侧，所述出液端口还连接有出液管，所述出液管的一端伸入所述罐体的底部，另一端穿过所述出液端口伸出至所述罐体盖外。
14.在可选的实施方式中，所述水凝胶丝的制备方法包括：将含肝细胞的海藻酸钠溶液、含肝窦内皮细胞的海藻酸钠溶液、缓冲液及胶凝液分别加入微流控芯片形成包裹有肝细胞和肝窦内皮细胞的仿肝板结构的水凝胶，将所述水凝胶导出形成所述水凝胶丝；
15.其中，所述含肝细胞的海藻酸钠溶液包括0.5-0.9％(w/v)海藻酸钠、0.7-1.1％(w/v)nacl、0.03-0.07％(w/v)去端肽胶原、0.8-1.2％(w/v)牛血清白蛋白、8-12mmol/l heaps及2
×
10
7-4
×
107个/ml肝细胞；所述含肝窦内皮细胞的海藻酸钠溶液包括0.5-0.9％(w/v)海藻酸钠、0.7-1.1％(w/v)nacl、0.03-0.07％(w/v)去端肽胶原、0.8-1.2％(w/v)牛血清白蛋白、8-12mmol/l heaps及1
×
10
7-2
×
107个/ml内皮细胞；所述缓冲液包括8-12％(w/v)葡聚糖、0.7-1.1％(w/v)nacl及8-12mmol/l heaps；所述胶凝液包括8-12％(w/v)葡聚糖、16-24mmol/l bacl2、0.6-0.9％(w/v)nacl及8-12mmol/l heaps。
16.在可选的实施方式中，所述水凝胶丝缠绕于所述附着杆的方法包括：采用附着柱夹和转动驱动件将所述水凝胶丝缠绕于所述附着杆上；所述附着柱夹包括旋转臂、第一夹臂和第二夹臂，所述第一夹臂和所述第二夹臂均连接至旋转臂的同一端，所述第一夹臂和所述第二夹臂之间呈5-60
°
设置，所述第一夹臂和所述第二夹臂夹设于所述附着杆上，所述旋转臂的另一端设置有安装孔，所述转动驱动件连接至所述安装孔内，所述转动驱动件带动所述旋转臂转动，从而将所述水凝胶丝缠绕于所述附着柱上。
17.第二方面，本发明提供一种基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝系统，其包括如前述实施方式任一项的所述基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器。
18.本发明实施例的有益效果包括，例如：
19.本技术提供的基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器采用包裹含有肝细胞和肝窦内皮细胞的仿肝板结构的水凝胶丝以及半透膜实现对血浆进行物质交换，水凝胶丝缠绕于附着杆上，使得水凝胶丝并能够长期稳定表达，使净化功能更全面，更高效。此外，水凝胶丝作为肝细胞和肝窦内皮细胞的载体，其可以单独培养，便于批量化生产，当罐体内的水凝胶丝使用结束后，可以直接对反应腔室进行替换，有利于优化资源利用率。该基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器的高分子水凝胶化学和机械稳定性以及生物相容性好，净化效率高，提升了肝细胞极性和生化功能。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
21.图1为本实施例提供的基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器的正视图；
22.图2为本实施例提供的基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器的俯视图；
23.图3为本实施例提供的基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器的罐体底部设置的转载柱的结构示意图；
24.图4为本实施例提供的基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器的透视立体图；
25.图5为本实施例提供的基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器的反应腔室的结构示意图；
26.图6为本实施例提供的基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器的水凝胶丝缠绕于附着杆上的结构示意图；
27.图7为本实施例提供的用于将水凝胶丝缠绕至附着杆上的附着柱夹的结构示意图。
28.图标：100-基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器；110-罐体；111-进液端口；112-出液端口；113-装载柱；114-罐体盖；115-分液管；120-反应腔室；121-柱体；122-附着杆；123-半透膜；124-水凝胶丝；125-限位凸点；126-装载端口；200-附着柱夹；201-旋转臂；202-第一夹臂；203-第二夹臂；204-安装孔。
具体实施方式
29.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
30.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
32.在本发明的描述中，需要说明的是，若出现术语“上”、“下”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
33.此外，若出现术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
