一种脱细胞冻干羊膜产品的制备工艺的制作方法

1.本发明涉及医用材料技术领域，具体为一种脱细胞冻干羊膜产品的制备工艺。


背景技术：

2.人羊膜是人胎盘的最内层，内部包被着羊水和胎儿，是一道阻隔母体与胎儿两个异体组织互不排斥的奇妙屏障。随着产妇分娩，胎盘被排出体外，对胎盘进行剥离即可得到新鲜羊膜。因此，羊膜来源充足。羊膜因其无血管、无神经、无淋巴，所以免疫性很低，在眼角损伤修复、皮肤损伤修复、肌腱重建、外科手术防黏连等领域具有极大应用前景。目前，市售的羊膜产品仅有三种。限制羊膜产品转化的因素有很多，其中羊膜不合理的生产方法是主要因素之一。
3.按照国家法律法规的要求，动物源医疗器械在生产过程中需进行病毒灭活以及免疫原性物质去除，保证产品的安全性。羊膜中的免疫原物质常指细胞成分，因此生产工艺中需包含病毒灭活操作以及脱细胞操作。关于病毒灭活，常见的处理方式有物理法如辐照灭活法和化学法如乙醇灭活法、过氧乙酸-乙醇法、酸碱法等。也有如专利cn 110946879 a所述病毒灭活方法为过氧乙酸/氯化钠溶液灭活法，高浓度氯化钠会损伤羊膜组织微结构。因此，选择合适的病毒灭活方法时还需考虑该方法对羊膜的结构和组成的影响。关于脱细胞，常选择温和试剂长时间浸泡处理，或剧烈型试剂短时间处理。采用温和试剂处理的目的是大程度上保留羊膜中的蛋白和因子，一般选用各种酶比如核酸酶、蛋白酶、脂肪酶等；专利号cn 108048391 a所述的脱细胞方法，采用了胰蛋白酶、中性蛋白酶、去污剂以及核酸酶的两种或多种组合进行脱细胞，但是核酸酶不易去除且免疫性比较大，尤其是动物来源的酶涉及到安全性问题，不适合在生产中使用；采用剧烈型试剂的目的是快速获得脱细胞羊膜。两种方式互有优劣，温和型试剂处理耗时太长，一般需要一两天；剧烈型试剂处理对羊膜的结构破坏大，且蛋白和因子也基本被清除。专利cn 110946879 a采用剧烈型试剂碳酸氢钠清洗，之后用温和型试剂胰蛋白酶以及tritonx-100分别进行脱细胞，耗时7小时以上。专利cn 110101909 a 提出一种性能可控的脱细胞羊膜生产方法，该方法采用多种化学试剂浸泡处理进行病毒灭活以及脱细胞，工艺过于复杂，增加了生产过程中的风险。专利cn 109395166 a提出一种物理脱细胞方法，即通过物理刮除以及超声清洗相结合的手段，避免使用化学试剂。该法忽略了羊膜质地柔软易破损的性质，极大概率会造成羊膜破损而不合格。此外，羊膜的常见应用形式是冻干羊膜，但是羊膜力学性能差且易于冻干收缩，因此尺寸难以精确控制。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：一种脱细胞冻干羊膜产品的制备工艺，步骤如下：s1.对羊膜进行胎盘剥离并分型；s2.将步骤s1所得羊膜浸泡于病毒灭活试剂中，浸泡进行病毒灭活；
s3.将步骤s2所得羊膜用纯化水进行病毒灭活试剂清洗，至无病毒灭活试剂残留；s4.将步骤s3所得羊膜浸泡于脱细胞试剂中，浸泡进行脱细胞处理；s5.将步骤s4所得羊膜用纯化水进行脱细胞试剂清洗，至无脱细胞试剂残留；s6.将步骤s5所得羊膜进行冷冻干燥，得到整张平面羊膜；s7.将步骤s6所得羊膜进行切割成型，得到规定尺寸的羊膜片；s8.将步骤s7所得羊膜进行内包装，辐照灭菌，再外包成品。
5.较佳的，所述分型包括有绒毛层羊膜和无绒毛层羊膜。
6.较佳的，所述病毒灭活试剂为75%乙醇溶液以及过氧乙酸/乙醇溶液其中的一种，浸泡时间为20~40分钟；所述过氧乙酸/乙醇溶液中浓度分别为过氧乙酸3.5~5%，乙醇20~30%。
7.较佳的，所述病毒灭活试剂清洗时间为30~60分钟，每间隔10分钟换液1次。
8.较佳的，所述脱细胞试剂包括tritonx-100和氢氧化钠；所述脱细胞处理为使用tritonx-100浸泡2小时，再使用氢氧化钠浸泡1小时；所述脱细胞处理条件为25℃摇床震荡，震荡频率为120-180rpm。
9.较佳的，所述tritonx-100浓度为0.5%-1%，所述氢氧化钠浓度为0.01%-0.1%。
10.较佳的，所述脱细胞试剂清洗时间为1~2小时，每隔10分钟换液1次。
11.较佳的，所述冷冻干燥时间为8小时及以上。
12.较佳的，所述内包装为双层包装，所述辐照灭菌步骤所用辐照源为钴-60(
60
co)，所用辐照剂量为25kgy。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果是：1.在病毒灭活操作中，选用适合羊膜组织微结构的75%乙醇溶液以及过氧乙酸/乙醇溶液作为病毒灭活试剂，在确保病毒灭火处理有效性的同时减小了对羊膜微组织结构的破坏性，且易于清洗不会造成残留；2.在脱细胞处理中，选用温和型试剂tritonx-100和剧烈型试剂氢氧化钠叠加的方法进行处理，先由tritonx-100试剂对羊膜进行脱细胞处理，脱细胞效果显著，且对羊膜微结构的破坏小；其次所用氢氧化钠浓度较低，可将tritonx-100破碎的细胞成分进行溶解的同时保证羊膜微结构不被氢氧化钠所破坏；3.加工顺序中，先对羊膜进行冷冻干燥处理，其后才是进行切割成型步骤，使羊膜在冷冻干燥处理前维持大体积，防止半透明状且易损的羊膜在溶液中遭到破坏或在换液时倒出；同时，切割成型后置可以有效避免冻干处理造成的尺寸收缩而形成的羊膜不合规；4.加工工艺针对有绒毛层和无绒毛层两种羊膜产品，适用范围广，可应用性强。
附图说明
14.图1为脱细胞冻干羊膜的生产工艺流程图；图2为病毒灭活处理后的羊膜h&e图，以及病毒灭活处理前的羊膜图；图3为脱细胞处理前后的羊膜h&e图；图4为脱细胞处理后的羊膜dna含量检测结果图。
具体实施方式
15.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
16.实施例1：选取足月胎盘钝性剥离羊膜组织，进行分型处理保留绒毛层，用纯化水清洗多次去除血液成分、胶质等杂质成分，得到一张完整的透明有绒毛层羊膜。
17.将完整的羊膜浸泡于作为病毒灭活试剂的75%乙醇溶液中，摇床震荡浸泡30分钟，进行病毒灭活处理，取出后的羊膜如附图2中a-1与a-2所表现的状态；此时将羊膜再次置于盛有纯化水的容器内，震荡清洗40分钟，每间隔10分钟进行一次换液，直至羊膜表面的病毒灭活试剂被清洗干净。
18.将洗净后的完整羊膜置于盛有一定量脱细胞试剂的容器中，脱细胞试剂选用浓度为1%的 tritonx-100溶液，根据tritonx-100较为温和的特性，以25℃的温度环境下摇床震荡，震荡频率为160rpm，震荡时间为2小时，确保对羊膜进行完整地脱细胞反应；用纯化水洗去羊膜表面的大量泡沫后，将羊膜置于盛有一定量浓度为0.01%的氢氧化钠容器中，继续震荡1小时，由于氢氧化钠属于剧烈型试剂，因此氢氧化钠应置于tritonx-100之后再进行处理，能够有效将tritonx-100破碎的细胞成分进行溶解，处理完成后的羊膜如附图3中放大200倍后的羊膜h&e图。
19.将经过脱细胞处理过后的羊膜置于盛有纯化水的容器内，震荡清洗1个小时，且每间隔10分钟进行一次换液，直至羊膜表面的脱细胞试剂被完全洗净，脱细胞处理完成后经检测，dna含量大幅度减小，如图4所示的脱细胞处理后的羊膜dna含量检测结果图。
20.将完整的羊膜平铺于冷冻干燥机的不锈钢托盘中进行冻干处理，冻干时间为8小时；将冻干后的羊膜平铺在不锈钢桌面，按照要求切割成型，由于冷冻干燥的过程中会逐渐脱水收缩，使其尺寸上发生变化，因此需要在冷冻干燥处理过后再进行裁剪，以最大程度上保证羊膜成品尺寸的合格率。
21.将裁剪合格的羊膜进行内包；将产品辐照灭菌，所用辐照源为钴-60(
60
co)，所用辐照剂量为25kgy，灭菌完成后，再进行外包装。
22.实施例2：选取足月胎盘钝性剥离羊膜组织，进行分型处理保留绒毛层，用纯化水清洗多次去除血液成分、胶质等杂质成分，得到一张完整的透明有绒毛层羊膜。
23.将羊膜浸泡于过氧乙酸/乙醇溶液中，摇床震荡浸泡30分钟，取出羊膜图2中b为过氧乙酸/乙醇醇溶液浸泡处理30分钟后的羊膜h&e图。