34.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例中的特征可以相互结合。
35.请参考图1，本实施例提供了一种基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器100，包括罐体110和反应腔室120。
36.其中，罐体110为中空圆筒状，罐体110的顶部开口且设置有罐体盖114，罐体盖114与罐体110螺纹连接或压力扣连接，罐体盖114用于实现封闭罐体110。罐体盖114和罐体110之间还设置有密封胶圈，密封胶圈可以加强密封性，防止液体渗出。当罐体盖114和罐体110
通过螺纹相结合时，罐体盖114内侧顶部加设一圈密封胶圈；当罐体盖114和罐体110通过压力扣相结合时，罐体盖114与罐体110连接处加设一圈密封胶圈。
37.请参阅图2，罐体110上设置有进液端口111和出液端口112，进液端口111和出液端口112的设置位置有多种，例如可以设置于罐体110顶部的罐体盖114上，也可以开设于罐体110的侧壁上。具体到本实施例中，该进液端口111和出液端口112均设置于罐体盖114上，其中，进液端口111设置于罐体盖114的中部，进液端口111通过分液管115分别与多个反应腔室120连通，实现将血浆通入反应腔室120内进行物质交换。出液端口112设置于罐体盖114的一侧，出液端口112还连接有出液管，出液管的一端伸入罐体110的底部，另一端穿过出液端口112伸出至罐体盖114外，实现将经过物质交换的血浆从罐体110内排出。进液端口111、出液端口112和罐体盖114为一体化结构，一体化结构可以避免液体从连接处渗出并减低加工生产难度与成本。
38.请参阅图4、图5和图6，反应腔室120安装于罐体110内，反应腔室120的个数为一个或多个，多个反应腔室120均匀分布于罐体110内。每个反应腔室120均包括柱体121、半透膜123和水凝胶丝124。柱体121是由多根间隔的附着杆122围成的柱状结构，每根附着杆122上均缠绕有水凝胶丝124，任意两个相邻的附着杆122之间安装有半透膜123，水凝胶丝124为包裹仿肝板结构的水凝胶丝124，仿肝板结构含有肝细胞和肝窦内皮细胞。半透膜123以及缠绕有水凝胶丝124的附着杆122形成分隔罐体110和反应腔室120的侧壁，进液端口111与罐体110或反应腔室120中的一者连通，出液端口112与另一者连通，从而实现血浆经反应腔室120处理后再排出。
39.其中，附着杆122为细长的杆状结构，其表面设置有多个用于对水凝胶丝124进行限位的限位凸点125；多个限位凸点125沿着附着杆122的轴线方向均匀分布；限位凸点125的设置可以有效避免水凝胶丝124在重力作用下出现滑脱的情况。附着杆122的个数大于等于8根，以减低水凝胶丝124在水平方向上受到的剪切应力的差异，从而减轻对水凝胶丝124内的细胞的生长和生化功能的影响。多根附着杆122围成柱体121，本技术中，柱体121的形状不受限制，例如可以由多根附着杆122围成圆柱形、四棱柱形、三棱柱形、椭圆柱形等等各种柱状结构。
40.本技术中，水凝胶丝124的制备方法可参阅专利号为cn201310593883.7的申请文件：仿肝板结构肝细胞三维培养装置及其培养方法，具体来说，水凝胶丝124的制备方法包括：将含肝细胞的海藻酸钠溶液、含肝窦内皮细胞的海藻酸钠溶液、缓冲液及胶凝液分别加入微流控芯片形成包裹有肝细胞和肝窦内皮细胞的仿肝板结构的水凝胶，将水凝胶导出形成水凝胶丝124；其中，含肝细胞的海藻酸钠溶液包括0.5-0.9％(w/v)海藻酸钠、0.7-1.1％(w/v)nacl、0.03-0.07％(w/v)去端肽胶原、0.8-1.2％(w/v)牛血清白蛋白、8-12mmol/l heaps及2
×
10
7-4
×
107个/ml肝细胞；含肝窦内皮细胞的海藻酸钠溶液包括0.5-0.9％(w/v)海藻酸钠、0.7-1.1％(w/v)nacl、0.03-0.07％(w/v)去端肽胶原、0.8-1.2％(w/v)牛血清白蛋白、8-12mmol/l heaps及1
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10
7-2
×
107个/ml内皮细胞；缓冲液包括8-12％(w/v)葡聚糖、0.7-1.1％(w/v)nacl及8-12mmol/l heaps；胶凝液包括8-12％(w/v)葡聚糖、16-24mmol/l bacl2、0.6-0.9％(w/v)nacl及8-12mmol/l heaps；优选地，含肝细胞的海藻酸钠溶液包括0.7％(w/v)海藻酸钠、0.9％(w/v)nacl、0.05％(w/v)去端肽胶原、1％(w/v)牛血清白蛋白、10mmol/l heaps及3
×
107个/ml肝细胞；含肝窦内皮细胞的海藻酸钠溶液包括0.7％(w/v)
海藻酸钠、0.9％(w/v)nacl、0.05％(w/v)去端肽胶原、1％(w/v)牛血清白蛋白、10mmol/l heaps及1
×
107个/ml内皮细胞；缓冲液包括10％(w/v)葡聚糖、0.9％(w/v)nacl及10mmol/l heaps；胶凝液包括10％(w/v)葡聚糖、20mmol/l bacl2、0.72％(w/v)nacl及10mmol/l heaps。
41.本实施例使用的肝细胞为人正常肝永生化细胞株l02，l02细胞具有肝功能好、增值力强、安全的优点。本技术使用的内皮细胞为人脐静脉内皮细胞株ea.hy926复苏传代培养的细胞，本技术中选择细胞状态最佳，活力超过90％以上的细胞作为本技术的肝细胞和内皮细胞。