24.将完整的羊膜浸泡于作为病毒灭活试剂的过氧乙酸/乙醇溶液中，摇床震荡浸泡30分钟，进行病毒灭活处理，取出后的羊膜如附图2中b-1与b-2所表现的状态；此时将羊膜再次置于盛有纯化水的容器内，震荡清洗40分钟，每间隔10分钟进行一次换液，直至羊膜表面的病毒灭活试剂被清洗干净。
25.将洗净后的完整羊膜置于盛有一定量脱细胞试剂的容器中，脱细胞试剂选用浓度为0.5%的tritonx-100溶液，根据tritonx-100较为温和的特性，以25℃的温度环境下摇床
震荡，震荡频率为160rpm，震荡时间为2小时，确保对羊膜进行完整地脱细胞反应；用纯化水洗去羊膜表面的大量泡沫后，将羊膜置于盛有一定量浓度为0.01%的氢氧化钠容器中，继续震荡1小时，由于氢氧化钠属于剧烈型试剂，因此氢氧化钠应置于tritonx-100之后再进行处理，能够有效将tritonx-100破碎的细胞成分进行溶解，处理完成后的羊膜如附图3中放大200倍后的羊膜h&e图。
26.将经过脱细胞处理过后的羊膜置于盛有纯化水的容器内，震荡清洗1个小时，且每间隔10分钟进行一次换液，直至羊膜表面的脱细胞试剂被完全洗净，脱细胞处理完成后经检测，dna含量大幅度减小，如图4所示的脱细胞处理后的羊膜dna含量检测结果图。
27.将完整的羊膜平铺于冷冻干燥机的不锈钢托盘中进行冻干处理，冻干时间为8小时；将冻干后的羊膜平铺在不锈钢桌面，按照要求切割成型，由于冷冻干燥的过程中会逐渐脱水收缩，使其尺寸上发生变化，因此需要在冷冻干燥处理过后再进行裁剪，以最大程度上保证羊膜成品尺寸的合格率。
28.将裁剪合格的羊膜进行内包；将产品辐照灭菌，所用辐照源为钴-60(
60
co)，所用辐照剂量为25kgy，灭菌完成后，再进行外包装。
29.实施例3：选取足月胎盘钝性剥离羊膜组织，进行分型处理去除绒毛层，用纯化水清洗多次去除血液成分、胶质等杂质成分，得到一张完整的透明有绒毛层羊膜。
30.将完整的羊膜浸泡于作为病毒灭活试剂的75%乙醇溶液中，摇床震荡浸泡30分钟，进行病毒灭活处理，取出后的羊膜如附图2中a-1与a-2所表现的状态；此时将羊膜再次置于盛有纯化水的容器内，震荡清洗40分钟，每间隔10分钟进行一次换液，直至羊膜表面的病毒灭活试剂被清洗干净。
31.将洗净后的完整羊膜置于盛有一定量脱细胞试剂的容器中，脱细胞试剂选用浓度为0.5%的tritonx-100溶液，根据tritonx-100较为温和的特性，以25℃的温度环境下摇床震荡，震荡频率为160rpm，震荡时间为2小时，确保对羊膜进行完整地脱细胞反应；用纯化水洗去羊膜表面的大量泡沫后，将羊膜置于盛有一定量浓度为0.01%的氢氧化钠容器中，继续震荡1小时，由于氢氧化钠属于剧烈型试剂，因此氢氧化钠应置于tritonx-100之后再进行处理，能够有效将tritonx-100破碎的细胞成分进行溶解，处理完成后的羊膜如附图3中放大200倍后的羊膜h&e图。
32.将经过脱细胞处理过后的羊膜置于盛有纯化水的容器内，震荡清洗1个小时，且每间隔10分钟进行一次换液，直至羊膜表面的脱细胞试剂被完全洗净，脱细胞处理完成后经检测，dna含量大幅度减小，如图4所示的脱细胞处理后的羊膜dna含量检测结果图。
33.将完整的羊膜平铺于冷冻干燥机的不锈钢托盘中进行冻干处理，冻干时间为8小时；将冻干后的羊膜平铺在不锈钢桌面，按照要求切割成型，由于冷冻干燥的过程中会逐渐脱水收缩，使其尺寸上发生变化，因此需要在冷冻干燥处理过后再进行裁剪，以最大程度上保证羊膜成品尺寸的合格率。
34.将裁剪合格的羊膜进行内包；将产品辐照灭菌，所用辐照源为钴-60(
60
co)，所用辐照剂量为25kgy，灭菌完成后，再进行外包装。
35.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换
和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。