42.请参阅图7，将制备获得的水凝胶丝124缠绕于附着杆122上，缠绕方法具体包括：采用附着柱夹200和转动驱动件(图未示)将水凝胶丝124缠绕于附着杆122上；优选地，附着柱夹200包括旋转臂201、第一夹臂202和第二夹臂203，第一夹臂202和第二夹臂203均连接至旋转臂201的同一端，第一夹臂202和第二夹臂203之间呈5-60
°
设置，第一夹臂202和第二夹臂203夹设于附着杆122上，旋转臂201的另一端设置有安装孔204，转动驱动件连接至安装孔204内，转动驱动件带动旋转臂201转动，从而将水凝胶丝124缠绕于附着柱上，待固定好，裁剪去除多余的水凝胶，完成固定。
43.半透膜123为生物相容性半透膜123；优选地，生物相容性半透膜123材质为聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚二甲基硅氧烷。生物相容性半透膜123和限位凸点125可使仿肝板结构三维共培养水凝胶丝124长期稳定地固定在反应腔室120上，生物相容性半透膜123和肝窦内皮细胞可使血液中的物质有效通过并由肝细胞分解代谢。
44.请参阅图3和图4，本技术中的反应腔室120个数也为多个，反应腔室120可拆卸地安装于罐体110的方式有多种，本技术示出了一种典型但非限制性的示例，本技术中，通过在罐体110的底部设置有多个用于安装反应腔室120的装载柱113，多个装载柱113均匀对称的分布于罐体110的底部，水凝胶固定柱的柱体121底部设置有用于与装载柱113配合安装的装载端口126，装载柱113的直径大致等于装载端口126的内径；本技术中，通过将水凝胶固定柱的装载端口126直接卡设于装载柱113上，从而将反应腔室120固定于罐体110底部，装载柱113的个数与反应腔室120的个数相同且一一对应，优选地，柱体121的个数为4-10个，装载柱113对应为4-10个。反应腔室120的装载端口126的设计可以按需求调整反应腔室120的数量，同时便于更换反应腔室120，优化资源利用率。
45.将反应腔室120固定于罐体110底部后，将罐体盖114盖上使其与罐体110连接，本技术中，基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器100还包括缠绕至连接的罐体盖114和罐体110的缝隙处的医用胶布密封层(图未示)，医用胶布密封层可以实现进一步加强密封性。本实施例提供的基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器100在使用前，需进行高压灭菌、消毒烤干的处理。
46.本实施例提供的一种基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器100利用多根缠绕有水凝胶丝124的附着杆122围成柱状结构的柱体121，同时利用安装于任意两个相邻的附着杆122之间的半透膜123形成柱体121的侧壁，从而使得反应腔室120将罐体110内的空间分为柱体121内部空间和柱体121外部空间。由于水凝胶丝124上包覆有仿肝板结构，仿肝板结构含有肝细胞和肝窦内皮细胞，此时在利用进液端口111向罐体110的反应腔室120内通入液体时，进入反应腔室120的液体可以与附着杆122上缠绕的水凝胶丝124进行液相
物质交换，将物质交换后的液体从反应腔室120内排出至反应腔室120外，此时利用罐体110内的出液端口112对物质交换后的液体进行排出，从而有效提升了肝细胞的极性和生化功能，并能够长期稳定表达，使净化功能更全面，更高效。此外，水凝胶丝124作为肝细胞和肝窦内皮细胞的载体，其可以单独培养，便于批量化生产，当罐体110内的水凝胶丝124使用结束后，可以直接对反应腔室120进行替换，有利于优化资源利用率。
47.本技术还提供了一种基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝系统，其包括基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器100，该系统还可以包括一些常规的分离血液的结构或者输送血液的结构。具体来说，该系统的使用方法为：将患者或实验动物的血液引出体外后，经血浆分离柱将全血分离为血浆及血细胞组分，其中血浆进入基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器100，分离的血细胞组分与在基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器100中解毒完的血浆重新混合后返回至患者或实验动物体内。
48.综上所述，本技术提供的基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器100密封性强，高分子水凝胶化学和机械稳定性以及生物相容性好，净化效率高，仿肝板结构三维共培养提升了肝细胞极性和生化功能，并能够长期稳定表达，使净化功能更全面，更高效，通入基于仿肝板结构三维培养的生物人工肝反应器100的血浆可以与水凝胶丝124内包裹的含有肝细胞和肝窦内皮细胞的肝板结构进行物质交换，将物质交换后的液体从出液端口112排出，从而有效提升了肝细胞的极性和生化功能，并能够长期稳定表达，使净化功能更全面，更高效。此外，水凝胶丝124作为肝细胞和肝窦内皮细胞的载体，其可以单独培养，便于批量化生产，当罐体110内的水凝胶丝124使用结束后，可以直接对反应腔室120进行替换，有利于优化资源利用率。
49.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。